Summary
פרוטוקול זה מפרט את השלבים של CRISPR / Cas9 mutagenesis ממוקד זבובי חול: אוסף עוברים, הזרקה, גידול חרקים, זיהוי, כמו גם מבחר של מוטציות של עניין.
Abstract
זבובי חול הם הווקטורים הטבעיים של מיני לישמניה, טפילי פרוטוזואן המייצרים קשת רחבה של תסמינים החל בנגעים עוריים ועד פתולוגיה קרבית. פענוח אופי האינטראקציות הווקטוריות/טפיליות הוא בעל חשיבות עליונה להבנה טובה יותר של שידור לישמניה למארחיהם. בין הפרמטרים השולטים ביכולת וקטור זבוב החול (כלומר היכולת שלהם לשאת ולהעביר פתוגנים), פרמטרים מהותיים לחרקים אלה הוצגו לשחק תפקיד מפתח. תגובת חיסון חרקים, למשל, משפיעה על יכולת וקטור זבוב חול לישמניה. המחקר של פרמטרים כאלה הוגבל על ידי היעדר שיטות של שינוי ביטוי גנים מותאם לשימוש באורגניזמים אלה שאינם מודל. הסרת רגולציה של גנים על ידי RNA מפריע קטן (siRNA) אפשרית, אך בנוסף להיותה מאתגרת מבחינה טכנית, ההשתקה מובילה לאובדן חלקי בלבד של תפקוד, שלא ניתן להעביר מדור לדור. mutagenesis ממוקד על ידי טכנולוגיית CRISPR / Cas9 הותאם לאחרונה זבוב חול פפטאסי Phlebotomus. טכניקה זו מובילה ליצירת מוטציות הניתנות להעברה במקום שנבחר במיוחד, ומאפשרת לחקור את הגנים המעניינים. מערכת CRISPR/Cas9 מסתמכת על אינדוקציה של הפסקות דנ"א דו-גדילי ממוקדות, שתוקנה מאוחר יותר על ידי הצטרפות קצה לא הומולוגית (NHEJ) או על ידי תיקון מונחה הומולוגיה (HDR). NHEJ מורכב מסגירה פשוטה של ההפסקה ולעתים קרובות מוביל לאירועי הוספה/מחיקה קטנים. לעומת זאת, HDR משתמש בנוכחות של מולקולת DNA תורמת שיתוף הומולוגיה עם ה-DNA היעד כתבנית לתיקון. כאן, אנו מציגים שיטת microinjection עובר זבוב חול עבור mutagenesis ממוקד על ידי CRISPR / Cas9 באמצעות NHEJ, שהיא טכניקת שינוי הגנום היחידה המותאמת וקטורים זבוב חול עד כה.
Introduction
מחלות המועברות על ידי וקטור מהוות איום מרכזי על בריאות הציבור באבולוציה מתמדת. מאות מינים וקטוריים הפרוסים על פני משפחות פילוגניות שונות מאוד (למשל, יתושים, קרציות, פרעושים) אחראים להעברת מספר עצום של פתוגנים מיקרוביאליים, וכתוצאה מכך יותר מ -700,000 מקרי מוות של בני אדם בשנה, על פי ארגון הבריאות העולמי. בין חרקים וקטוריים, זבובי חול פלבוטומין (דיפטרה, פסיכודידיה) מהווים קבוצה עצומה, עם 80 מינים וקטורים מוכחים המציגים תכונות פנוטיפיות מובהקות ויבולות וקטוריות שנמצאו באזורים גיאוגרפיים שונים. הם וקטורים עבור טפילי פרוטוזואן של הסוג לישמניה, גורם סביב 1.3 מיליון מקרים חדשים של לישמניאסים בין 20,000 ל 30,000 מקרי מוות בשנה. התוצאות הקליניות של לישמניאס מגוונות, עם תסמינים הנעים בין נגעים עוריים המגבילים את עצמם ועד להפצה הקרביים שהיא קטלנית בהיעדר טיפול.
זבובי חול הם חרקים יבשתיים לחלוטין. מחזור החיים שלהם, ארוך יחסית לדיפטרה אחרת, נמשך עד שלושה חודשים, בהתאם לפרמטרים שונים כגון טמפרטורה, לחות ותזונה. הוא מורכב משלב עוברי אחד (6 עד 11 ימים), ארבעה שלבי זחל (הנמשכת בסך הכל 23 עד 25 ימים) ושלב פופי אחד (9 עד 10 ימים) ואחריו מטמורפוזה ולאחר מכן בגרות. זבובי חול דורשים סביבה לחה וחמה לגידול. זכרים ונקבות כאחד ניזונים מסוכרים, המתקבלים בטבע מצוף פרחים. רק נקבות הן מאכילות דם, שכן הן דורשות חלבונים המתקבלים מארוחת הדם לייצור ביצים1.
מוקד מחקר חשוב הוא לזהות את אופי האינטראקציות הווקטוריות/טפיליות המובילות להתפתחות זיהומים הניתנים להעברה. כמו חרקים וקטוריים אחרים, פרמטרים מהותיים לזבובי חול הוכחו כמשפיעים על יכולתם הווקטורית, המוגדרת כיכולתם לשאת ולהעביר פתוגנים למארחיהם. לדוגמה, הביטוי של גלקטינים על ידי חול פפטאסי Phlebotomus לטוס תאים midgut, מתנהג כמו קולטנים זיהוי רכיבים משטח טפיל, יכול להשפיע ישירות על היכולת הווקטורית שלהם עבור Leishmania גדול2,3. מסלול התגובה החיסונית חרקים, מחסור במערכת החיסון (IMD), הוא גם חיוני עבור Phlebotomus papatasi חול זבוב וקטור יכולת עבור לישמניה גדול4. תפקיד קריטי עבור מסלולי תגובה חיסונית חרקים וקטוריים בשליטה על העברתם של פתוגנים זיהומיות דווח באופן דומה יתושים Aedes aegypti 5,6,7, ב tsetse לטוס Glossina morsitans8, וב Anopheles gambiae יתושים 9,10.
