זבוב חול (פלבוטומוס פפטאסי) עובר מיקרו-אינג'קציה עבור CRISPR/Cas9 מוטגנזה

סיכום

פרוטוקול זה מפרט את השלבים של CRISPR / Cas9 mutagenesis ממוקד זבובי חול: אוסף עוברים, הזרקה, גידול חרקים, זיהוי, כמו גם מבחר של מוטציות של עניין.

תקציר

זבובי חול הם הווקטורים הטבעיים של מיני לישמניה, טפילי פרוטוזואן המייצרים קשת רחבה של תסמינים החל בנגעים עוריים ועד פתולוגיה קרבית. פענוח אופי האינטראקציות הווקטוריות/טפיליות הוא בעל חשיבות עליונה להבנה טובה יותר של שידור לישמניה למארחיהם. בין הפרמטרים השולטים ביכולת וקטור זבוב החול (כלומר היכולת שלהם לשאת ולהעביר פתוגנים), פרמטרים מהותיים לחרקים אלה הוצגו לשחק תפקיד מפתח. תגובת חיסון חרקים, למשל, משפיעה על יכולת וקטור זבוב חול לישמניה. המחקר של פרמטרים כאלה הוגבל על ידי היעדר שיטות של שינוי ביטוי גנים מותאם לשימוש באורגניזמים אלה שאינם מודל. הסרת רגולציה של גנים על ידי RNA מפריע קטן (siRNA) אפשרית, אך בנוסף להיותה מאתגרת מבחינה טכנית, ההשתקה מובילה לאובדן חלקי בלבד של תפקוד, שלא ניתן להעביר מדור לדור. mutagenesis ממוקד על ידי טכנולוגיית CRISPR / Cas9 הותאם לאחרונה זבוב חול פפטאסי Phlebotomus. טכניקה זו מובילה ליצירת מוטציות הניתנות להעברה במקום שנבחר במיוחד, ומאפשרת לחקור את הגנים המעניינים. מערכת CRISPR/Cas9 מסתמכת על אינדוקציה של הפסקות דנ"א דו-גדילי ממוקדות, שתוקנה מאוחר יותר על ידי הצטרפות קצה לא הומולוגית (NHEJ) או על ידי תיקון מונחה הומולוגיה (HDR). NHEJ מורכב מסגירה פשוטה של ההפסקה ולעתים קרובות מוביל לאירועי הוספה/מחיקה קטנים. לעומת זאת, HDR משתמש בנוכחות של מולקולת DNA תורמת שיתוף הומולוגיה עם ה-DNA היעד כתבנית לתיקון. כאן, אנו מציגים שיטת microinjection עובר זבוב חול עבור mutagenesis ממוקד על ידי CRISPR / Cas9 באמצעות NHEJ, שהיא טכניקת שינוי הגנום היחידה המותאמת וקטורים זבוב חול עד כה.

מבוא

מחלות המועברות על ידי וקטור מהוות איום מרכזי על בריאות הציבור באבולוציה מתמדת. מאות מינים וקטוריים הפרוסים על פני משפחות פילוגניות שונות מאוד (למשל, יתושים, קרציות, פרעושים) אחראים להעברת מספר עצום של פתוגנים מיקרוביאליים, וכתוצאה מכך יותר מ -700,000 מקרי מוות של בני אדם בשנה, על פי ארגון הבריאות העולמי. בין חרקים וקטוריים, זבובי חול פלבוטומין (דיפטרה, פסיכודידיה) מהווים קבוצה עצומה, עם 80 מינים וקטורים מוכחים המציגים תכונות פנוטיפיות מובהקות ויבולות וקטוריות שנמצאו באזורים גיאוגרפיים שונים. הם וקטורים עבור טפילי פרוטוזואן של הסוג לישמניה, גורם סביב 1.3 מיליון מקרים חדשים של לישמניאסים בין 20,000 ל 30,000 מקרי מוות בשנה. התוצאות הקליניות של לישמניאס מגוונות, ....

פרוטוקול

השימוש בעכברים כמקור דם להאכלת זבוב חול נעשה בהתאם להמלצות המדריך לטיפול ושימוש בחיות מעבדה של המכונים הלאומיים לבריאות (NIH). הפרוטוקול אושר על ידי ועדת הטיפול והשימוש בבעלי חיים של NIAID, NIH (מספר פרוטוקול LPD 68E). חסרי חוליות אינם מכוסים תחת הנחיות NIH.

1. הכנת מחט (איור 1)

1. משוך מחטים ושיפוע כמתואר ב Meuti והארל¹⁹. בקצרה, משוך מחטים על משיכת מיקרופיפט זכוכית דו-שלבית, באמצעות נימי זכוכית בורוסיליקט.
2. לחדד את המחטים על ידי שיפוע רטוב על שיפוע micropipette, באמצעות אבן עדינה נוספת.

