Summary
Detta protokoll beskriver stegen i CRISPR/Cas9 riktad mutagenes i sandflugor: embryosamling, injektion, insektsuppfödning och identifiering samt urval av mutationer av intresse.
Abstract
Sandflugor är de naturliga vektorerna för Leishmania-arter, protozoiska parasiter som producerar ett brett spektrum av symtom som sträcker sig från testning skador till visceral patologi. Dechiffrering av vektor/ parasitinteraktioner är av primär betydelse för bättre förståelse av Leishmania-överföring till sina värdar. Bland de parametrar som styr sandflugans vektorkompetens (dvs. deras förmåga att bära och överföra patogener) visades parametrar som är inneboende i dessa insekter spela en nyckelroll. Insekt immunsvar, till exempel, påverkar sandfluga vektor kompetens till Leishmania. Studien av sådana parametrar har begränsats av bristen på metoder för genuttrycksmodifiering anpassad för användning i dessa icke-modellorganismer. Gen downregulation av små störande RNA (siRNA) är möjligt, men förutom att vara tekniskt utmanande, leder tystningen till endast en partiell förlust av funktion, som inte kan överföras från generation till generation. Riktad mutagenes av CRISPR/Cas9-tekniken anpassades nyligen till Phlebotomus papatasi sandfluga. Denna teknik leder till generering av överförbara mutationer i en specifikt vald locus, vilket gör det möjligt att studera de gener av intresse. CRISPR/Cas9-systemet förlitar sig på induktion av riktade DNA-pauser med dubbla strängar, som senare repareras av antingen icke-homolog end joining (NHEJ) eller av Homology Driven Repair (HDR). NHEJ består av en enkel stängning av pausen och leder ofta till små insättnings-/raderingshändelser. Hdr använder däremot närvaron av en donator-DNA-molekyl som delar homologi med mål-DNA som en mall för reparation. Här presenterar vi en mikroinjektionsmetod för sandflugaembryon för riktad mutagenes av CRISPR/Cas9 med NHEJ, som är den enda genommodifieringstekniken som hittills anpassats för sandflygvektorer.
Introduction
Vektorburna sjukdomar är ett stort folkhälsohot i ständig utveckling. Hundratals vektorarter spridda över mycket distinkta fylogena familjer (t.ex. myggor, fästingar, loppor) är ansvariga för överföringen av ett stort antal mikrobiella patogener, vilket resulterar i mer än 700 000 mänskliga dödsfall per år, enligt Världshälsoorganisationen. Bland vektorinsekter utgör phlebotomine sandflugor (Diptera, Psychodidae) en stor grupp, med 80 beprövade vektorarter som uppvisar distinkta fenotypiska egenskaper och vektorkapacitet som finns i olika geografiska regioner. De är vektorer för protozoiska parasiter av släktet Leishmania, vilket orsakar cirka 1,3 miljoner nya fall av Leishmaniases och mellan 20 000 och 30 000 dödsfall per år. Leishmaniases kliniska resultat är olika, med symtom som sträcker sig från självbegränsande testning skador till visceral spridning som är dödlig i avsaknad av behandling.
Sandflugor är strikt jordiska insekter. Deras livscykel, relativt lång jämfört med andra Diptera, varar upp till tre månader, beroende på olika parametrar som temperatur, fuktighet och näring. Den består av ett embryonalt stadium (6 till 11 dagar), fyra larvsteg (som varar totalt 23 till 25 dagar) och ett pupalstadium (9 till 10 dagar) följt av metamorfos och sedan vuxen ålder. Sandflugor kräver en fuktig och varm miljö för uppfödning. Både män och kvinnor matar på sockerarter, som erhålls i naturen från blomnektar. Endast kvinnor är blodmatare, eftersom de kräver proteiner som erhållits från blodmjölet för äggproduktion1.
Ett viktigt fokus för forskningen är att identifiera arten av vektor/ parasitinteraktioner som leder till utveckling av överförbara infektioner. Liksom med andra vektorinsekter har parametrar som är inneboende i sandflugor visat sig påverka deras vektorkompetens, vilket definieras som deras förmåga att bära och överföra patogener till sina värdar. Till exempel kan uttrycket av galectiner av Phlebotomus papatasi sand flyga midgutceller, som fungerar som receptorer som känner igen parasitytans komponenter, direkt påverka deras vektorkompetens för Leishmania major2,3. Insekt immunsvarsvägen, Immunbrist (IMD), är också avgörande för Phlebotomus papatasi sandfluga vektor kompetens för Leishmania major4. En kritisk roll för vektor insekt immunsvar vägar för att kontrollera deras överföring av infektiös patogener har rapporterats på samma sätt i Aedes aegypti myggor5,6,7, i tsetse flyga Glossina morsitans8, och i Anopheles gambiae myggor9,10.