מחקרים על זבוב חול / אינטראקציותלישמניה הוגבלו על ידי היעדר שיטות לשינוי ביטוי גנים המותאמות לשימוש בחרקים אלה. רק הסרת רגולציה של גנים על ידי RNA מפריע קטן (siRNA)בוצעה 11,12,13,14 עד לאחרונה. הטכניקה, המוגבלת על ידי התמותה הקשורה למיקרו-אינג'ים של נקבות בוגרות, מובילה רק לאובדן חלקי של תפקוד, שלא ניתן להעביר מדור לדור.
טכנולוגיית CRISPR/Cas9 חוללה מהפכה במחקר הגנומי הפונקציונלי באורגניזמים שאינם מדגמים כגון זבובי חול. שונה ממערכת החיסון האדפטיבית בפרוקריוטים להגנה מפני בקטריופאג'ים15,16, מערכת CRISPR Cas9 הותאמה במהירות ככלי לעריכת גנום לאורגניזמים אוקריוטיים מעולים, כולל חרקים. העיקרון של עריכת גנום ממוקד CRISPR/Cas9 מבוסס על המשלימות של RNA מדריך יחיד (sgRNA) לוקוס גנומי ספציפי. גרעין Cas9 נקשר לסגנ"א ויוצר שבירת דנ"א דו-גדילי (dsDNA) בדנ"א הגנומי שבו הסג'רנה מתחבר לרצף המשלים שלו. קומפלקס Cas9-sgRNA מונחה לרצף היעד על ידי 17 עד 20 בסיסים משלימים בסגנ"א למוקד הנבחר, ניתן לתקן את הפסקת dsDNA על ידי שני מסלולים עצמאיים: הצטרפות קצה לא הומולוגית (NHEJ) או תיקון מונחה הומולוגיה (HDR)17. תיקון NHEJ כרוך בסגירה פשוטה של ההפסקה אך לעתים קרובות מוביל לאירועי הוספה/מחיקה קטנים. תיקון דנ"א באמצעות HDR משתמש במולקולת דנ"א תורמת החולקת הומולוגיה עם הדנ"א של המטרה כתבנית לתיקון. חרקים מחזיקים בשתי המכונות.
טכנולוגיית CRISPR/Cas9 יכולה ליצור מוטציות בלוקוס שנבחר, דרך מסלול התיקון של NHEJ; או לאסטרטגיות מורכבות יותר לעריכת גנום, כגון דפיקות או כתבי ביטוי, דרך מסלול HDR עם תבנית תורמת מתאימה. בזבובי חול, אללים מוטנטים ריקים של גורם התגובה החיסונית Relish נוצרו באמצעות CRISPR בתיווך NHEJ בפלבוטומוס פאפטאסי4. עוברי זבוב חול הוזרקו גם במחקר אחר עם תערובת CRISPR/Cas9 המכוונת לגן המקודד צהוב. ובכל זאת, לא היו מבוגרים הנושאים את המוטציה18. אנו מתארים כאן שיטה מפורטת של זבוב חול mutagenesis ממוקד על ידי CRISPR /Cas9 בתיווך NHEJ, עם דגש מסוים על microinjection העובר, צעד קריטי של הפרוטוקול.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
השימוש בעכברים כמקור דם להאכלת זבוב חול נעשה בהתאם להמלצות המדריך לטיפול ושימוש בחיות מעבדה של המכונים הלאומיים לבריאות (NIH). הפרוטוקול אושר על ידי ועדת הטיפול והשימוש בבעלי חיים של NIAID, NIH (מספר פרוטוקול LPD 68E). חסרי חוליות אינם מכוסים תחת הנחיות NIH.
1. הכנת מחט (איור 1)
- משוך מחטים ושיפוע כמתואר ב Meuti והארל19. בקצרה, משוך מחטים על משיכת מיקרופיפט זכוכית דו-שלבית, באמצעות נימי זכוכית בורוסיליקט.
- לחדד את המחטים על ידי שיפוע רטוב על שיפוע micropipette, באמצעות אבן עדינה נוספת.
2. אוסף עוברים ומיקרומניפולציה (איור 2)
- חמישה ימים לפני יום ההזרקה, נקבות חול מאכילות דם עפות כפי שהן מבוצעות באופן שגרתי לתחזוקת המושבה. לפרטים על מושבות זבוב חול גידול נהלים וחומר נדרש, אנא עיין עו"ד ואח'1 לשמור על החרקים באינקובטורים ב 70% לחות ו 26 °C (60 °F), במהלך כל התפתחותם.
- יום אחד לאחר האכלת הדם, ללכוד נקבות שניזונו בדם על ידי קבוצות של 100-150 בסירי גבס עם נמל צדדי. לשמור על הנקבות על ידי האכלת אותם עם תמיסת סוכר (30% סוכרוז – נפח מספיק כדי להשרות כדור כותנה קטן) וזה הרגיל לתחזוקת המושבה.
- ביום 2-3 לאחר האכלת הדם, אין להרטיב את סירי הגבס. שמירה על הנקבות על מצע יבש תמנע הטלת ביצים מוקדמת, שכן הנקבות מעדיפות להטיל ביצים על סביבה לחה.
- ביום 5 לאחר האכלת הדם, לבצע את אוסף העובר, מיקרומניפולציה, microinjection. הכניסו נייר סינון לח לתא הטלת הביצים. לעוברים טריים אין כוריון מפותח לחלוטין והם נראים לבנים. השתמש בנייר סינון שחור במהלך ההליך כדי להקל על הדמיית העוברים הלבנים.
