Summary
このプロトコルは、超音波造影剤によって誘発されるソノポレーションを介して細胞に迅速に分子送達するための低コストのアユースト流体デバイスの組み立ておよび動作を記述する。
Abstract
生体内での効率的な送達は、幅広い生物医学研究や細胞ベースの治療用途に必要です。超音波介在性ソノポレーションは、生体分子の細胞内送達を迅速に行うための新たな技術です。ソノポレーションは、ガスで満たされたマイクロバブルのキャビテーションが近くの細胞膜で一過性の細孔を形成し、周囲の流体からの生体分子の迅速な取り込みが可能になると起こります。懸濁液中の細胞のインビトロ超音波処理のための現在の技術は、遅いスループット、各細胞の超音波暴露条件の変動、および高コストによって制限される。これらの制限に対処するために、超音波造影剤と組み合わせてチャネルを流れる細胞の一貫したソノポレーションを誘導するために、PDMSベースの流体デバイスに超音波トランスデューサを統合する低コストのアクロス流体デバイスが開発されました。この装置は、PDMSベースの流体チップを製造するために標準的なフォトリソグラフィ技術を使用して製造される。超音波ピエゾディスクトランスデューサは、デバイスに取り付けられ、マイクロコントローラによって駆動されます。アセンブリは3Dプリントされたケースの内部に組み込まれ、保護を強化することができます。細胞およびマイクロバブルは、シリンジポンプまたはPVCチューブに接続された蠕動ポンプを使用してデバイスを介して押し出されます。生体分子のヒトT細胞および肺癌細胞への送達が増強され、このアバイオス流体系で実証される。一括治療アプローチと比較して、このアクロス流体システムは、スループットを増加させ、変動性を低減し、生物医学研究アプリケーションおよび細胞ベースの治療薬の製造のための細胞処理方法を改善することができます。
Introduction
ウイルスおよび非ウイルスプラットフォームは、細胞への分子送達を増強するために利用されてきた。ウイルス送達(伝達)は、ゲノム修飾を必要とする細胞ベースの治療法で利用される一般的な技術である。ウイルス送達に関する制限は、潜在的な挿入突然変異誘発、限られたトランスジェニック容量、および感染の望ましくない多重度1、2を含む。そのため、非ウイルス分子送達技術は、幅広い生物医学および研究用途に向けて開発中である。一般的な技術は、機械的、電気的、流体力学、または細胞3への生体分子の取り込みを強化するためのレーザーベースのエネルギーの使用を含む。エレクトロポレーションは、分子化合物4、5、6、7、8、9の細胞内送達のために、細胞膜中の一過性穿孔を誘導する能力を有する一般的に使用される非ウイルス性分子送達プラットフォームである。しかしながら、電気ポレーションを介した確率的プロセスおよび分子取り込みである形質膜の過渡性穿孔は、一般的に、一過性膜細孔4、7、8を横切る受動的拡散に依存する。
別の方法は、超音波造影剤(すなわち、ガス充填マイクロバブル)のキャビテーションを介して細胞内分子送達を増強するための超音波の利用である。マイクロバブルキャビテーションは、周囲の媒体にマイクロストリーミング効果を誘導し、近くの血漿膜の過渡穿圧(「ソノポレーション」)を引き起こす可能性があり、受動または活動的な輸送機構10、11、12を介した生体分子の急速な細胞内取り込みを可能にする。ソノポレーションは細胞への迅速な分子送達に有効な技術であるが、このアプローチは、多くの場合、超音波暴露条件13における低いスループットおよび高い変動性によって制限される高価な機器およびバルク処理方法を必要とする。これらの制限に対処するために、懸濁液中の細胞の一貫したソノポレーションを可能にするアクロプト流体デバイスは、現在開発中です。
アクロウス流体は、超音波とマイクロ流体技術を幅広い用途に統合した拡大分野です。このアプローチは、流体チャネル14、15、16、17内の立ち位置音響波を誘導するために連続的な超音波エネルギーを適用することによって粒子分離のために以前に使用されてきた。パーティクルは、粒子サイズ、密度、および媒体16に対する圧縮性などのさまざまな特性に基づいて、デバイスの異なる部分に向かってソートされる。アキュスト流体技術は、細胞療法18の研究用途および製造のための様々な細胞タイプへの迅速な分子送達を可能にする開発中である。最近、PDMS系アユースト流体装置19を用いて赤血球への分子送達を増強することを実証した。アシュー流体プラットフォームでは、細胞とマイクロバブルのダイナミクスを操作して、生体分子の送達を強化する物理的相互作用を誘導することができます。細胞内の分子送達の効率と一貫性は、細胞とマイクロバブルの距離を最適化することによって、潜在的に増加させることができます。
