Summary
Dieses Protokoll beschreibt die Schritte der gezielten Mutagenese von CRISPR/Cas9 bei Sandfliegen: Embryoentnahme, Injektion, Insektenzucht und -identifikation sowie Auswahl von Mutationen von Interesse.
Abstract
Sandfliegen sind die natürlichen Vektoren für Leishmanien-Arten, Protozoen-Parasiten, die ein breites Spektrum von Symptomen produzieren, die von Hautläsionen bis hin zu viszeraler Pathologie reichen. Die Entschlüsselung der Art der Vektor-Parasiten-Wechselwirkungen ist von primärer Bedeutung für ein besseres Verständnis der Leishmanie-Übertragung auf ihre Wirte. Unter den Parametern, die die Sandfliegenvektorkompetenz steuern (d.h. ihre Fähigkeit, Krankheitserreger zu transportieren und zu übertragen), spielten parameter, die diesen Insekten innewohnen, eine Schlüsselrolle. Die Insektenimmunantwort zum Beispiel beeinflusst die Sandfliegenvektorkompetenz auf Leishmania. Die Untersuchung solcher Parameter wurde durch das Fehlen von Methoden zur Veränderung der Genexpression eingeschränkt, die für die Verwendung in diesen Nichtmodellorganismen angepasst wurden. Eine Gendownregulation durch kleine störende RNA (siRNA) ist möglich, aber neben der technischen Herausforderung führt das Silencing nur zu einem partiellen Funktionsverlust, der nicht von Generation zu Generation übertragen werden kann. Die gezielte Mutagenese durch CRISPR/Cas9-Technologie wurde kürzlich an die Phlebotomus papatasi Sandfliege angepasst. Diese Technik führt zur Erzeugung übertragbarer Mutationen in einem speziell ausgewählten Ort, der es ermöglicht, die genesweisend zu untersuchen. Das CRISPR/Cas9-System basiert auf der Induktion gezielter Doppelstrang-DNA-Breaks, die später entweder durch Non-Homologous End Joining (NHEJ) oder durch Homology Driven Repair (HDR) repariert werden. NHEJ besteht aus einem einfachen Abschluss der Pause und führt häufig zu kleinen Einfüge-/Löschereignissen. Im Gegensatz dazu verwendet HDR das Vorhandensein eines Spender-DNA-Moleküls, das Homologie mit der Ziel-DNA teilt, als Vorlage für die Reparatur. Hier präsentieren wir eine Sandfliegen-Embryo-Mikroinjektionsmethode zur gezielten Mutagenese von CRISPR/Cas9 mit NHEJ, der bisher einzigen Genommodifikationstechnik, die an Sandfliegenvektoren angepasst ist.
Introduction
Vektorübertragene Krankheiten stellen in ständiger Weiterentwicklung eine große Bedrohung für die öffentliche Gesundheit dar. Hunderte von Vektorarten, die sich über sehr unterschiedliche phylogene Familien (z. B. Mücken, Zecken, Flöhe) verteilen, sind für die Übertragung einer großen Anzahl von mikrobiellen Krankheitserregern verantwortlich, was nach Angaben der Weltgesundheitsorganisation zu mehr als 700.000 Todesfällen pro Mensch pro Jahr führt. Unter den Vektorinsekten bilden Phlebotomin-Sandfliegen (Diptera, Psychodidae) eine große Gruppe, mit 80 bewährten Vektorarten, die unterschiedliche phänotypische Merkmale und vektorielle Fähigkeiten aufweisen, die in verschiedenen geographischen Regionen zu finden sind. Sie sind Vektoren für die protozoischen Parasiten der Gattung Leishmania, verursacht etwa 1,3 Millionen neue Fälle von Leishmaniosen und zwischen 20.000 und 30.000 Todesfälle pro Jahr. Leishmaniose klinische Ergebnisse sind vielfältig, mit Symptomen, die von selbstbegrenzenden hautenden Läsionen bis hin zu viszeraler Verbreitung reichen, die in Ermangelung einer Behandlung tödlich ist.
Sandfliegen sind streng terrestrische Insekten. Ihr Lebenszyklus, relativ lang im Vergleich zu anderen Diptera, dauert bis zu drei Monate, abhängig von verschiedenen Parametern wie Temperatur, Feuchtigkeit, und Ernährung. Es besteht aus einem embryonalen Stadium (6 bis 11 Tage), vier Larvenstadien (insgesamt 23 bis 25 Tage) und einem Pupalstadium (9 bis 10 Tage) gefolgt von Metamorphose und dann Erwachsenwerden. Sandfliegen benötigen eine feuchte und warme Umgebung für die Aufzucht. Sowohl Männchen als auch Weibchen ernähren sich von Zucker, der in freier Wildbahn aus Blütennektaren gewonnen wird. Nur Weibchen sind Blutfütterer, da sie Proteine benötigen, die aus der Blutmahlzeit für die Eiproduktion gewonnen werden1.
Ein wichtiger Forschungsschwerpunkt ist die Identifizierung der Art der Vektor-Parasiten-Wechselwirkungen, die zur Entwicklung übertragbarer Infektionen führen. Wie bei anderen Vektorinsekten haben Parameter, die Sandfliegen innewohnen, gezeigt, dass sie ihre Vektorkompetenz beeinflussen, was als ihre Fähigkeit definiert ist, Krankheitserreger zu tragen und auf ihre Wirte zu übertragen. Zum Beispiel kann die Expression von Galektinen durch die Phlebotomus papatasi Sandfliegen-Mitteldarmzellen, die als Rezeptoren fungieren, die Parasitenoberflächenkomponenten erkennen, ihre Vektorkompetenz für Leishmania major2,3direkt beeinflussen. Der Immunantwortweg von Insekten, Immundeficiency (IMD), ist auch entscheidend für die Phlebotomus papatasi Sandfliegenvektor-Kompetenz für Leishmania major4. Eine entscheidende Rolle für Vektorinsekten Immunantwort Bahnen bei der Kontrolle ihrer Übertragung von infektiösen Krankheitserregern wurde ähnlich berichtet in Aedes aegypti Mücken5,6,7, in der Tsetse Fly Glossina morsitans8, und in Anopheles gambiae Mücken9,10.