- מעבירים קבוצה קטנה של נקבות מסיר הגבס לתא הטלת הביצים דרך היציאות הצדדיות באמצעות שאיפת פה. נוכחותו של מצע לח (נייר הסינון) גורם לנקבות לביצית.
- לאחר 30-60 דקות, בזהירות לאחזר את נייר המסנן עם עוברים שהונחו לאחרונה מן התא. שומרים את נייר הסינון והעוברים בצלחת פטרי עד 3 שעות. במהלך תקופה זו, להעריך באופן קבוע את רמת הלחות של נייר המסנן כדי להבטיח שהוא נשאר לח. במהלך תקופה זו, לחזור על שלבים 2.4 כדי 2.6 עם קבוצות חדשות של נקבות ולאסוף עוברים רבים ככל האפשר.
- מכינים שקופיות מיקרוסקופ להזרקה: אוספים ידנית את הביצים אחת אחרי השנייה עם מברשת צבע עדינה מאוד ומעבירים אותן בזהירות לחתיכה אחרת של נייר סינון שחור לח שהונח על מגלשת מיקרוסקופ ומעליה כיסוי זכוכית.
- מוסיפים מים לנייר הסינון, מספיק כדי לשמור על העוברים לחים אך לא גורמים להם לצוף הרחק מהכיסוי או להישאב מתחת לכיסוי. תסדר את העוברים כנגד הכיסוי. העטיפה משמשת כפסע אחורי המונע מהביצים להתגלגל במהלך ההזרקה.
3. זריקות עוברים (איור 3)
- התחל זריקות 2.5 עד 3 שעות לאחר תחילת איסוף הביצים. בצעו זריקות בטמפרטורת החדר ובלחות המעבדה הסביבתית.
- ודאו שלעוברים המיושרים יש מספיק מים כדי שהם יישמרו לחים.
הערה: זה קריטי כי העוברים נשמרים לחים במהלך הזריקות. אם הם לא לחים במהלך תהליך ההזרקה, זריקות להיות קשה כי המחט מתקשה פירסינג העובר. כמות המים הנכונה היא הנקודה שבה לעוברים יש מניסקוס של מים סביבם, אך הכיסוי אינו צף על גבי המים וגורם לעוברים לדחוף מתחת לכיסוי. זה קריטי כדי לפקח על כמות המים סביב העוברים במהלך זריקות. מוסיפים מים לפי הצורך כדי לשמור על העוברים לחים. - מוסיפים מים בזהירות על ידי הרטבת מברשת עם מים והעברת המים לקצה האחורי של נייר המסנן. הוספת מים בצורה זו מאפשרת להוסיף מים בצורה איטית ומבוקרת, כך שרק מספיק מתווסף כדי לשמור על העוברים לחים. יותר מדי מים יכולים לגרום לעוברים לצוף מחוץ ליישור, מה שמקשה על הזרקת העוברים.
- תערובת הזרקת עומס גב לתוך מחט microinjection. הוסף כ 0.5 כדי 1 μL של תערובת הזרקה לתוך המחט באמצעות מילוי מחט borosilicate מצויר ביד, טיפים צינור טעינת ג'ל ניתן להשתמש גם. תערובת ההזרקה מורכבת RNA מדריך אחד או יותר (80 ng / μL כל אחד) שנועד למקד לוקוס ספציפי מעורבב עם חלבון Cas9 רקומביננטי מסחרי (300 ng / μL).
- החל מלחץ ההזרקה ב 30 psi, לחץ על ההדק ההזרקה כדי לגרש אוויר מקצה המחט. זה יאלץ את תערובת ההזרקה לקצה המחט ומאפשר לתערובת ההזרקה לזרום. בשלב זה, לאט להגדיל את הלחץ להחזיק / קבוע עד חומר ההזרקה מתחיל לזרום, ולאחר מכן לסגת להחזיק / לחץ קבוע, כך שהוא ממש מתחת לנקודת תערובת ההזרקה זורם מן המחט. ההגדרה מגודרת צריך לספק רק מספיק חומר הזרקה, כך כמות קטנה של חומר ניתן לראות להיכנס העובר.
הערה: הזרקת עוברים זבוב חול תחת שמן halocarbon דומה לפרוטוקולים אחרים המשמשים Drosophila ו יתושים נבדק בתחילה, אולם אחוז ההישרדות עבור זריקות אלה היה נמוך מאוד. ההישרדות שופרה על ידי מעבר לזריקות על נייר סינון לח כמתואר לעיל. - הכנס את המחט לצד העובר. השתמש בכיסוי מאחורי העובר כמו backstop אשר יסייע המחט לנקב את העובר. לספק כמות קטנה של תערובת הזרקה לתוך העובר לפני בעדינות להסיר את המחט.
- מיד לאחר הסרת המחט, לחץ על המזרק כדי להסיר כל חומר ממולא לאחור מקצה המחט. זה יעזור למנוע את המחט סתימת.
- המשך לעובר הבא. בין כל זריקה, ודא כי נייר המסנן לח והמחט אינה סתומה.
- לאחר שכל העוברים הוזרקו, לספור את מספר העוברים מוזרקים כדי לשמור על ספירת ריצה.
- הסר את הכיסוי על-ידי הוספת מים לנייר הסינון כך שהכיסוי יצוף. בשלב זה, השתמש בבדיקה (מקל אפליקטור עץ עם סיכת חרק מודבק לקצה) כדי להחזיק את נייר המסנן במקום בעוד אצבע משמשת כדי למשוך את הכיסוי מן העוברים מוזרקים.
- מחק מים עודפים מנייר הסינון לאחר הסרת העטיפה.
4. גידול לאחר הזרקה (G0) (איור 4)
- מעבירים את נייר המסנן עם העוברים על גבי מספר שכבות של נייר סינון לח הממוקם בצלחת פטרי כדי לשמור על לחות. שמור את העוברים כאן בזמן הדרוש כדי להזריק עוברים אחרים. עוברים יכולים להיות מוחזקים לכל היותר 3 שעות כאלה. לאחר ההזרקה הם יהפכו לאט חום.