Studier av sandfluga /Leishmania interaktioner har begränsats av bristen på genuttryck modifieringsmetoder anpassade för användning i dessa insekter. Endast gen downregulation av små störande RNA (siRNA) hade utförts11,12,13,14 tills nyligen. Tekniken, begränsad av dödligheten i samband med mikroinjektion av vuxna kvinnor, leder endast till en partiell funktionsförlust, som inte kan överföras från generation till generation.
CRISPR/Cas9-tekniken har revolutionerat funktionell genomisk forskning i icke-modellorganismer som sandflugor. Modifierad från det adaptiva immunsystemet i prokaryoter för försvar mot bakteriofag15,16, har CRISPR Cas9-systemet snabbt anpassats som ett genomredigeringsverktyg för överlägsna eukaryota organismer, inklusive insekter. Principen om CRISPR/Cas9 riktad genomredigering bygger på komplementariteten hos en enda guide RNA (sgRNA) till en specifik genomisk locus. Cas9-kärnan binder till sgRNA och skapar en dubbelsträngad DNA -brytning (dsDNA) i det genomiska DNA där sgRNA associerar med sin kompletterande sekvens. Cas9-sgRNA-komplexet styrs till målsekvensen med 17 till 20 kompletterande baser i sgRNA till den valda locus, dsDNA-pausen kan sedan repareras av två oberoende vägar: nonhomologous end joining (NHEJ) eller homology-regisserad reparation (HDR)17. NHEJ-reparation innebär en enkel stängning av pausen men leder ofta till små insättnings-/raderingshändelser. DNA-reparation genom HDR använder en donator-DNA-molekyl som delar homologi med mål-DNA som en mall för reparation. Insekter har båda maskinerierna.
CRISPR/Cas9-tekniken kan generera mutationer i en vald locus, genom NHEJ-reparationsvägen; eller för mer komplexa genomredigeringsstrategier, till exempel knock-ins eller expression reportrar, genom HDR-vägen med en lämplig donatormall. I sandflugor genererades null mutant alleler av immunsvarsfaktorn Relish genom NHEJ-medierad CRISPR i Phlebotomus papatasi4. Sandflugaembryon injicerades också i en annan studie med en CRISPR/Cas9-blandning riktad mot genkodningen Gul. Fortfarande producerades inga vuxna som bär mutationen18. Vi beskriver här en detaljerad metod för sandfluga riktad mutagenes av NHEJ-medierad CRISPR/Cas9, med särskilt fokus på embryomikroinjektion, ett kritiskt steg i protokollet.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Användningen av möss som blodkälla för utfodring av sandfluga utfördes i strikt enlighet med rekommendationerna i vägledningen för vård och användning av laboratoriedjur vid National Institutes of Health (NIH). Protokollet godkändes av Animal Care and Use Committee of the NIAID, NIH (protokollnummer LPD 68E). Ryggradslösa djur omfattas inte av NIH:s riktlinjer.
1. Nålpreparat(figur 1)
- Dra nålar och fasa enligt beskrivningen i Meuti och Harrell19. Kort, dra nålar på en dubbelstegs glas micropipette puller, med hjälp av borosilikatglas kapillärer.
- Slipa nålarna genom att svetsa på mikropipettefasaden med en extra fin sten.
2. Insamling av embryon och mikromanipulation (figur 2)
- Fem dagar före injektionsdagen flyger blodfodersand honor som utförs rutinmässigt för koloniunderhåll. För detaljer om sandfluga kolonier uppfödning förfaranden och nödvändigt material, se Advokat et al.1 Underhåll insekterna i inkubatorer vid 70% fuktighet och 26 °C, under hela deras utveckling.
- En dag efter blodmatning, fånga blodmatade kvinnor av grupper på 100-150 i gipskrukor med en sidoport. Behåll honorna genom att mata dem med sockerlösning (30% sackaros - tillräckligt med volym för att suga en liten bomullsboll) vilket är vanligt för koloniunderhåll.
- På dag 2-3 efter blodmatning, fukta INTE gipskrukorna. Att hålla kvinnorna på ett torrt substrat kommer att förhindra för tidig äggläggning, eftersom kvinnor föredrar att lägga ägg på en fuktig miljö.
- På dag 5 efter blodmatning, utför embryosamlingen, mikromanipulationen och mikroinjektionen. För in ett fuktigt filterpapper i äggläggningskammaren. Nylagda embryon har inte en fullt utvecklad käk och verkar vita. Använd svart filterpapper under proceduren för att underlätta visualisering av de vita embryona.
- Överför en liten grupp honor från gipsgrytan till äggläggningskammaren genom sidoportarna med hjälp av en munaspirator. Närvaron av ett fuktigt substrat (filterpapperet) inducerar kvinnor till oviposit.
- Efter 30-60 min, hämta försiktigt filterpapperet med nylagda embryon från kammaren. Förvara filterpapperet och embryona i en petriskål i upp till 3 timmar. Under denna tid, utvärdera regelbundet filterpappers fuktnivå för att säkerställa att det förblir fuktigt. Under denna tid, upprepa steg 2.4 till 2.6 med nya grupper av honor och samla så många embryon som möjligt.
