Trinvis celle såning på Tessellated stilladser til undersøgelse spirende blodkar
Summary
Manipuleret væv er stærkt afhængige af ordentlige vaskulære netværk til at levere vitale næringsstoffer og gasser og fjerne metabolisk affald. I dette arbejde skaber en trinvis såningsprotokol af endotelceller og støtteceller højt organiserede vaskulære netværk i en højoverførselshastighedsplatform til undersøgelse af udvikling af fartøjsadfærd i et kontrolleret 3D-miljø.
Abstract
Det kardiovaskulære system er en central aktør i menneskets fysiologi, der giver næring til de fleste væv i kroppen; forskellige størrelser, strukturer, fænotyper og ydeevne afhængigt af hvert enkelt perfunderet væv. Området for vævsteknik, som har til formål at reparere eller erstatte beskadigede eller manglende kropsvæv, er afhængig af kontrolleret angiogenese for at skabe en ordentlig vaskularisering inden for de manipulerede væv. Uden et vaskulært system kan tykke konstruerede konstruktioner ikke næres tilstrækkeligt, hvilket kan resultere i celledød, dårlig engraftment og i sidste ende fiasko. Således, forståelse og kontrol af adfærd manipuleret blodkar er en enestående udfordring på området. Dette arbejde præsenterer et højoverførselssystem, der giver mulighed for oprettelse af organiserede og repeterbare fartøjsnetværk til at studere fartøjsadfærd i et 3D-stilladsmiljø. Denne totrins såningsprotokol viser, at fartøjer i systemet reagerer på stilladstopografien og udviser karakteristisk spiringsadfærd afhængigt af rumgeometrien, hvor fartøjerne bor. De opnåede resultater og forståelse fra dette højoverførselssystem kan anvendes til at informere bedre 3D bioprintede stilladskonstruktionsdesign, hvor fremstilling af forskellige 3D-geometrier ikke hurtigt kan vurderes, når der anvendes 3D-udskrivning som grundlag for cellulære biologiske miljøer. Desuden kan forståelsen fra dette høje gennemløbssystem anvendes til forbedring af hurtig lægemiddelscreening, den hurtige udvikling af samkulturmodeller og undersøgelse af mekaniske stimuli på blodkardannelse for at uddybe kendskabet til det vaskulære system.
Introduction
Vævsteknikken udvikler sig hurtigt i retning af fremstilling af konstruerede konstruktioner til erstatning for manglende eller beskadigede organer og væv1. Der er dog endnu ikke opnået fuldt funktionelle konstruktioner, da det fortsat er en enestående udfordring at generere operationelle vaskulære netværk til vævsernæring. Uden korrekt vaskularisering er manipuleret væv begrænset til en passiv diffusionstransport af ilt og næringsstoffer, der begrænser den maksimale levedygtige vævstykkelse til diffusionsgrænsen, ca. 200 μm2. Sådanne tykkelser er ikke egnede til at reparere store vævsdefekter eller til fuld organfremstilling, hvilket gør tilstedeværelsen af funktionelt vaskulært netværk til en obligatorisk egenskab for funktionelle og implantable væv3.
Det vaskulære system består af en bred vifte af blodkar, med forskellige størrelser, fænotyper og organisation, tæt relateret til værtsvævet. Forståelse af adfærd, reaktion og migration beslutninger truffet af udviklingslandene og spirende fartøjer kan instruere deres integration i manipuleret væv4. I øjeblikket er den mest almindelige tilgang til oprettelse af in vitro vaskulære netværk at kombinere endotelceller (ECs) med støtteceller (SCs, med evnen til at differentiere sig til vægmalericeller), seedet i et tredimensionelt mikromiljø. Dette miljø giver kemiske og fysiske signaler, så cellerne kan fastgøres, formere sig og samle sig i fartøjsnetværk2,5,6,7,8. Når SCs er medkulturerede, udskiller de ekstracellulære matrixproteiner (ECM), samtidig med at de yder mekanisk støtte til EC’erne, som danner de rørformede strukturer. Desuden fremmer en krydsinteraktion mellem begge celletyper tubulogenese, karspiring og migration ud over SCs modning og differentiering i α glatte muskelaktilkende (αSMA) vægmalericeller4. Udvikling af fartøjsnetværk studeres oftest i 3D-miljøer, der er skabt ved hjælp af hydrogeler, porøse polymere stilladser eller en kombination heraf. Sidstnævnte mulighed giver ligeledes et cellevenligt miljø og den nødvendige mekaniske støtte til både cellerne og ECM9.
