Summary
Dit protocol beschrijft de stappen van CRISPR/Cas9 gerichte mutagenese bij zandvliegen: embryoverzameling, injectie, insectenopfok en identificatie, evenals selectie van mutaties van belang.
Abstract
Zandvliegen zijn de natuurlijke vectoren voor Leishmania-soorten, protozoaanse parasieten die een breed spectrum van symptomen produceren, variërend van cutane laesies tot viscerale pathologie. Het ontcijferen van de aard van de vector/parasiet interacties is van primair belang voor een beter begrip van Leishmania transmissie naar hun gastheren. Onder de parameters die de competentie van de zandvliegvector controleren (d.w.z. hun vermogen om ziekteverwekkers te dragen en over te dragen), bleken parameters die inherent zijn aan deze insecten een sleutelrol te spelen. Insecten immuunrespons, bijvoorbeeld, beïnvloedt zandvlieg vector competentie naar Leishmania. De studie van dergelijke parameters is beperkt door het ontbreken van methoden voor genexpressiemodificatie die zijn aangepast voor gebruik in deze niet-modelorganismen. Gen downregulatie door kleine interfererende RNA (siRNA) is mogelijk, maar naast het feit dat het technisch uitdagend is, leidt het uitschakeling tot slechts een gedeeltelijk functieverlies, dat niet van generatie op generatie kan worden overgedragen. Gerichte mutagenese door CRISPR/Cas9 technologie is onlangs aangepast aan de Phlebotomus papatasi zandvlieg. Deze techniek leidt tot het genereren van overdraagbare mutaties in een specifiek gekozen locus, waardoor de genen van belang kunnen worden bestudeerd. Het CRISPR/Cas9-systeem is gebaseerd op de inductie van gerichte dubbelstrengs DNA-breuken, later gerepareerd door non-homologous end joining (NHEJ) of door Homology Driven Repair (HDR). NHEJ bestaat uit een eenvoudige afsluiting van de pauze en leidt vaak tot kleine invoeg-/verwijderingsgebeurtenissen. HDR gebruikt daarentegen de aanwezigheid van een donor-DNA-molecuul dat homologie deelt met het doel-DNA als sjabloon voor reparatie. Hier presenteren we een zandvliegembryomicro-injectiemethode voor gerichte mutagenese door CRISPR/Cas9 met behulp van NHEJ, de enige genoommodificatietechniek die tot nu toe is aangepast aan zandvliegvectoren.
Introduction
Vector-overgedragen ziekten zijn een grote bedreiging voor de volksgezondheid in constante evolutie. Honderden vectorsoorten verspreid over zeer verschillende fylogene families (bijv. muggen, teken, vlooien) zijn verantwoordelijk voor de overdracht van een groot aantal microbiële pathogenen, wat volgens de Wereldgezondheidsorganisatie resulteert in meer dan 700.000 menselijke sterfgevallen per jaar. Onder vectorinsecten vormen flebotominezandvliegen (Diptera, Psychodidae) een enorme groep, met 80 bewezen vectorsoorten die verschillende fenotypische eigenschappen en vectoriële capaciteiten vertonen die in verschillende geografische regio's worden aangetroffen. Het zijn vectoren voor de protozoaanse parasieten van het geslacht Leishmania, die ongeveer 1,3 miljoen nieuwe gevallen van Leishmaniases en tussen de 20.000 en 30.000 sterfgevallen per jaar veroorzaken. De klinische resultaten van Leishmaniases zijn divers, met symptomen variërend van zelfbeperkende cutane laesies tot viscerale verspreiding die fataal is bij afwezigheid van behandeling.
Zandvliegen zijn strikt terrestrische insecten. Hun levenscyclus, relatief lang in vergelijking met andere Diptera, duurt maximaal drie maanden, afhankelijk van verschillende parameters zoals temperatuur, vochtigheid en voeding. Het bestaat uit één embryonaal stadium (6 tot 11 dagen), vier larvale stadia (die in totaal 23 tot 25 dagen duren) en één popstadium (9 tot 10 dagen) gevolgd door metamorfose en vervolgens volwassenheid. Zandvliegen vereisen een vochtige en warme omgeving voor de opfok. Zowel mannetjes als vrouwtjes voeden zich met suikers, in het wild verkregen uit bloemnectars. Alleen vrouwtjes zijn bloedvoeders, omdat ze eiwitten nodig hebben die zijn verkregen uit het bloedmeel voor de productie van eieren1.
Een belangrijk aandachtspunt van onderzoek is het identificeren van de aard van de vector/parasiet interacties die leiden tot de ontwikkeling van overdraagbare infecties. Net als bij andere vectorinsecten is aangetoond dat parameters die inherent zijn aan zandvliegen van invloed zijn op hun vectorcompetentie, die wordt gedefinieerd als hun vermogen om ziekteverwekkers naar hun gastheren te dragen en over te dragen. Bijvoorbeeld, de uitdrukking van galectines door de Phlebotomus papatasi zandvlieg midgut cellen, die fungeren als receptoren die parasietoppervlakcomponenten herkennen, kunnen hun vectorcompetentie voor Leishmania major2,3direct beïnvloeden . De insect immuunrespons route, Immune Deficiency (IMD), is ook cruciaal voor de Phlebotomus papatasi zandvlieg vector competentie voor Leishmania major4. Een cruciale rol voor vector insect immuunresponsroutes bij het beheersen van hun overdracht van infectieuze pathogenen is op dezelfde manier gemeld bij Aedes aegypti muggen5,6,7, in de tseetseevlieg Glossina morsitans8, en in Anopheles gambiae muggen9,10.
