Summary
Dit protocol beschrijft de assemblage en werking van een goedkoop acoustofluidisch apparaat voor snelle moleculaire levering aan cellen via sonoporatie geïnduceerd door ultrasone contrastmiddelen.
Abstract
Efficiënte intracellulaire toediening van biomoleculen is vereist voor een breed scala aan biomedisch onderzoek en celgebaseerde therapeutische toepassingen. Echografie-gemedieerde sonoporatie is een opkomende techniek voor snelle intracellulaire toediening van biomoleculen. Sonoporatie treedt op wanneer cavitatie van met gas gevulde microbubbels voorbijgaande poriën vormt in nabijgelegen celmembranen, waardoor een snelle opname van biomoleculen uit de omringende vloeistof mogelijk is. De huidige technieken voor in vitro sonoporatie van cellen in suspensie worden beperkt door langzame doorvoer, variabiliteit in de ultrasone blootstellingsomstandigheden voor elke cel en hoge kosten. Om deze beperkingen aan te pakken, is een goedkoop acoustofluidic apparaat ontwikkeld dat een ultrasone transducer integreert in een pdms-gebaseerd vloeibaar apparaat om consistente sonoporatie van cellen te induceren terwijl ze door de kanalen stromen in combinatie met ultrasone contrastmiddelen. Het apparaat is vervaardigd met behulp van standaard fotolithografietechnieken om de op PDMS gebaseerde vloeistofchip te produceren. Een ultrasone piëzoschijftransducer wordt aan het apparaat bevestigd en aangedreven door een microcontroller. De montage kan worden geïntegreerd in een 3D-geprinte behuizing voor extra bescherming. Cellen en microbubbels worden door het apparaat geduwd met behulp van een spuitpomp of een peristaltische pomp die is aangesloten op PVC-buizen. Verbeterde levering van biomoleculen aan menselijke T-cellen en longkankercellen wordt aangetoond met dit acoustofluidische systeem. In vergelijking met bulkbehandelingsbenaderingen verhoogt dit acoustofluidische systeem de doorvoer en vermindert het de variabiliteit, wat de celverwerkingsmethoden voor biomedische onderzoekstoepassingen en de productie van celgebaseerde therapieën kan verbeteren.
Introduction
Virale en niet-virale platforms zijn gebruikt om moleculaire levering aan cellen te verbeteren. Virale toediening (transductie) is een veelgebruikte techniek die wordt gebruikt in celgebaseerde therapieën die genomische modificatie vereisen. Beperkingen met virale toediening omvatten potentiële insertie mutagenese, beperkte transgene capaciteit en ongewenste veelheid van infectie1,2. Daarom zijn niet-virale moleculaire toedieningstechnieken in ontwikkeling voor een breed scala aan biomedische en onderzoekstoepassingen. Veel voorkomende technieken zijn mechanische, elektrische, hydrodynamische of het gebruik van lasergebaseerde energie om de opname van biomoleculen in cellen 3te verbeteren. Elektroporatie is een veelgebruikt niet-viraal moleculair afgifteplatform dat de mogelijkheid heeft om voorbijgaande perforatie in het plasmamembraan te induceren voor intracellulaire levering van moleculaire verbindingen4,5,6,7,8,9. De transiënte perforatie van het plasmamembraan is echter een stochastisch proces en de moleculaire opname via elektroporatie is over het algemeen afhankelijk van passieve diffusie over de voorbijgaande membraanporiën4,7,8.
Een alternatieve methode is het gebruik van ultrageluid voor verbeterde intracellulaire moleculaire toediening via cavitatie van ultrasone contrastmiddelen (d.w.z. met gas gevulde microbubbels). Microbubble cavitatie induceert microstreaming-effecten in de omringende media die voorbijgaande perforatie van nabijgelegen plasmamembranen ("sonoporatie ") kunnen veroorzaken, waardoor een snelle intracellulaire opname van biomoleculen via passieve of actieve transportmechanismen mogelijk is10,11,12. Sonoporatie is een effectieve techniek voor de snelle moleculaire levering aan cellen, maar deze aanpak vereist vaak dure apparatuur en bulkbehandelingsmethoden die worden beperkt door een lagere doorvoer en een hogere variabiliteit in ultrasone blootstellingsomstandigheden13. Om deze beperkingen aan te pakken, zijn acoustofluidische apparaten, die consistente sonoporatie van cellen in suspensie mogelijk maken, momenteel in ontwikkeling.
Acoustofluidics is een groeiend veld dat ultrasone en microfluïdische technologieën integreert voor een breed scala aan toepassingen. Deze benadering is eerder gebruikt voor deeltjesscheiding door continue ultrasone energie toe te passen om staande akoestische golven binnen de vloeistofkanalen14,15,16,17te induceren . Deeltjes worden gesorteerd naar verschillende delen van het apparaat op basis van een verscheidenheid aan eigenschappen, zoals deeltjesgrootte, dichtheid en samendrukbaarheid ten opzichte van het medium16. Acoustofluidische technologieën zijn ook in ontwikkeling om een snelle moleculaire levering aan een verscheidenheid van celtypes voor onderzoekstoepassingen en productie van celtherapieën mogelijk te maken18. Onlangs hebben we een verbeterde moleculaire levering aan erytrocyten aangetoond met behulp van een pdms-gebaseerd acoustofluidisch apparaat19. In het acoustofluidische platform kan cel- en microbubbeldynamiek worden gemanipuleerd om fysieke interacties te induceren die een verbeterde levering van biomoleculen mogelijk maken. De efficiëntie en consistentie van intracellulaire moleculaire toediening kan mogelijk worden verhoogd door de afstand tussen cellen en microbubbels te optimaliseren.