- לאחר כל העוברים הוזרקו, להעביר אותם באופן ידני על סירי גבס בגודל קטן לח בעבר. אין לשים יותר מדי עוברים בכל סיר ולשמור על מרחק ביניהם, כדי למנוע זיהום פטרייתי אפשרי בין אנשים. מכסים את הסירים במסך ומאחסנים אותם כפי שנעשה בדרך כלל עבור ביצי מושבת זבוב חול, המתוחזקות באינקובטורים ב 70% לחות ו 26 °C (60 °F), במהלך כל הפיתוח שלהם.
- ביום הראשון שלאחר ההזרקה, הסר את כל העוברים הפגומים והמתים עם מברשת צבע. הוסף 100 μL של 0.5% חומצה propionic, טיפה אחר טיפה, על סירי טיח המכילים את העוברים מוזרקים להגביל זיהום פטרייתי. שחרור ציטופלסמה מעוברים שנפגעו במהלך תהליך ההזרקה הוא חיובי במיוחד לצמיחה פטרייתית.
- בדוק את סירי הגבס כל יום ולהסיר את כל העוברים רעים או מתים. אם פטרייה קיימת, להסיר את כל העוברים הנגועים ולהוסיף כמה טיפות של 0.5% חומצה propionic.
- הזחלים בוקעים בין היום ה-8 ל-12 לאחר ההזרקה. פעמיים ביום, להעביר את הזחלים החדשים הגיח על סירי גבס חדשים, בקבוצות של 5-10 מקסימום. מוסיפים כמות קטנה של מזון ולבדוק את האוכל 2-3 פעמים בשבוע.
- בזהירות לפקח על כמות המזון הזחל, כמו יותר מדי מגדיל מאוד את הסיכון לזיהום פטרייתי. זחלי זבוב חול לשרוד טוב יותר בקבוצות עם זאת הם יכולים להיות קניבליים אם אין מספיק מזון.
- כאשר הזחלים גורים, להפריד אותם על ידי מין כדי לשמור על הנקבות כמו בתולות. אם יש הרבה ניצולים, להשליך את הזכרים ולשמור רק את הנקבות.
הערה: זכרים ונקבות כאחד יכולים לשאת ולהעביר מוטציות. עם זאת, כמו נקבות צריך להישמר בתולות לפני שהם להיות חצה, קל יותר להשתמש רק G0 מוזרק נקבות, כדי למנוע צורך להפריד wt חרקים על ידי מין. זכרי G0 יכולים להישמר כגיבוי אם מספר הניצולים הבוגרים נמוך ובמקרה זה יוזדווגו עם נקבות בתולות ממוינות.
5. בחירה והקרנה של אללים מוטנטים (איור 5)
- המוני לחצות את נקבות G0 עם זכרים wt בכלוב. דם להאכיל אותם לגמרי, כפי שנעשה לתחזוקת מושבה נורמלית.
- יום אחד לאחר האכלת הדם, להעביר כל נקבת G0 עם 2-3 זכרים wt לתוך צינורות גבס בודדים באמצעות שאיפה בפה. להאכיל את הזבובים עם סוכר על כדור כותנה קטן השתנה כל יום ולהשתמש במזרק מים כדי להבטיח את לחות הטיח מתאים הטלת ביצה.
- לאחר נקבות G0 הטילו ביצים (המקביל G1), לאסוף את גופם בודדים, מבואר צינורות Eppendorf עבור genotyping מאוחר יותר. לשמור על העוברים כפי שנעשה בדרך כלל עבור מושבות wt.
- לחלץ את ה-DNA מן הנקבות G0 בשיטת הבחירה.
- לסנן את ה-DNA לנוכחות של מוטציות, למשל על ידי עיצוב PCR assay באמצעות פריימרים המקיפים את האזור של חתכים CRISPR צפוי.
- שמור רק את עוברי G1 שהונחו על ידי נקבות G0 מראה ראיות לשינוי. כאשר עוברים אלה G1 לפתח גלמים, להפריד אותם על ידי מין ולשמור רק את הנקבות. לחצות את נקבות G1 מאותה נקבת G0 לזכרים wt, להאכיל אותם בדם, ואז להעביר בקבוצות קטנות של 2-3 נקבות ו 4-5 זכרים לתוך מיכלים בגודל קטן.
הערה: כל האנשים G1 יש סיכוי לשאת מוטציה ייחודית, אז אם מספר האנשים ששרדו הוא לא גבוה מדי אז עדיף לחצות G1 נקבות בנפרד עם זכרים wt. המקרה של מספר נקבות הנושאות מוטציה שונה נוכח בצינור זהה הוא נדיר אבל יכול להתרחש. אם מקרה כזה נצפה לאחר genotyping, נקבות צאצאי G2 אז צריך להיות מזדווג בנפרד עם זכרים wt. ערכת הזדווגות זו מונעת את האפשרות של מוטציות מרובות בצאצאים. - לאחר הטלת ביצים, לאסוף את הגופות הנשיות G1 ולסנן אותם מוטציות. שמור רק את הצינורות שבהם לפחות נקבה אחת הראתה ראיות למוטציה.