- Förbered mikroskopbilder för injektionen: samla manuellt äggen en efter en med en mycket fin pensel och överför dem försiktigt till en annan bit fuktigt svart filterpapper placerat på en mikroskopbild toppad med ett glaslock.
- Tillsätt vatten till filterpapperet, tillräckligt för att hålla embryona fuktiga men inte få dem att flyta bort från täcket eller sugas under täcket. Rada upp embryona mot täckglaset. Täckglaset fungerar som en backstop som hindrar äggen från att rulla bort under injektionen.
3. Embryoinjektioner(figur 3)
- Börja injektionerna 2,5 till 3 timmar efter äggsamlingens början. Utför injektioner vid rumstemperatur och omgivande labbfuktighet.
- Se till att de justerade embryona har tillräckligt med vatten så att de hålls fuktiga.
OBS: Det är viktigt att embryona hålls fuktiga under injektioner. Om de inte är fuktiga under injektionsprocessen blir injektioner svåra eftersom nålen har problem med att genomborra embryot. Den korrekta mängden vatten är den punkt där embryona har en menisk av vatten runt sig, men täckglaset flyter inte ovanpå vattnet vilket gör att embryona trycker under täcket. Det är viktigt att övervaka mängden vatten runt embryona under injektioner. Tillsätt vatten vid behov för att hålla embryona fuktiga. - Tillsätt vatten försiktigt genom att blöta en borste med vatten och överföra vattnet till baksidan av filterpapperet. Genom att tillsätta vatten på detta sätt kan vatten tillsättas på ett långsamt och kontrollerat sätt så att precis tillräckligt tillsätts för att hålla embryona fuktiga. För mycket vatten kan få embryona att flyta ur linje, vilket gör det svårt att injicera embryona.
- Injektionsblandning med ryggbelastning i mikroinjektionsnålen. Tillsätt cirka 0,5 till 1 μL injektionsblandning i nålen med hjälp av ett handritat borosilikatnålfyllmedel, gelbelastningsrörspetsar kan också användas. Injektionsblandningen består av ett eller flera styr-RNA (80 ng/μL vardera) som är utformade för att rikta in sig på en specifik locus blandad med kommersiellt rekombinant Cas9-protein (300 ng/μL).
- Börja med injektionstrycket vid 30 psi, tryck på injektionsutlösaren för att driva ut luft ur nålens spets. Detta kommer att tvinga injektionsblandningen till nålens spets så att injektionsblandningen kan flöda. Vid denna punkt, öka långsamt håll/ konstant tryck tills injektionsmaterialet börjar flöda och backa sedan från håll/ konstant tryck så att det är strax under injektionsblandningens punkt som strömmar från nålen. Den gated inställningen bör leverera precis tillräckligt med injektionsmaterial så att en liten mängd material kan ses för att komma in i embryot.
OBS: Injektion av sandfluga embryon under halokarbon olja liknar andra protokoll som används för Drosophila och myggor testades ursprungligen, men överlevnadsprocenten för dessa injektioner var mycket låg. Överlevnaden förbättrades genom att byta till injektioner på fuktigt filterpapper enligt beskrivningen ovan. - För in nålen i embryots sida. Använd täckglaset bakom embryot som en backstop som hjälper nålen att genomborra embryot. Leverera en liten mängd injektionsblandning i embryot innan du försiktigt tar bort nålen.
- Omedelbart efter borttagning av nålen, tryck på injektorn för att ta bort eventuellt återfyllt material från nålspetsen. Detta hjälper till att förhindra att nålen täpps till.
- Fortsätt till nästa embryo. Mellan varje injektion, se till att filterpapperet är fuktigt och att nålen inte är igensatt.
- När alla embryon har injicerats, räkna antalet injicerade embryon för att hålla en löpande räkning.
- Ta bort täckglaset genom att tillsätta vatten i filterpapperet så att täckglaset flyter. Använd vid denna tidpunkt en sond (träapplikatorpinne med insektsstift limmad på spetsen) för att hålla filterpapperet på plats medan ett finger används för att dra täcket bort från de injicerade embryona.
- Blot bort överflödigt vatten från filterpapperet när täckglaset har tagits bort.
4. Uppfödning efter injektion (G0) (figur 4)
- Överför filterpapperet med embryona ovanpå flera lager fuktigt filterpapper placerat i en petriskål för att bibehålla luftfuktigheten. Förvara embryona här under den tid som behövs för att injicera andra embryon. Embryon kan hållas i högst 3 timmar så här. Efter injektionen blir de långsamt bruna.
- När alla embryon har injicerats, överför dem manuellt till tidigare fuktade gipskrukor i liten storlek. Lägg inte för många embryon i varje kruka och håll avstånd mellan dem för att undvika eventuell svampförorening mellan individer. Täck krukorna med en skärm och förvara dem som vanligtvis skulle göras för sandfluga koloniägg, underhålls i inkubatorer vid 70% fuktighet och 26 °C, under hela deras utveckling.