Een belangrijke toepassing voor acoustofluidic-gemedieerde sonoporatie omvat het transport van biomoleculen naar primaire menselijke T-cellen. Immunotherapieën op basis van adoptieve T-celoverdracht, zoals Chimeric Antigen Receptor T cell (CAR T) therapie, zijn snel in opkomst voor de behandeling van verschillende ziekten, waaronder kanker en virussen zoals HIV20. CAR T-therapie is bijzonder effectief geweest bij pediatrische acute lymfoblastische leukemie (ALL) patiënten, met volledige remissiepercentages van 70-90%21. De productie van T-cellen voor deze therapieën hangt echter over het algemeen af van virale transductie, die wordt beperkt door potentiële insertie mutagenese, lange verwerkingstijden en uitdagingen van het leveren van niet-genetische biomoleculen zoals eiwitten of kleine moleculen1. Acoustofluidic-gemedieerde moleculaire leveringsmethoden kunnen mogelijk deze beperkingen overwinnen en de productie van T-celtherapieën verbeteren.
Een andere belangrijke toepassing voor acoustofluidic-gemedieerde sonoporatie omvat intracellulaire levering van conserveermiddelen, zoals trehalose, die cellen beschermen tijdens bevriezing en uitdroging. Trehalose wordt geproduceerd door sommige organismen in de natuur en helpt hen bevriezing en uitdroging te verdragen door hun cellulaire membranen te beschermen22,23. Trehalose wordt echter niet geproduceerd door zoogdiercellen en is ondoordringbaar voor zoogdiercelmembranen. Daarom zijn effectieve moleculaire toedieningstechnieken, zoals sonoporatie, nodig om voldoende intracellulaire trehaloseniveaus te bereiken die nodig zijn om interne cellulaire membranen te beschermen. Deze aanpak is momenteel in ontwikkeling voor droge conservering van verschillende celtypen.
Dit protocol geeft een gedetailleerde beschrijving van de assemblage en werking van een relatief goedkoop acoustofluidisch systeem aangedreven door een microcontroller. Ultrasone contrastmiddelen worden gebruikt om sonoporatie in de vloeibare kanalen te induceren en een snelle moleculaire levering aan verschillende celtypen mogelijk te maken, waaronder T-cellen en kankercellen. Dit acoustofluidic systeem kan worden gebruikt voor een verscheidenheid van onderzoekstoepassingen en kan ook nuttig zijn als een prototype systeem om sonoporatie methoden voor verbeterde celtherapie productieprocessen te evalueren.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Volbloeddonaties werden verzameld van gezonde donoren volgens protocollen die waren goedgekeurd door de institutionele beoordelingscommissie van de Universiteit van Louisville.
1. Vervaardiging van acoustofluidic apparaat
- Verkrijg een fotomasker met een concentrisch spiraalontwerp met kanalen met een diameter van 500 μm. Een CAD-bestand wordt als voorbeeld in de aanvullende bestanden opgenomen. Een aangepast fotomasker kan worden besteld bij een commerciële leverancier of met een patroon met behulp van een maskerschrijver.
- Bereid een mal van het concentrische spiraalontwerp voor op een met fotoresisten bedekte siliciumwafel met behulp van standaard fotolithografietechnieken.
- Voeg ongeveer 2 El (~30 ml) SU-8 2100 toe aan een 100 mm siliciumwafel.
- Draai de wafer op een spinner met een snelheid van 150 tpm gedurende 30 s om de fotoresist uit te spreiden en verhoog vervolgens de snelheid tot 1.200 tpm gedurende 60 s om een dikte van 200 μm op te leveren.
- Hard de met fotoresist bedekte wafel uit in een polyimide vacuümoven met een helling van 30 minuten omhoog en 30 minuten stilstaan bij 115 °C en vervolgens 30 minuten naar beneden.
- Stel de met fotoresisten bedekte wafer 130 s bloot met behulp van een maskeruitlijner met het fotomasker uit stap 1.1.
- Bak het wafeltje na blootstelling volgens hetzelfde proces als beschreven in stap 1.2.3.
- Ontwikkel de fotoresist in SU-8 developer oplossing gedurende ongeveer 8 min.
LET OP: Gebruik de ontwikkelaarsoplossing alleen in een goed geventileerde chemische zuurkast.
- Silanize de schimmel om het oppervlak meer hydrofoob te maken. Doe de met fotoresist bedekte wafer in een desiccator en voeg een druppel chlorosilane van 20 μL (C8H4Cl3F13 Si)toe. Breng 30 s vacuüm aan op de kamer, sluit de kamer af en laat 's nachts staan.
LET OP: Chlorosilane is zeer gevaarlijk en ontvlambaar. Blootstelling veroorzaakt ernstige brandwonden en oogschade. - Combineer 54 g polydimethsiloxaan (PDMS) basis en 6 g uithardingsmiddel in een kopje en meng krachtig en grondig met een spatel gedurende ten minste 1 min.
- Plaats de beker met de PDMS-oplossing ongeveer 30 minuten in een desiccator of totdat de resterende luchtbellen uit de oplossing zijn verwijderd.
- Plaats een met fotoresisten bedekt wafeltje met de patronen naar boven gericht in een petrischaal van 150 mm.
- Giet de PDMS-oplossing over de mal in de 150 mm petrischaal.
- Plaats indien nodig de 150 mm petrischaal in een desiccator en breng vacuüm aan totdat de resterende luchtbellen verdwijnen.
- Breng de 150 mm Petrischaal over in een laboratoriumoven en bak gedurende 2 uur bij 60 °C om het PDMS uit te harden.
- Verwijder na het uitharden voorzichtig het PDMS uit de Petrischaal door met een scheermesje rond de randen van de wafel te snijden.
- Knip elk afzonderlijk apparaat uit met een mes of scheermesje.
- Pons gaten door de inlaat- en uitlaatpoorten van elk apparaat met behulp van een biopsiestoot van 2,5 mm.
- Plaats elk PDMS-apparaat in een plasma asher met kanalen blootgesteld (naar boven gericht). Breng zuurstofplasmabehandeling aan (100 W gedurende 45 s, 500 mbar O2)en plaats elk PDMS-apparaat onmiddellijk op een schone sodakalkglasmicroscoopschuif (75 mm x 25 mm x 1 mm) met kanalen naar het glasoppervlak gericht.
