Summary
Denne protokollen beskriver trinnene i CRISPR/Cas9 målrettet mutagenese i sandfluer: embryosamling, injeksjon, insektoppdrett og identifisering samt utvalg av mutasjoner av interesse.
Abstract
Sandfluer er de naturlige vektorene for Leishmania-arter, protozoanske parasitter som produserer et bredt spekter av symptomer som spenner fra kutane lesjoner til visceral patologi. Dechiffrering av arten av vektor / parasitt interaksjoner er av største betydning for bedre forståelse av Leishmania overføring til sine verter. Blant parametrene som kontrollerer sandfluevektorkompetansen (dvs. deres evne til å bære og overføre patogener), ble parametere iboende for disse insektene vist seg å spille en nøkkelrolle. Insekt immunrespons, for eksempel, påvirker sandfluevektorkompetanse til Leishmania. Studien av slike parametere har vært begrenset av mangelen på metoder for genuttrykksmodifisering tilpasset bruk i disse ikke-modellorganismer. Genderegulering ved liten forstyrrende RNA (siRNA) er mulig, men i tillegg til å være teknisk utfordrende, fører silencingen til bare et delvis tap av funksjon, som ikke kan overføres fra generasjon til generasjon. Målrettet mutagenese av CRISPR/Cas9-teknologi ble nylig tilpasset Phlebotomus papatasi sandflue. Denne teknikken fører til generering av overførbare mutasjoner i et spesielt valgt locus, slik at man kan studere gener av interesse. CRISPR/Cas9-systemet er avhengig av induksjon av målrettede DNA-pauser med dobbel tråd, senere reparert av enten Non-Homologous End Joining (NHEJ) eller av Homology Driven Repair (HDR). NHEJ består av en enkel lukking av pausen og fører ofte til små innsettings-/slettingshendelser. I motsetning bruker HDR tilstedeværelsen av et donor DNA-molekyl som deler homologi med målet DNA som en mal for reparasjon. Her presenterer vi en mikroinjeksjonsmetode for sandflue embryo for målrettet mutagenese av CRISPR/Cas9 ved hjelp av NHEJ, som er den eneste genommodifikasjonsteknikken tilpasset sandfluevektorer til dags dato.
Introduction
Vektorbårne sykdommer er en stor folkehelsetrussel i konstant evolusjon. Hundrevis av vektorarter spredt over svært distinkte fylogene familier (f.eks. mygg, flått, lopper) er ansvarlige for overføringen av et stort antall mikrobielle patogener, noe som resulterer i mer enn 700.000 menneskelige dødsfall i året, ifølge Verdens helseorganisasjon. Blant vektorinsekter utgjør phlebotomine sandfluer (Diptera, Psychodidae) en stor gruppe, med 80 påviste vektorarter som viser distinkte fenotypiske egenskaper og vektorkapasiteter som finnes i forskjellige geografiske regioner. De er vektorer for protozoanske parasitter av slekten Leishmania, forårsaker rundt 1,3 millioner nye tilfeller av Leishmaniases og mellom 20.000 og 30.000 dødsfall i året. Leishmaniases kliniske utfall er varierte, med symptomer som spenner fra selvbegrensende kutane lesjoner til visceral formidling som er dødelig i fravær av behandling.
Sandfluer er strengt jordbaserte insekter. Deres livssyklus, relativt lang sammenlignet med andre Diptera, varer opptil tre måneder, avhengig av forskjellige parametere som temperatur, fuktighet og ernæring. Den består av ett embryonalt stadium (6 til 11 dager), fire larvestadier (som varer totalt 23 til 25 dager) og en puppetrinn (9 til 10 dager) etterfulgt av metamorfose og deretter voksen alder. Sandfluer krever et fuktig og varmt miljø for oppdrett. Både menn og kvinner spiser på sukker, oppnådd i naturen fra blomsternektarer. Bare kvinner er blodmatere, da de krever proteiner hentet fra blodmelet for eggproduksjon1.
Et viktig forskningsfokus er å identifisere arten av vektor/parasitt interaksjoner som fører til utvikling av overførbare infeksjoner. Som med andre vektorinsekter har parametere iboende til sandfluer vist seg å påvirke deres vektorkompetanse, som er definert som deres evne til å bære og overføre patogener til vertene. For eksempel kan uttrykket av galectins av Phlebotomus papatasi sand fly midgut celler, som fungerer som reseptorer som gjenkjenner parasittoverflatekomponenter, direkte påvirke deres vektorkompetanse for Leishmania major2,3. Insekt immunresponsveien, Immunmangel (IMD), er også avgjørende for Phlebotomus papatasi sandflue vektor kompetanse for Leishmania major4. En kritisk rolle for vektor insekt immunrespons veier i å kontrollere overføringen av smittsomme patogener har blitt rapportert på samme måte i Aedes aegypti mygg5,6,7, i tsetse fly Glossina morsitans8, og i Anopheles gambiae mygg9,10.