Der er udført en stor mængde arbejde for at undersøge vaskulær udvikling, herunder fælles dyrkning af cellerne på hydrogels10, hydrogels-stilladskombinationer11,12, 2D-platforme og mikrofluidiske anordninger13. Hydrogels kan dog let deformeres af de celleudførte kræfter14, mens 2D- og mikrofluidics-systemer ikke genskaber et tættere på naturen-miljø for at opnå en mere ekstrapolatablerespons 15,16. At forstå, hvordan dannende fartøjer reagerer på deres omgivende miljø, kan give kritisk indsigt, der kan give mulighed for fremstilling af konstruerede miljøer med evnen til at styre skibets udvikling på en forudsigelig måde. Forståelse vaskulære dannelse fænomener er især afgørende for at holde trit med den hurtige fremkomsten af submicron-til-mikron skala fabrikation teknikker, såsom stereolitografi, digital projektion litografi, kontinuerlig flydende interface produktion, 3D smelte-elektro jetwriting, løsning baseret 3D elektro jet skriftligt, og nye bioprint teknikker17,18,19,20,21. Tilpasning af kontrollen af disse mikrofabrikationsteknikker med en uddybet forståelse af vaskulær biologi er nøglen til skabelsen af en passende manipuleret vaskulatur til et målvæv.
Her præsenterer vi et 3D-system til at studere reaktionen fra nye dannende og spirende fartøjer på den omgivende stilladsgeometri, observere deres spire oprindelse og efterfølgende migration22. Ved at bruge 3D stilladser med tessellated rum geometrier, og en to-trins såning teknik, lykkedes det os at skabe højt organiserede vaskulære netværk i en klar og nem at analysere mode. De tessellerede geometrier giver et højgennemstrømningssystem med individuelle enheder, der indeholder fartøjer, der reagerer på deres lokale miljø. Ved hjælp af flerfarvede ECs sporede vi spiredannelsesoprindelse og efterfølgende migrationsmønstre, korreleret med rumgeometrien og SCs-placeringen22.
Selvom den foreslåede protokol er blevet forberedt til at analysere virkningerne af geometriske signaler på vaskulæriseringsadfærd, kan denne tilgang udvides og anvendes på en række nye applikationer. Det tessellerede stillads og de let billedlige netværk giver mulighed for en enkel analyse af forskellige ECs og SCs interaktion, tilføjelse af specifikke organceller og deres interaktion med de vaskulære netværk, lægemiddeleffekt på vaskulære netværk og meget mere. Vores foreslåede systemresultater er meget alsidige og af enkel fabrikation og forarbejdning.
Protocol
Representative Results
Discussion
Behovet for en rig vaskulatur i indlejret i manipuleret væv er afgørende for konstruere overlevelse og korrekt funktion1. Selvom teknik det vaskulære system har været i fokus for en enorm mængde forskning, er der meget tilbage at undersøge og forstå24. Især ved genskabelse af et bestemt væv skal mikrovasculaturen opføre sig og organisere i overensstemmelse hermed12. Den mest almindelige tilgang til generation af mikrovessels er co-seeding e…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Denne forskning blev støttet af midler fra University of Michigan – Israel Partnerskab for Forskning. Forfatterne vil gerne takke Uri Merdler, Lior Debbi og Galia Ben David for deres store hjælp og støtte, Nadine Wang, Ph.D. og Pilar Herrera-Fierro, Ph.D. af Lurie Nanofabrication Facility ved University of Michigan, samt Luis Solorio, Ph.D. for oplysende diskussioner af fotolitografi teknikker.