アクロス流体媒介ソノポローションの重要なアプリケーションの1つは、生体分子を原発ヒトT細胞に輸送することを含む。キメラ抗原受容体T細胞(CAR T)療法などの養子T細胞転移に基づく免疫療法は、HIV20などの癌およびウイルスを含む様々な疾患の治療のために急速に出現している。CAR T療法は小児急性リンパ芽球性白血病(ALL)患者において特に有効であり、完全寛解率は70-90%21である。しかしながら、これらの治療法のT細胞製造は一般に、潜在的な挿入突然変異誘発によって制限されるウイルス伝達に依存し、長い処理時間、およびタンパク質または小分子などの非遺伝的生体分子を送達するという課題1。アキュスト流体媒介性分子送達方法は、これらの制限を克服し、T細胞療法の製造を改善する可能性がある。
アソウス流体媒介ソノポレーションのもう一つの重要なアプリケーションは、凍結および乾燥中に細胞を保護するトレハロースのような防腐剤化合物の細胞内送達を含む。トレハロースは、自然の中でいくつかの生物によって生成され、彼らは彼らの細胞膜22、23を保護することによって凍結と乾燥を許容するのに役立ちます。しかし、トレハロースは哺乳動物細胞によって産生されず、哺乳類細胞膜に対して不浸透性である。したがって、内部細胞膜を保護するために必要な十分な細胞内トレハロースレベルを達成するためには、ソノポレーションなどの効果的な分子送達技術が必要です。このアプローチは、現在、様々な細胞タイプの乾燥保存のために開発中である。
このプロトコルは、マイクロコントローラによって駆動される比較的低コストのアクロス流体システムの組立と動作の詳細な説明を提供します。超音波造影剤は、流体チャネル内のソノポレーションを誘導し、T細胞および癌細胞を含む様々な細胞タイプへの迅速な分子送達を可能にするために利用される。このアインクルード流体システムは、様々な研究用途に使用することができ、また、改善された細胞療法の製造プロセスのためのソノポレーション方法を評価するためのプロトタイプシステムとして有用であり得る。
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
全血献金は、ルイビル大学の機関審査委員会によって承認されたプロトコルに従って、健康なドナーから集められました。
1. アヌースト流体デバイスの製造
- 直径500μmのチャンネルを含む同心渦巻き設計のフォトマスクを入手してください。CAD ファイルは、例として補助ファイルに用意されています。カスタムフォトマスクは、市販のベンダーから注文することも、マスクライターを使用してパターン化することもできます。
- 標準的なフォトリソグラフィ技術を使用してフォトレジストコーティングされたシリコンウエハー上に同心円スパイラル設計の金型を準備します。
- 100mmシリコンウエハに、SU-8 2100大さじ2(約30mL)を加えます。
- 30 sの速度でスピンコートを150 rpmでスピナーにしてフォトレジストを広げ、60 sの速度を1,200 rpmに上げて200μmの厚さを得る。
- 115°Cで30分のランプアップと30分の住み込みでポリイミド真空オーブンでフォトレジストコーティングウエハーを硬化させ、30分間ランプダウンします。
- ステップ1.1のフォトマスクとマスクアライナーを使用して130s用のフォトレジストコーティングウエハを露出させる。
- ステップ1.2.3で説明したのと同じプロセスに従って露光後にウェーハを焼く。
- SU-8現像液で約8分間フォトレジストを開発。
注意:風通しの良い化学発煙フードに現像液のみを使用してください。
- 金型をシルナイズして表面をより疎水性にします。フォトレジストコーティングされたウエハーをデシケータに入れ、クロロシラン(C8 H4Cl3F13Si)を20μL滴加えます。30 sのチャンバーに真空を適用し、その後、チャンバーを密封し、一晩残します。
注意:クロロシランは非常に危険で可燃性です。暴露は重度の火傷および眼の損傷を引き起こす。 - ポリジメシロキサン(PDMS)ベース54gと6gの硬化剤をカップに組み合わせ、ヘラで少なくとも1分間激しく徹底的に混ぜます。
- PDMS溶液を含むカップをデシケータに約30分間、または残気泡が溶液から取り除かれるまで置きます。
- 150mmペトリ皿に上向きのパターンを持つフォトレジストコーティングウエハースを置きます。
- 150mmペトリ皿の中の型の上にPDMS溶液を注ぎます。