Studies van zandvlieg /Leishmania interacties zijn beperkt door het ontbreken van genexpressiemodificatiemethoden aangepast voor gebruik bij deze insecten. Tot voor kort werden alleen gen downregulatie door klein interfererend RNA (siRNA) uitgevoerd11,12,13,14. De techniek, beperkt door de mortaliteit geassocieerd met de micro-injection van volwassen vrouwtjes, leidt slechts tot een gedeeltelijk verlies van functie, dat niet van generatie op generatie kan worden overgedragen.
CRISPR/Cas9-technologie heeft een revolutie teweeggebracht in functioneel genomisch onderzoek in niet-modelorganismen zoals zandvliegen. Aangepast van het adaptieve immuunsysteem in prokaryoten voor verdediging tegen bacteriofagen15,16, is het CRISPR Cas9-systeem snel aangepast als een genoombewerkingstool voor superieure eukaryotische organismen, waaronder insecten. Het principe van CRISPR/Cas9 gerichte genoombewerking is gebaseerd op de complementariteit van een enkele guide RNA (sgRNA) tot een specifieke genomische locus. De Cas9 nuclease bindt zich aan de sgRNA en creëert een dubbelstrengs DNA (dsDNA) breuk in het genomische DNA waar de sgRNA associeert met zijn complementaire sequentie. Het Cas9-sgRNA-complex wordt door 17 tot 20 complementaire bases in de sgRNA naar de gekozen locus geleid, de dsDNA-breuk kan vervolgens worden gerepareerd door twee onafhankelijke trajecten: niet-homologe eindaanvoeging (NHEJ) of homologie-gerichte reparatie (HDR)17. NHEJ-reparatie omvat een eenvoudige sluiting van de onderbreking, maar leidt vaak tot kleine invoeg- / verwijderingsgebeurtenissen. DNA-reparatie via HDR maakt gebruik van een donor-DNA-molecuul dat homologie deelt met het doel-DNA als sjabloon voor reparatie. Insecten bezitten beide machines.
CRISPR/Cas9-technologie kan mutaties genereren in een gekozen locus, via het NHEJ-reparatietraject; of voor complexere genoombewerkingsstrategieën, zoals knock-ins of expressiereporters, via het HDR-traject met een geschikte donorsjabloon. Bij zandvliegen werden null mutante allelen van de immuunresponsfactor Relish gegenereerd via NHEJ-gemedieerde CRISPR in Phlebotomus papatasi4. Zandvliegembryo's werden ook geïnjecteerd in een andere studie met een CRISPR/Cas9-mix gericht op het gen dat codeert voor Geel. Toch werden er geen volwassenen geproduceerd die de mutatie droegen18. We beschrijven hier een gedetailleerde methode van zandvlieg gerichte mutagenese door NHEJ-gemedieerde CRISPR / Cas9, met een bijzondere focus op de embryomicro-injection, een kritieke stap van het protocol.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Het gebruik van muizen als bloedbron voor zandvliegvoeding werd uitgevoerd in strikte overeenstemming met de aanbevelingen in de Gids voor de verzorging en het gebruik van proefdieren van de National Institutes of Health (NIH). Het protocol is goedgekeurd door de Commissie Dierverzorging en Gebruik van het NIAID, NIH (protocolnummer LPD 68E). Ongewervelde dieren vallen niet onder de NIH-richtlijnen.
1. Naaldvoorbereiding (Figuur 1)
- Trek naalden en schuine kanten zoals beschreven in Meuti en Harrell19. Trek kort naalden op een tweetraps glazen micropipettrekker, met behulp van borosilicaatglas haarvaten.
- Slijp de naalden door nat af te schuinen op de micropipet beveller, met behulp van een extra fijne steen.
2. Embryoverzameling en micromanipulatie (figuur 2)
- Vijf dagen voor de dag van injectie, bloedvoer zand vliegen vrouwtjes zoals routinematig uitgevoerd voor kolonie onderhoud. Voor meer informatie over de opfokprocedures van zandvliegkolonies en het vereiste materiaal, raadpleegt u Lawyer et al.1 Onderhoud de insecten in incubators bij 70% vochtigheid en 26 °C, tijdens hun hele ontwikkeling.
- Op een dag na het bloeden, vangen bloed gevoede vrouwtjes door groepen van 100-150 in gipsen potten met een zijpoort. Onderhoud de vrouwtjes door ze te voeden met suikeroplossing (30% sacharose - genoeg volume om een kleine katoenen bal te weken) wat gebruikelijk is voor kolonieonderhoud.
- Bevochtig de gipspotten NIET op dag 2-3 na het bloeden. Door de vrouwtjes op een droog substraat te houden, voorkomt u voortijdige eierlegging, omdat vrouwtjes liever eieren leggen op een vochtige omgeving.
- Voer op dag 5 na bloedvoeding de embryoverzameling, micromanipulatie en micro-injection uit. Breng een vochtig filterpapier in de legkamer. Vers gelegde embryo's hebben geen volledig ontwikkeld koraal en lijken wit. Gebruik zwart filterpapier tijdens de procedure om het visualiseren van de witte embryo's te vergemakkelijken.
- Breng een kleine groep vrouwtjes over van de gipspot naar de eierlegkamer via de zijpoorten met behulp van een mondaspirator. De aanwezigheid van een vochtig substraat (het filterpapier) induceert vrouwtjes tot legboor.
- Haal na 30-60 minuten het filterpapier met nieuw gelegde embryo's voorzichtig uit de kamer. Bewaar het filterpapier en de embryo's maximaal 3 uur in een petrischaaltje. Beoordeel gedurende deze tijd regelmatig het vochtgehalte van het filterpapier om ervoor te zorgen dat het vochtig blijft. Herhaal gedurende deze tijd stap 2.4 tot 2.6 met nieuwe groepen vrouwtjes en verzamel zoveel mogelijk embryo's.