Studier avsandflue/ Leishmania interaksjoner har vært begrenset av mangel på genuttrykk modifikasjonsmetoder tilpasset for bruk i disse insektene. Bare genderegulering ved liten forstyrrende RNA (siRNA) hadde blitt utført11,12,13,14 inntil nylig. Teknikken, begrenset av dødeligheten forbundet med mikroinjeksjon av voksne kvinner, fører bare til et delvis funksjonstap, som ikke kan overføres fra generasjon til generasjon.
CRISPR/Cas9-teknologi har revolusjonert funksjonell genomisk forskning i ikke-modellorganismer som sandfluer. Modifisert fra det adaptive immunforsvaret i prokaryoter for forsvar mot bakteriofager15,16, crispr cas9-systemet har blitt raskt tilpasset som et genomredigeringsverktøy for overlegne eukaryote organismer, inkludert insekter. Prinsippet om CRISPR/Cas9 målrettet genomredigering er basert på komplementariteten til en enkelt guide RNA (sgRNA) til et spesifikt genomisk locus. Cas9-kjernen binder seg til sgRNA og skaper et dobbeltstrenget DNA (dsDNA) brudd i det genomiske DNA-et der sgRNA forbinder med sin komplementære sekvens. Cas9-sgRNA-komplekset styres til målsekvensen med 17 til 20 komplementære baser i sgRNA til det valgte locus, dsDNA-pausen kan deretter repareres av to uavhengige veier: nonhomologous end joining (NHEJ) eller homology-rettet reparasjon (HDR)17. NHEJ reparasjon innebærer en enkel lukking av pausen, men fører ofte til små innsetting / sletting hendelser. DNA-reparasjon gjennom HDR bruker en donor DNA-molekyl som deler homologi med målet DNA som mal for reparasjon. Insekter har begge maskinsaker.
CRISPR/Cas9-teknologi kan generere mutasjoner i et valgt locus, gjennom NHEJ-reparasjonsveien; eller for mer komplekse genomredigeringsstrategier, for eksempel knock-ins eller expression-reportere, gjennom HDR-banen med en passende donormal. I sandfluer ble null mutante alleler av immunresponsfaktoren Relish generert gjennom NHEJ-mediert CRISPR i Phlebotomus papatasi4. Sandflueembryoer ble også injisert i en annen studie med en CRISPR/Cas9-blanding rettet mot genkodingen Yellow. Likevel ble ingen voksne som bærer mutasjonen produsert18. Vi beskriver her en detaljert metode for sandflue målrettet mutagenese av NHEJ-mediert CRISPR / Cas9, med et spesielt fokus på embryomikroinjeksjonen, et kritisk trinn i protokollen.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Bruk av mus som kilde til blod til sandfluefôring ble utført i henhold til anbefalingene i Veiledningen for pleie og bruk av laboratoriedyr ved National Institutes of Health (NIH). Protokollen ble godkjent av Dyrepleie- og brukskomiteen i NIAID, NIH (protokollnummer LPD 68E). Hvirvelløse dyr dekkes ikke av NIH-retningslinjer.
1. Nålpreparat (Figur 1)
- Trekk nåler og skråkant som beskrevet i Meuti og Harrell19. Trekk kort nåler på en dual-stage glass mikropipette puller, ved hjelp av borosilikat glass kapillærer.
- Slip nålene ved våt skråkant på mikropipettens skråkant, ved hjelp av en ekstra fin stein.
2. Embryosamling og mikromanipulering (Figur 2)
- Fem dager før injeksjonsdagen flyr blodfôrsand kvinner som utføres rutinemessig for kolonivedlikehold. For detaljer om sandfluekolonier oppdrettsprosedyrer og nødvendig materiale, se Advokat et al.1 Vedlikehold insekter i inkubatorer ved 70% fuktighet og 26 °C under hele utviklingen.
- En dag etter blodfôring, fange blodmatede kvinner i grupper på 100-150 i gipspotter med en sideport. Vedlikehold hunnene ved å mate dem med sukkeroppløsning (30% sukrose - nok volum til å suge en liten bomullsdott) som er vanlig for kolonivedlikehold.
- På dag 2-3 etter blodfôring, IKKE fukt gipspottene. Å holde hunnene på et tørt substrat vil forhindre for tidlig egglegging, siden kvinner foretrekker å legge egg på et fuktig miljø.
- På dag 5 etter blodfôring, utfør embryosamling, mikromanipulering og mikroinjeksjon. Introduser et fuktig filterpapir i eggleggingskammeret. Nylagde embryoer har ikke en fullt utviklet kor og virker hvite. Bruk svart filterpapir under prosedyren for å lette visualiseringen av de hvite embryoene.
- Overfør en liten gruppe kvinner fra gipspotten til eggleggingskammeret gjennom sideportene ved hjelp av en munnaspirator. Tilstedeværelsen av et fuktig substrat (filterpapiret) induserer kvinner til oviposit.
- Etter 30-60 min, hent forsiktig filterpapiret med nylagte embryoer fra kammeret. Oppbevar filterpapiret og embryoene i en Petri-tallerken i opptil 3 timer. I løpet av denne tiden må du regelmessig vurdere fuktighetsnivået på filterpapiret for å sikre at det forblir fuktig. I løpet av denne tiden gjentar du trinn 2,4 til 2,6 med nye grupper av kvinner og samler så mange embryoer som mulig.