- במשך דורות מאוחרים יותר לעשות זוג אחד בצלבים. לאחר הטלת ביצים, הורים מסך לנוכחות של מוטציה. חזרו על הפעולה בכל דור עד ששני ההורים יהיו הומוזיגיים לאותה מוטציה. ברגע שזוהו, הם יהיו המייסדים של מלאי מוטנטים הומוזיגי.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
פרוטוקול המיקרו-injection CRISPR/Cas9 המתואר כאן ליצירת מוטנטים של זבוב חול הוקם בפרסום הקודם4. גישה זו יצרה mutagenesis יעיל מאוד, כמו 11 מתוך 540 אנשים שרדו את ההליך, מתוכם 9 היו מוטנטים. בעת תכנון מדריכים למוטציה CRISPR/Cas9, צעד ראשון קריטי הוא לרצף את האזור סביב האזור שיש לפלח. התבנית לריצוף צריכה להיות מהזן שישמש כמקור לעוברים להזרקה. מסוכן להסתמך רק על רצפי גנום שפורסמו כדי לעצב מדריכים. זה לא יוצא דופן שיש הבדלים בין הגנום שפורסם ורצפי עיצוב מראש מדריך. במקרים מסוימים, מדריכים שעוצבו מרצף הגנום שפורסם אינם נוכחים כאשר האזור סביב גן היעד רצף (הארל, התבוננות אישית). בנוסף, הרצף עשוי לכלול פולימורפיזם נוקליאוטיד יחיד (SNPs) שניתן לטעות בו כעריכות CRISPR אמיתיות במהלך genotyping. לכן, אישור הרצף עבור אזור היעד הוא קריטי עבור שאר הפרוטוקול להצליח.
שינוי גנטי מוצלח של חרקים על ידי microinjection תלוי בעיקר בשני היבטים קריטיים: אספקת חומרים (חלבון, פלסמיד, או mRNA) בזמן המתאים בפיתוח עם נזק קטן ככל האפשר לעוברים; וגידול חרקים חזקים ובריאים שישרדו את ההליך וייצרו צאצאים. השלב הראשוני של הליך זה, המתואר באיור 2, מתחיל בהזנת דם של הנקבות ממושבת WT וממשיך לאוסף עוברים ולמיקרו-יין חמישה ימים לאחר מכן. השלב השני מורכב מגידול העוברים המוזרקים עד לבגרות, מה שהופך את הצלבים המתאימים וזיהוי ובידוד מוטציות מעניינות.
עוברים להזרקה נאספים במשך 30 - 60 דקות, כך שניתן לקבוע את הגיל היחסי בשעות שלאחר ההזרקה. עוברים רשאים להתפתח במשך 3 שעות לפני תחילת הזריקות. חלון הזמן הזה של התפתחות חרקים מאפשר לעוברים לשרוד את הזריקות. לאחר תקופת הזדקנות זו, העוברים נאספים על מגלשת הזרקה מוכנה והעוברים מגולגלים למקומם כנגד קצה כיסוי באמצעות מברשת עדינה. התצורה הסופית מוצגת באיור 3A. חשוב להרטיב את נייר הסינון מספיק כדי שמניסקוס יטפס בקצה הכיסוי שבו יושבים העוברים. יותר מדי מים והעוברים יידחקו מקצה הכיסוי. מעט מדי יגרום לעוברים להימשך מתחת לשמיכה. העוברים צריכים להישמר לחים, אחרת קרום העובר הופך להיות קשה להזריק. קצה הכיסוי פועל כעצירה אחורית, ומאפשר למחט לחדור את העוברים כאשר לוחצים על הקצה. זהו שילוב של מחט חדה ו backstop המאפשר את המחט לחדור בצורה חלקה.
כמו עם פרוטוקולי microinjection המוצלחים ביותר, מחט microinjection טוב מתאים העוברים להיות מוזרק חשוב. מחטים טובות וחדות מוגדרות כמחטים החודרות בקלות לעובר מבלי לאפשר לחומר להימלט לאחר ההזרקה. חדירה טובה ניכרת כאשר המחט מחליקה לתוך העובר, מה שגורם מעט מאוד חדירה של קרום העובר במהלך החדירה ולא דליפות חומר מן העובר לאחר המחט נסוגה. מחטים חדות וטובות מיוצרות באמצעות הגדרות משיכת מחט המייצרות מחט שמגיעה לנקודה עדינה(איור 1A). המחט משוך לא צריך להתחדד כי הוא ארוך מדי. אחרת, לומן המחט הופך צר מאוד עבור חלק גדול של להתחדד (איור 1B), וזה הופך להיות קשה לקבל את לחץ ההזרקה גבוה מספיק כדי לכפות את החומר דרך המחט. בפרוטוקול זה נעשה שימוש במחטים משופע. תהליך המשיכה והשיפוע של מחטים מתואר במוטי ובהארל19. במקרה של עוברי זבוב חול המתפתחים על פני תקופה ארוכה של זמן, זה קריטי במיוחד יש מחטים חדות למזער את הנזק לעובר, ובכך למנוע חומר דולף באתר ההזרקה. כאשר עובר דולף מעובר לאחר הזרקה, חומר זה הוא מדיום עשיר עבור עובש וצמיחה פטרייתית. בעוברים המתפתחים על פני תקופה קצרה יותר של זמן העובר יכול להתפתח ולבקע לפני העובש הופך לבעיה. יש להסיר את כל העוברים הדולפים בעליל לאחר ההזרקה.
במהלך הזריקות, חשוב להוסיף מים לפי הצורך על ידי הרטבת מכחול דק ונגיעה בו לנייר הסינון, חוזר לפי הצורך עד המניסקוס של מים הוא רק בבסיס העוברים. יש לציין תשומת לב ללחות יחסית ביום ההזרקה. בימים של לחות נמוכה, יהיה צורך להוסיף עוד מים. לאחר השלמת הזריקות, מעט מים נוספים מתווספים לנייר הסינון, כך שהכיסוי צף מעט, מה שמקל על ההסרה. לאחר הסרת העטיפה, ניתן למחוק את נייר המסנן עם עוברים מוזרקים, כך שנייר הסינון בקושי לח. לאחר מכן ניתן להעביר עוברים לסיר גבס לח לבקיעה באמצעות מברשת צבע עדינה. בשלב זה, העוברים שבריריים מאוד ולכן יש לבצע את התהליך בזהירות רבה. חשוב גם למנוע מהעוברים לגעת זה בזה כדי להיות מסוגלים להסיר עוברים מעופשים ולהגביל את התפשטות הזיהום הפטרייתי.