Materials
| Angiotool freeware | NIH-CCR | Free download at https://ccrod.cancer.gov/confluence/display/ROB2/Home | |
| Bovine albumin serum Probumin | Millipore | 82-045-1 | |
| Dental pulp stem cells | Lonza | PT-5025 | |
| ECM media + bullet kit | Sciencell | #1001 | |
| Ethanol 96% | Gadot-Group | 64-17-5 | |
| Evicel fibrin sealant | Johnson&Johnson | EVB05IL | Provides both thrombin and fibrinogen (BAC2) solutions |
| GlutaMAX | Gibco | 35050061 | |
| Goat anti-mouse Cy3 antibody | Jackson | 115-166-072 | |
| Goat anti-rabbit Alexa-Fluor 488 | Thermo- Fisher Scientific | A11034 | |
| Human adipose microvascular cells | Sciencell | #7200 | |
| Human fibronectin | Sigma | F0895-5MG | Stock concentration: 1 mg/mL |
| ImageJ | NIH | Free download at https://imagej.nih.gov/ij/download.html | |
| Isopropyl alcohol | Gadot-Group | 67-63-0 | |
| Lift-off reagent | Kayaku Advanced Materials, Inc | G112850 | Commercial name Omnicoat |
| Low-glucose DMEM | Biological Industries | 01-050-1A | |
| Mouse anti-SMA antibody | Dako | M0851 | |
| NEAA | Gibco | 11140068 | |
| Paraformaldehyde solution 4% in PBS | ChemCruz | SC-281692 | |
| Penicillin-Streptomycin-Nystatin Solution | Biological Industries | 03-032-1B | |
| Phospate buffered saline (PBS) | Sigma | P5368-10PAK | |
| Rabbit anti-vWF antibody | Abcam | ab9378 | |
| Silicon wafer | Silicon Valley Microelectronics (SVM) | Wafers 4", Type N-1-10, 500-550 microns thick | |
| SU-8 2050 photoresist | Kayaku Advanced Materials, Inc | Y11058 | |
| SU-8 developer | Kayaku Advanced Materials, Inc | Y020100 | |
| Tryton-X 100 | BioLab LTD | 57836 |
References
- Novosel, E. C., Kleinhans, C., Kluger, P. J. Vascularization is the key challenge in tissue engineering. Advanced Drug Delivery Reviews. 63 (4), 300-311 (2011).
- Landau, S., Guo, S., Levenberg, S. Localization of Engineered Vasculature within 3D Tissue Constructs. Frontiers in Bioengineering and Biotechnology. 6, 2 (2018).
- Griffith, C. K., et al. Diffusion Limits of an in Vitro Thick Prevascularized Tissue. Tissue Engineering. 11 (12), (2005).
- Potente, M., Gerhardt, H., Carmeliet, P. Basic and therapeutic aspects of angiogenesis. Cell. 146 (6), 873-887 (2011).
- Landau, S., et al. Tropoelastin coated PLLA-PLGA scaffolds promote vascular network formation. Biomaterials. 122, 72-82 (2017).
- Lesman, A., et al. Engineering vessel-like networks within multicellular fibrin-based constructs. Biomaterials. 32 (31), 7856-7869 (2011).
- Richards, D., Jia, J., Yost, M., Markwald, R., Mei, Y. 3D Bioprinting for Vascularized Tissue Fabrication. Annals of Biomedical Engineering. 45 (1), 132-147 (2017).
- Levenberg, S., et al. Engineering vascularized skeletal muscle tissue. Nature Biotechnology. 23 (7), 879-884 (2005).
- Rouwkema, J., Khademhosseini, A. Vascularization and Angiogenesis in Tissue Engineering: Beyond Creating Static Networks. Trends in Biotechnology. 34 (9), 733-745 (2016).
- Miller, J. S., et al. Rapid casting of patterned vascular networks for perfusable engineered three-dimensional tissues. Nature Materials. 11, (2012).
- Gariboldi, M. I., Butler, R., Best, S. M., Cameron, R. E. Engineering vasculature Architectural effects on microcapillary-like structure self-assembly. PLOS ONE. 14 (1), 1-13 (2019).
- Blache, U., Guerrero, J., Güven, S., Klar, A. S., Scherberich, A. Microvascular Networks and Models, In vitro Formation. Vascularization for Tissue Engineering and Regenerative Medicine. , 1-40 (2018).
- Wong, K. H. K., Chan, J. M., Kamm, R. D., Tien, J. Microfluidic Models of Vascular Functions. Annual Review of Biomedical Engineering. 14 (1), 205-230 (2012).
- Jansen, K. A., Bacabac, R. G., Piechocka, I. K., Koenderink, G. H. Cells actively stiffen fibrin networks by generating contractile stress. Biophysical Journal. 105 (10), 2240-2251 (2013).
- Pollet, A. M. A. O., den Toonder, J. M. J. Recapitulating the vasculature using Organ-on-Chip technology. Bioengineering. 7 (1), (2020).