- På dag 1 efter injektionen, ta bort alla skadade och döda embryon med en pensel. Tillsätt 100 μL 0,5% propionsyra, droppe för droppe, på gipskrukorna som innehåller de injicerade embryona för att begränsa svampföroreningen. Frisättningen av cytoplasma från embryon som skadats under injektionsprocessen är särskilt gynnsam för svamptillväxt.
- Kontrollera gipskrukorna varje dag och ta bort eventuella dåliga eller döda embryon. Om svamp finns, ta bort alla infekterade embryon och tillsätt några droppar 0,5% propionsyra.
- Larver kläcker mellan dag 8 och 12 efter injektionen. Två gånger om dagen, överför de nyuppkomna larverna till nya gipskrukor, i grupper om 5-10 maximalt. Tillsätt en liten mängd mat och kontrollera maten 2-3 gånger i veckan.
- Övervaka noggrant mängden larvmat, eftersom för mycket ökar risken för svampförorening. Sandfluga larver överlever bättre i grupper men de kan vara kannibalistiska om det inte finns tillräckligt med mat.
- När larverna poppar, separera dem efter kön för att behålla kvinnorna som oskulder. Om det finns många överlevande, kassera männen och håll bara kvinnorna.
OBS: Både män och kvinnor kan bära och överföra mutationer. Men eftersom kvinnor måste hållas oskulder innan de ska korsas, är det lättare att använda endast G0 injicerade honor för att undvika att behöva separera wt insekter efter kön. G0-männen kan hållas som en backup om antalet vuxna överlevande är lågt och i detta fall kommer att paras med sorterade wt jungfruliga kvinnor.
5. Urval och screening av mutanta alleler(figur 5)
- Masskorsa G0-honorna med wt män i en bur. Blodmata dem helt och hållet, som skulle göras för normalt koloniunderhåll.
- En dag efter blodmatning, överför varje G0-kvinna med 2-3 wt män till enskilda gipsrör med hjälp av en munaspirator. Mata flugorna med socker på en liten bomullsboll som byts varje dag och använd en spruta vatten för att säkerställa att gipsfuktigheten är lämplig för äggläggning.
- Efter att G0-honorna har lagt ägg (motsvarande G1),samla sina kroppar i enskilda, kommenterade Eppendorf-rör för senare genotypning. Underhåll embryona som vanligt för wt kolonier.
- Extrahera DNA från G0-honorna med valfri metod.
- Screena DNA för förekomst av mutationer, till exempel genom att designa en PCR-analys med hjälp av primers som omger regionen av förväntade CRISPR-snitt.
- Förvara endast de G1-embryon som G0-honorna har lagt och som visar tecken på förvandling. När dessa G1-embryon utvecklas till puppar, separera dem efter kön och håll bara kvinnorna. Korsa G1-honorna från samma G0-kvinna till wt män, blodmata dem och överför sedan i små grupper av 2-3 honor och 4-5 män i små behållare.
OBS: Alla G1 individer har en chans att bära en unik mutation, så om antalet överlevande individer inte är för högt så är det bättre att korsa G1 honor individuellt med wt män. Fallet med flera honor som bär en annan mutation som finns i ett samma rör är sällsynta men kan uppstå. Om ett sådant fall observeras efter genotypning, ska G 2-avkomman honor sedan paras individuellt till wt män. Detta parningssystem undviker möjligheten till flera mutationer i avkomman. - Efter äggläggning, samla G1 kvinnliga kroppar och screena dem för mutationer. Håll bara rören där minst en kvinna visade tecken på mutation.
- För mer sistnämnda utvecklingar gör singelpar in-crosses. Efter äggläggning, screena föräldrar för närvaro av mutation. Upprepa vid varje generation tills båda föräldrarna är homozygous för samma mutation. När de har identifierats kommer de att vara grundare av ett homozygous mutant lager.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
CRISPR/Cas9 mikroinjektion protokoll beskrivs här för att generera sandfluga mutanter fastställdes i en tidigare publikation4. Detta tillvägagångssätt producerade mycket effektiv mutagenes, eftersom 11 av 540 individer överlevde förfarandet, varav 9 var mutanta. När du utformar guider för CRISPR/Cas9-mutation är ett viktigt första steg att sekvensera regionen runt det område som ska riktas. Mallen för sekvensering bör vara från den stam som kommer att användas som en källa till embryon för injektion. Det är riskabelt att bara förlita sig på publicerade genomsekvenser för att designa guider. Det är inte ovanligt att ha skillnader mellan publicerade genom- och förguidedesignsekvenser. I vissa fall finns inte guider utformade från publicerad genomsekvens när regionen runt målgenen är sekvenserad (Harrell, personlig observation). Dessutom kan sekvensen innehålla Single Nucleotide Polymorphisms (SNPs) som kan misstas som riktiga CRISPR-redigeringar under genotypning. Därför är det viktigt för resten av protokollet att lyckas bekräfta sekvensen för målregionen.