- Forbered mikroskopsklier til injeksjonen: Samle eggene manuelt en etter en med en veldig fin pensel og overfør dem forsiktig til et annet stykke fuktig svart filterpapir plassert på et mikroskopsklie toppet med en glassdekslerlip.
- Tilsett vann til filterpapiret, nok til å holde embryoene fuktige, men ikke få dem til å flyte bort fra dekslene eller bli sugd under dekslene. Still opp embryoene mot dekslene. Dekslene fungerer som en backstop som hindrer eggene i å rulle bort under injeksjonen.
3. Embryoinjeksjoner (Figur 3)
- Start injeksjoner 2,5 til 3 timer etter starten av eggsamlingen. Utfør injeksjoner ved romtemperatur og luftfuktighet i omgivelseslaboratoriet.
- Pass på at de justerte embryoene har nok vann slik at de holdes fuktige.
MERK: Det er kritisk at embryoene holdes fuktige under injeksjoner. Hvis de ikke er fuktige under injeksjonsprosessen, blir injeksjoner vanskelige fordi nålen har problemer med å piercing embryoet. Riktig mengde vann er punktet der embryoene har en menisk av vann rundt seg, men dekslene flyter ikke på toppen av vannet, noe som får embryoene til å presse under dekslene. Det er viktig å overvåke mengden vann rundt embryoene under injeksjoner. Tilsett vann etter behov for å holde embryoene fuktige. - Tilsett vann forsiktig ved å fukte en børste med vann og overføre vannet til baksiden av filterpapiret. Å legge til vann på denne måten gjør at vann kan legges på en langsom og kontrollert måte, slik at akkurat nok legges til for å holde embryoene fuktige. For mye vann kan føre til at embryoene flyter ut av justering, noe som gjør det vanskelig å injisere embryoene.
- Rygglastinjeksjon blandes inn i mikroinjeksjonsnålen. Tilsett ca. 0,5 til 1 μL injeksjonsblanding i kanylen ved hjelp av et håndtegnet borosilikatnålfyller, gellastepipetspisser kan også brukes. Injeksjonsblandingen består av en eller flere guide RNA (80 ng/μL hver) designet for å målrette mot et spesifikt locus blandet med kommersielt rekombinant Cas9-protein (300 ng/μL).
- Start med injeksjonstrykket ved 30 psi, trykk på injeksjonsutløseren for å utvise luft ut av nålens spiss. Dette vil tvinge injeksjonsblandingen til spissen av nålen slik at injeksjonsblandingen kan strømme. På dette punktet, sakte øke hold / konstant trykk til injeksjonsmaterialet begynner å strømme, deretter tilbake av hold / konstant trykk slik at det er like under punktet av injeksjon blandingen strømmer fra nålen. Den inngjerdede innstillingen skal levere akkurat nok injeksjonsmateriale slik at en liten mengde materiale kan ses for å komme inn i embryoet.
MERK: Injeksjon av sandflueembryoer under halokarbonolje som ligner på andre protokoller som brukes for Drosophila og mygg ble først testet, men overlevelsesprosenten for disse injeksjonene var svært lav. Overlevelsen ble forbedret ved å bytte til injeksjoner på fuktig filterpapir som beskrevet ovenfor. - Sett nålen inn i siden av embryoet. Bruk dekslene bak embryoet som en backstop som vil hjelpe nålen til å pierce embryoet. Lever en liten mengde injeksjonsblanding inn i embryoet før du forsiktig fjerner nålen.
- Umiddelbart etter at nålen er fjernet, trykker du på injektoren for å fjerne eventuelt etterfylt materiale fra nålespissen. Dette vil bidra til å forhindre at nålen tetter seg.
- Fortsett til neste embryo. Mellom hver injeksjon må du sørge for at filterpapiret er fuktig og at kanylen ikke er tilstoppet.
- Når alle embryoer er injisert, tell antall injiserte embryoer for å holde en løpende oversikt.
- Fjern dekslene ved å tilsette vann til filterpapiret slik at dekslene flyter. På dette tidspunktet bruker du en sonde (treapplikatorpinne med insektpinne limt til spissen) for å holde filterpapiret på plass mens en finger brukes til å trekke dekslene bort fra de injiserte embryoene.
- Flekk bort overflødig vann fra filterpapiret når dekslene er fjernet.
4. Oppdrett etter injeksjon (G0) (Figur 4)
- Overfør filterpapiret med embryoene på toppen av flere lag fuktig filterpapir plassert i en Petri-tallerken for å opprettholde fuktighet. Hold embryoene her i løpet av tiden som trengs for å injisere andre embryoer. Embryoer kan holdes i maksimalt 3 timer som dette. Etter injeksjon blir de sakte brune.
- Når alle embryoer er injisert, må du manuelt overføre dem til tidligere fuktede gipspotter i liten størrelse. Ikke legg for mange embryoer i hver gryte og hold avstand mellom dem, for å unngå mulig soppforurensning mellom individer. Dekk pottene med en skjerm og lagre dem som vanligvis vil bli gjort for sandfluekoloniegg, opprettholdt i inkubatorer ved 70% fuktighet og 26 ° C, under hele utviklingen.