לאחר ההזרקה, העוברים המוזרקים G0 נשמרים על סירי גבס לפי נהלי גידול רגילים. עד שהם בוקעים, סירי עובר מוזרקים צריכים להיבדק פעם ביום כדי להסיר עוברים לא בריאים. איור 4A מציג את ציר הזמן הצפוי של גידול בודד G0 מיום הטלת הביצים והזרקתן לבגרות. איור 4B מציגדוגמאות לעוברים ב-G 0 שהם בריאים ויש לשמור עליהם; או פגום, מזוהם על ידי פטרייה, מיובש, או מעוות ויש להשליך אותו. G0 מוזרק אנשים הם כביכול פסיפס עבור אללים מוטנטים. יש לתכנן שיטה לזיהוי אללים מוטנטים פוטנציאליים, כגון PCR-assay של האזור המקיף את אתרי החיתוך הצפויים. איור 4C מציג דוגמה של PCR-assay מראה פסיפס G0 הפרט, הצגת מוצר PCR נוסף למוצר wt הצפוי, המייצג אלל מוטציה.
ברגע שהמבוגרים מופיעים, נקבות G0 המתפתחות מעוברים מוזרקים G0 מוצלבים עם זכרי wt, מותר להטיל ביצים, והם genotyped מאוחר יותר. רק הצינורות המכילים זבוב G0 מראה ראיות של מוטציה משיטת genotyping של בחירה נשמרים. הזבובים מהדורות הבאים (נקבות G1) מוצלבים עם זכרי wt או בנפרד בין אחים (מ- G2). צלבים אלה מותר להטיל ביצים ולאחר מכן genotyped על ידי שיטת הבחירה. הצעד האחרון חוזר על עצמו עד שמקבלים זכרים ונקבות מוטנטים הומוזיגיים, מה שמבסס קו מוטנטים הומוזיגי. באיור 5Aניתן ייצוג סכמטי של רצף הצלבים המתאים להקמת קו מוטנטים . איור 5B מציג דוגמה של PCR genotyping המאפשר זיהוי של צלב אח מוטנט הומוזיגי.
איור 1: מחטי מיקרו-ג'ינג'. א. מחט טובה. ב. מחט עם להתחדד קיצוני לא טוב לזריקות. לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.
איור 2: סקירה כללית של איסוף עוברים ומיקרומניפולציה (נתון זה הותאםמ-4). לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.
איור 3: הגדרת מיקרו-מיון. א. ייצוג סכמטי של הגדרת המיקרו-מיון. ב. תקריב של עובר מיושר למיקרו-לינקציה. לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.
איור 4: גידול וזיהוי של פסיפס G0 אנשים בוגרים. א. לוח זמנים צפוי ממיקרו-מיון עוברי לבגרות G0. ב. דוגמאות לעוברים נאים ורעים לאחר ההזרקה. C. GENOTYPING PCR של אדם אחד פסיפס G0 טרנספורמציה. לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.
איור 5: זיהוי ובידוד של מוטציות מעניינות. א. ייצוג סכמטי של האסטרטגיה הניסיונית לבידוד אללים מוטנטים ולהקמת מניות מוטנטים הומוזיגיים (איור מ-4). הצבע מייצג את נוכחותם של תאים הנושאים אללים מוטנטים, במצב הטרוזיגי (ורוד) או הומוזיגי (אדום). ב. דוגמה לאסטרטגיית סינון PCR עבור genotyping בודדים לגימות צלבים של זבובים חול. לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
אנו מציגים כאן שיטת מיקרו-אינג'ינג עובר שפותחה לאחרונה עבור mutagenesis ממוקד על ידי CRISPR / Cas9 בפליבוטומוס פאפטאסי חול זבובים. מיקרו-לינקציה של עוברים לשינוי גנטי של חרקים פותחה בדרוסופילה באמצע שנות ה-80 של21 וכיום נעשה בה שימוש שגרתי במגוון רחב של חרקים. שיטות אחרות להעברת חומרים לשינוי גנטי פותחו לשימוש חרקים, כגון ReMOT20,21,22,23 ו electroporation23. עם זאת, microinjection העובר היא כיום השיטה המגוונת והיעילה ביותר למסירת חומרים אלה. ReMOT הוא מבטיח מאוד כשיטת משלוח ויש לחקור לשימוש זבובים חול, בשל הקלות היחסית של זריקות למבוגרים לעומת microinjections העובר. עם זאת, עד כה ReMot לא שימש בהצלחה עבור CRISPR / Cas9 HDR או transgenesis טרנספוזון. למרות הטכניקה עבור microinjections העובר חרקים הוא בעצם זהה שפותחה בתחילה, עבור כל מין חדש עידונים של הטכניקות עשוי להיות נחוץ. הבדלים אלה בין המינים כוללים את הדפוס ומשך התפתחות העובר, מבנה העובר והסביבה שבה העובר מתפתח בדרך כלל. עוברים זבוב חול הם קטנים במיוחד (0.3-0.5 מ"מ ארוך ו 0.1- 0.15 מ"מ רוחב, המייצג בערך 1/3 מגודל של ביצה Drosophila 1). גודל מופחת זה מגדיל את הקושי בטיפול בביצים מבלי לפגוע בהן. רמת הלחות בכל שלב של הפרוטוקול צריכה להיות במעקב בזהירות רבה, שכן עוברי זבוב חול רגישים במיוחד להתייבשות. עם זאת, הם אינם מימיים ימותו אם שקועים לחלוטין במים לתקופה ממושכת. מיקרו-לינקציה של עובר דרוזופילה דורשת הזרקה בקצה האחורי של העובר. בגלל הצורה הסימטרית הקרובה של עוברי זבוב חול, קביעת קוטביות העובר קשה. לבסוף, בעוד פיתוח עובר זבוב חול ממשיך דומה Drosophila, הוא עושה זאת בקצב הרבה יותר איטי. העובר לבדו נמשך בין 6 ל -11 ימים, בהתאם למין זבוב החול, ואילו ביצי דרוזופילה בוקעות רק יום אחד לאחר הטלת הביצים. תאיזציה של ביצי Drosophila מתרחשת כשעתיים לאחר oviposition, ואילו עוברי זבוב חול להגיע לשלב זה קרוב 9 שעות לאחר oviposition. בהתחשב בהבדל זה בתזמון ההתפתחותי, הזריקות מכוונות למרכז העובר המתפתח זבוב חול בהנחה שפיתוח גרעינים בעובר הסינקיטיאלי ממוקם בסמוך למרכז העובר המתפתח בשלב מוקדם זה של ההתפתחות, ובכך מייתר את הצורך להבחין בין קוטביות העובר.