- Laat apparaten 's nachts op kamertemperatuur hechten.
- Breng voorzichtig siliconen aan op het oppervlak van de piëzo-transducer met een diameter van 1 cm bij een dikte van ~ 1-2 mm, lijn de transducer vervolgens voorzichtig uit met de concentrische spiraal en druk deze voorzichtig op de onderkant van de glazen microscoopschuif (tegenover de zijkant van het PDMS-apparaat).
2. Montage en werking van acoustofluidic systeem
- Sluit een microcontroller aan op een computer met behulp van een USB A-naar-B-kabel. Een groene led-indicator (met het label PWR) moet branden.
- Gebruik het bijbehorende programma op de computer om een programma te uploaden dat een 8 MHz-signaal genereert. Een voorbeeldprogramma is opgenomen in de Aanvullende Files. Na het uploaden van het programma wordt het opgeslagen in het microprocessorgeheugen en hoeft het niet opnieuw te worden geüpload.
- Soldeer een 1" 22G draad aan het uiteinde van elke draad op de PZT transducer.
- Sluit de negatieve (zwarte) aansluitdraad van de PZT transducer aan op een GND pin via de gesoldeerde draad.
- Sluit de positieve (rode) aansluitdraad van de PZT-transducer aan op de uitgangspen (#9 in het meegeleverde voorbeeldprogramma) via de gesoldeerde draad.
- Monteer eventueel het acoustofluidische apparaat en de microcontroller in een 3D-geprinte behuizing. CAD-bestanden worden als voorbeelden verstrekt in de Supplemental Files. Extra draden kunnen worden aangesloten op andere microcontroller pinnen om een externe LED-indicator te bedienen en aan / uit drukknop indien gewenst.
- Snijd 3-6" delen tygon PVC zachte kunststof buizen (1/16" ID, 1/8" OD) en duw de slang in de inlaat- en uitlaatpoorten. Het kan nodig zijn om de slang te draaien terwijl u druk uitoefent totdat deze in de opening past. Optioneel kan na het plaatsen van de slang in elke poort lijm worden aangebracht op de kruising om het PDMS en de slang aan elkaar te lijmen.
- Monteer het microfluïdische reservoir volgens de instructies van de fabrikant.
- Snijd een 3-6" sectie van tygon PVC zachte kunststof buizen (1/16" ID, 1/8" OD) en duw de slang over de 1/32" ID slang van de microfluïdische reservoir output slang. Wikkel eventueel de verbinding met paraffinefolie om lekkage te voorkomen.
- Vul een spuit van 60 ml met omgevingslucht (filter eventueel de lucht met een filter van 0,2 μm) en sluit deze aan op tygon PVC-buizen (1/16" ID, 1/8" OD) aan de zijkant van het microfluïdische reservoir.
- Stel de spuitpomp in op een snelheid van 200 ml/h om de oplossingen voor cel/ultrageluidcontrastmiddelen met een volumetrisch debiet van 50 ml/h door het acoustofluidische apparaat te duwen en de monsters van de uitgang van het acoustofluidische apparaat in een centrifugebuis van 50 ml te verzamelen. Spoel het spoelkanaal eventueel voorafgaand aan de acoustofluidische behandeling met 15 ml 70% ethanoloplossing om de steriliteit van vloeibare kanalen te verhogen. Bovendien kunnen kanalen worden gespoeld met 15 ml gedeï gedeïdiseerd water om resterende ethanol in het apparaat te verwijderen voordat cellen door het systeem worden gepompt.
3. Bereiding van ultrasone contrastmiddelen
OPMERKING: Ultrasone contrastmiddelen verbeteren de acoustofluidische levering van moleculaire verbindingen aanzienlijk door de permeabilisatie van nabijgelegen cellulaire membranen tijdelijk te verhogen19. Moleculaire toediening is zeer beperkt zonder ultrasone contrastmiddelen in dit systeem.
- Bereid een fosfolipideoplossing in een scintillatieflacon van 20 ml die het volgende mengsel bevat:
- Voeg 25 mg 1,2-distearoyl-sn-glycero-3-phosphocholine (DSPC) toe.
- Voeg 11,6 mg 1,2-distearoyl-sn-glycero-3-ethylfosfocholine (DSEPC) toe.
- Voeg 0,26 mg 1,2-distearoyl-sn-glycero-3-phosphoglycerol (DSPG) toe.
- Voeg 0,88 mg polyoxyethyleen40 stearaat toe.
- Voeg chloroform toe totdat alle fosfolipiden zijn opgelost (bijv. 3 ml chloroform).
- Verdamper chloroform in een desiccator gedurende 48 uur om een droge lipidefilm te vormen (verdamping onder argon of met een roterende verdamper kan worden gebruikt om het droogproces te versnellen).
- Rehydrateer de lipidenfilm met 10 ml steriele fosfaatgebufferde zoutoplossing (PBS).
- Soniceer de lipideoplossing gedurende 3 minuten bij 40% amplitude om een kationische micellaire oplossing te vormen.
- Bewaar na sonicatie de fosfolipideoplossing maximaal 1 maand bij 2-6 °C.
- Om ultrasone contrastmiddelen voor te bereiden, voegt u 200 μL kationische micellaire oplossing en 600 μL steriel PBS toe aan een glazen septumflacon van 2 ml.
- Sluit de flacon af door de dop te krimpen.
- Gebruik een 1,5" 20G naald om de oppervlakte van de flaconkop gedurende 30 s te vullen met decafluorbutaangas.
- Voeg de flacon samen gedurende 45 s bij 4.350 cpm om perfluorbutaan gasgevulde ultrasone contrastmiddelen te vormen.
- Voeg 25 μL ultrasone contrastmiddeloplossing per 1 ml celoplossing toe vlak voordat u het gecombineerde contrastmiddel/celmengsel door het acoustofluidische apparaat pompt. De celoplossing kan naar wens door de gebruiker worden aangepast, maar in onze studies bestond de celoplossing uit primaire T-cellen in stap 4.21 en A549 longkankercellen in stap 5.7, respectievelijk.