Framgångsrik genetisk modifiering av insekter genom mikroinjektion beror främst på två kritiska aspekter: leverans av material (protein, plasmid eller mRNA) vid lämplig tidpunkt under utveckling med så liten skada på embryona som möjligt; och uppfödning av robusta, friska insekter som kommer att överleva proceduren och producera avkommor. Den inledande fasen av detta förfarande, beskrivet i figur 2, börjar med blodmatning av honorna från wt-kolonin och fortsätter till embryosamling och mikroinjektion fem dagar senare. Den andra fasen består i att föda upp de injicerade embryona fram till vuxen ålder, göra lämpliga kors och identifiera och isolera mutationer av intresse.
Embryon för injektion samlas in i 30– 60 min så att den relativa åldern i timmar efter oviposition kan bestämmas. Embryon får sedan utvecklas i 3 timmar innan injektionerna påbörjas. Denna tidsfönster av insektsutveckling gör det möjligt för embryona att överleva injektionerna. Efter denna åldrandeperiod samlas embryona på en förberedd injektionsrutschbana och embryona rullas på plats mot en täckkant med en fin borste. Den slutliga konfigurationen visas i figur 3A. Det är viktigt att blöta filterpapperet tillräckligt så att en menisk bildas vid täckkanten där embryona sitter. För mycket vatten och embryona kommer att skjutas bort från täckkanten. För lite kommer att orsaka att embryona dras under täcket. Embryona måste hållas fuktiga, annars blir embryomembranen svåra att injicera. Täckkanten fungerar som ett bakstopp, så att nålen kan tränga in i embryona när den pressas mot kanten. Det är kombinationen av en skarp nål och en backstop som gör att nålen kan tränga in smidigt.
Som med de mest framgångsrika mikroinjektionsprotokollen är en bra mikroinjektionsnål som passar de embryon som injiceras viktig. Bra, vassa nålar definieras som nålar som lätt tränger in i embryot utan att materialet kan fly efter injektionen. God penetration är uppenbar när nålen glider in i embryot, vilket orsakar liten eller ingen fördjupning av embryomembranet under penetration och inget material läcker från embryot efter att nålen har dragits tillbaka. Bra vassa nålar produceras med hjälp av nåldragarinställningar som ger en nål som kommer till en fin punkt (Figur 1A). Den dragna nålen ska inte ha en avsmalning som är för lång. Annars blir nålens lumen mycket smal för en stor del av avsmalning (figur 1B), och det blir svårt att få injektionstrycket tillräckligt högt för att tvinga materialet genom nålen. I detta protokoll användes avfasade nålar. Processen för att dra och fasa nålar beskrivs i Meuti och Harrell19. När det gäller embryon från sandfluga som utvecklas under lång tid är det särskilt viktigt att ha vassa nålar som minimerar skador på embryot, vilket förhindrar att material läcker på injektionsstället. När embryoplasma läcker från ett embryo efter injektionen är detta material ett rikt medium för mögel- och svamptillväxt. I embryon som utvecklas under en kortare tid kan embryot utvecklas och kläckas innan formen blir ett problem. Alla embryon som synligt läcker embryoplasma efter injektion bör avlägsnas.
Under injektioner är det viktigt att tillsätta vatten efter behov genom att fukta en fin pensel och röra vid den till filterpapperet och upprepa vid behov tills vattnets menisk bara ligger vid embryots botten. Uppmärksamhet på relativ fuktighet på injektionsdagen måste noteras. På dagar med låg luftfuktighet måste mer vatten tillsättas. När injektionerna är klara tillsätts lite extra vatten till filterpapperet så att täcket flyter något, vilket gör det lättare att ta bort. När täckglaset har tagits bort kan filterpapperet med injicerade embryon blottas, så att filterpapperet knappt är fuktigt. Embryon kan sedan överföras till en fuktig gipskruka för kläckning med en fin pensel. I detta skede är embryon mycket bräckliga, så processen måste genomföras mycket noggrant. Det är också viktigt att förhindra att embryona rör vid varandra för att kunna ta bort mögliga embryon och begränsa spridningen av svampförorening.
Efter injektionen hålls de G0 injicerade embryona på gipskrukor enligt normala uppfödningsförfaranden. Tills de kläcks bör injicerade embryokrukor kontrolleras en gång om dagen för att avlägsna ohälsosamma embryon. Figur 4A presenterar den förväntade tidslinjen för G0 individuell uppfödning från dagen för äggläggning och injektion till vuxen ålder. Figur 4B visar exempel på G0-embryon som är friska och bör behållas. eller skadas, förorenas av svamp, uttorkas eller deformeras och bör kasseras. G0 injicerade individer är förmodligen mosaik för mutanta alleler. En metod för att identifiera potentiella mutanta alleler bör utformas, t.ex. Figur 4C presenterar ett exempel på en PCR-analys som visar en mosaik G0-individ, som uppvisar en PCR-produkt som är ytterligare till den förväntade wt-produkten, som representerar en mutant allel.