Studien über Sandfliegen/Leishmanie-Wechselwirkungen wurden durch den Mangel an Methoden zur Modifikation der Genexpression, die für den Einsatz in diesen Insekten angepasst wurden, eingeschränkt. Bis vor kurzem wurdennur 11,12,13,14 durch kleine interferierende RNA (siRNA) durchgeführt. Die Technik, begrenzt durch die Mortalität im Zusammenhang mit der Mikroinjektion von erwachsenen Frauen, führt nur zu einem teilweisen Verlust der Funktion, die nicht von Generation zu Generation übertragen werden kann.
Die CRISPR/Cas9-Technologie hat die funktionelle Genomforschung bei Nicht-Modellorganismen wie Sandfliegen revolutioniert. Modifiziert vom adaptiven Immunsystem in Prokaryoten zur Abwehr von Bakteriophagen15,16, wurde das CRISPR Cas9-System schnell als Genom-Editing-Tool für überlegene eukaryotische Organismen, einschließlich Insekten, angepasst. Das Prinzip der gezielten Genombearbeitung von CRISPR/Cas9 basiert auf der Komplementarität einer einzelnen Führungs-RNA (sgRNA) zu einem bestimmten genomischen Ort. Die Cas9-Nuklease bindet an die sgRNA und erzeugt einen Doppelstrang-DNA-Bruch (dsDNA) in der genomischen DNA, bei dem die sgRNA mit ihrer komplementären Sequenz assoziiert. Der Cas9-sgRNA-Komplex wird durch 17 bis 20 komplementäre Basen in der sgRNA zum gewählten Ort zur Zielsequenz geführt, der dsDNA-Bruch kann dann durch zwei unabhängige Wege repariert werden: nichthomologe Endverbindung (NHEJ) oder homologiegesteuerte Reparatur (HDR)17. Die NHEJ-Reparatur beinhaltet einen einfachen Abschluss der Unterbrechung, führt aber häufig zu kleinen Einfüge-/Löschereignissen. DNA-Reparatur durch HDR verwendet ein Spender-DNA-Molekül, das Homologie mit der Ziel-DNA teilt, als Vorlage für die Reparatur. Insekten besitzen beide Maschinen.
Die CRISPR/Cas9-Technologie kann Mutationen in einem ausgewählten Ort über den NHEJ-Reparaturweg erzeugen; oder für komplexere Genom-Editing-Strategien, wie Knock-Ins oder Ausdrucksreporter, durch den HDR-Pfad mit einer geeigneten Spendervorlage. Bei Sandfliegen wurden null mutierte Allele des Immunantwortfaktors Relish durch NHEJ-vermittelte CRISPR in Phlebotomus papatasi4erzeugt. Sandfliegen-Embryonen wurden auch in einer anderen Studie mit einem CRISPR/Cas9-Mix injiziert, der auf das Gen abzielt, das Yellow kodiert. Dennoch wurden keine Erwachsenen mit der Mutationproduziert 18. Wir beschreiben hier eine detaillierte Methode der Sandfliegengezielten Mutagenese durch NHEJ-vermittelte CRISPR/Cas9, mit einem besonderen Fokus auf die Embryo-Mikroinjektion, ein kritischer Schritt des Protokolls.
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Protocol
Die Verwendung von Mäusen als Blutquelle für die Sandfliegenfütterung erfolgte in strikter Übereinstimmung mit den Empfehlungen des Leitfadens für die Pflege und Verwendung von Labortieren der National Institutes of Health (NIH). Das Protokoll wurde vom Animal Care and Use Committee des NIAID, NIH (Protokollnummer LPD 68E) genehmigt. Wirbellose fallen nicht unter die NIH-Richtlinien.
1. Nadelpräparation (Abbildung 1)
- Ziehen Sie Nadeln und Abschrägung, wie in Meuti und Harrell19beschrieben. Kurz, ziehen Sie Nadeln auf einem zweistufigen Glas Mikropipette Puller, mit Borosilikat Glas Kapillaren.
- Schärfen Sie die Nadeln durch nasses Abschrägen auf dem Micropipette-Abschräger mit einem extra feinen Stein.
2. Embryo-Sammlung und Mikromanipulation (Abbildung 2)
- Fünf Tage vor dem Tag der Injektion, Blut-Feed-Sand fliegen Weibchen wie routinemäßig für die Pflege der Kolonie durchgeführt. Einzelheiten zu Sandfliegenkolonien und benötigtem Material finden Sie unter Lawyer et al.1 Pflegen Sie die Insekten in Brutkästen bei 70% Luftfeuchtigkeit und 26 °C während ihrer gesamten Entwicklung.
- Eines Tages nach der Blutfütterung, fangen blutgefütterte Weibchen von Gruppen von 100-150 in Gipstöpfen mit einem Seitenport. Pflegen Sie die Weibchen, indem Sie sie mit Zuckerlösung (30% Saccharose – genug Volumen, um eine kleine Baumwollkugel zu tränken) füttern, was für die Pflege der Kolonie üblich ist.
- An Tag 2-3 nach der Blutfütterung, befeuchten Sie NICHT die Gipstöpfe. Die Weibchen auf einem trockenen Substrat zu halten, verhindert eine vorzeitige Eiablage, da Weibchen es vorziehen, Eier auf eine feuchte Umgebung zu legen.
- Führen Sie am 5. Tag nach der Blutfütterung die Embryoentnahme, Mikromanipulation und Mikroinjektion durch. Führen Sie ein feuchtes Filterpapier in die Eiablagekammer ein. Frisch verlegte Embryonen haben keine voll entwickelte Choreographie und wirken weiß. Verwenden Sie während des Verfahrens schwarzes Filterpapier, um die Visualisierung der weißen Embryonen zu erleichtern.
- Übertragen Sie eine kleine Gruppe von Weibchen aus dem Gipstopf in die Ei-Laying-Kammer durch die Seitenöffnungen mit einem Mundsauger. Das Vorhandensein eines feuchten Substrats (das Filterpapier) induziert Weibchen zu Oviposit.