2. אוסף עוברים ומיקרומניפולציה (....

תוצאות

פרוטוקול המיקרו-injection CRISPR/Cas9 המתואר כאן ליצירת מוטנטים של זבוב חול הוקם בפרסום הקודם⁴. גישה זו יצרה mutagenesis יעיל מאוד, כמו 11 מתוך 540 אנשים שרדו את ההליך, מתוכם 9 היו מוטנטים. בעת תכנון מדריכים למוטציה CRISPR/Cas9, צעד ראשון קריטי הוא לרצף את האזור סביב האזור שיש לפלח. התבנית לריצוף צריכה להיות מהזן שישמש כמקור לעוברים להזרקה. מסוכן להסתמך רק על רצפי גנום שפורסמו כדי לעצב מדריכים. זה לא יוצא דופן שיש הבדלים בין הגנום שפורסם ורצפי עיצוב מראש מדריך. במקרים מסוימים, מדריכים שעוצבו מרצף .......

דיון

אנו מציגים כאן שיטת מיקרו-אינג'ינג עובר שפותחה לאחרונה עבור mutagenesis ממוקד על ידי CRISPR / Cas9 בפליבוטומוס פאפטאסי חול זבובים. מיקרו-לינקציה של עוברים לשינוי גנטי של חרקים פותחה בדרוסופילה באמצע שנות ה-80 של²¹ וכיום נעשה בה שימוש שגרתי במגוון רחב של חרקים. שיטות אחרות להעברת חומרים לשינוי גנטי פותחו לשימוש חרקים, כגון ReMOT^20,21,22,23 ו electroporat.......

חומרים

רשימת החומרים שנעשה בהם שימוש במאמר זה

שם	חברה	מספר קטלוג	הערות
נייר סינון שחור 4.25 ס"מ PK100	VWR	28342-012	חתוך למלבנים בגודל של כ-46 X 22 מ"מ. אלה ממוקמים בין השקופית לכיסוי ומשמשים כשכבת בסיס לחה לעוברים במהלך ההזרקה.
Coverslips	Fisher Scientific	12-543A
ניתוח מיקרוסקופ	כל מותג		ליישור עוברים
שקופיות זכוכית	Fisher Scientific	12-550-A3	שכבת בסיס של המיקרו-הזרקה הוקמה איור 2A
כלוב חרקים	בהתאמה אישית או מספר אפשרויות מסחריות		כלוב פוליקרבונט למבוגרים אוחזים ומזדווגים עורך דין, פיליפ, מיריי קיליק-קנדריק, טובין רולנד, אדגר רוטון ופטר וולף. “ קולוניזציה במעבדה וגידול המוני של זבובי חול פלבוטומינים (Diptera, Psychodidae)." טפיל 24. גישה ל-6 באוגוסט 2020. https://doi.org/10.1051/parasite/2017041.
מזון זחלים	בהתאמה אישית הכין		תערובת של צ'או ארנב וצואת ארנב עורך דין, פיליפ, מיריי קיליק-קנדריק, טובין רולנד, אדגר רוטון ופטר וולף. " קולוניזציה במעבדה וגידול המוני של זבובי חול פלבוטומינים (Diptera, Psychodidae)." טפיל 24. https://doi.org/10.1051/parasite/2017041.
מיקרוקאפ 100 מ"ל	דראמונד	1-000-1000	משמש למילוי חוזר של מחטי מיקרו-הזרקה
שואב פה	ג'ון וו. הוק חברת	דגם 612	שואב פה עם מסנן HEPA
אולימפוס SZX12	אולימפוס מדעי		מיקרוסקופ מיקרוסקופ הזרקה
חברת Ovipots	Nalge		ביצים עשויות מצנצנות פלוליפרופילן של 125 מ"ל או 500 מ"ל ששונו על ידי קידוח חורים של 2.5 ס"מ בתחתית וממולאות בטיח של 1 ס"מ של פריז. עורך דין, פיליפ, מיריי קיליק-קנדריק, טובין רולנד, אדגר רוטון ופטר וולף. “ קולוניזציה במעבדה וגידול המוני של זבובי חול פלבוטומינים (Diptera, Psychodidae)." טפיל 24. גישה ל-6 באוגוסט 2020. https://doi.org/10.1051/parasite/2017041.
מברשת צבע 6-0	כל חברת אספקת אמנות	n/a	משמש ליישור עוברים
חומצה פרופיונית	סיגמא-אולדריץ'	402907	חומר אנטי פטרייתי
נימי זכוכית סטנדרטיים	מכשירי דיוק עולמיים	1B100-3	משמש לייצור מחטי מיקרו-הזרקה
בקר Trio-MPC100 ומניפולטור MP845	מכשירי סאטר		בקר מיקרו-הזרקה ו מיקרומניפולטור

החיים