- På dag 1 etter injeksjon, fjern alle skadede og døde embryoer med pensel. Tilsett 100 μL 0,5% propionsyre, dråpe for dråpe, på gipspottene som inneholder de injiserte embryoene for å begrense soppforurensning. Frigjøring av cytoplasma fra embryoer skadet under injeksjonsprosessen er spesielt gunstig for soppvekst.
- Sjekk gipspottene hver dag og fjern eventuelle dårlige eller døde embryoer. Hvis sopp er til stede, fjern alle infiserte embryoer og legg til noen dråper 0,5% propionsyre.
- Larver klekkes mellom dag 8 og 12 etter injeksjon. To ganger om dagen, overfør de nyoppdagede larver til nye gipspotter, i grupper på 5-10 maksimum. Tilsett en liten mengde mat og sjekk maten 2-3 ganger i uken.
- Overvåk nøye mengden larvmat, da for mye øker risikoen for soppforurensning. Sandflue larver overlever bedre i grupper, men de kan være kannibalistiske hvis det ikke er nok mat.
- Når larvene popper, skille dem etter kjønn for å opprettholde hunnene som jomfruer. Hvis det er mange overlevende, kast mennene og hold bare hunnene.
MERK: Både menn og kvinner kan bære og overføre mutasjoner. Men som kvinner må holdes jomfruer før de skal krysses, er det lettere å bruke bare G0 injiserte kvinner for å unngå å måtte skille wt insekter etter kjønn. G0-hannene kan holdes som en sikkerhetskopi hvis antall voksne overlevende er lavt og i dette tilfellet vil bli parret med sorterte wt jomfruhunner.
5. Utvelgelse og screening av mutante alleler (Figur 5)
- Massekryss G0 kvinner med wt menn i et bur. Blod-mate dem helt, som ville bli gjort for normal koloni vedlikehold.
- En dag etter blodfôring, overfør hver G0 kvinne med 2-3 wt menn til individuelle gipsrør ved hjelp av en munnaspirator. Fôr fluene med sukker på en liten bomullskule endret hver dag og bruk en sprøyte med vann for å sikre at gipsfuktigheten er egnet for egglegging.
- Etter at G0-hunnene har lagt egg (tilsvarende G1), samle kroppene sine i individuelle, kommenterte Eppendorf-rør for senere genotyping. Opprettholde embryoer som vanligvis gjort for wt kolonier.
- Trekk ut DNA-et fra G0-hunnene ved valgmetoden.
- Screen DNA for tilstedeværelse av mutasjoner, for eksempel ved å designe en PCR-analyse ved hjelp av primere rundt regionen med forventede CRISPR-kutt.
- Hold bare G1 embryoer lagt av G0 kvinner som viser tegn på transformasjon. Når disse G1 embryoene utvikler seg til pupper, skille dem etter kjønn og holde bare hunnene. Kryss G1 hunnene fra samme G0 kvinnelige til wt menn, blod-mate dem, deretter overføre i små grupper på 2-3 kvinner og 4-5 menn i små størrelse beholdere.
MERK: Alle G1 individer har en sjanse til å bære en unik mutasjon, så hvis antall overlevende individer ikke er for høyt, er det bedre å krysse G1 kvinner individuelt med wt menn. Tilfellet av flere kvinner som bærer en annen mutasjon tilstede i samme rør er sjelden, men kan forekomme. Hvis et slikt tilfelle observeres etter genotyping, bør G2 avkomhunnene deretter parres individuelt for å wt menn. Denne paringsordningen unngår muligheten for flere mutasjoner i avkommet. - Etter egglegging samler du G1 kvinnelige kropper og screener dem for mutasjoner. Hold bare rørene der minst en kvinne viste tegn på mutasjon.
- For senere generasjoner gjør enkeltpar i kors. Etter egglegging, screen foreldre for tilstedeværelse av mutasjon. Gjenta ved hver generasjon til begge foreldrene er homozygote for samme mutasjon. Når de er identifisert, vil de være grunnleggerne av en homozygot mutantbestand.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
CRISPR/Cas9 mikroinjeksjonsprotokollen som er beskrevet her for å generere sandfluemutanter, ble etablert i en tidligere publikasjon4. Denne tilnærmingen produserte svært effektiv mutagenese, da 11 av 540 individer overlevde prosedyren, hvorav 9 var mutante. Når du designer guider for CRISPR/Cas9-mutasjon, er et kritisk første skritt å sekvensere regionen rundt området som skal målrettes. Malen for sekvensering bør være fra stammen som skal brukes som en kilde til embryoer til injeksjon. Det er risikabelt å bare stole på publiserte genomsekvenser for å designe guider. Det er ikke uvanlig å ha forskjeller mellom publiserte genom- og pre-guide designsekvenser. I noen tilfeller er guider designet fra publisert genomsekvens ikke til stede når regionen rundt målgenet er sekvensert (Harrell, personlig observasjon). I tillegg kan sekvensen inkludere Single Nucleotide Polymorphisms (SNPs) som kan forveksles med ekte CRISPR-redigeringer under genotyping. Derfor er det viktig å bekrefte sekvensen for målområdet for at resten av protokollen skal lykkes.