- Nach 30-60 min das Filterpapier mit neu verlegten Embryonen vorsichtig aus der Kammer holen. Das Filterpapier und die Embryonen bis zu 3 Stunden in einer Petrischale aufbewahren. Bewerten Sie während dieser Zeit regelmäßig den Feuchtigkeitsgehalt des Filterpapiers, um sicherzustellen, dass es feucht bleibt. Wiederholen Sie während dieser Zeit die Schritte 2.4 bis 2.6 mit neuen Gruppen von Weibchen und sammeln Sie so viele Embryonen wie möglich.
- Mikroskopdias für die Injektion vorbereiten: Die Eier nacheinander mit einem sehr feinen Pinsel nacheinander sammeln und vorsichtig auf ein anderes Stück feuchtes schwarzes Filterpapier übertragen, das auf einem Mikroskopschlitten mit einem Glasdeckel platziert ist.
- Fügen Sie Wasser in das Filterpapier, genug, um die Embryonen feucht zu halten, aber nicht dazu führen, dass sie weg von der Abdeckung rutschen oder unter dem Deckschein gesaugt werden. Richten Sie die Embryonen gegen den Deckzettel aus. Der Deckelschlupf dient als Backstop, der verhindert, dass die Eier während der Injektion wegrollen.
3. Embryo-Injektionen (Abbildung 3)
- Beginnen Sie die Injektionen 2,5 bis 3 Stunden nach Beginn der Eiabfuhr. Führen Sie Injektionen bei Raumtemperatur und Umgebungsfeuchtigkeit im Labor durch.
- Stellen Sie sicher, dass die ausgerichteten Embryonen genügend Wasser haben, damit sie feucht gehalten werden.
HINWEIS: Es ist wichtig, dass die Embryonen während der Injektionen feucht gehalten werden. Wenn sie während des Injektionsprozesses nicht feucht sind, werden Injektionen schwierig, weil die Nadel Probleme hat, den Embryo zu durchbohren. Die richtige Wassermenge ist der Punkt, an dem die Embryonen einen Meniskus wasserumlaufen, aber der Deckelrutsch schwebt nicht auf dem Wasser, wodurch die Embryonen unter den Deckelrutschen schieben. Es ist wichtig, die Wassermenge um die Embryonen während der Injektionen zu überwachen. Fügen Sie Wasser nach Bedarf hinzu, um die Embryonen feucht zu halten. - Fügen Sie Wasser sorgfältig hinzu, indem Sie eine Bürste mit Wasser benetzen und das Wasser an das hintere Ende des Filterpapiers übertragen. Das Hinzufügen von Wasser auf diese Weise ermöglicht es, Wasser in einer langsamen und kontrollierten Weise hinzugefügt werden, so dass gerade genug hinzugefügt wird, um die Embryonen feucht zu halten. Zu viel Wasser kann dazu führen, dass die Embryonen aus der Ausrichtung schweben, was es schwierig macht, die Embryonen zu injizieren.
- Rücklastinjektion in die Mikroinjektionsnadel mischen. Fügen Sie mit einem handgezeichneten Borosilikatnadelfüller ca. 0,5 bis 1 l Injektionsmischung in die Nadel ein, Gel-Ladepipettenspitzen können ebenfalls verwendet werden. Der Injektionsmix besteht aus einer oder mehreren Führungs-RNA (jeweils 80 ng/l), die auf einen bestimmten Ort abzielt, der mit kommerziellem rekombinantem Cas9-Protein (300 ng/l) gemischt wird.
- Beginnend mit dem Injektionsdruck bei 30 psi, drücken Sie den Injektionsauslöser, um Luft aus der Spitze der Nadel zu vertreiben. Dadurch wird die Injektionsmischung an die Spitze der Nadel zwingen, so dass die Injektionsmischung fließen kann. An diesem Punkt, langsam erhöhen Sie den Halte-/Konstantdruck, bis das Injektionsmaterial zu fließen beginnt, und dann wieder vom Halte-/Konstantdruck, so dass er sich knapp unter dem Punkt der Injektionsmischung befindet, die aus der Nadel fließt. Die gated Einstellung sollte gerade genug Injektionsmaterial liefern, so dass eine kleine Menge an Material gesehen werden kann, um in den Embryo zu gelangen.
HINWEIS: Die Injektion von Sandfliegenembryonen unter Halocarbonöl ähnlich wie andere Protokolle, die für Drosophila und Mücken verwendet wurden, wurde ursprünglich getestet, aber der Überlebensprozentsatz für diese Injektionen war sehr gering. Das Überleben wurde durch die Umstellung auf Injektionen auf feuchtem Filterpapier wie oben beschrieben verbessert. - Setzen Sie die Nadel in die Seite des Embryos ein. Verwenden Sie den Deckelhinterrutsch hinter dem Embryo als Backstop, der der Nadel hilft, den Embryo zu durchbohren. Geben Sie eine kleine Menge Injektionsmischung in den Embryo, bevor Sie die Nadel vorsichtig entfernen.
- Drücken Sie unmittelbar nach dem Entfernen der Nadel den Injektor, um das aufgefüllte Material von der Nadelspitze zu entfernen. Dies wird helfen, zu verhindern, dass die Nadel verstopft.
- Fahren Sie mit dem nächsten Embryo fort. Zwischen jeder Injektion stellen Sie sicher, dass das Filterpapier feucht ist und die Nadel nicht verstopft ist.
- Sobald alle Embryonen injiziert wurden, zählen Sie die Anzahl der injizierten Embryonen, um eine laufende Zählung zu halten.
- Entfernen Sie den Deckelschlupf, indem Sie dem Filterpapier Wasser hinzufügen, damit der Coverslip schwimmt. Verwenden Sie an dieser Stelle eine Sonde (Holzapplikator-Stick mit Anstecknadel an der Spitze) um das Filterpapier an Ort und Stelle zu halten, während ein Finger verwendet wird, um den Deckelrutsch von den injizierten Embryonen wegzuziehen.
- Überschüssiges Wasser aus dem Filterpapier wegblasen, sobald der Deckelschlupf entfernt wurde.
4. Post-Injection-Aufzucht (G0) (Abbildung 4)
- Übertragen Sie das Filterpapier mit den Embryonen auf mehrere Schichten feuchten Filterpapiers, das in eine Petrischale gelegt wird, um die Feuchtigkeit aufrechtzuerhalten. Bewahren Sie die Embryonen hier während der Zeit auf, die für die Injektion anderer Embryonen benötigt wird. Embryonen können maximal 3 Stunden lang gehalten werden. Nach der Injektion werden sie langsam braun.