- Hasan, A., et al. Microfluidic techniques for development of 3D vascularized tissue. Biomaterials. 35 (26), 7308-7325 (2014).
- Jordahl, J. H., et al. 3D Jet Writing: Functional Microtissues Based on Tessellated Scaffold Architectures. Advanced Materials. 30 (14), 1707196 (2018).
- Gauvin, R., et al. Microfabrication of complex porous tissue engineering scaffolds using 3D projection stereolithography. Biomaterials. 33 (15), 3824-3834 (2012).
- Coscoy, S., et al. Microtopographies control the development of basal protrusions in epithelial sheets. Biointerphases. 13 (4), 041003 (2018).
- Kaplan, B., et al. Rapid prototyping fabrication of soft and oriented polyester scaffolds for axonal guidance. Biomaterials. , (2020).
- Steier, A., Muñiz, A., Neale, D., Lahann, J. Emerging Trends in Information-Driven Engineering of Complex Biological Systems. Advanced Materials. 31 (26), 11806898 (2019).
- Szklanny, A. A., et al. High-Throughput Scaffold System for Studying the Effect of Local Geometry and Topology on the Development and Orientation of Sprouting Blood Vessels. Advanced Functional Materials. , 1901335 (2019).
- Welti, J., Loges, S., Dimmeler, S., Carmeliet, P. Recent molecular discoveries in angiogenesis and antiangiogenic therapies in cancer. Journal of Clinical Investigation. 123 (8), 3190-3200 (2013).
- Gui, L., Niklason, L. E. Vascular Tissue Engineering: Building Perfusable Vasculature for Implantation. Current Opinion in Chemical Engineering. 3, 68-74 (2014).
- Blache, U., Ehrbar, M. Inspired by nature: Hydrogels as versatile tools for vascular engineering. Advances in Wound Care. 7 (7), 232-246 (2018).
- Cochrane, A., et al. Advanced in vitro models of vascular biology: Human induced pluripotent stem cells and organ-on-chip technology. Advanced Drug Delivery Reviews. 140, 68-77 (2019).
- Nemani, K. V., Moodie, K. L., Brennick, J. B., Su, A., Gimi, B. In vitro and in vivo evaluation of SU-8 biocompatibility. Materials Science & Engineering. C, Materials for Biological Applications. 33 (7), 4453-4459 (2013).
- Mathew, R., Ravi Sankar, A. A Review on Surface Stress-Based Miniaturized Piezoresistive SU-8 Polymeric Cantilever Sensors. Nano-Micro Letters. 10 (2), 1-41 (2018).
- Knowlton, S., Yenilmez, B., Anand, S., Tasoglu, S. Photocrosslinking-based bioprinting: Examining crosslinking schemes. Bioprinting. 5, 10-18 (2017).
- Redd, M. A., et al. Patterned human microvascular grafts enable rapid vascularization and increase perfusion in infarcted rat hearts. Nature Communications. 10 (1), 1-14 (2019).
- Zhu, Y., et al. SU-8 Photoresist. Encyclopedia of Nanotechnology. , 2530-2543 (2012).
- Zheng, F., et al. Organ-on-a-Chip Systems: Microengineering to Biomimic Living Systems. Small. 12 (17), 2253-2282 (2016).
- Freiman, A., et al. Adipose-derived endothelial and mesenchymal stem cells enhance vascular network formation on three-dimensional constructs in vitro. Stem Cell Research & Therapy. 7 (1), 5 (2016).
- van Duinen, V., et al. Perfused 3D angiogenic sprouting in a high-throughput in vitro platform. Angiogenesis. 22 (1), 157-165 (2019).
- Nguyen, D. -. H. T., et al. Biomimetic model to reconstitute angiogenic sprouting morphogenesis in vitro. Proceedings of the National Academy of Sciences. 110 (17), 6712-6717 (2013).
- Nashimoto, Y., et al. Integrating perfusable vascular networks with a three-dimensional tissue in a microfluidic device. Integrative Biology. 9 (6), 506-518 (2017).
- Rosenfeld, D., et al. Morphogenesis of 3D vascular networks is regulated by tensile forces. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 113 (12), 3215-3220 (2016).
- Neto, F., et al. and TAZ regulate adherens junction dynamics and endothelial cell distribution during vascular development. bioRxiv. , 174185 (2017).