- 必要に応じて、デシケータの中に150mmのペトリ皿を置き、残された気泡が消えるまで真空を適用します。
- 150mmペトリ皿をラボオーブンに移し、60°Cで2時間焼いてPDMSを治します。
- 硬化後、カミソリの刃を使用してウエハーの縁を切り取って、ペトリ皿からPDMSを慎重に取り除きます。
- ナイフやカミソリの刃を使用して、個々のデバイスを切り取ります。
- 2.5mmバイオプシーパンチを使用して、各デバイスの入口ポートと出口ポートに穴を開けます。
- 各PDMSデバイスを、チャンネルが露出したプラズマアッシャーに配置します(上向き)。酸素プラズマ処理(45 sの100 W、500 mbar O2)を適用し、各PDMSデバイスを、ガラス表面に向けられたチャネルを備えたきれいなソーダライムガラス顕微鏡スライド(75mm x 25 mm x 1 mm)にすぐに置きます。
- デバイスを室温で一晩結合させます。
- 直径1cmのピエゾトランスデューサの表面にシリコンを1~2mmの厚さでそっと塗布し、トランスデューサを同心渦巻きに慎重に合わせ、ガラス顕微鏡スライドの底面(PDMSデバイスの反対側)にそっと押し込みます。
2. アスース流体システムの組立と操作
- USB AからBのケーブルを使用して、マイクロコントローラをコンピュータに接続します。緑色の電源 LED インジケータ(PWR と表示)が点灯する必要があります。
- コンピュータ上の関連プログラムを使用して、8 MHz信号を生成するプログラムをアップロードします。プログラムの例は補足Fのイルに用意されています。プログラムをアップロードした後、マイクロプロセッサメモリに保存され、再度アップロードする必要はありません。
- PZTトランスデューサ上の各ワイヤの端に1 "22Gワイヤーをはんだ付けします。
- PZTトランスデューサのマイナス(黒)端子線をはんだ付きワイヤーを介してGNDピンに接続します。
- PZTトランスデューサの正(赤)端子線を、はんだ付きワイヤーを介して出力ピン(提供例プログラムの#9)に接続します。
- オプションで、アクロス流体デバイスとマイクロコントローラを3Dプリントケースに取り付けます。CAD ファイルは、例としてSアッププレメンタル Fイルに用意されています。追加のワイヤを他のマイクロコントローラピンに接続して、必要に応じて外部LEDインジケータとオン/オフプッシュボタンを制御できます。
- タイゴンPVCソフトプラスチックチューブ(1/16"ID、1/8"OD)の3-6"セクションをカットし、入口と出口ポートにチューブを押します。開口部に収まるまで圧力をかけながらチューブを回転させる必要があるかもしれません。必要に応じて、各ポートにチューブを挿入した後、接着は、PDMSとチューブを結合するために接合部に適用することができます。
- メーカーの指示に従ってマイクロ流体貯留層を組み立てます。
- タイゴンPVCソフトプラスチックチューブ(1/16"ID、1/8"OD)の3-6"セクションをカットし、マイクロ流体貯水池の出力チューブから1/32"IDチューブの上にチューブをプッシュします。必要に応じて、漏れを防ぐためにパラフィンフィルムで接合部を包みます。
- 60 mL シリンジに周囲の空気を充填し(必要に応じて、0.2 μm フィルターで空気をろ過)、マイクロ流体貯留層の側面にあるタイゴン PVC チューブ (1/16" ID、1/8" OD)に接続します。
- シリンジポンプを200 mL/hの速度に設定して、50 mL/hの体積流量でアクロ流体デバイスを介して細胞/超音波造影剤溶液を押し込み、アユースト流体デバイスの出力から50mL遠心チューブにサンプルを収集します。必要に応じて、70%エタノール溶液の15 mLでア菌流体処理の前にリンスチャネルは、流体チャネルの無菌性を増加させる。さらに、チャネルは、システムを介して細胞をポンピングする前に、デバイス内の残留エタノールを除去するために、15 mLの脱イオン水でリンスすることができます。
3. 超音波造影剤の調製
注:超音波造影剤は、近くの細胞膜19の一過性の透過性を増加させることによって、分子化合物のアキュスト流体送達を有意に増強する。分子送達は、このシステムで超音波造影剤なしで非常に限られています。
- 以下の混合物を含む20mLシンチレーションバイアルでリン脂質溶液を調製する:
- 1,2-ジステアロイル-sn-グリセロ-3-ホスホコリン(DSPC)の25mgを加える。
- 11.6 mgの 1,2-ディステアロイル-sn-グリセロ-3-エチルホスホコリン (DSEPC).