- Bereid microscoopglaasjes voor op de injectie: verzamel de eieren handmatig één voor één met een zeer fijne kwast en breng ze voorzichtig over op een ander stuk vochtig zwart filterpapier dat op een microscoopschuif is geplaatst, bedekt met een glazen afdeklip.
- Voeg water toe aan het filterpapier, genoeg om de embryo's vochtig te houden, maar niet om ze weg te laten drijven van de afdeklip of onder de afdeklip te worden gezogen. Zet de embryo's op een rij tegen de afdeklip. De afdeklip fungeert als een backstop die voorkomt dat de eieren wegrollen tijdens de injectie.
3. Embryo-injecties (figuur 3)
- Start injecties 2,5 tot 3 uur na het begin van de eierverzameling. Voer injecties uit bij kamertemperatuur en luchtvochtigheid in het laboratorium.
- Zorg ervoor dat de uitgelijnde embryo's voldoende water hebben, zodat ze vochtig worden gehouden.
OPMERKING: Het is van cruciaal belang dat de embryo's vochtig worden gehouden tijdens injecties. Als ze tijdens het injectieproces niet vochtig zijn, worden injecties moeilijk omdat de naald moeite heeft met het doorboren van het embryo. De juiste hoeveelheid water is het punt waarop de embryo's een meniscus van water om zich heen hebben, maar de deklip drijft niet bovenop het water waardoor de embryo's onder de afdeklip duwen. Het is van cruciaal belang om de hoeveelheid water rond de embryo's tijdens injecties te controleren. Voeg indien nodig water toe om de embryo's vochtig te houden. - Voeg voorzichtig water toe door een borstel met water te bevochtigen en het water naar de achterkant van het filterpapier over te brengen. Door op deze manier water toe te voegen, kan water op een langzame en gecontroleerde manier worden toegevoegd, zodat net genoeg wordt toegevoegd om de embryo's vochtig te houden. Te veel water kan ervoor zorgen dat de embryo's uit de uitlijning zweven, waardoor het moeilijk is om de embryo's te injecteren.
- Rugbelasting injectiemix in de micro-injectienaald. Voeg ongeveer 0,5 tot 1 μL injectiemengsel toe aan de naald met behulp van een handgetekende borosilicaatnaaldvuller, gellaadpipettips kunnen ook worden gebruikt. De injectiemix bestaat uit een of meer geleide-RNA (elk 80 ng/μL) die is ontworpen om zich te richten op een specifieke locus gemengd met commercieel recombinant Cas9-eiwit (300 ng/μL).
- Vanaf de injectiedruk bij 30 psi drukt u op de injectietrigger om lucht uit de punt van de naald te verdrijven. Hierdoor wordt de injectiemix naar de punt van de naald geforceerd, waardoor de injectiemix kan stromen. Verhoog op dit punt langzaam de hold/constante druk totdat het injectiemateriaal begint te stromen en trek vervolgens de hold/constante druk terug zodat deze net onder het punt van de injectiemix uit de naald stroomt. De gated setting moet net genoeg injectiemateriaal leveren, zodat een kleine hoeveelheid materiaal in het embryo kan worden gezien.
OPMERKING: Injectie van zandvliegembryo's onder halokoolstofolie vergelijkbaar met andere protocollen die worden gebruikt voor Drosophila en muggen werd aanvankelijk getest, maar het overlevingspercentage voor deze injecties was zeer laag. De overleving werd verbeterd door over te schakelen op injecties op vochtig filterpapier zoals hierboven beschreven. - Steek de naald in de zijkant van het embryo. Gebruik de deklip achter het embryo als een backstop die de naald zal helpen om het embryo te doorboren. Breng een kleine hoeveelheid injectiemix aan in het embryo voordat u de naald voorzichtig verwijdert.
- Druk onmiddellijk na het verwijderen van de naald op de injector om eventueel opgevuld materiaal van de naaldpunt te verwijderen. Dit helpt om verstopping van de naald te voorkomen.
- Ga naar het volgende embryo. Zorg er tussen elke injectie voor dat het filterpapier vochtig is en dat de naald niet verstopt is.
- Zodra alle embryo's zijn geïnjecteerd, telt u het aantal geïnjecteerde embryo's om een lopende telling bij te houden.
- Verwijder de afdeklip door water aan het filterpapier toe te voegen, zodat de afdeklip drijft. Gebruik op dit punt een sonde (houten applicatorstok met insectenpen aan de punt gelijmd) om het filterpapier op zijn plaats te houden terwijl een vinger wordt gebruikt om de deklip weg te trekken van de geïnjecteerde embryo's.
- Vlek overtollig water van het filterpapier weg zodra de afdeklip is verwijderd.
4. Opfok na injectie (G0) (figuur 4)
- Breng het filterpapier over met de embryo's bovenop verschillende lagen vochtig filterpapier dat in een petrischaal is geplaatst om de vochtigheid te behouden. Bewaar de embryo's hier gedurende de tijd die nodig is om andere embryo's te injecteren. Embryo's kunnen maximaal 3 uur op deze plaats worden gehouden. Na injectie worden ze langzaam bruin.
- Zodra alle embryo's zijn geïnjecteerd, breng je ze handmatig over op eerder bevochtigde gipspotten van kleine omvang. Doe niet te veel embryo's in elke pot en houd afstand tussen hen, om mogelijke schimmelbesmetting tussen individuen te voorkomen. Bedek de potten met een scherm en bewaar ze zoals typisch zou worden gedaan voor zandvliegkolonie-eieren, onderhouden in incubators bij 70% vochtigheid en 26 °C, tijdens hun hele ontwikkeling.