- Sobald alle Embryonen injiziert wurden, übertragen Sie sie manuell auf zuvor befeuchtete kleine Gipstöpfe. Legen Sie nicht zu viele Embryonen in jeden Topf und halten Sie Denabstand zwischen ihnen, um eine mögliche Pilzkontamination zwischen Individuen zu vermeiden. Bedecken Sie die Töpfe mit einem Bildschirm und lagern Sie sie, wie es typischerweise für Sandfliegenkolonie-Eier, die in Brutkästen bei 70% Luftfeuchtigkeit und 26 °C gehalten werden, während ihrer gesamten Entwicklung durchgeführt würde.
- Entfernen Sie am ersten Tag nach der Injektion alle beschädigten und toten Embryonen mit einem Pinsel. Fügen Sie 100 l 0,5% Propionsäure, Tropfen für Tropfen, auf die Gipstöpfe mit den injizierten Embryonen, um die Pilzkontamination zu begrenzen. Die Freisetzung von Zytoplasma von Embryonen, die während des Injektionsprozesses geschädigt wurden, ist besonders günstig für das Pilzwachstum.
- Überprüfen Sie die Gipstöpfe jeden Tag und entfernen Sie alle schlechten oder toten Embryonen. Wenn Pilz vorhanden ist, entfernen Sie alle infizierten Embryonen und fügen Sie ein paar Tropfen von 0,5% Propionsäure hinzu.
- Larven schlüpfen zwischen Tag 8 und 12 nach der Injektion. Zweimal täglich die neu entstandenen Larven auf neue Gipstöpfe übertragen, in Gruppen von maximal 5-10. Fügen Sie eine kleine Menge Ankost hinzu und überprüfen Sie das Essen 2-3 mal pro Woche.
- Überwachen Sie sorgfältig die Menge an Larvenfutter, da zu viel das Risiko einer Pilzkontamination erhöht. Sandfliegenlarven überleben besser in Gruppen, aber sie können kannibalistisch sein, wenn es nicht genug Nahrung gibt.
- Wenn die Larven verpupate, trennen Sie sie nach Geschlecht, um die Weibchen als Jungfrauen zu erhalten. Wenn es viele Überlebende gibt, entsorgen Sie die Männchen und halten Sie nur die Weibchen.
HINWEIS: Sowohl Männchen als auch Weibchen können Mutationen tragen und übertragen. Da Weibchen jedoch Jungfrauen gehalten werden müssen, bevor sie gekreuzt werden sollen, ist es einfacher, nur die G0 injizierten Weibchen zu verwenden, um zu vermeiden, dass wt Insekten durch Geschlecht getrennt werden müssen. Die G0 Männchen können als Backup gehalten werden, wenn die Anzahl der erwachsenen Überlebenden gering ist und in diesem Fall mit sortierten wt jungfrauen Weibchen gepaart werden.
5. Auswahl und Screening von mutierten Allelen (Abbildung 5)
- Massenüberquerung der G0 Weibchen mit Wt-Männchen in einem Käfig. Blutfüttern Sie sie ganz, wie es für die normale Pflege der Kolonie nen würde.
- Eines Tages nach der Blutfütterung jedes G0 Weibchen mit 2-3 Gew.-Männchen mit einem Mundsauger in einzelne Gipsröhren übertragen. Füttern Sie die Fliegen mit Zucker auf einer kleinen Baumwollkugel, die jeden Tag gewechselt wird, und verwenden Sie eine Spritze Wasser, um sicherzustellen, dass die Putzfeuchtigkeit für die Eiablage geeignet ist.
- Nachdem die G0-Weibchen Eier gelegt haben (entsprechend G1), sammeln ihre Körper einzeln, beschreibte Eppendorfer Röhren zur späteren Genotypisierung. Pflegen Sie die Embryonen, wie sie normalerweise für Wt-Kolonien durchgeführt werden.
- Extrahieren Sie die DNA aus den G0 Weibchen nach der Methode der Wahl.
- Überprüfen Sie die DNA auf das Vorhandensein von Mutationen, z. B. durch die Entwicklung eines PCR-Assays mit Primern, die die Region der erwarteten CRISPR-Schnitte umgeben.
- Bewahren Sie nur die G1-Embryonen auf, die von G0-Weibchen gelegt wurden und Anzeichen einer Transformation zeigen. Wenn sich diese G1-Embryonen zu Pupas entwickeln, trennen Sie sie nach Geschlecht und halten nur die Weibchen. Kreuzen Sie die G1 Weibchen von der gleichen G0 Weibchen zu Wt Männchen, Blut füttern sie, dann in kleinen Gruppen von 2-3 Weibchen und 4-5 Männchen in kleine Behälter übertragen.
HINWEIS: Alle G1 Individuen haben eine Chance, eine einzigartige Mutation zu tragen, also wenn die Anzahl der überlebenden Individuen nicht zu hoch ist, dann ist es besser, G1 Weibchen einzeln mit Wt-Männchen zu kreuzen. Der Fall mehrerer Weibchen, die eine andere Mutation in einem selben Röhrchen tragen, ist selten, kann aber auftreten. Wenn ein solcher Fall nach der Genotypisierung beobachtet wird, sollten dieG2-Nachkommenweibchen dann einzeln mit Wt-Männchen gepaart werden. Dieses Paarungsschema vermeidet die Möglichkeit mehrerer Mutationen in der Nachkommenschaft. - Nach der Eiablage die weiblichenG1-Körper sammeln und auf Mutationen abschirmen. Bewahren Sie nur die Röhren auf, in denen mindestens ein Weibchen Anzeichen einer Mutation zeigte.
- Für spätere Generationen machen einzelne Paar in-Kreuze. Nach der Eiablage, Bildschirm Eltern für das Vorhandensein von Mutation. Wiederholen Sie dies bei jeder Generation, bis beide Elternteile für die gleiche Mutation homozygot sind. Einmal identifiziert, werden sie die Gründer eines homozygoten mutierten Bestandes sein.