Vellykket genetisk modifikasjon av insekter ved mikroinjeksjon avhenger hovedsakelig av to kritiske aspekter: levering av materialer (protein, plasmid eller mRNA) på riktig tidspunkt i utvikling med så lite skade på embryoene som mulig; og oppdrett av robuste, sunne insekter som vil overleve prosedyren og produsere avkom. Den første fasen av denne prosedyren, beskrevet i figur 2, starter med blodfôring av hunnene fra wt-kolonien og fortsetter til embryosamling og mikroinjeksjon fem dager senere. Den andre fasen består av å oppdra de injiserte embryoene til voksen alder, noe som gjør de riktige kryssene og identifiserer og isolerer mutasjoner av interesse.
Embryoer til injeksjon samles i 30 - 60 min slik at den relative alderen i timer etter oviposisjon kan bestemmes. Embryoer får da utvikle seg i 3 timer før injeksjonsstart. Dette tidsvinduet for insektutvikling gjør at embryoene kan overleve injeksjonene. Etter denne aldringsperioden samles embryoene på en forberedt injeksjonssklie og embryoene rulles på plass mot en dekslekant ved hjelp av en fin børste. Den endelige konfigurasjonen vises i figur 3A. Det er viktig å fukte filterpapiret nok slik at en menisk dannes på dekslekanten der embryoene sitter. For mye vann og embryoene vil bli skjøvet bort fra dekslene. For lite vil føre til at embryoene trekkes under dekslene. Embryoene må holdes fuktige, ellers blir embryomembranene vanskelige å injisere. Coverlipkanten fungerer som et bakstopp, slik at nålen kan trenge inn i embryoene når den presses mot kanten. Det er kombinasjonen av en skarp nål og en backstop som gjør at nålen kan trenge jevnt inn.
Som med de mest vellykkede mikroinjeksjonsprotokollene, er en god mikroinjeksjonsnål som passer til embryoene som injiseres viktig. Gode, skarpe nåler er definert som nåler som lett trenger inn i embryoet uten å la materialet unnslippe etter injeksjon. God penetrasjon er tydelig når nålen glir inn i embryoet, noe som forårsaker lite eller ingen innrykk av embryomembranen under penetrasjon og ingen materielle lekkasjer fra embryoet etter at nålen er trukket tilbake. Gode skarpe nåler produseres ved hjelp av nåletrekkerinnstillinger som produserer en nål som kommer til et fint punkt (Figur 1A). Den trukket nålen bør ikke ha en kon som er for lang. Ellers blir lumen på nålen svært smal for en stor del av konen (Figur 1B), og det blir vanskelig å få injeksjonstrykket høyt nok til å tvinge materialet gjennom nålen. I denne protokollen ble skråkantede nåler brukt. Prosessen for å trekke og skråstille nåler er beskrevet i Meuti og Harrell19. Når det gjelder sandflueembryoer som utvikler seg over lang tid, er det spesielt viktig å ha skarpe nåler som minimerer skade på embryoet, og dermed forhindrer materiale i å lekke på injeksjonsstedet. Når embryoplasma lekker fra et embryo etter injeksjon, er dette materialet et rikt medium for mugg og soppvekst. I embryoer som utvikler seg over en kortere periode kan embryoet utvikle seg og klekkes før formen blir et problem. Eventuelle embryoer som er synlig lekkende embryoplasma etter injeksjon bør fjernes.
Under injeksjoner er det viktig å legge til vann etter behov ved å fukte en fin pensel og berøre den til filterpapiret, gjenta etter behov til menisken av vann er bare ved bunnen av embryoene. Oppmerksomhet på relativ fuktighet på injeksjonsdagen må noterres. På dager med lav luftfuktighet må mer vann tilsettes. Når injeksjonene er fullført, legges litt ekstra vann til filterpapiret slik at dekslene flyter litt, noe som gjør det lettere å fjerne. Når dekslene er fjernet, kan filterpapiret med injiserte embryoer bli blottet, slik at filterpapiret bare er knapt fuktig. Embryoer kan deretter overføres til en fuktig gipspotte for klekking ved hjelp av en fin pensel. På dette stadiet er embryoer svært skjøre, så prosessen må utføres veldig nøye. Det er også viktig å forhindre at embryoene berører hverandre for å kunne fjerne moldy embryoer og begrense spredningen av soppforurensning.
Etter injeksjon holdes G0 injiserte embryoer på gipspotter i henhold til normale oppdrettsprosedyrer. Inntil de klekkes, bør injiserte embryopotter kontrolleres en gang om dagen for å fjerne usunne embryoer. Figur 4A presenterer forventet tidslinje for G0 individuell oppdrett fra dagen for egglegging og injeksjon til voksen alder. Figur 4B viser eksempler på G0 embryoer som er sunne og bør beholdes; eller skadet, forurenset av sopp, tørket eller deformert og skal kastes. G0 injiserte individer er angivelig mosaikk for mutante alleler. En metode for å identifisere potensielle mutant alleler bør utformes, for eksempel en PCR-analyse av regionen rundt de forventede skjærestedene. Figur 4C presenterer et eksempel på en PCR-analyse som viser en mosaikk G0-person, som viser et PCR-produkt i tillegg til det forventede wt-produktet, som representerer et mutant allel.