När de vuxna dyker upp korsas G0-honorna som utvecklas från G0 injicerade embryon med wt-män, får lägga ägg och genotypas senare. Endast de rör som innehåller en G0-fluga som visar tecken på mutation från den valda genotypningsmetoden behålls. Flugorna från nästa generation (G1 honor) korsas antingen med wt män eller individuellt mellan syskon (från G2). Dessa kors får lägga ägg och sedan genotypade enligt valmetoden. Det sista steget upprepas tills homozygous mutanta män och kvinnor erhålls, etablera en homozygous mutant linje. En schematisk representation av lämplig arvsföljd av kors för att upprätta en mutantlinje ges i figur 5A. Figur 5B visar ett exempel på en genotypning PCR som gör det möjligt att identifiera ett homozygous mutant syskonkors.
Figur 1: Mikroinjektionsnålar. A. Bra nål. B. Nål med extrem avsmalning inte bra för injektioner. Klicka här om du vill visa en större version av den här figuren.
Figur 2: Översikt över embryosamling och mikromanipulation (Denna siffra hade anpassats från4). Klicka här om du vill visa en större version av den här figuren.
Figur 3: Inställningar för mikroinjektion. A. Schematisk representation av mikroinjektionsuppsättningen. B. Näring av justerat embryo för mikroinjektion. Klicka här om du vill visa en större version av den här figuren.
Figur 4: Uppfödning och identifiering av mosaik G0 vuxna individer. A. Förväntad tidsplan från embryomikroinjektion till G0 vuxen ålder. B. Exempel på snygga och snygga embryon efter injektionen. C. PCR genotypning av en omvandlad G0 mosaik individ. Klicka här om du vill visa en större version av den här figuren.
Figur 5: Identifiering och isolering av mutationer av intresse. A. Schematisk representation av den experimentella strategin för att isolera mutanta alleler och upprätta homozygous mutant lager (figur från 4). Färgen representerar närvaron av celler som bär mutanta alleler, vid heterozygous (rosa) eller homozygous (rött) tillstånd. B. Exempel på en PCR-screeningstrategi för genotypning av enskilda sibblingskors av sandflugor. Klicka här om du vill visa en större version av den här figuren.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Vi presenterar här en nyligen utvecklad embryo microinjection metod för riktade mutagenesis av CRISPR/Cas9 i Phlebotomus papatasi sandflugor. Embryomikroinjektion för insektsgenetisk modifiering utvecklades i Drosophila i mitten av 1980-talet21 och används nu rutinmässigt i en mängd olika insekter. Andra metoder för leverans av genetiska modifieringsmaterial har utvecklats för användning i insekter, såsom ReMOT20,21,22,23 och elektroporation23. Embryomikroinjektion är dock för närvarande den mest mångsidiga och effektiva metoden för leverans av dessa material. ReMOT är extremt lovande som leveransmetod och bör undersökas för användning i sandflugor, på grund av den relativa lättheten hos vuxna injektioner jämfört med embryomikroinjektioner. Hittills har Dock ReMot inte framgångsrikt använts för CRISPR/ Cas9 HDR eller transposontransgenes. Även om tekniken för embryomikroinjektioner hos insekter i princip är densamma som ursprungligen utvecklades, kan det behövas för varje ny artförfining av teknikerna. Dessa skillnader mellan arter inkluderar mönstret och varaktigheten av embryoutveckling, embryostruktur och den miljö där embryot normalt utvecklas. Sandfluga embryon är särskilt små (0,3-0,5 mm långa och 0,1- 0,15 mm breda, vilket motsvarar ungefär 1/3 av storleken på Drosophila ägg1). Denna minskade storlek ökar svårigheten att hantera äggen utan att skada dem. Fuktnivån vid varje steg i protokollet måste övervakas mycket noggrant, eftersom sandflugaembryon är särskilt känsliga för uttorkning. De är dock inte vattenlevande och kommer att dö om de är helt nedsänkta i vatten under en längre period. Drosophila embryo microinjection kräver injektion i den bakre änden av embryot. På grund av den nära symmetriska formen av sandflugaembryon är det svårt att bestämma embryopolariteten. Slutligen, medan sandfluga embryo utveckling fortsätter som Drosophila, det gör det i en mycket långsammare takt. Embryogenesis ensam varar mellan 6 och 11 dagar, beroende på sandflugan, medan Drosophila ägg kläcker bara en dag efter äggläggning. Drosophila ägg cellularization sker ca 2 timmar efter oviposition, medan sandfluga embryon når detta stadium i proximately 9 timmar efter oviposition. Med tanke på denna skillnad i utvecklingsmässiga timing, injektioner är riktade till mitten av den utvecklande sandfluga embryot på antagandet att utveckla atomkärnor i syncytial embryo ligger nära centrum av det utvecklande embryot i detta tidiga utvecklingsstadium, vilket undanrömar behovet av att skilja embryopolaritet.