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Representative Results
Das hier beschriebene CRISPR/Cas9-Mikroinjektionsprotokoll zur Erzeugung von Sandfliegenmutanten wurde in einer früheren Publikation4eingerichtet. Dieser Ansatz führte zu einer hocheffizienten Mutagenese, da 11 von 540 Personen das Verfahren überlebten, von denen 9 mutiert waren. Beim Entwerfen von Leitfäden für die CRISPR/Cas9-Mutation besteht ein wichtiger erster Schritt darin, die Region um das zielgerichtete Gebiet zu sequenzieren. Die Vorlage für die Sequenzierung sollte von dem Stamm stammen, der als Quelle für Dieinjektionsembryonen verwendet werden soll. Es ist riskant, sich nur auf veröffentlichte Genomsequenzen zu verlassen, um Leitfäden zu entwerfen. Es ist nicht ungewöhnlich, Unterschiede zwischen veröffentlichten Genom und Pre-Guide-Design-Sequenzen zu haben. In einigen Fällen sind Anleitungen, die aus veröffentlichten Genomsequenzen entworfen wurden, nicht vorhanden, wenn die Region um das Zielgen sequenziert wird (Harrell, persönliche Beobachtung). Darüber hinaus kann die Sequenz Single Nukleotide Polymorphismen (SNPs) enthalten, die als echte CRISPR-Bearbeitungen während der Genotypisierung verwechselt werden könnten. Daher ist das Bestätigen der Reihenfolge für die Zielregion entscheidend, damit der Rest des Protokolls erfolgreich ist.
Eine erfolgreiche genetische Veränderung von Insekten durch Mikroinjektion hängt hauptsächlich von zwei kritischen Aspekten ab: der Lieferung von Materialien (Protein, Plasmid oder mRNA) zum richtigen Zeitpunkt in der Entwicklung mit so wenig Schäden an den Embryonen wie möglich; und Aufzucht von robusten, gesunden Insekten, die das Verfahren überleben und Nachkommen produzieren. Die Anfangsphase dieses in Abbildung 2beschriebenen Verfahrens beginnt mit der Blutfütterung der Weibchen aus der Wt-Kolonie und geht fünf Tage später zur Embryoentnahme und Mikroinjektion über. Die zweite Phase besteht darin, die injizierten Embryonen bis ins Erwachsenenalter aufzuzüchten, die entsprechenden Kreuze zu machen und Mutationen von Interesse zu identifizieren und zu isolieren.
Embryonen zur Injektion werden für 30 – 60 min gesammelt, so dass das relative Alter in Stunden nach der Eileiter ungewirg werden kann. Embryonen dürfen sich dann 3 h vor Beginn der Injektionen entwickeln. Dieses Zeitfenster der Insektenentwicklung ermöglicht es den Embryonen, die Injektionen zu überleben. Nach dieser Reifungsphase werden die Embryonen auf einem vorbereiteten Injektionsschlitten gesammelt und die Embryonen mit einer feinen Bürste gegen eine Deckskante gerollt. Die endgültige Konfiguration ist in Abbildung 3Adargestellt. Es ist wichtig, das Filterpapier so zu benetzen, dass sich an der Deckskante, an der die Embryonen sitzen, ein Meniskus bildet. Zu viel Wasser und die Embryonen werden von der Deckskante weggedrückt. Zu wenig führt dazu, dass die Embryonen unter den Deckschein gezogen werden. Die Embryonen müssen feucht gehalten werden, sonst werden die Embryomembranen schwer zu injizieren. Die Abdeckungsrutschkante fungiert als Backstop, so dass die Nadel in die Embryonen eindringen kann, wenn sie gegen die Kante gedrückt wird. Es ist die Kombination aus einer scharfen Nadel und einem Backstop, die es ermöglicht, dass die Nadel glatt durchdringt.
Wie bei den meisten erfolgreichen Mikroinjektionsprotokollen ist eine gute Mikroinjektionsnadel für die injizierten Embryonen wichtig. Gute, scharfe Nadeln sind definiert als Nadeln, die leicht in den Embryo eindringen können, ohne dass das Material nach der Injektion entweichen kann. Eine gute Penetration zeigt sich, wenn die Nadel in den Embryo rutscht, was zu wenig bis keiner Einbuchtung der Embryomembran während des Eindringens führt und kein Material aus dem Embryo austritt, nachdem die Nadel entnommen wurde. Gute scharfe Nadeln werden mit NadelzieherEinstellungen hergestellt, die eine Nadel erzeugen, die zu einem feinen Punkt kommt (Abbildung 1A). Die gezogene Nadel sollte keine zu lange Verjüngung haben. Andernfalls wird das Lumen der Nadel für einen großen Teil der Verjüngung sehr schmal (Abbildung 1B), und es wird schwierig, den Injektionsdruck hoch genug zu bekommen, um das Material durch die Nadel zu zwingen. In diesem Protokoll wurden abgeschrägte Nadeln verwendet. Das Verfahren zum Ziehen und Abschrägen von Nadeln wird in Meuti und Harrell19beschrieben. Bei Sandfliegen-Embryonen, die sich über einen langen Zeitraum entwickeln, ist es besonders wichtig, scharfe Nadeln zu haben, die Schäden am Embryo minimieren und so verhindern, dass Material an der Injektionsstelle austritt. Wenn Embryoplasmen aus einem Embryo nach der Injektion austritten, ist dieses Material ein reiches Medium für Schimmel- und Pilzwachstum. In Embryonen, die sich über einen kürzeren Zeitraum entwickeln, kann sich der Embryo entwickeln und schlüpfen, bevor die Form zum Problem wird. Embryonen, die nach der Injektion sichtbar undicht sind, sollten entfernt werden.