4. Bereiding van primaire Tcells
- Isoleer perifere bloedmononucleaire cellen (PBMC's) uit volbloedoplossingen en bewaar bij -150 °C. Dichtheidsgradiëntscheiding met een substraat wordt gewoonlijk gebruikt om PBMC's van volbloed te scheiden24,25,26.
- Ontdooi bevroren flacon in een waterbad van 37 °C.
- Verdun ontdooide PBMC's 1:10 met PBS in een centrifugebuis van 15 ml. Elke flacon van 1 ml bevat ongeveer 10 miljoen PBMCs.
- Centrifugeer verdunde PBMC's bij 580 x g gedurende 11 min bij 4 °C.
- Aspireer het supernatant en voeg 13 ml MACs met buffer toe om de cellen opnieuw te gebruiken.
- Tel de PBMC's met een geautomatiseerde celteller of hemocytometer.
- Centrifugeer de PBMC's opnieuw op 580 x g gedurende 11 min bij 4 °C en aspireer het supernatant.
- Voeg 40 μL gekoelde running buffer toe per 10 miljoen PBMC's.
- Om T-cellen te isoleren, voegt u 10 μL Pan T-Cell Biotine Antibody Cocktail toe per 10 miljoen PBMC's.
- Roer de PBMC's voorzichtig en bewaar de oplossing bij 4 °C gedurende 5 minuten per 10 miljoen cellen.
- Voeg 30 μL running buffer en 20 μL Pan T-Cell MicroBead Cocktail per 10 miljoen PBMC's toe.
- Meng de PBMC's en kralen grondig en incubeer nog eens 15 minuten bij 4 °C.
- Voeg een actieve buffer toe om een totaal volume van 500 μL te bereiken.
- Scheid primaire T-cellen met een in de handel verkrijgbaar magnetisch sorteerinstrument op de bank met behulp van de instelling "depletes separation" volgens het protocol van de fabrikant. Deze stap moet tussen de 5-10 miljoen T-cellen opleveren na het sorteren van cellen.
- T-cellen tellen met behulp van een geautomatiseerde celteller of hemocytometer.
- Verdun T-cellen in 10 ml steriel PBS en centrifugeer bij 580 x g gedurende 10 minuten bij 4 °C om de cellen te pelleteren.
- Aspireer de supernatant en resuspend T cellen in 1 ml PBS.
- Tel T-cellen met behulp van een geautomatiseerde celteller of hemocytometer en aliquot 1 miljoen/ml voor experimenten.
- Bereid een fluoresceïneoplossing van 1 mg/ml in PBS.
- Voeg onmiddellijk voorafgaand aan de verwerking 100 μL fluoresceïneoplossing per 1 ml T-celoplossing (uiteindelijke fluoresceïneconcentratie = 100 μg/ml) toe.
- Voeg 25 μL ultrageluidcontrastmiddeloplossing toe zoals eerder beschreven in stap 3.11.
- Verwerk 1 ml aliquots cellen met behulp van het acoustofluidische systeem (zie stap 2.10-2.11). Deze stap verbetert de afgifte van fluoresceïne in primaire T-cellen.
- Was de cellen onmiddellijk na de behandeling driemaal via centrifugeren op 580 x g gedurende 10 minuten met 500 μL PBS om extracellulair fluoresceïne te verwijderen. Cellen moeten binnen 10 minuten na toevoeging van fluoresceïneoplossing worden gewassen.
- Na de laatste wasstap resuspendeert u cellen in 250 μL PBS en meet u fluorescentie op flowcytometer.
5. Bereiding van A549 longkankercellen
- Kweek A549 (adenocarcinomic humane alveolaire basale epitheel) cellen in volledige DMEM media (10% foetale runderserum, 1% penicilline/streptomycine) bij 37 °C en 5% CO2 in een platbodem weefselkweekkolf.
- Oogst A549-cellen wanneer ze 70-90% samenvloeiing bereiken. Aspireer media uit de kolf en was de cellen eenmaal met PBS om serumeiwitten te verwijderen.
- Voeg trypsine (0,25%) EDTA toe aan de kolf en incubeer gedurende 5 minuten bij 37 °C. Trypsine is een spijsverteringsenzym dat ervoor zorgt dat de cellen loskomen van het onderste oppervlak van de weefselkweekkolf.
- Breng de trypsineoplossing over naar een centrifugebuis van 15 ml en neutraliseer deze door complete DMEM-media toe te voegen in een verhouding van 1:3.
- Pellet de cellen via centrifugeren bij 1.500 x g gedurende 5 min bij 4 °C.
- Aspireer het supernatant en resuspendeer de pellet bij een concentratie van 100.000/ml in PBS-oplossing met 200 mM trehalose in 15 ml conische flacon.
- Voeg 25 μL ultrageluidcontrastmiddeloplossing toe zoals eerder beschreven in stap 3.11.
- Verwerk 1 ml aliquots cellen met behulp van het acoustofluidische systeem (zie stap 2.10-2.11). Deze stap verbetert de afgifte van trehalose in A549 longkankercellen.
- Was de cellen onmiddellijk na de behandeling driemaal via centrifugeren met 500 μL PBS om extracellulaire trehalose te verwijderen. Cellen moeten binnen 10 minuten na toevoeging van trehaloseoplossing worden gewassen.
- Na de laatste wasstap resuspend cellen in 100 μL PBS.
- Voeg 11 μL 1% Triton X-100 oplossing toe aan lysecellen en laat intracellulaire trehalose vrij.
- Vortex gedurende 15 s, vervolgens 30 min incuberen bij kamertemperatuur.