- Verwijder op dag 1 na de injectie alle beschadigde en dode embryo's met een penseel. Voeg 100 μL propionzuur van 0,5% druppel voor druppel toe aan de gipspotten met de geïnjecteerde embryo's om schimmelverontreiniging te beperken. Het vrijkomen van cytoplasma uit embryo's die tijdens het injectieproces zijn beschadigd, is bijzonder gunstig voor schimmelgroei.
- Controleer elke dag de gipspotten en verwijder eventuele slechte of dode embryo's. Als schimmel aanwezig is, verwijder dan alle geïnfecteerde embryo's en voeg een paar druppels propionzuur van 0,5% toe.
- Larven komen uit tussen dag 8 en 12 na injectie. Breng twee keer per dag de nieuw ontstane larven over op nieuwe gipspotten, in groepen van maximaal 5-10. Voeg een kleine hoeveelheid voedsel toe en controleer het voedsel 2-3 keer per week.
- Controleer zorgvuldig de hoeveelheid larvaal voedsel, omdat te veel het risico op schimmelbesmetting aanzienlijk verhoogt. Zandvlieglarven overleven beter in groepen, maar ze kunnen kannibalistisch zijn als er niet genoeg voedsel is.
- Wanneer de larven verpoppen, scheidt u ze per geslacht om de vrouwtjes als maagden te behouden. Als er veel overlevenden zijn, gooi dan de mannetjes weg en houd alleen de vrouwtjes.
OPMERKING: Zowel mannetjes als vrouwtjes kunnen mutaties dragen en overbrengen. Omdat vrouwtjes echter maagden moeten worden gehouden voordat ze moeten worden gekruist, is het gemakkelijker om alleen de G0 geïnjecteerde vrouwtjes te gebruiken om te voorkomen dat ze wt-insecten per geslacht moeten scheiden. De G0-mannetjes kunnen als back-up worden bewaard als het aantal volwassen overlevenden laag is en zullen in dit geval worden gepaard met gesorteerde wt maagdelijke vrouwtjes.
5. Selectie en screening van gemuteerde allelen (Figuur 5)
- Steek de G0-vrouwtjes massaal over met wt-mannetjes in een kooi. Voer ze helemaal, zoals zou worden gedaan voor normaal kolonieonderhoud.
- Breng op een dag na bloedvoeding elke G0-vrouw met 2-3 wt-mannetjes over in individuele gipsbuizen met behulp van een mondaspirator. Voed de vliegen met suiker op een kleine wattenbol die elke dag wordt verschoond en gebruik een spuit water om ervoor te zorgen dat het gipsvocht geschikt is voor het leggen van eieren.
- Nadat de G0-vrouwtjes eieren hebben gelegd (overeenkomend met G1),verzamelen ze hun lichaam in individuele, geannoteerde Eppendorf-buizen voor latere genotypering. Onderhoud de embryo's zoals gewoonlijk gedaan voor wt kolonies.
- Haal het DNA uit de G0-vrouwtjes volgens de methode naar keuze.
- Screen het DNA op de aanwezigheid van mutaties, bijvoorbeeld door een PCR-test te ontwerpen met primers rond het gebied van verwachte CRISPR-sneden.
- Houd alleen de G1 embryo's gelegd door G0 vrouwtjes die bewijs van transformatie vertonen. Wanneer deze G1 embryo's zich ontwikkelen tot poppen, scheid ze dan naar geslacht en houd alleen de vrouwtjes. Kruis de G1-vrouwtjes van hetzelfde G0-vrouwtje naar wt-mannetjes, voer ze met bloed en breng ze vervolgens over in kleine groepen van 2-3 vrouwtjes en 4-5 mannetjes in kleine containers.
OPMERKING: Alle G1-individuen hebben een kans om een unieke mutatie te dragen, dus als het aantal overlevende individuen niet te hoog is, is het beter om G1-vrouwtjes individueel met wt-mannetjes te kruisen. Het geval van verschillende vrouwtjes die een andere mutatie in dezelfde buis dragen, is zeldzaam, maar kan voorkomen. Als een dergelijk geval wordt waargenomen na genotypering, moeten de G2-nakomelingen vervolgens individueel worden gedekt om mannetjes te wten. Dit paringsschema vermijdt de mogelijkheid van meerdere mutaties in het nageslacht. - Verzamel na het leggen van eieren de G1 vrouwelijke lichamen en screen ze op mutaties. Bewaar alleen de buizen waar ten minste één vrouw bewijs van mutatie vertoonde.
- Maak voor latere generaties enkele paar in-crosses. Screen ouders na het leggen van eieren op aanwezigheid van mutatie. Herhaal dit bij elke generatie totdat beide ouders homozygoot zijn voor dezelfde mutatie. Eenmaal geïdentificeerd, zullen ze de oprichters zijn van een homozygoot mutantenbestand.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Het CRISPR/Cas9 micro-injection protocol dat hier wordt beschreven om zandvliegmutanten te genereren, werd vastgesteld in een eerdere publicatie4. Deze aanpak produceerde zeer efficiënte mutagenese, omdat 11 van de 540 individuen de procedure overleefden, waarvan er 9 mutant waren. Bij het ontwerpen van handleidingen voor CRISPR/Cas9-mutatie is een cruciale eerste stap het opeenvolgen van het gebied rond het te richten gebied. Het sjabloon voor sequencing moet afkomstig zijn van de stam die zal worden gebruikt als een bron van embryo's voor injectie. Het is riskant om alleen te vertrouwen op gepubliceerde genoomsequenties om gidsen te ontwerpen. Het is niet ongebruikelijk om verschillen te hebben tussen gepubliceerde genoom- en pre-guide ontwerpsequenties. In sommige gevallen zijn gidsen die zijn ontworpen op basis van gepubliceerde genoomsequentie niet aanwezig wanneer het gebied rond het doelgen wordt gesequenced (Harrell, persoonlijke observatie). Bovendien kan de reeks single nucleotide polymorfismen (SNP's) bevatten die kunnen worden verward als echte CRISPR-bewerkingen tijdens genotypering. Daarom is het bevestigen van de volgorde voor de doel regio van cruciaal belang voor de rest van het protocol om te slagen.