Während der Injektionen ist es wichtig, Wasser nach Bedarf hinzuzufügen, indem Sie einen feinen Pinsel benetzen und es auf das Filterpapier berühren, wobei es sich bei Bedarf wiederholt, bis sich der Meniskus des Wassers nur an der Basis der Embryonen befindet. Die Aufmerksamkeit auf die relative Luftfeuchtigkeit am Injektionstag ist zu beachten. An Tagen mit niedriger Luftfeuchtigkeit muss mehr Wasser zugegeben werden. Sobald die Injektionen abgeschlossen sind, wird dem Filterpapier etwas zusätzliches Wasser zugesetzt, so dass der Deckel leicht schwimmt, was das Entfernen erleichtert. Sobald der Deckelschlupf entfernt ist, kann das Filterpapier mit injizierten Embryonen gefleckt werden, so dass das Filterpapier kaum feucht ist. Embryonen können dann mit einem feinen Pinsel in einen feuchten Gipstopf zum Schlüpfen gebracht werden. In diesem Stadium sind Embryonen sehr zerbrechlich, so dass der Prozess sehr sorgfältig durchgeführt werden muss. Es ist auch wichtig, zu verhindern, dass die Embryonen sich gegenseitig berühren, um verschimmelte Embryonen entfernen und die Ausbreitung der Pilzkontamination begrenzen zu können.
Nach der Injektion werden die g0 injizierten Embryonen nach normalen Aufzuchtverfahren auf Gipstöpfen gehalten. Bis sie schlüpfen, sollten injizierte Embryotöpfe einmal täglich überprüft werden, um ungesunde Embryonen zu entfernen. Abbildung 4A zeigt den erwarteten Zeitplan der G 0-Einzelaufzucht vom Tag der Eiablage und Injektion bis ins Erwachsenenalter. Abbildung 4B zeigt Beispiele für G0-Embryonen, die gesund sind und erhalten bleiben sollten; oder beschädigt, durch Pilze verunreinigt, ausgetrocknet oder verformt und entsorgt werden sollten. Die G0 injizierten Individuen sind angeblich Mosaik für mutierte Allele. Es sollte eine Methode zur Identifizierung potenzieller mutierter Allele entwickelt werden, z. B. ein PCR-Assay der Region, die die zu erwartenden Schneidestellen umgibt. Abbildung 4C zeigt ein Beispiel für einen PCR-Assay, der ein Mosaik G0 Einzel zeigt und ein PCR-Produkt zusätzlich zum erwarteten Wt-Produkt aufweist, das ein mutiertes Allel darstellt.
Sobald die Erwachsenen auftauchen, werden die G0-Weibchen, die sich aus G0 injizierten Embryonen entwickeln, mit Wt-Männchen gekreuzt, eierlegen dürfen und werden später genotypisiert. Nur die Rohre, die eine G0-Fliege enthalten, die einen Nachweis einer Mutation aus der Genotypisierungsmethode der Wahl zeigt, bleiben erhalten. Die Fliegen der nächsten Generationen (G1 Hündinnen) werden entweder mit Wt-Männchen oder einzeln zwischen Geschwistern gekreuzt (ab G2). Diese Kreuze dürfen Eier legen und dann genotypisiert nach der Methode der Wahl. Der letzte Schritt wird wiederholt, bis homozygote mutierte Männchen und Weibchen erhalten sind, wodurch eine homozygote mutierte Linie gebildet wird. Eine schematische Darstellung der entsprechenden Abfolge von Kreuzen zur Festlegung einer mutierten Linie ist in Abbildung 5Aangegeben. Abbildung 5B zeigt ein Beispiel für eine genotypisierende PCR, die die Identifizierung eines homozygoten mutierten Geschwisterkreuzes ermöglicht.
Abbildung 1: Mikroinjektionsnadeln. A. Gute Nadel. B. Nadel mit extremer Verjüngung nicht gut für Injektionen. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.
Abbildung 2: Überblick über embryonale Entnahme und Mikromanipulation (Diese Abbildung wurde von4angepasst). Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.
Abbildung 3: Microinjection-Setup. A. Schematische Darstellung des Mikroinjektionsaufbaus. B. Nahaufnahme des ausgerichteten Embryos zur Mikroinjektion. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.
Abbildung 4: Aufzucht und Identifizierung von Mosaik G0 erwachsene Personen. A. Voraussichtlicher Zeitplan von der Embryo-Mikroinjektion bis zum G 0-Erwachsenenalter. B. Beispiele für gut und schlecht aussehende Embryonen nach der Injektion. C. PCR-Genotypisierung eines transformierten G0 Mosaikindividuums. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.
Abbildung 5: Identifizierung und Isolierung von Mutationen von Interesse. A. Schematische Darstellung der experimentellen Strategie, mutierte Allele zu isolieren und homozygote mutierte Bestände zu etablieren (Abbildung aus 4). Die Farbe stellt das Vorhandensein von Zellen dar, die mutierte Allele tragen, im heterozygoten (rosa) oder homozygoten (roten) Zustand. B. Beispiel für eine PCR-Screening-Strategie zur Genotypisierung einzelner Sbohnekreuze von Sandfliegen. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.