- Vortex opnieuw gedurende 15 s, meet vervolgens de trehaloseconcentratie met behulp van in de handel verkrijgbare trehalosetest volgens de aanbeveling van de fabrikant.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Figuur 1geeft een afbeelding weer van het acoustofluidische systeem dat in een 3D-geprinte behuizing is geassembleerd. Dit protocol produceert een acoustofluidisch systeem dat kan worden gebruikt om de intracellulaire moleculaire levering in meerdere cellijnen te verbeteren met behulp van ultrasone contrastmiddelen.
Figuur 2 toont een verbeterde intracellulaire toediening van een fluorescerende verbinding, fluoresceïne, aan primaire menselijke T-cellen met acoustofluidische behandeling in vergelijking met een onbehandelde controlegroep(p<0,05, n=3/groep). T-cellen werden gesuspendeerd in een concentratie van 1 miljoen/ml in PBS met 100 μg/ml fluoresceïneoplossing en 25 μL/ml ultrasone contrastmiddeloplossing, en het mengsel werd door het acoustofluidische apparaat gepasseerd voor ultrasone behandeling. Intracellulaire fluoresceïneafgifte en cel levensvatbaarheid werden gemeten met flowcytometrie na het wassen van cellen via centrifugeren om extracellulaire fluoresceïne te verwijderen. T-cellen in de onbehandelde controlegroep werden ook opgeschort bij 1 miljoen/ml in PBS met 100 μg/ml fluoresceïneoplossing, maar er werd geen oplossing voor een ultrageluidcontrastmiddel toegevoegd en cellen werden niet door het acoustofluidische apparaat gepasseerd. De fluorescentie-intensiteit van T-cellen steeg met 5-voudig na acoustofluidische behandeling ten opzichte van de fluorescentie-intensiteit van T-cellen in de onbehandelde controlegroep, wat wijst op een verbeterde afgifte van fluoresceïne. De levensvatbaarheid van de cellen daalde licht na acoustofluidische behandeling, maar bleef boven 80% (p<0,05, n=3/groep).
Figuur 3 toont een verbeterde intracellulaire toediening van een conserveermiddelverbinding, trehalose, aan menselijke A549 longcarcinoomcellen met acoustofluidische behandeling in vergelijking met de stroom alleen (geen ultrasone contrastmiddelen of blootstelling aan echografie) en vergeleken met cellen in de onbehandelde controlegroep (ANOVA p<0,05, n=3/groep). A549-cellen werden gesuspendeerd bij een concentratie van 100.000/ml in PBS met 200 mM trehaloseoplossing en 25 μL/ml ultrasone contrastmiddeloplossing, en het mengsel werd door het acoustofluidische apparaat gepasseerd voor echografiebehandeling. A549-cellen in de controlegroepen ("Alleen stroom" en "Geen behandeling") werden ook opgeschort bij 100.000/ml in PBS met 200 mM trehalose, maar echografiecontrastmiddeloplossing werd niet toegevoegd en cellen werden niet blootgesteld aan ultrasone behandeling. Intracellulaire trehalose werd gekwantificeerd met behulp van een trehalosetestkit en genormaliseerd naar de onbehandelde controlegroep. De levensvatbaarheid van de cel werd gemeten met trypan blauwe assay. Er was geen statistisch verschil in cel levensvatbaarheid tussen groepen (n=3-7/groep).
Figuur 1: Foto van acoustofluidic systeem. Het acoustofluidische flowsysteem bevat een PDMS-gebaseerde flowkamer met een geïntegreerde PZT transducer aangedreven door een microcontroller. Een 3D-geprinte behuizing met een LED-indicator en aan/uit drukknop zijn optionele extra functies. Klik hier om een grotere versie van deze afbeelding te bekijken.
Figuur 2: Acoustofluidische behandeling verbetert delevering van fluoresceïne aan menselijke T-cellen. (A) De fluorescentie-intensiteit in primaire T-cellen nam toe na acoustofluidische behandeling met fluoresceïne in vergelijking met de onbehandelde controlegroep (geen acoustofluidics en geen microbubbels) (p<0,05, n=3/groep). (B) De levensvatbaarheid van de cellen daalde licht na acoustofluidische behandeling, maar bleef boven de 80% zoals gemeten door flowcytometrie (p<0,05, n=3/groep). (C) Representatief flow cytometrie histogram dat wijst op een hogere fluorescentie in de acoustofluidische behandelingsgroep. Klik hier om een grotere versie van deze afbeelding te bekijken.
Figuur 3: Acoustofluidische behandeling verbetert det-rehalosetoevoer naar menselijke longkankercellen. (A) De opname van trehalose nam toe in A549 longcarcinoomcellen in vergelijking met alleen stroom (geen echografie en geen microbubbels) en de onbehandelde controlegroep (ANOVA p<0,05, n=3/groep). (B) De levensvatbaarheid van de cel bleef boven 90% na acoustofluidische behandeling, gemeten aan de hand van trypanblauwe assay (n=3-7/groep). Klik hier om een grotere versie van deze afbeelding te bekijken.
Aanvullende bestanden. Klik hier om dit bestand te downloaden.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Dit protocol beschrijft de assemblage en werking van een goedkoop acoustofluidisch systeem dat de intracellulaire levering van biomoleculen voor onderzoekstoepassingen verbetert. Er zijn verschillende belangrijke factoren waarmee u rekening moet houden bij het assembleren en bedienen van dit systeem. Het acoustofluidische apparaat is vervaardigd in PDMS, een biocompatibel materiaal dat gemakkelijk kan worden gevormd met consistente kanaalafmetingen27. De apparaatkanalen kunnen voorafgaand aan de acoustofluidische verwerking worden gespoeld met 15 ml 70% ethanoloplossing om de steriliteit bij het werken met gekweekte cellen te vergroten. Na het reinigen van ethanol kan 15 ml gedeï gedeï gedeïdensieerd water worden gebruikt om het apparaat te spoelen om resterende ethanol uit de kanalen te verwijderen voordat celoplossingen worden toegevoegd. Kleine acoustofluidische kanalen kunnen gemakkelijk worden geblokkeerd door puin of celaggregaten, waardoor dit een beperking is voor het frequente gebruik van het apparaat. Door de kanalen tussen elk monster grondig te spoelen, voorkomt u problemen met kanaalblokkades. Bovendien kunnen in elke batch meerdere PDMS-apparaten worden gefabriceerd, zodat apparaten indien nodig snel kunnen worden vervangen. Voor ultrasone toepassingen is het belangrijk om PDMS-apparaten met een consistente dikte te produceren, omdat verschillen in PDMS-dikte de ultrasone druk binnen de vloeistofkanalen kunnen beïnvloeden. Ultrasone golven verspreiden zich continu door het apparaat en overgedragen golven interageren met gereflecteerde golven om staande akoestische golfpatronen te vormen die zeer gevoelig zijn voor verschillen in PDMS-dikte17. De PDMS-dikte wordt voornamelijk bepaald door de hoeveelheid PDMS die aan de mal is toegevoegd (stap 1.7) en dit protocol levert een PDMS-dikte van 3,5 mm op.