Succesvolle genetische modificatie van insecten door micro-injectie hangt voornamelijk af van twee kritieke aspecten: levering van materialen (eiwit, plasmide of mRNA) op het juiste moment in ontwikkeling met zo min mogelijk schade aan de embryo's; en het fokken van robuuste, gezonde insecten die de procedure zullen overleven en nakomelingen zullen produceren. De beginfase van deze procedure, beschreven in figuur 2,begint met bloedtoevoer van de vrouwtjes uit de wt-kolonie en gaat vijf dagen later over naar embryoverzameling en micro-injection. De tweede fase bestaat uit het opvoeden van de geïnjecteerde embryo's tot volwassenheid, het maken van de juiste kruisen en het identificeren en isoleren van mutaties van belang.
Embryo's voor injectie worden gedurende 30 – 60 minuten verzameld, zodat de relatieve leeftijd in uren na ovipositie kan worden bepaald. Embryo's mogen zich dan 3 uur voor het begin van de injecties ontwikkelen. Dit tijdvenster van insectenontwikkeling stelt de embryo's in staat om de injecties te overleven. Na deze verouderingsperiode worden de embryo's verzameld op een voorbereide injectieschuif en worden de embryo's met een fijne borstel tegen een afdekliprand gerold. De uiteindelijke configuratie wordt weergegeven in figuur 3A. Het is belangrijk om het filterpapier voldoende nat te maken, zodat er een meniscus ontstaat aan de rand van de deklip waar de embryo's zitten. Te veel water en de embryo's worden van de rand van de deklip geduwd. Te weinig zal ervoor zorgen dat de embryo's onder de afdeklip worden getrokken. De embryo's moeten vochtig worden gehouden, anders worden de embryomembranen moeilijk te injecteren. De coverliprand fungeert als een backstop, waardoor de naald de embryo's kan binnendringen wanneer deze tegen de rand wordt gedrukt. Het is de combinatie van een scherpe naald en een backstop waardoor de naald soepel kan doordringen.
Net als bij de meeste succesvolle micro-injectieprotocollen is een goede micro-injectienaald die geschikt is voor de embryo's die worden geïnjecteerd belangrijk. Goede, scherpe naalden worden gedefinieerd als naalden die gemakkelijk het embryo binnendringen zonder het materiaal na injectie te laten ontsnappen. Een goede penetratie is duidelijk wanneer de naald in het embryo glijdt, waardoor er tijdens de penetratie weinig tot geen inkeping van het embryomembraan ontstaat en er geen materiaal uit het embryo lekt nadat de naald is teruggetrokken. Goede scherpe naalden worden geproduceerd met behulp van naaldtrekkerinstellingen die een naald produceren die tot een fijn punt komt (Figuur 1A). De getrokken naald mag geen taps toelopen die te lang is. Anders wordt het lumen van de naald erg smal voor een groot deel van de taper(figuur 1B),en wordt het moeilijk om de injectiedruk hoog genoeg te krijgen om het materiaal door de naald te dwingen. In dit protocol werden afgeschuinde naalden gebruikt. Het proces voor het trekken en afschuinenaalden wordt beschreven in Meuti en Harrell19. In het geval van zandvliegembryo's die zich gedurende een lange periode ontwikkelen, is het bijzonder belangrijk om scherpe naalden te hebben die schade aan het embryo minimaliseren, waardoor wordt voorkomen dat materiaal op de injectieplaats lekt. Wanneer embryoplasma lekt uit een embryo na injectie, is dit materiaal een rijk medium voor schimmel- en schimmelgroei. Bij embryo's die zich over een kortere periode ontwikkelen, kan het embryo zich ontwikkelen en uitkomen voordat de schimmel een probleem wordt. Embryo's die zichtbaar lekkend embryoplasma na injectie moeten worden verwijderd.
Tijdens injecties is het belangrijk om water toe te voegen als dat nodig is door een fijne kwast nat te maken en aan te raken op het filterpapier, zo nodig herhalend totdat de meniscus van water zich net aan de basis van de embryo's bevindt. Aandacht voor de relatieve vochtigheid op de injectiedag moet worden opgemerkt. Op dagen met een lage luchtvochtigheid moet er meer water worden toegevoegd. Zodra de injecties zijn voltooid, wordt een beetje extra water aan het filterpapier toegevoegd, zodat de afdeklip enigszins drijft, waardoor het gemakkelijker te verwijderen is. Zodra de afdeklip is verwijderd, kan het filterpapier met geïnjecteerde embryo's worden gevlekt, zodat het filterpapier nauwelijks vochtig is. Embryo's kunnen vervolgens worden overgebracht naar een vochtige gipsen pot om uit te broeden met behulp van een fijne kwast. In dit stadium zijn embryo's erg kwetsbaar, dus het proces moet zeer zorgvuldig worden uitgevoerd. Het is ook belangrijk om te voorkomen dat de embryo's elkaar raken om beschimmelde embryo's te kunnen verwijderen en de verspreiding van schimmelbesmetting te beperken.