CRISPR/Cas9 יוצר הפסקות dsDNA בלוקוס גנומי נבחר. שברים דו-גדיליים אלה מתוקנים בתא על-ידי NHEJ או על-ידי HDR. השיטה שאנו מציגים כאן שימשה בעבר רק עבור mutagenesis מבוסס NHEJ, אשר יצר אירועי הכנסה / מחיקה קטנים, indels, המוביל frameshift ברצפי גנים, וכתוצאה מכך קודונים עצירה מוקדמת חלבון חסר כל התחומים הפונקציונליים4. חרקים גם להחזיק את המכונות הסלולר עבור dsDNA לשבור לתקן דרך HDR, אשר לאחר מכן ניתן לנתב מחדש כדי לעצב אסטרטגיות עריכת גנום מורכבות יותר. עריכת גנום CRISPR/Cas9 מבוססת HDR עדיין צריכה להיות מוגדרת לשימוש בזבובי חול, וצריכה לאפשר פיתוח של כתבי ביטוי ומוטנטים של ביטוי מותנה, בין שאר הבניינים.
הפיתוח של פרוטוקול microinjection זה פותח כעת את הדלת לשימוש בשיטות אחרות לשינוי הגנום, כגון CRISPR / Cas9 HDR, transgenesis טרנספוזון, מערכות ביטוי בינאריות כגון UAS / Gal4, ורקומבינציה ספציפית לאתר על ידי phiC31 או Cre /lox. הפיתוח של שיטות אחרות אלה ירחיב עוד יותר את ארגז הכלים לשינוי ביטוי גנים זבוב חול על ידי מתן מניפולציה גנומית מורכבת יותר. עם זאת, לפני שניתן יהיה צורך בשיטות אחרות אלה, יהיה צורך בזיהוי ובידוד אלמנטים של הרגולטור כדי להניע ביטוי של גנים שהוכנסו לזבובי חול, כמו גם סמנים של הכנסה ורכיבים אחרים של שיטות אלה, כגון מקדמים כדי להניע ביטוי של טרנספוסאזים ו recombinases.
לבסוף, עריכת הגנום חרקים שאינם מודל הפך עכשיו אפשרות, במיוחד בזכות המהפכה של CRISPR / Cas9 גילוי והסתגלות15,16. בחרקים, רוב טכניקות עריכת הגנום, למעט טכניקת ReMOT שפותחה לאחרונה, דורשות מיקרו-יין עוברי, צעד חיוני ותובעני מבחינה טכנית. אנו מקווים כי פרסום זה יסייע בהרחבת מגוון טכניקות שינוי ביטוי הגנים המותאמות לזבובי חול, ומוביל לתגליות חדשות על הביולוגיה שלהם, כמו גם יכולת וקטורית לטפילי לישמניה.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
ללא
Acknowledgments
המחברים מודים לוונסה מלדנר-הארל על הקריאה הביקורתית של כתב היד.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Black Filter Paper 4.25CM PK100 | VWR | 28342-012 | Cut into rectangles that are approximately 46 X 22mm. These are placed between the slide and the coverslip and act as a moist base layer for the embryos during injection. |
| Coverslips | Fisher Scientific | 12-543A | |
| Dissecting Microscope | Any brand | For aligning embryos | |
| Glass slides | Fisher Scientific | 12-550-A3 | Base layer of the microinjection set up Figure 2A |
| Insect cage | custom made or several commercial options | polycarbonate cage for adults holding and mating Lawyer, Phillip, Mireille Killick-Kendrick, Tobin Rowland, Edgar Rowton, and Petr Volf. “Laboratory Colonization and Mass Rearing of Phlebotomine Sand Flies (Diptera, Psychodidae).” Parasite 24. Accessed August 6, 2020. https://doi.org/10.1051/parasite/2017041. | |
| Larval food | custom made | a mix of rabbit chow and rabbit feces Lawyer, Phillip, Mireille Killick-Kendrick, Tobin Rowland, Edgar Rowton, and Petr Volf. “Laboratory Colonization and Mass Rearing of Phlebotomine Sand Flies (Diptera, Psychodidae).” Parasite 24. https://doi.org/10.1051/parasite/2017041. | |
| Microcaps 100 ml | Drummond | 1-000-1000 | Used to back fill microinjection needles |
| Mouth aspirator | John W. Hock Company | Model 612 | mouth aspirator with HEPA filter |
| Olympus SZX12 | Olympus Life Sciences | Microinjection microscope | |
| Ovipots | Nalge company | ovipots are made from 125-ml or 500-ml straigh-sided plolypropylene jars modified by drilling 2.5cm holes in the bottom and filled with 1cm of plaster of Paris. Lawyer, Phillip, Mireille Killick-Kendrick, Tobin Rowland, Edgar Rowton, and Petr Volf. “Laboratory Colonization and Mass Rearing of Phlebotomine Sand Flies (Diptera, Psychodidae).” Parasite 24. Accessed August 6, 2020. https://doi.org/10.1051/parasite/2017041. | |
| Paint Brush 6-0 | Any Art Supply Company | n/a | Used for aligning embryos |
| Propionic acid | Sigma-Aldrich | 402907 | antifungal agent |
| Standard Glass Capillaries | World Precision Instruments | 1B100-3 | Used for making microinjection needles |
| Trio-MPC100 Controller and MP845 Manipulator | Sutter Instruments | Microinjection Controller and Micromanipulator |
References
- Lawyer, P., Killick-Kendrick, M., Rowland, T., Rowton, E., Volf, P. Laboratory colonization and mass rearing of phlebotomine sand flies (Diptera, Psychodidae). Parasite. 24, 42 (2017).