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Discussion
Wir präsentieren hier eine kürzlich entwickelte Embryo-Mikroinjektionsmethode für gezielte Mutagenese von CRISPR/Cas9 in Phlebotomus papatasi Sandfliegen. Embryo-Mikroinjektion zur insektengenetischen Veränderung wurde Mitte der 1980er Jahre21 in Drosophila entwickelt und wird heute routinemäßig in einer Vielzahl von Insekten eingesetzt. Andere Methoden zur Lieferung von genetischen Veränderungsmaterialien wurden für den Einsatz in Insekten entwickelt, wie ReMOT20,21,22,23 und Elektroporation23. Die Embryo-Mikroinjektion ist derzeit jedoch die vielseitigste und effizienteste Methode für die Lieferung dieser Materialien. ReMOT ist als Abgabemethode äußerst vielversprechend und sollte aufgrund der relativen Leichtigkeit von Injektionen für Erwachsene im Vergleich zu Embryo-Mikroinjektionen für den Einsatz in Sandfliegen erforscht werden. Bisher wurde ReMot jedoch nicht erfolgreich für CRISPR/Cas9 HDR oder Transposontransgenese eingesetzt. Obwohl die Technik für Embryo-Mikroinjektionen bei Insekten im Grunde die gleiche ist wie ursprünglich entwickelt, kann für jede neue Art Verfeinerung der Techniken erforderlich sein. Zu diesen Artenunterschieden gehören das Muster und die Dauer der Embryoentwicklung, die Embryostruktur und die Umgebung, in der sich der Embryo normalerweise entwickelt. Sandfliegen-Embryonen sind besonders klein (0,3-0,5 mm lang und 0,1- 0,15 mm breit, was etwa 1/3 der Größe des Drosophila-Ei 1) entspricht. Diese reduzierte Größe erhöht die Schwierigkeit, die Eier zu behandeln, ohne sie zu beschädigen. Der Feuchtigkeitsgehalt bei jedem Schritt des Protokolls muss sehr sorgfältig überwacht werden, da Sandfliegen-Embryonen besonders empfindlich auf Austrocknung reagieren. Sie sind jedoch nicht aquatisch und sterben, wenn sie für einen längeren Zeitraum vollständig in Wasser getaucht werden. Drosophila Embryo Mikroinjektion erfordert Injektion am hinteren Ende des Embryos. Aufgrund der nahezu symmetrischen Form von Sandfliegenembryonen ist es schwierig, die Embryopolarität zu bestimmen. Schließlich, während Sandfliegen Embryo Entwicklung verläuft ähnlich wie Drosophila, Es tut dies mit einer viel langsameren Rate. Embryogenese allein dauert zwischen 6 und 11 Tagen, abhängig von der Sandfliegenart, während Drosophila Eier nur einen Tag nach der Eiablage schlüpfen. Drosophila Ei Zellzellulisierung tritt etwa 2 Stunden nach der Eioviposition, während Sandfliegen Embryonen erreichen dieses Stadium bei caxiamly 9 Stunden nach der Eioviposition. Angesichts dieses Unterschieds im Entwicklungszeitpunkt werden Injektionen auf das Zentrum des sich entwickelnden Sandfliegen-Embryos unter der Annahme ausgerichtet, dass sich die Entwicklung von Kernen im synzytialen Embryo in diesem frühen Entwicklungsstadium in der Nähe des Zentrums des sich entwickelnden Embryos befindet, wodurch die Notwendigkeit, die Polarität des Embryos zu unterscheiden, die Notwendigkeit besteht, die Polarität des Embryos zu unterscheiden.
CRISPR/Cas9 erzeugt dsDNA-Brüche an einem ausgewählten genomischen Ort. Diese Doppelstrangbrüche werden in der Zelle entweder durch NHEJ oder durch HDR repariert. Die Methode, die wir hier präsentieren, wurde bisher nur für NHEJ-basierte Mutagenese verwendet, die kleine Insertions-/Löschereignisse, Indels, erzeugte, was zu einer Frameverschiebung in Gensequenzen führte, was zu vorzeitigen Stop-Codons und einem Protein ohne alle funktionellen Domänen4führte. Insekten besitzen auch die zelluläre Maschinerie für dsDNA Brechen Reparatur durch HDR, die dann umgeleitet werden könnte, um komplexere Genom-Editing-Strategien zu entwerfen. Die HDR-basierte CRISPR/Cas9-Genombearbeitung muss noch für den Einsatz in Sandfliegen eingerichtet werden und sollte unter anderem die Entwicklung von Reportern von Expressions- und bedingten Expressionsmutanten ermöglichen.
Die Entwicklung dieses Mikroinjektionsprotokolls öffnet nun die Tür für andere Genommodifikationsmethoden wie CRISPR/Cas9 HDR, Transposontransgenese, binäre Expressionssysteme wie UAS/Gal4 und standortspezifische Rekombination durch phiC31 oder Cre/lox. Die Entwicklung dieser anderen Methoden wird die Toolbox für die Modifikation der Sandfliegen-Genexpression weiter erweitern, indem eine komplexere genomische Manipulation ermöglicht wird. Bevor jedoch diese anderen Methoden eingesetzt werden können, werden Arbeiten zur Identifizierung und Isolierung von Reglerelementen benötigt, um die Expression von eingesetzten Genen in Sandfliegen zu fördern, sowie Marker der Einfügung und anderer Komponenten dieser Methoden, wie Z. B. Promotoren, um die Expression von Transposasen und Rekombinanten zu fördern.
Schließlich ist die Genombearbeitung bei Nicht-Modellinsekten nun eine Möglichkeit geworden, insbesondere dank der Revolution der CRISPR/Cas9-Entdeckung und -Anpassung15,16. Bei Insekten erfordern die meisten Genombearbeitungstechniken, bis zur bemerkenswerten Ausnahme der neu entwickelten ReMOT-Technik, eine Embryo-Mikroinjektion, ein Schritt, der sowohl entscheidend als auch technisch anspruchsvoll ist. Wir hoffen, dass diese Veröffentlichung dazu beitragen wird, das Spektrum der an Sandfliegen angepassten Techniken zur Modifikation von Genexpressionen zu erweitern und zu neuen Entdeckungen über ihre Biologie sowie zu Vektorkompetenz für Leishmanien-Parasiten zu führen.
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Disclosures
nichts
Acknowledgments
Die Autoren danken Vanessa Meldener-Harrell für die kritische Lektüre des Manuskripts.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Black Filter Paper 4.25CM PK100 | VWR | 28342-012 | Cut into rectangles that are approximately 46 X 22mm. These are placed between the slide and the coverslip and act as a moist base layer for the embryos during injection. |
| Coverslips | Fisher Scientific | 12-543A | |
| Dissecting Microscope | Any brand | For aligning embryos | |
| Glass slides | Fisher Scientific | 12-550-A3 | Base layer of the microinjection set up Figure 2A |
| Insect cage | custom made or several commercial options | polycarbonate cage for adults holding and mating Lawyer, Phillip, Mireille Killick-Kendrick, Tobin Rowland, Edgar Rowton, and Petr Volf. “Laboratory Colonization and Mass Rearing of Phlebotomine Sand Flies (Diptera, Psychodidae).” Parasite 24. Accessed August 6, 2020. https://doi.org/10.1051/parasite/2017041. | |
| Larval food | custom made | a mix of rabbit chow and rabbit feces Lawyer, Phillip, Mireille Killick-Kendrick, Tobin Rowland, Edgar Rowton, and Petr Volf. “Laboratory Colonization and Mass Rearing of Phlebotomine Sand Flies (Diptera, Psychodidae).” Parasite 24. https://doi.org/10.1051/parasite/2017041. | |
| Microcaps 100 ml | Drummond | 1-000-1000 | Used to back fill microinjection needles |
| Mouth aspirator | John W. Hock Company | Model 612 | mouth aspirator with HEPA filter |
| Olympus SZX12 | Olympus Life Sciences | Microinjection microscope | |
| Ovipots | Nalge company | ovipots are made from 125-ml or 500-ml straigh-sided plolypropylene jars modified by drilling 2.5cm holes in the bottom and filled with 1cm of plaster of Paris. Lawyer, Phillip, Mireille Killick-Kendrick, Tobin Rowland, Edgar Rowton, and Petr Volf. “Laboratory Colonization and Mass Rearing of Phlebotomine Sand Flies (Diptera, Psychodidae).” Parasite 24. Accessed August 6, 2020. https://doi.org/10.1051/parasite/2017041. | |
| Paint Brush 6-0 | Any Art Supply Company | n/a | Used for aligning embryos |
| Propionic acid | Sigma-Aldrich | 402907 | antifungal agent |
| Standard Glass Capillaries | World Precision Instruments | 1B100-3 | Used for making microinjection needles |
| Trio-MPC100 Controller and MP845 Manipulator | Sutter Instruments | Microinjection Controller and Micromanipulator |
References
- Lawyer, P., Killick-Kendrick, M., Rowland, T., Rowton, E., Volf, P. Laboratory colonization and mass rearing of phlebotomine sand flies (Diptera, Psychodidae). Parasite. 24, 42 (2017).