Na de injectie worden de G0 geïnjecteerde embryo's op gipspotten bewaard volgens normale opfokprocedures. Totdat ze uitkomen, moeten geïnjecteerde embryopotten eenmaal per dag worden gecontroleerd om ongezonde embryo's te verwijderen. Figuur 4A geeft de verwachte tijdlijn weer van de individuele opfok van G0 vanaf de dag van het leggen van eieren en injectie tot de volwassenheid. Figuur 4B toont voorbeelden van G0-embryo's die gezond zijn en moeten worden behouden; of beschadigd, besmet met schimmel, uitgedroogd of vervormd en moet worden weggegooid. De G0 geïnjecteerde individuen zijn zogenaamd mozaïek voor mutante allelen. Er moet een methode worden ontworpen voor het identificeren van potentiële mutante allelen, zoals een PCR-test van het gebied rond de verwachte snijplaats(en). Figuur 4C geeft een voorbeeld van een PCR-test met een mozaïek G0-individu, met een PCR-product naast het verwachte wt-product, dat een mutant allel vertegenwoordigt.
Zodra de volwassenen tevoorschijn komen, worden de G0-vrouwtjes die zich ontwikkelen uit G0 geïnjecteerde embryo's gekruist met wt-mannetjes, mogen ze eieren leggen en worden ze later genotoxiceerd. Alleen de buizen met een G0-vlieg die tekenen van mutatie van de genotyperingsmethode van keuze vertonen, blijven behouden. De vliegen van de volgende generaties (G1 vrouwtjes) worden gekruist met wt mannetjes of individueel tussen broers en zussen (vanaf G2). Deze kruisen mogen eieren leggen en vervolgens worden gegenerigd volgens de methode van keuze. De laatste stap wordt herhaald totdat homozygote gemuteerde mannetjes en vrouwtjes zijn verkregen, waardoor een homozygote mutantenlijn wordt vastgesteld. Figuur 5Ageeft een schematische weergave van de juiste opeenvolging van kruisen om een mutante lijn vast te stellen . Figuur 5B toont een voorbeeld van een genotyperende PCR die de identificatie van een homozygoot mutant broers en zussen kruis mogelijk maakt.
Figuur 1: Micro-injectie naalden. A. Goede naald. B. Naald met extreme taper niet goed voor injecties. Klik hier om een grotere versie van deze afbeelding te bekijken.
Figuur 2: Overzicht van embryoverzameling en micromanipulatie (Dit cijfer was aangepast van4). Klik hier om een grotere versie van deze afbeelding te bekijken.
Figuur 3: Micro-injectie opstelling. A. Schematische weergave van de micro-injectie-opstelling. B. Close-up van gericht embryo voor microinjection. Klik hier om een grotere versie van deze afbeelding te bekijken.
Figuur 4: Opfok en identificatie van mozaïek G0 volwassen personen. A. Verwacht tijdschema van embryomicro-injectie tot G0-volwassenheid. B. Voorbeelden van goed en slecht uitziende embryo's na injectie. C. PCR genotypering van een getransformeerd G0 mozaïek individu. Klik hier om een grotere versie van deze afbeelding te bekijken.
Figuur 5: Identificatie en isolatie van mutaties van belang. A. Schematische weergave van de experimentele strategie om gemuteerde allelen te isoleren en homozygote mutantenbestanden vast te stellen (figuur uit 4). De kleur vertegenwoordigt de aanwezigheid van cellen die gemuteerde allelen dragen, in de heterozygote (roze) of homozygote (rode) toestand. B. Voorbeeld van een PCR-screeningsstrategie voor het genotyperen van individuele sissende kruisen van zandvliegen. Klik hier om een grotere versie van deze afbeelding te bekijken.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
We presenteren hier een recent ontwikkelde embryomicro-injectiemethode voor gerichte mutagenese door CRISPR/Cas9 in Phlebotomus papatasi zandvliegen. Embryomicro-injection voor genetische modificatie van insecten werd ontwikkeld in Drosophila in het midden van de jaren 198021 en wordt nu routinematig gebruikt bij een grote verscheidenheid aan insecten. Andere methoden voor de levering van genetisch modificatiemateriaal zijn ontwikkeld voor gebruik bij insecten, zoals ReMOT20,21,22,23 en elektroporatie23. Embryomicro-injection is momenteel echter de meest veelzijdige en efficiënte methode voor de levering van deze materialen. ReMOT is zeer veelbelovend als toedieningsmethode en moet worden onderzocht voor gebruik bij zandvliegen, vanwege het relatieve gemak van injecties voor volwassenen in vergelijking met embryomicro-injecties. Tot nu toe is ReMot echter niet met succes gebruikt voor CRISPR / Cas9 HDR of transposon transgenese. Hoewel de techniek voor embryomicro-invoegingen bij insecten in principe hetzelfde is als aanvankelijk ontwikkeld, kunnen voor elke nieuwe soort verfijningen van de technieken nodig zijn. Deze soorten verschillen omvatten het patroon en de duur van de embryoontwikkeling, de embryostructuur en de omgeving waarin het embryo zich normaal ontwikkelt. Zandvliegembryo's zijn bijzonder klein (0,3-0,5 mm lang en 0,1- 0,15 mm breed, wat ongeveer 1/3 van de grootte van Drosophila-ei vertegenwoordigt 1). Deze kleinere omvang verhoogt de moeilijkheid om de eieren te hanteren zonder ze te beschadigen. Het vochtgehalte bij elke stap van het protocol moet zeer zorgvuldig worden gecontroleerd, omdat zandvliegembryo's bijzonder gevoelig zijn voor uitdroging. Ze zijn echter niet aquatisch en zullen sterven als ze gedurende een langere periode volledig in water worden ondergedompeld. Drosophila embryo micro-injectie vereist injectie aan het achterste uiteinde van het embryo. Vanwege de bijna symmetrische vorm van zandvliegembryo's is het moeilijk om de polariteit van embryo's te bepalen. Ten slotte, terwijl de ontwikkeling van zandvliegembryo's vergelijkbaar is met Drosophila,doet het dit in een veel langzamer tempo. Embryogenese alleen duurt tussen de 6 en 11 dagen, afhankelijk van de zandvliegsoort, terwijl Drosophila-eieren slechts één dag na het leggen van eieren uitkomen. Drosophila ei cellularisatie vindt plaats ongeveer 2 uur na ovipositie, terwijl zandvlieg embryo's dit stadium bereiken op proximately 9 uur na ovipositie. Gezien dit verschil in ontwikkelingstiming, zijn injecties gericht op het centrum van het zich ontwikkelende zandvliegembryo in de veronderstelling dat de ontwikkeling van kernen in het syncytiële embryo zich in dit vroege stadium van ontwikkeling in het centrum van het zich ontwikkelende embryo bevindt, waardoor de noodzaak om embryopolariteit te onderscheiden wordt weggevaald.