CRISPR/Cas9 skapar dsDNA-pauser vid en vald genomisk locus. Dessa dubbelsträngsbrott repareras i cellen av antingen NHEJ eller HDR. Metoden vi presenterar här användes tidigare endast för NHEJ-baserad mutagenes, som genererade små insättnings-/raderingshändelser, indels, vilket ledde till en ramförskjutning i gensekvenser, vilket resulterade i för tidiga stoppkodoner och ett protein som saknade alla funktionella domäner4. Insekter har också cellulära maskiner för dsDNA bryta reparation genom HDR, som sedan kan omdirigeras för att utforma mer komplexa genomredigeringsstrategier. HDR-baserad CRISPR/Cas9 genomredigering behöver fortfarande ställas in för användning i sandflugor, och bör möjliggöra utveckling av reportrar av uttryck och villkorliga uttryck mutanter, bland andra konstruktioner.
Utvecklingen av detta mikroinjektionsprotokoll öppnar nu dörren för att använda andra genommodifieringsmetoder, såsom CRISPR / Cas9 HDR, transposontransgenes, binära uttryckssystem som UAS / Gal4 och platsspecifik rekombination av phiC31 eller Cre /lox. Utvecklingen av dessa andra metoder kommer att ytterligare utöka verktygslådan för sandfluga genuttryck modifiering genom att möjliggöra mer komplexa genomisk manipulation. Innan dessa andra metoder kan användas kommer dock arbete med att identifiera och isolera regulatorelement för att driva uttryck av infogade gener i sandflugor att behövas, liksom markörer för införing och andra komponenter i dessa metoder, såsom promotors för att driva uttryck av transpoaser och rekombiner.
Slutligen har genomredigering i icke-modellinsekter nu blivit en möjlighet, särskilt tack vare revolutionen av CRISPR / Cas9 upptäckt och anpassning15,16. I insekter kräver de flesta genomredigeringstekniker, till det anmärkningsvärda undantaget för den nyutvecklade ReMOT-tekniken, embryomikroinjektion, ett steg som är både avgörande och tekniskt krävande. Vi hoppas att denna publikation kommer att bidra till att utöka utbudet av genuttrycksmodifieringstekniker anpassade till sandflugor och leda till nya upptäckter om deras biologi samt vektorkompetens till Leishmania parasiter.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
ingen
Acknowledgments
Författarna tackar Vanessa Meldener-Harrell för kritisk läsning av manuskriptet.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Black Filter Paper 4.25CM PK100 | VWR | 28342-012 | Cut into rectangles that are approximately 46 X 22mm. These are placed between the slide and the coverslip and act as a moist base layer for the embryos during injection. |
| Coverslips | Fisher Scientific | 12-543A | |
| Dissecting Microscope | Any brand | For aligning embryos | |
| Glass slides | Fisher Scientific | 12-550-A3 | Base layer of the microinjection set up Figure 2A |
| Insect cage | custom made or several commercial options | polycarbonate cage for adults holding and mating Lawyer, Phillip, Mireille Killick-Kendrick, Tobin Rowland, Edgar Rowton, and Petr Volf. “Laboratory Colonization and Mass Rearing of Phlebotomine Sand Flies (Diptera, Psychodidae).” Parasite 24. Accessed August 6, 2020. https://doi.org/10.1051/parasite/2017041. | |
| Larval food | custom made | a mix of rabbit chow and rabbit feces Lawyer, Phillip, Mireille Killick-Kendrick, Tobin Rowland, Edgar Rowton, and Petr Volf. “Laboratory Colonization and Mass Rearing of Phlebotomine Sand Flies (Diptera, Psychodidae).” Parasite 24. https://doi.org/10.1051/parasite/2017041. | |
| Microcaps 100 ml | Drummond | 1-000-1000 | Used to back fill microinjection needles |
| Mouth aspirator | John W. Hock Company | Model 612 | mouth aspirator with HEPA filter |
| Olympus SZX12 | Olympus Life Sciences | Microinjection microscope | |
| Ovipots | Nalge company | ovipots are made from 125-ml or 500-ml straigh-sided plolypropylene jars modified by drilling 2.5cm holes in the bottom and filled with 1cm of plaster of Paris. Lawyer, Phillip, Mireille Killick-Kendrick, Tobin Rowland, Edgar Rowton, and Petr Volf. “Laboratory Colonization and Mass Rearing of Phlebotomine Sand Flies (Diptera, Psychodidae).” Parasite 24. Accessed August 6, 2020. https://doi.org/10.1051/parasite/2017041. | |
| Paint Brush 6-0 | Any Art Supply Company | n/a | Used for aligning embryos |
| Propionic acid | Sigma-Aldrich | 402907 | antifungal agent |
| Standard Glass Capillaries | World Precision Instruments | 1B100-3 | Used for making microinjection needles |
| Trio-MPC100 Controller and MP845 Manipulator | Sutter Instruments | Microinjection Controller and Micromanipulator |
References
- Lawyer, P., Killick-Kendrick, M., Rowland, T., Rowton, E., Volf, P. Laboratory colonization and mass rearing of phlebotomine sand flies (Diptera, Psychodidae). Parasite. 24, 42 (2017).