- Pelletier, I., et al. Specific recognition of Leishmania major poly-beta-galactosyl epitopes by galectin-9: possible implication of galectin-9 in interaction between L. major and host cells. Journal Biological Chemistry. 278 (25), 22223-22230 (2003).
- Kamhawi, S., et al. A role for insect galectins in parasite survival. Cell. 119 (3), 329-341 (2004).
- Louradour, I., Ghosh, K., Inbar, E., Sacks, D. L. CRISPR/Cas9 Mutagenesis in Phlebotomus papatasi: the Immune Deficiency Pathway Impacts Vector Competence for Leishmania major. MBio. 10 (4), (2019).
- Xi, Z., Ramirez, J. L., Dimopoulos, G. The Aedes aegypti toll pathway controls dengue virus infection. PLoS Pathogens. 4 (7), 1000098 (2008).
- Ramirez, J. L., Dimopoulos, G. The Toll immune signaling pathway control conserved anti-dengue defenses across diverse Ae. aegypti strains and against multiple dengue virus serotypes. Development and Comparative Immunology. 34 (6), 625-629 (2010).
- Ramirez, J. L., et al. Reciprocal tripartite interactions between the Aedes aegypti midgut microbiota, innate immune system and dengue virus influences vector competence. PLoS Neglected Tropical Diseases. 6 (3), 1561 (2012).
- Hu, C., Aksoy, S. Innate immune responses regulate trypanosome parasite infection of the tsetse fly Glossina morsitans morsitans. Molecular Microbiology. 60 (5), 1194-1204 (2006).
- Meister, S., et al. Anopheles gambiae PGRPLC-mediated defense against bacteria modulates infections with malaria parasites. PLoS Pathogens. 5 (8), 1000542 (2009).
- Meister, S., et al. Immune signaling pathways regulating bacterial and malaria parasite infection of the mosquito Anopheles gambiae. Proceedings of the National Academy of Sciences U S A. 102 (32), 11420-11425 (2005).
- Telleria, E. L., et al. Caspar-like gene depletion reduces Leishmania infection in sand fly host Lutzomyia longipalpis. Journal of Biological Chemistry. 287 (16), 12985-12993 (2012).
- Sant'Anna, M. R., Alexander, B., Bates, P. A., Dillon, R. J. Gene silencing in phlebotomine sand flies: Xanthine dehydrogenase knock down by dsRNA microinjections. Insect Biochemistry and Molecular Biology. 38 (6), 652-660 (2008).
- Sant'anna, M. R., Diaz-Albiter, H., Mubaraki, M., Dillon, R. J., Bates, P. A. Inhibition of trypsin expression in Lutzomyia longipalpis using RNAi enhances the survival of Leishmania. Parasites and Vectors. 2 (1), 62 (2009).
- Diaz-Albiter, H., Mitford, R., Genta, F. A., Sant'Anna, M. R., Dillon, R. J. Reactive oxygen species scavenging by catalase is important for female Lutzomyia longipalpis fecundity and mortality. PLoS One. 6 (3), 17486 (2011).
- Barrangou, R., et al. CRISPR provides acquired resistance against viruses in prokaryotes. Science. 315 (5819), 1709-1712 (2007).
- Jinek, M., et al. A programmable dual-RNA-guided DNA endonuclease in adaptive bacterial immunity. Science. 337 (6096), 816-821 (2012).
- Pawelczak, K. S., Gavande, N. S., VanderVere-Carozza, P. S., Turchi, J. J. Modulating DNA Repair Pathways to Improve Precision Genome Engineering. ACS Chemical Biology. 13 (2), 389-396 (2018).
- Martin-Martin, I., Aryan, A., Meneses, C., Adelman, Z. N., Calvo, E. Optimization of sand fly embryo microinjection for gene editing by CRISPR/Cas9. PLoS Neglected Tropical Diseases. 12 (9), 0006769 (2018).
- Meuti, M., Harrell, R. Preparing and Injecting Embryos of Culex Mosquitoes to Generate Null Mutations Using CRISPR/Cas9. JoVE. (163), e61651 (2020).
- Chaverra-Rodriguez, D., et al. Targeted delivery of CRISPR-Cas9 ribonucleoprotein into arthropod ovaries for heritable germline gene editing. Nature Communications. 9 (1), 3008 (2018).
- Chaverra-Rodriguez, D., et al. Germline mutagenesis of Nasonia vitripennis through ovarian delivery of CRISPR-Cas9 ribonucleoprotein. Insect Molecular Biology. , (2020).
- Heu, C. C., McCullough, F. M., Luan, J., Rasgon, J. L. CRISPR-Cas9-Based Genome Editing in the Silverleaf Whitefly (Bemisia tabaci). CRISPR Journal. 3 (2), 89-96 (2020).
- Macias, V. M., et al. Cas9-Mediated Gene-Editing in the Malaria Mosquito Anopheles stephensi by ReMOT Control. Genes, Genomes and Genetics (Bethesda). 10 (4), 1353-1360 (2020).