De maximale uitgangsfrequentie van de microcontroller (8 MHz) werd geselecteerd om de kleinste akoestische golflengte binnen het vloeiende kanaal te produceren. De microcontroller-uitgang is meestal een vierkante golf, maar oscilloscoopmetingen toonden aan dat de uitvoer op 8 MHz meer lijkt op een sinusoïde golfvorm als gevolg van slew-snelheidsbeperkingen. Een beperking van dit systeem is dat de maximale spanningsuitgang van de microcontroller 5V is en een externe RF-versterker vereist is als hogere spanningsuitgangen gewenst zijn. De vrije-velddrukafgifte van de transducer in dit systeem was 18 kPa op 1 cm zoals gemeten met een naaldhydrofoon (Precision Acoustics, Dorchester, Verenigd Koninkrijk). Hoewel deze druk relatief laag is, kunnen staande golven in de kanalen de akoestische druk verhogen waaraan monsters worden blootgesteld terwijl ze door de ultrasone straal gaan.
Ultrasone contrastmiddelen worden gebruikt om akoestische cavitatie in de acoustofluidische kanalen te nucleeren, wat de levering van biomoleculen over celmembranenverbetert 28,29. Dit protocol beschrijft de synthese van met perfluorkoolstofgas gevulde microbubbels die zijn ingekapseld door een kationisch fosfolipidemembraan. Zoals eerder beschreven, bestaat deze formulering voornamelijk uit microbubbels met een diameter van 1-3μm 30. Het positief geladen oppervlak van de microbubbels trekt hen naar negatief geladen celmembranen, wat de sonoporatiegemedieerde moleculaire levering verhoogt wanneer de microbubbels en cellen zich in de buurt bevinden. De concentratie van microbubbels in de celoplossing is een kritische factor die de efficiëntie van moleculaire afgifte en cel levensvatbaarheid na acoustofluidische behandeling kan beïnvloeden, en de optimale microbubbelconcentratie kan specifiek zijn voor elk celtype 19. De concentratie van met gas gevulde microbubbels met een lipideschaal kan na verloop van tijd na de synthese afnemen, dus ultrasone contrastmiddelen moeten binnen een paar uur na de synthese worden gebruikt.
We hebben aangetoond dat een fluorescerende verbinding (fluoresceïne) wordt geleverd aan primaire niet-geactiveerde menselijke T-cellen met behulp van het acoustofluidische systeem in dit protocol. Het is belangrijk op te merken dat de activeringsstatus van primaire menselijke T-cellen de efficiëntie van intracellulaire moleculaire toediening kan beïnvloeden. De fluorescentie-eigenschappen van fluoresceïne maken gevoelige intracellulaire detectie met flowcytometrie mogelijk, maar andere oplosbare verbindingen kunnen ook in cellen worden geleverd met behulp van dit acoustofluidic-systeem. We hebben bijvoorbeeld aangetoond dat trehalose in menselijke longkankercellen wordt geleverd. Acoustofluidische toediening van trehalose in cellen kan een verhoogd herstel na bevroren en droge opslag mogelijk maken, wat aanzienlijke gevolgen kan hebben voor een reeks biomedische en onderzoekstoepassingen 19.
Acoustofluidische levering van andere biomoleculen, zoals eiwitten of DNA-plasmiden, is ook mogelijk, hoewel een beperking van dit systeem is dat de efficiëntie van moleculaire levering lager kan zijn voor grotere verbindingen18,31. Optimalisatie van acoustofluidic stroomsnelheid, concentraties van ultrasone contrastmiddelen, celconcentraties, en media kan nodig zijn voor de levering van andere biomoleculen. Bovendien kunnen optimale parameters variëren tussen verschillende celtypen als gevolg van factoren zoals celdiameter, morfologie, membraaneigenschappen en fenotype.
Het acoustofluidische systeem zoals beschreven in dit protocol kan eenvoudig worden geassembleerd en bediend tegen relatief lage kosten. Bovendien kan dit systeem worden aangepast voor andere toepassingen door andere signaalbronnen of ultrasone transducers aan te sluiten om specifieke uitgangsdrukken en frequenties32,33,34te genereren. Bovendien kan het in dit protocol beschreven spuitpompsysteem desgewenst worden vervangen door peristaltische pompen. Bij een debiet van 50 ml/h bedraagt de verblijftijd voor cellen in de ultrasone straal wanneer ze door het acoustofluidische kanaal gaan ongeveer 1 s, maar deze verblijftijd kan naar behoefte voor specifieke toepassingen worden aangepast door het vloeistofdebiet aan te passen.
In tegenstelling tot andere gangbare transfectietechnieken kunnen biomoleculen binnen enkele minuten in cellen worden geleverd in plaats van uren en dit systeem vereist geen gespecialiseerde en dure apparatuur. Bovendien is dit systeem compatibel met een breed scala aan veelgebruikte celkweekmedia of andere buffers. Kortom, dit acoustofluidische systeem maakt een snelle levering van biomoleculen aan cellen mogelijk, wat nuttig kan zijn voor een breed scala aan onderzoekstoepassingen.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Co-auteurs MAM en JAK zijn eigenaar van DesiCorp, dat financieel kan profiteren van producten die verband houden met dit onderzoek.