Når de voksne kommer frem, krysses G0-hunnene som utvikler seg fra G0 injiserte embryoer med wt menn, får lov til å legge egg og blir genotypet senere. Bare rørene som inneholder en G0-flue som viser tegn på mutasjon fra den valgte genotypingsmetoden beholdes. Fluene fra de neste generasjonene (G1 kvinner) krysses enten med wt menn eller individuelt mellom søsken (fra G2). Disse kryssene har lov til å legge egg og deretter genotypes ved valgmetoden. Det siste trinnet gjentas til homozygote mutante menn og kvinner oppnås, og etablerer en homozygot mutantlinje. En skjematisk representasjon av riktig rekkefølge av kryss for å etablere en mutantlinje er angitt i figur 5A. Figur 5B viser et eksempel på en genotyping PCR som tillater identifisering av et homozygott mutantsøskenkors.
Figur 1: Mikroinjeksjonsnåler. A. God nål. B. Nål med ekstrem kon ikke bra for injeksjoner. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
Figur 2: Oversikt over embryosamling og mikromanipulering (Dette tallet var tilpasset fra4). Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
Figur 3: Mikroinjeksjonsoppsett. A. Skjematisk representasjon av mikroinjeksjonsoppsettet. B. Nærbilde av justert embryo for mikroinjeksjon. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
Figur 4: Oppdrett og identifisering av mosaikk G0 voksne individer. A. Forventet tidsplan fra embryomikroinjeksjon til G0 voksen alder. B. Eksempler på gode og dårlige embryoer etter injeksjon. C. PCR genotyping av en forvandlet G0 mosaikk individ. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
Figur 5: Identifisering og isolering av mutasjoner av interesse. A. Skjematisk representasjon av den eksperimentelle strategien for å isolere mutante alleler og etablere homozygote mutantbestander (figur fra 4). Fargen representerer tilstedeværelsen av celler som bærer mutante alleler, ved heterzygot (rosa) eller homozygot (rød) tilstand. B. Eksempel på en PCR-screeningstrategi for genotyping av individuelle sibbling kryss av sandfluer. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Vi presenterer her en nylig utviklet embryomikroinjeksjonsmetode for målrettet mutagenese av CRISPR / Cas9 i Phlebotomus papatasi sandfluer. Embryomikroinjeksjon for insektgenetiske modifikasjoner ble utviklet i Drosophila på midten av 1980-tallet21 og brukes nå rutinemessig i et bredt spekter av insekter. Andre metoder for levering av genetiske modifikasjonsmaterialer er utviklet for bruk i insekter, for eksempel ReMOT20,21,22,23 og elektroporasjon23. Embryomikroinjeksjon er imidlertid for tiden den mest allsidige og effektive metoden for levering av disse materialene. ReMOT er ekstremt lovende som leveringsmetode og bør utforskes for bruk i sandfluer, på grunn av den relative brukervennligheten av voksne injeksjoner sammenlignet med embryomikroinjeksjoner. ReMot har imidlertid så langt ikke blitt brukt til CRISPR/Cas9 HDR eller transposontransgenese. Selv om teknikken for embryomikroinjeksjoner i insekter i utgangspunktet er den samme som opprinnelig utviklet, kan det være nødvendig med for hver nye artsforbedringer av teknikkene. Disse artsforskjellene inkluderer mønsteret og varigheten av embryoutvikling, embryostruktur og miljøet der embryoet normalt utvikler seg. Sandflueembryoer er spesielt små (0,3-0,5 mm lange og 0,1-0,15 mm brede, noe som representerer omtrent 1/3 av størrelsen på Drosophila egg1). Denne reduserte størrelsen øker vanskeligheten med å håndtere eggene uten å skade dem. Fuktighetsnivået på hvert trinn i protokollen må overvåkes veldig nøye, da sandflueembryoer er spesielt følsomme for uttørking. Imidlertid er de ikke akvatiske og vil dø hvis de er helt nedsenket i vann i en lengre periode. Drosophila embryomikroinjeksjon krever injeksjon i den bakre enden av embryoet. På grunn av den nær symmetriske formen av sandflue embryoer, er det vanskelig å bestemme embryopolaritet. Til slutt, mens sandflue embryoutvikling fortsetter som Drosophila, gjør den det med mye langsommere hastighet. Embryogenese alene varer mellom 6 og 11 dager, avhengig av sandfluearter, mens Drosophila egg klekker bare en dag etter egglegging. Drosophila egg cellinering skjer ca 2 timer etter oviposisjon, mens sand fly embryoer når dette stadiet på proksimalt 9 timer etter oviposisjon. Gitt denne forskjellen i utviklingstid, er injeksjoner rettet mot sentrum av det utviklende sandflueembryoet på antagelsen om at utviklende kjerner i det synytiale embryoet ligger nær sentrum av det utviklende embryoet på dette tidlige utviklingsstadiet, og dermed motvirker behovet for å skille embryopolaritet.