- Pelletier, I., et al. Specific recognition of Leishmania major poly-beta-galactosyl epitopes by galectin-9: possible implication of galectin-9 in interaction between L. major and host cells. Journal Biological Chemistry. 278 (25), 22223-22230 (2003).
- Kamhawi, S., et al. A role for insect galectins in parasite survival. Cell. 119 (3), 329-341 (2004).
- Louradour, I., Ghosh, K., Inbar, E., Sacks, D. L. CRISPR/Cas9 Mutagenesis in Phlebotomus papatasi: the Immune Deficiency Pathway Impacts Vector Competence for Leishmania major. MBio. 10 (4), (2019).
- Xi, Z., Ramirez, J. L., Dimopoulos, G. The Aedes aegypti toll pathway controls dengue virus infection. PLoS Pathogens. 4 (7), 1000098 (2008).
- Ramirez, J. L., Dimopoulos, G. The Toll immune signaling pathway control conserved anti-dengue defenses across diverse Ae. aegypti strains and against multiple dengue virus serotypes. Development and Comparative Immunology. 34 (6), 625-629 (2010).
- Ramirez, J. L., et al. Reciprocal tripartite interactions between the Aedes aegypti midgut microbiota, innate immune system and dengue virus influences vector competence. PLoS Neglected Tropical Diseases. 6 (3), 1561 (2012).
- Hu, C., Aksoy, S. Innate immune responses regulate trypanosome parasite infection of the tsetse fly Glossina morsitans morsitans. Molecular Microbiology. 60 (5), 1194-1204 (2006).
- Meister, S., et al. Anopheles gambiae PGRPLC-mediated defense against bacteria modulates infections with malaria parasites. PLoS Pathogens. 5 (8), 1000542 (2009).
- Meister, S., et al. Immune signaling pathways regulating bacterial and malaria parasite infection of the mosquito Anopheles gambiae. Proceedings of the National Academy of Sciences U S A. 102 (32), 11420-11425 (2005).
- Telleria, E. L., et al. Caspar-like gene depletion reduces Leishmania infection in sand fly host Lutzomyia longipalpis. Journal of Biological Chemistry. 287 (16), 12985-12993 (2012).
- Sant'Anna, M. R., Alexander, B., Bates, P. A., Dillon, R. J. Gene silencing in phlebotomine sand flies: Xanthine dehydrogenase knock down by dsRNA microinjections. Insect Biochemistry and Molecular Biology. 38 (6), 652-660 (2008).
- Sant'anna, M. R., Diaz-Albiter, H., Mubaraki, M., Dillon, R. J., Bates, P. A. Inhibition of trypsin expression in Lutzomyia longipalpis using RNAi enhances the survival of Leishmania. Parasites and Vectors. 2 (1), 62 (2009).
- Diaz-Albiter, H., Mitford, R., Genta, F. A., Sant'Anna, M. R., Dillon, R. J. Reactive oxygen species scavenging by catalase is important for female Lutzomyia longipalpis fecundity and mortality. PLoS One. 6 (3), 17486 (2011).
- Barrangou, R., et al. CRISPR provides acquired resistance against viruses in prokaryotes. Science. 315 (5819), 1709-1712 (2007).
- Jinek, M., et al. A programmable dual-RNA-guided DNA endonuclease in adaptive bacterial immunity. Science. 337 (6096), 816-821 (2012).
- Pawelczak, K. S., Gavande, N. S., VanderVere-Carozza, P. S., Turchi, J. J. Modulating DNA Repair Pathways to Improve Precision Genome Engineering. ACS Chemical Biology. 13 (2), 389-396 (2018).
- Martin-Martin, I., Aryan, A., Meneses, C., Adelman, Z. N., Calvo, E. Optimization of sand fly embryo microinjection for gene editing by CRISPR/Cas9. PLoS Neglected Tropical Diseases. 12 (9), 0006769 (2018).
- Meuti, M., Harrell, R. Preparing and Injecting Embryos of Culex Mosquitoes to Generate Null Mutations Using CRISPR/Cas9. JoVE. (163), e61651 (2020).
- Chaverra-Rodriguez, D., et al. Targeted delivery of CRISPR-Cas9 ribonucleoprotein into arthropod ovaries for heritable germline gene editing. Nature Communications. 9 (1), 3008 (2018).
- Chaverra-Rodriguez, D., et al. Germline mutagenesis of Nasonia vitripennis through ovarian delivery of CRISPR-Cas9 ribonucleoprotein. Insect Molecular Biology. , (2020).
- Heu, C. C., McCullough, F. M., Luan, J., Rasgon, J. L. CRISPR-Cas9-Based Genome Editing in the Silverleaf Whitefly (Bemisia tabaci). CRISPR Journal. 3 (2), 89-96 (2020).
- Macias, V. M., et al. Cas9-Mediated Gene-Editing in the Malaria Mosquito Anopheles stephensi by ReMOT Control. Genes, Genomes and Genetics (Bethesda). 10 (4), 1353-1360 (2020).