Acknowledgments
Dit werk werd mede ondersteund door financiering van de National Science Foundation (#1827521, #1827521, #1450370) en de National Institutes of Health (U01HL127518). Fotolithografiediensten werden geleverd door het University of Louisville Micro/Nano Technology Center.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Fabrication of Acoustofluidic Device | |||
| DOW SYLGARD 184 SILICONE ENCAPSULANT CLEAR 0.5 KG KIT | Ellsworth Adhesives | 4019862 (SKU) | https://www.ellsworth.com/products/by-market/consumer-products/encapsulants/silicone/dow-sylgard-184-silicone-encapsulant-clear-0.5-kg-kit/ |
| Harris Uni-Core (2.5 mm) | Electron Microscopy Sciences | 69039-25 | |
| Microfluidic Reservoir for 15 mL Falcon Tube - S (2/4 port) | Darwin Microfluidics | LVF-KPT-S-2 (SKU) | https://darwin-microfluidics.com/products/15-ml-falcon-tube-microfluidic-reservoir-s-2-4-port |
| Microscope Slide | VWR | 16004-430 | https://us.vwr.com/store/product/4646174/vwr-vistavisiontm-microscope-slides-plain-and-frosted-premium |
| trichlorosilane | Gelest | 105732-02-3 (Cas. No.) | Chlorosilane is very hazaradous and flammable. Exposure causes severe burns and eye damage. |
| Tygon PVC soft plastic tubing (1/16" ID, 1/8" OD) | McMaster-Carr | 5233K51 (Part #) | https://www.mcmaster.com/pvc-tubing/soft-tubing-for-air-and-water/ |
| Assembly of Acoustofluidic System | |||
| Arduino Uno | Arduino | 7630049200050 (Barcode) | https://store.arduino.cc/usa/arduino-uno-rev3 |
| Preparation of Ultrasound Contrast Agents | |||
| 1,2-distearoyl-sn-glycero-3-ethylphosphocholine (DSEPC) | Avanti Lipids | 890703P-25mg (SKU) | https://avantilipids.com/product/890703 |
| 1,2-distearoyl-sn-glycero-3-phosphocholine (DSPC) | Avanti Lipids | 850365P-25mg (SKU) | https://avantilipids.com/product/850365 |
| 1,2-distearoyl-sn-glycero-3-phosphoglycerol (DSPG) | Avanti Lipids | 840465P-25mg (SKU) | https://avantilipids.com/product/840465 |
| APF-140HP (decafluorobutate gas) | FlouroMed | 355-25-9 (Cas No.) | http://www.fluoromed.com/products/perfluorodecalin/ |
| DB-338 Amalgamators | COXO | https://www.coxotec.com/coxo/db-338-amalgamators/ | |
| polyoxyethylene 40 stearate | Sigma-Aldrich | P3440-250G (SKU) | https://www.sigmaaldrich.com/catalog/product/sigma/p3440?lang=en®ion=US&gclid= Cj0KCQjwy8f6BRC7ARIsAPIXOjjj Jh_151mYVEUyLZRavt4re9YQMLS vID64X-1KbO3LUKGjVUwb PDAaAqvOEALw_wcB |
| Q125 Sonicator | Qsonica | Q125-110 (Ref.) | https://www.sonicator.com/products/q125-sonicator?_pos=1&_sid=406df3776&_ss=r |
| Preparation of Primarty T Cells | |||
| autoMACs running buffer | Miltenyi Biotec | 130-091-221 (Order No.) | https://www.miltenyibiotec.com/US-en/products/automacs-running-buffer-macs-separation-buffer.html#gref |
| Pan T Cell Isolation Kit, human (Pan T-Cell Biotin Antibody Cocktail & Pan T-Cell MicroBead Cocktail) | Miltenyi Biotec | 130-096-535 (Order No.) | https://www.miltenyibiotec.com/US-en/products/pan-t-cell-isolation-kit-human.html#130-096-535 |
| magnetic cell sorter (autoMACS Pro Separator) | Miltenyi Biotec | 130-092-545 (Order No.) | https://www.miltenyibiotec.com/US-en/products/automacs-pro-separator-starter-kit.html#130-092-545 |
| Preparation of A549 Lung Cancer Cells | |||
| Trehalose Assay Kit | Megazyme | K-TREH (Cat. No.) | https://www.megazyme.com/trehalose-assay-kit |
| Trypan blue (0.4% in aqueous solution Ready-to-Use, sterile) | VWR | 97063-702 (Cat. No.) | https://us.vwr.com/store/product/7437427/trypan-blue-0-4-in-aqueous-solution-ready-to-use-sterile |
References
- Gardlik, R., et al. Vectors and delivery systems in gene therapy. Medical Science Monitor. 11 (4), 110-121 (2005).
- Wahlers, A., et al. Influence of multiplicity of infection and protein stability on retroviral vector-mediated gene expression in hematopoietic cells. Gene Therapy. 8 (6), 477-486 (2001).
- Nayerossadat, N., Maedeh, T., Ali, P. A. Viral and nonviral delivery systems for gene delivery. Advanced Biomedical Research. 1, 27 (2012).
- Chen, C., Smye, S. W., Robinson, M. P., Evans, J. A. Membrane electroporation theories: a review. Medical & Biological Engineering & Computing. 44 (1-2), 5-14 (2006).
- Gehl, J. Electroporation: theory and methods, perspectives for drug delivery, gene therapy and research. Acta Physiologica Scandinavica. 177 (4), 437-447 (2003).
- Lin, Y. C., Li, M., Wu, C. C. Simulation and experimental demonstration of the electric field assisted electroporation microchip for in vitro gene delivery enhancement. Lab on a Chip. 4 (2), 104-108 (2004).