CRISPR/Cas9 creëert dsDNA breaks op een gekozen genomische locus. Deze dubbele strengbreuken worden in de cel gerepareerd door NHEJ of door HDR. De methode die we hier presenteren werd voorheen alleen gebruikt voor op NHEJ gebaseerde mutagenese, die kleine insertie- / deletiegebeurtenissen, indels gen, wat leidde tot een frameshift in gensequenties, wat resulteerde in voortijdige stop codons en een eiwit dat niet alle functionele domeinenmiste 4. Insecten bezitten ook de cellulaire machines voor dsDNA-breukreparatie door HDR, die vervolgens kan worden omgeleid om complexere genoombewerkingsstrategieën te ontwerpen. HDR-gebaseerde CRISPR / Cas9-genoombewerking moet nog steeds worden ingesteld voor gebruik in zandvliegen en moet de ontwikkeling van verslaggevers van expressie- en voorwaardelijke expressiemutanten mogelijk maken, onder andere constructies.
De ontwikkeling van dit micro-injectieprotocol opent nu de deur om andere genoommodificatiemethoden te gebruiken, zoals CRISPR / Cas9 HDR, transposon transgenese, binaire expressiesystemen zoals UAS / Gal4 en sitespecifieke recombinatie door phiC31 of Cre /lox. De ontwikkeling van deze andere methoden zal de toolbox voor genexpressiemodificatie van zandvlieg verder uitbreiden door complexere genomische manipulatie mogelijk te maken. Voordat deze andere methoden echter kunnen worden gebruikt, zal werk nodig zijn om regulatorelementen te identificeren en te isoleren om de expressie van ingebrachte genen in zandvliegen te stimuleren, evenals markers van invoeging en andere componenten van deze methoden, zoals promotors om de expressie van transposases en recombinaties te stimuleren.
Ten slotte is genoombewerking bij niet-modelinsecten nu een mogelijkheid geworden, met name dankzij de revolutie van CRISPR / Cas9-ontdekking en aanpassing15,16. Bij insecten vereisen de meeste genoombewerkingstechnieken, tot de opmerkelijke uitzondering van de nieuw ontwikkelde ReMOT-techniek, embryomicro-invoeging, een stap die zowel cruciaal als technisch veeleisend is. We hopen dat deze publicatie zal helpen bij het uitbreiden van het scala aan genexpressiemodificatietechnieken die zijn aangepast aan zandvliegen, en zal leiden tot nieuwe ontdekkingen over hun biologie en vectorcompetentie voor Leishmania-parasieten.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
geen
Acknowledgments
De auteurs danken Vanessa Meldener-Harrell voor het kritisch lezen van het manuscript.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Black Filter Paper 4.25CM PK100 | VWR | 28342-012 | Cut into rectangles that are approximately 46 X 22mm. These are placed between the slide and the coverslip and act as a moist base layer for the embryos during injection. |
| Coverslips | Fisher Scientific | 12-543A | |
| Dissecting Microscope | Any brand | For aligning embryos | |
| Glass slides | Fisher Scientific | 12-550-A3 | Base layer of the microinjection set up Figure 2A |
| Insect cage | custom made or several commercial options | polycarbonate cage for adults holding and mating Lawyer, Phillip, Mireille Killick-Kendrick, Tobin Rowland, Edgar Rowton, and Petr Volf. “Laboratory Colonization and Mass Rearing of Phlebotomine Sand Flies (Diptera, Psychodidae).” Parasite 24. Accessed August 6, 2020. https://doi.org/10.1051/parasite/2017041. | |
| Larval food | custom made | a mix of rabbit chow and rabbit feces Lawyer, Phillip, Mireille Killick-Kendrick, Tobin Rowland, Edgar Rowton, and Petr Volf. “Laboratory Colonization and Mass Rearing of Phlebotomine Sand Flies (Diptera, Psychodidae).” Parasite 24. https://doi.org/10.1051/parasite/2017041. | |
| Microcaps 100 ml | Drummond | 1-000-1000 | Used to back fill microinjection needles |
| Mouth aspirator | John W. Hock Company | Model 612 | mouth aspirator with HEPA filter |
| Olympus SZX12 | Olympus Life Sciences | Microinjection microscope | |
| Ovipots | Nalge company | ovipots are made from 125-ml or 500-ml straigh-sided plolypropylene jars modified by drilling 2.5cm holes in the bottom and filled with 1cm of plaster of Paris. Lawyer, Phillip, Mireille Killick-Kendrick, Tobin Rowland, Edgar Rowton, and Petr Volf. “Laboratory Colonization and Mass Rearing of Phlebotomine Sand Flies (Diptera, Psychodidae).” Parasite 24. Accessed August 6, 2020. https://doi.org/10.1051/parasite/2017041. | |
| Paint Brush 6-0 | Any Art Supply Company | n/a | Used for aligning embryos |
| Propionic acid | Sigma-Aldrich | 402907 | antifungal agent |
| Standard Glass Capillaries | World Precision Instruments | 1B100-3 | Used for making microinjection needles |
| Trio-MPC100 Controller and MP845 Manipulator | Sutter Instruments | Microinjection Controller and Micromanipulator |
References
- Lawyer, P., Killick-Kendrick, M., Rowland, T., Rowton, E., Volf, P. Laboratory colonization and mass rearing of phlebotomine sand flies (Diptera, Psychodidae). Parasite. 24, 42 (2017).