CRISPR/Cas9 skaper dsDNA-pauser ved et valgt genomisk locus. Disse dobbeltstrengspausene repareres i cellen enten av NHEJ eller HDR. Metoden vi presenterer her ble tidligere bare brukt for NHEJ-basert mutagenese, som genererte små innsettings- / slettingshendelser, indels, noe som førte til en frameshift i gensekvenser, noe som resulterte i for tidlig stopp codons og et protein som mangler alle funksjonelle domener4. Insekter har også det cellulære maskineriet for dsDNA-reparasjon gjennom HDR, som deretter kan omruting for å designe mer komplekse genomredigeringsstrategier. HDR-basert CRISPR/Cas9 genomredigering må fortsatt settes opp for bruk i sandfluer, og bør tillate utvikling av blant annet reportere av uttrykk og betingede uttrykksmutanter.
Utviklingen av denne mikroinjeksjonsprotokollen åpner nå døren for å bruke andre genommodifiseringsmetoder, for eksempel CRISPR / Cas9 HDR, transposontransgenese, binære uttrykkssystemer som UAS / Gal4, og stedsspesifikk rekombinasjon av phiC31 eller Cre /lox. Utviklingen av disse andre metodene vil ytterligere utvide verktøykassen for endring av sandfluegenuttrykk ved å muliggjøre mer kompleks genomisk manipulering. Men før disse andre metodene kan brukes, vil det være nødvendig med arbeid som identifiserer og isolerer regulatorelementer for å drive uttrykk for innsatte gener i sandfluer, samt markører for innsetting og andre komponenter i disse metodene, for eksempel promotorer for å drive uttrykk for transposaser og rekombinasjoner.
Endelig har genomredigering i ikke-modellinsekter nå blitt en mulighet, spesielt takket være revolusjonen av CRISPR / Cas9-oppdagelse og tilpasning15,16. I insekter krever de fleste genomredigeringsteknikker, til det bemerkelsesverdige unntaket av den nyutviklede ReMOT-teknikken, embryomikroinjeksjon, et skritt både avgjørende og teknisk krevende. Vi håper at denne publikasjonen vil bidra til å utvide spekteret av genuttrykksmodifiseringsteknikker tilpasset sandfluer, og føre til nye funn på deres biologi samt vektorkompetanse til Leishmania parasitter.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
ingen
Acknowledgments
Forfatterne takker Vanessa Meldener-Harrell for kritisk lesning av manuskriptet.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Black Filter Paper 4.25CM PK100 | VWR | 28342-012 | Cut into rectangles that are approximately 46 X 22mm. These are placed between the slide and the coverslip and act as a moist base layer for the embryos during injection. |
| Coverslips | Fisher Scientific | 12-543A | |
| Dissecting Microscope | Any brand | For aligning embryos | |
| Glass slides | Fisher Scientific | 12-550-A3 | Base layer of the microinjection set up Figure 2A |
| Insect cage | custom made or several commercial options | polycarbonate cage for adults holding and mating Lawyer, Phillip, Mireille Killick-Kendrick, Tobin Rowland, Edgar Rowton, and Petr Volf. “Laboratory Colonization and Mass Rearing of Phlebotomine Sand Flies (Diptera, Psychodidae).” Parasite 24. Accessed August 6, 2020. https://doi.org/10.1051/parasite/2017041. | |
| Larval food | custom made | a mix of rabbit chow and rabbit feces Lawyer, Phillip, Mireille Killick-Kendrick, Tobin Rowland, Edgar Rowton, and Petr Volf. “Laboratory Colonization and Mass Rearing of Phlebotomine Sand Flies (Diptera, Psychodidae).” Parasite 24. https://doi.org/10.1051/parasite/2017041. | |
| Microcaps 100 ml | Drummond | 1-000-1000 | Used to back fill microinjection needles |
| Mouth aspirator | John W. Hock Company | Model 612 | mouth aspirator with HEPA filter |
| Olympus SZX12 | Olympus Life Sciences | Microinjection microscope | |
| Ovipots | Nalge company | ovipots are made from 125-ml or 500-ml straigh-sided plolypropylene jars modified by drilling 2.5cm holes in the bottom and filled with 1cm of plaster of Paris. Lawyer, Phillip, Mireille Killick-Kendrick, Tobin Rowland, Edgar Rowton, and Petr Volf. “Laboratory Colonization and Mass Rearing of Phlebotomine Sand Flies (Diptera, Psychodidae).” Parasite 24. Accessed August 6, 2020. https://doi.org/10.1051/parasite/2017041. | |
| Paint Brush 6-0 | Any Art Supply Company | n/a | Used for aligning embryos |
| Propionic acid | Sigma-Aldrich | 402907 | antifungal agent |
| Standard Glass Capillaries | World Precision Instruments | 1B100-3 | Used for making microinjection needles |
| Trio-MPC100 Controller and MP845 Manipulator | Sutter Instruments | Microinjection Controller and Micromanipulator |
References
- Lawyer, P., Killick-Kendrick, M., Rowland, T., Rowton, E., Volf, P. Laboratory colonization and mass rearing of phlebotomine sand flies (Diptera, Psychodidae). Parasite. 24, 42 (2017).