- Sugar, I. P., Neumann, E. Stochastic model for electric field-induced membrane pores. Electroporation. Biophysical Chemistry. 19 (3), 211-225 (1984).
- Weaver, J. C. Electroporation: a general phenomenon for manipulating cells and tissues. Journal of Cellular Biochemistry. 51 (4), 426-435 (1993).
- Hashimoto, M., Takemoto, T. Electroporation enables the efficient mRNA delivery into the mouse zygotes and facilitates CRISPR/Cas9-based genome editing. Scientific Reports. 5, 11315 (2015).
- Klibanov, A. L. Microbubble contrast agents: targeted ultrasound imaging and ultrasound-assisted drug-delivery applications. Investigative Radiology. 41 (3), 354-362 (2006).
- Klibanov, A. L., Shevchenko, T. I., Raju, B. I., Seip, R., Chin, C. T. Ultrasound-triggered release of materials entrapped in microbubble-liposome constructs: a tool for targeted drug delivery. Journal of Controlled Release. 148 (1), 13-17 (2010).
- Fan, Z., Kumon, R. E., Deng, C. X. Mechanisms of microbubble-facilitated sonoporation for drug and gene delivery. Therapeutic Delivery. 5 (4), 467-486 (2014).
- Secomski, W., et al. In vitro ultrasound experiments: Standing wave and multiple reflections influence on the outcome. Ultrasonics. 77, 203-213 (2017).
- Gedge, M., Hill, M. Acoustofluidics 17: theory and applications of surface acoustic wave devices for particle manipulation. Lab on a Chip. 12 (17), 2998-3007 (2012).
- Shi, J., et al. Acoustic tweezers: patterning cells and microparticles using standing surface acoustic waves (SSAW). Lab on a Chip. 9 (20), 2890-2895 (2009).
- Shi, J., Huang, H., Stratton, Z., Huang, Y., Huang, T. J. Continuous particle separation in a microfluidic channel via standing surface acoustic waves (SSAW). Lab on a Chip. 9 (23), 3354-3359 (2009).
- Shields, C. W. t, Cruz, D. F., Ohiri, K. A., Yellen, B. B., Lopez, G. P. Fabrication and operation of acoustofluidic devices supporting bulk acoustic standing waves for sheathless focusing of particles. Journal of Visualized Experiments. (109), e53861 (2016).
- Belling, J. N., et al. Acoustofluidic sonoporation for gene delivery to human hematopoietic stem and progenitor cells. Proceedings of the National Academy of Sciences. 117 (20), 10976-10982 (2020).
- Centner, C. S., et al. Ultrasound-induced molecular delivery to erythrocytes using a microfluidic system. Biomicrofluidics. 14 (2), 024114 (2020).
- Qi, J., Ding, C., Jiang, X., Gao, Y. Advances in developing CAR T-cell therapy for HIV cure. Frontiers in Immunology. 11, 361 (2020).
- Annesley, C. E., Summers, C., Ceppi, F., Gardner, R. A. The evolution and future of CAR T cells for B-Cell Acute lymphoblastic leukemia. Clinical Pharmacology & Therapeutics. 103 (4), 591-598 (2018).
- Hand, S. C., Menze, M. A. Molecular approaches for improving desiccation tolerance: insights from the brine shrimp Artemia franciscana. Planta. 242 (2), 379-388 (2015).
- Zhang, M., et al. Freeze-drying of mammalian cells using trehalose: preservation of DNA integrity. Scientific Reports. 7 (1), 6198 (2017).
- Grievink, H. W., Luisman, T., Kluft, C., Moerland, M., Malone, K. E. Comparison of three isolation techniques for human peripheral blood mononuclear cells: Cell recovery and viability, population composition, and cell functionality. Biopreserv Biobank. 14 (5), 410-415 (2016).
- Jaatinen, T., Laine, J. Isolation of mononuclear cells from human cord blood by Ficoll-Paque density gradient. Current Protocol in Stem Cell Biology. , Chapter 2, Unit 2A 1 (2007).
- Ulmer, A. J., Scholz, W., Ernst, M., Brandt, E., Flad, H. D. Isolation and subfractionation of human peripheral blood mononuclear cells (PBMC) by density gradient centrifugation on Percoll. Immunobiology. 166 (3), 238-250 (1984).
- Halldorsson, S., Lucumi, E., Gomez-Sjoberg, R., Fleming, R. M. T. Advantages and challenges of microfluidic cell culture in polydimethylsiloxane devices. Biosensors and Bioelectronics. 63, 218-231 (2015).
- Helfield, B., Chen, X., Watkins, S. C., Villanueva, F. S. Biophysical insight into mechanisms of sonoporation. Proceedings of the National Academy of Sciences. 113 (36), 9983-9988 (2016).
- Hu, Y., Wan, J. M., Yu, A. C. Membrane perforation and recovery dynamics in microbubble-mediated sonoporation. Ultrasound in Medicine and Biology. 39 (12), 2393-2405 (2013).
- Kopechek, J. A., et al. Ultrasound targeted microbubble destruction-mediated delivery of a transcription factor decoy inhibits STAT3 signaling and tumor growth. Theranostics. 5 (12), 1378-1387 (2015).
- Bhutto, D. F., et al. Effect of molecular weight on sonoporation-mediated uptake in human cells. Ultrasound in Medical Biology. 44 (12), 2662-2672 (2018).
- Forbes, M. M., Steinberg, R. L., O'Brien, W. D. Frequency-dependent evaluation of the role of definity in producing sonoporation of Chinese hamster ovary cells. Journal of Ultrasound in Medicine. 30 (1), 61-69 (2011).
- Helfield, B., Chen, X., Watkins, S. C., Villanueva, F. S. Biophysical insight into mechanisms of sonoporation. Proceedings of National Academy of Science U. S. A. 113 (36), 9983-9988 (2016).
- Miller, D. L., Bao, S., Morris, J. E. Sonoporation of cultured cells in the rotating tube exposure system. Ultrasound in Medical Biology. 25 (1), 143-149 (1999).