- Pelletier, I., et al. Specific recognition of Leishmania major poly-beta-galactosyl epitopes by galectin-9: possible implication of galectin-9 in interaction between L. major and host cells. Journal Biological Chemistry. 278 (25), 22223-22230 (2003).
- Kamhawi, S., et al. A role for insect galectins in parasite survival. Cell. 119 (3), 329-341 (2004).
- Louradour, I., Ghosh, K., Inbar, E., Sacks, D. L. CRISPR/Cas9 Mutagenesis in Phlebotomus papatasi: the Immune Deficiency Pathway Impacts Vector Competence for Leishmania major. MBio. 10 (4), (2019).
- Xi, Z., Ramirez, J. L., Dimopoulos, G. The Aedes aegypti toll pathway controls dengue virus infection. PLoS Pathogens. 4 (7), 1000098 (2008).
- Ramirez, J. L., Dimopoulos, G. The Toll immune signaling pathway control conserved anti-dengue defenses across diverse Ae. aegypti strains and against multiple dengue virus serotypes. Development and Comparative Immunology. 34 (6), 625-629 (2010).
- Ramirez, J. L., et al. Reciprocal tripartite interactions between the Aedes aegypti midgut microbiota, innate immune system and dengue virus influences vector competence. PLoS Neglected Tropical Diseases. 6 (3), 1561 (2012).
- Hu, C., Aksoy, S. Innate immune responses regulate trypanosome parasite infection of the tsetse fly Glossina morsitans morsitans. Molecular Microbiology. 60 (5), 1194-1204 (2006).
- Meister, S., et al. Anopheles gambiae PGRPLC-mediated defense against bacteria modulates infections with malaria parasites. PLoS Pathogens. 5 (8), 1000542 (2009).
- Meister, S., et al. Immune signaling pathways regulating bacterial and malaria parasite infection of the mosquito Anopheles gambiae. Proceedings of the National Academy of Sciences U S A. 102 (32), 11420-11425 (2005).
- Telleria, E. L., et al. Caspar-like gene depletion reduces Leishmania infection in sand fly host Lutzomyia longipalpis. Journal of Biological Chemistry. 287 (16), 12985-12993 (2012).
- Sant'Anna, M. R., Alexander, B., Bates, P. A., Dillon, R. J. Gene silencing in phlebotomine sand flies: Xanthine dehydrogenase knock down by dsRNA microinjections. Insect Biochemistry and Molecular Biology. 38 (6), 652-660 (2008).
- Sant'anna, M. R., Diaz-Albiter, H., Mubaraki, M., Dillon, R. J., Bates, P. A. Inhibition of trypsin expression in Lutzomyia longipalpis using RNAi enhances the survival of Leishmania. Parasites and Vectors. 2 (1), 62 (2009).
- Diaz-Albiter, H., Mitford, R., Genta, F. A., Sant'Anna, M. R., Dillon, R. J. Reactive oxygen species scavenging by catalase is important for female Lutzomyia longipalpis fecundity and mortality. PLoS One. 6 (3), 17486 (2011).
- Barrangou, R., et al. CRISPR provides acquired resistance against viruses in prokaryotes. Science. 315 (5819), 1709-1712 (2007).
- Jinek, M., et al. A programmable dual-RNA-guided DNA endonuclease in adaptive bacterial immunity. Science. 337 (6096), 816-821 (2012).
- Pawelczak, K. S., Gavande, N. S., VanderVere-Carozza, P. S., Turchi, J. J. Modulating DNA Repair Pathways to Improve Precision Genome Engineering. ACS Chemical Biology. 13 (2), 389-396 (2018).
- Martin-Martin, I., Aryan, A., Meneses, C., Adelman, Z. N., Calvo, E. Optimization of sand fly embryo microinjection for gene editing by CRISPR/Cas9. PLoS Neglected Tropical Diseases. 12 (9), 0006769 (2018).
- Meuti, M., Harrell, R. Preparing and Injecting Embryos of Culex Mosquitoes to Generate Null Mutations Using CRISPR/Cas9. JoVE. (163), e61651 (2020).
- Chaverra-Rodriguez, D., et al. Targeted delivery of CRISPR-Cas9 ribonucleoprotein into arthropod ovaries for heritable germline gene editing. Nature Communications. 9 (1), 3008 (2018).
- Chaverra-Rodriguez, D., et al. Germline mutagenesis of Nasonia vitripennis through ovarian delivery of CRISPR-Cas9 ribonucleoprotein. Insect Molecular Biology. , (2020).
- Heu, C. C., McCullough, F. M., Luan, J., Rasgon, J. L. CRISPR-Cas9-Based Genome Editing in the Silverleaf Whitefly (Bemisia tabaci). CRISPR Journal. 3 (2), 89-96 (2020).
- Macias, V. M., et al. Cas9-Mediated Gene-Editing in the Malaria Mosquito Anopheles stephensi by ReMOT Control. Genes, Genomes and Genetics (Bethesda). 10 (4), 1353-1360 (2020).