- Pelletier, I., et al. Specific recognition of Leishmania major poly-beta-galactosyl epitopes by galectin-9: possible implication of galectin-9 in interaction between L. major and host cells. Journal Biological Chemistry. 278 (25), 22223-22230 (2003).
- Kamhawi, S., et al. A role for insect galectins in parasite survival. Cell. 119 (3), 329-341 (2004).
- Louradour, I., Ghosh, K., Inbar, E., Sacks, D. L. CRISPR/Cas9 Mutagenesis in Phlebotomus papatasi: the Immune Deficiency Pathway Impacts Vector Competence for Leishmania major. MBio. 10 (4), (2019).
- Xi, Z., Ramirez, J. L., Dimopoulos, G. The Aedes aegypti toll pathway controls dengue virus infection. PLoS Pathogens. 4 (7), 1000098 (2008).
- Ramirez, J. L., Dimopoulos, G. The Toll immune signaling pathway control conserved anti-dengue defenses across diverse Ae. aegypti strains and against multiple dengue virus serotypes. Development and Comparative Immunology. 34 (6), 625-629 (2010).
- Ramirez, J. L., et al. Reciprocal tripartite interactions between the Aedes aegypti midgut microbiota, innate immune system and dengue virus influences vector competence. PLoS Neglected Tropical Diseases. 6 (3), 1561 (2012).
- Hu, C., Aksoy, S. Innate immune responses regulate trypanosome parasite infection of the tsetse fly Glossina morsitans morsitans. Molecular Microbiology. 60 (5), 1194-1204 (2006).
- Meister, S., et al. Anopheles gambiae PGRPLC-mediated defense against bacteria modulates infections with malaria parasites. PLoS Pathogens. 5 (8), 1000542 (2009).
- Meister, S., et al. Immune signaling pathways regulating bacterial and malaria parasite infection of the mosquito Anopheles gambiae. Proceedings of the National Academy of Sciences U S A. 102 (32), 11420-11425 (2005).
- Telleria, E. L., et al. Caspar-like gene depletion reduces Leishmania infection in sand fly host Lutzomyia longipalpis. Journal of Biological Chemistry. 287 (16), 12985-12993 (2012).
- Sant'Anna, M. R., Alexander, B., Bates, P. A., Dillon, R. J. Gene silencing in phlebotomine sand flies: Xanthine dehydrogenase knock down by dsRNA microinjections. Insect Biochemistry and Molecular Biology. 38 (6), 652-660 (2008).
- Sant'anna, M. R., Diaz-Albiter, H., Mubaraki, M., Dillon, R. J., Bates, P. A. Inhibition of trypsin expression in Lutzomyia longipalpis using RNAi enhances the survival of Leishmania. Parasites and Vectors. 2 (1), 62 (2009).
- Diaz-Albiter, H., Mitford, R., Genta, F. A., Sant'Anna, M. R., Dillon, R. J. Reactive oxygen species scavenging by catalase is important for female Lutzomyia longipalpis fecundity and mortality. PLoS One. 6 (3), 17486 (2011).
- Barrangou, R., et al. CRISPR provides acquired resistance against viruses in prokaryotes. Science. 315 (5819), 1709-1712 (2007).
- Jinek, M., et al. A programmable dual-RNA-guided DNA endonuclease in adaptive bacterial immunity. Science. 337 (6096), 816-821 (2012).
- Pawelczak, K. S., Gavande, N. S., VanderVere-Carozza, P. S., Turchi, J. J. Modulating DNA Repair Pathways to Improve Precision Genome Engineering. ACS Chemical Biology. 13 (2), 389-396 (2018).
- Martin-Martin, I., Aryan, A., Meneses, C., Adelman, Z. N., Calvo, E. Optimization of sand fly embryo microinjection for gene editing by CRISPR/Cas9. PLoS Neglected Tropical Diseases. 12 (9), 0006769 (2018).
- Meuti, M., Harrell, R. Preparing and Injecting Embryos of Culex Mosquitoes to Generate Null Mutations Using CRISPR/Cas9. JoVE. (163), e61651 (2020).
- Chaverra-Rodriguez, D., et al. Targeted delivery of CRISPR-Cas9 ribonucleoprotein into arthropod ovaries for heritable germline gene editing. Nature Communications. 9 (1), 3008 (2018).
- Chaverra-Rodriguez, D., et al. Germline mutagenesis of Nasonia vitripennis through ovarian delivery of CRISPR-Cas9 ribonucleoprotein. Insect Molecular Biology. , (2020).
- Heu, C. C., McCullough, F. M., Luan, J., Rasgon, J. L. CRISPR-Cas9-Based Genome Editing in the Silverleaf Whitefly (Bemisia tabaci). CRISPR Journal. 3 (2), 89-96 (2020).
- Macias, V. M., et al. Cas9-Mediated Gene-Editing in the Malaria Mosquito Anopheles stephensi by ReMOT Control. Genes, Genomes and Genetics (Bethesda). 10 (4), 1353-1360 (2020).