- Pelletier, I., et al. Specific recognition of Leishmania major poly-beta-galactosyl epitopes by galectin-9: possible implication of galectin-9 in interaction between L. major and host cells. Journal Biological Chemistry. 278 (25), 22223-22230 (2003).
- Kamhawi, S., et al. A role for insect galectins in parasite survival. Cell. 119 (3), 329-341 (2004).
- Louradour, I., Ghosh, K., Inbar, E., Sacks, D. L. CRISPR/Cas9 Mutagenesis in Phlebotomus papatasi: the Immune Deficiency Pathway Impacts Vector Competence for Leishmania major. MBio. 10 (4), (2019).
- Xi, Z., Ramirez, J. L., Dimopoulos, G. The Aedes aegypti toll pathway controls dengue virus infection. PLoS Pathogens. 4 (7), 1000098 (2008).
- Ramirez, J. L., Dimopoulos, G. The Toll immune signaling pathway control conserved anti-dengue defenses across diverse Ae. aegypti strains and against multiple dengue virus serotypes. Development and Comparative Immunology. 34 (6), 625-629 (2010).
- Ramirez, J. L., et al. Reciprocal tripartite interactions between the Aedes aegypti midgut microbiota, innate immune system and dengue virus influences vector competence. PLoS Neglected Tropical Diseases. 6 (3), 1561 (2012).
- Hu, C., Aksoy, S. Innate immune responses regulate trypanosome parasite infection of the tsetse fly Glossina morsitans morsitans. Molecular Microbiology. 60 (5), 1194-1204 (2006).
- Meister, S., et al. Anopheles gambiae PGRPLC-mediated defense against bacteria modulates infections with malaria parasites. PLoS Pathogens. 5 (8), 1000542 (2009).
- Meister, S., et al. Immune signaling pathways regulating bacterial and malaria parasite infection of the mosquito Anopheles gambiae. Proceedings of the National Academy of Sciences U S A. 102 (32), 11420-11425 (2005).
- Telleria, E. L., et al. Caspar-like gene depletion reduces Leishmania infection in sand fly host Lutzomyia longipalpis. Journal of Biological Chemistry. 287 (16), 12985-12993 (2012).
- Sant'Anna, M. R., Alexander, B., Bates, P. A., Dillon, R. J. Gene silencing in phlebotomine sand flies: Xanthine dehydrogenase knock down by dsRNA microinjections. Insect Biochemistry and Molecular Biology. 38 (6), 652-660 (2008).
- Sant'anna, M. R., Diaz-Albiter, H., Mubaraki, M., Dillon, R. J., Bates, P. A. Inhibition of trypsin expression in Lutzomyia longipalpis using RNAi enhances the survival of Leishmania. Parasites and Vectors. 2 (1), 62 (2009).
- Diaz-Albiter, H., Mitford, R., Genta, F. A., Sant'Anna, M. R., Dillon, R. J. Reactive oxygen species scavenging by catalase is important for female Lutzomyia longipalpis fecundity and mortality. PLoS One. 6 (3), 17486 (2011).
- Barrangou, R., et al. CRISPR provides acquired resistance against viruses in prokaryotes. Science. 315 (5819), 1709-1712 (2007).
- Jinek, M., et al. A programmable dual-RNA-guided DNA endonuclease in adaptive bacterial immunity. Science. 337 (6096), 816-821 (2012).
- Pawelczak, K. S., Gavande, N. S., VanderVere-Carozza, P. S., Turchi, J. J. Modulating DNA Repair Pathways to Improve Precision Genome Engineering. ACS Chemical Biology. 13 (2), 389-396 (2018).
- Martin-Martin, I., Aryan, A., Meneses, C., Adelman, Z. N., Calvo, E. Optimization of sand fly embryo microinjection for gene editing by CRISPR/Cas9. PLoS Neglected Tropical Diseases. 12 (9), 0006769 (2018).
- Meuti, M., Harrell, R. Preparing and Injecting Embryos of Culex Mosquitoes to Generate Null Mutations Using CRISPR/Cas9. JoVE. (163), e61651 (2020).
- Chaverra-Rodriguez, D., et al. Targeted delivery of CRISPR-Cas9 ribonucleoprotein into arthropod ovaries for heritable germline gene editing. Nature Communications. 9 (1), 3008 (2018).
- Chaverra-Rodriguez, D., et al. Germline mutagenesis of Nasonia vitripennis through ovarian delivery of CRISPR-Cas9 ribonucleoprotein. Insect Molecular Biology. , (2020).
- Heu, C. C., McCullough, F. M., Luan, J., Rasgon, J. L. CRISPR-Cas9-Based Genome Editing in the Silverleaf Whitefly (Bemisia tabaci). CRISPR Journal. 3 (2), 89-96 (2020).
- Macias, V. M., et al. Cas9-Mediated Gene-Editing in the Malaria Mosquito Anopheles stephensi by ReMOT Control. Genes, Genomes and Genetics (Bethesda). 10 (4), 1353-1360 (2020).