- 0.26 mgの 1,2-ディステアロイル-sn-グリセロ-3-ホスホグリセロール (DSPG) を加えます。
- 0.88mgのポリオキシエチレン40ステアリン酸を加えます。
- すべてのリン脂質が溶解するまでクロロホルムを加える(例えば、3mLのクロロホルム)。
- 乾燥した脂質膜を形成するために48時間乾燥剤でクロロホルムを蒸発させる(アルゴン下またはロータリーエバポレーターによる蒸発は、乾燥プロセスを加速するために使用することができる)。
- 10 mLの無菌リン酸緩衝食塩水(PBS)で脂質膜を再水和する。
- 40%振幅で3分間の脂質溶液を超音波処理し、カチ素ミセル溶液を形成します。
- 超音波処理の後、リン脂質溶液を2〜6°Cで最大1ヶ月間保存します。
- 超音波造影剤を調製するには、2mLガラス中隔バイアルに200μLのカチオンミセル溶液と600 μLの無菌PBSを加えます。
- キャップを圧着してバイアルを密封します。
- 1.5インチ20Gの針を使用して、バイアルヘッドスペースにデカフルオロブタンガスを30sで充填します。
- 4,350 cpmで45秒のバイアルをアマルガメートし、パーフルオロブタンガス充填超音波造影剤を形成する。
- 超音波造影剤溶液を1 mL当たり25μLの細胞溶液に加えて、結合された造影剤/細胞混合物をアプス流体装置に送り込みます。細胞溶液は、ユーザーが望むように修飾することができるが、我々の研究では、細胞溶液は、それぞれステップ4.21の原発性T細胞と、ステップ5.7のA549肺癌細胞で構成された。
4. 原発性T細胞の調製
- 末梢血単核細胞(PBMC)を全血溶液から分離し、-150°Cで保存する。 基板を含む密度勾配分離は、一般に全血24、25、26からPBMCを分離するために利用される。
- 37°Cの水浴で冷凍バイアルを解凍します。
- 15mL遠心分離管にPBSで解凍PBMCs 1:10を希釈します。各1mLバイアルには約1,000万PBMCsが含まれています。
- 遠心分離機は4°Cで11分間580 x gでPBMCsを希釈した。
- 上清を吸引し、細胞を再懸濁させるためにバッファを実行しているMAの13 mLを追加します。
- 自動セルカウンターまたはヘモサイトメーターでPBMCをカウントします。
- PBMCsを4°Cで11分間580xgで再び遠心分離し、上清を吸引する。
- 1,000万 PBMCあたり40μLのチルドランニングバッファを追加します。
- T細胞を単離するには、1000万PBCsあたり10μLのパンT細胞ビオチン抗体カクテルを加えます。
- PBMCsを軽く攪拌し、4°Cで1000万個の細胞あたり5分間溶液を保存します。
- 1000万PBCsあたり30μLのランニングバッファと20 μLのパンTセルマイクロビードカクテルを追加します。
- PBMCsとビーズを十分に混ぜ、4°Cでさらに15分間インキュベートします。
- 実行中のバッファを追加して、合計ボリューム500 μLに達します。
- メーカーのプロトコルに従って「分離を枯渇させる」設定を使用して、市販のベンチトップ磁気選別装置を備えた一次T細胞を分離します。このステップは、細胞の並べ替え後に5000万から1000万T細胞の間で得るはずです。
- 自動細胞カウンターまたはヘモサイトメーターを使用してT細胞を数える。
- T細胞を10mLの無菌PBSおよび遠心分離機で580 x gで4°Cで10分間希釈し、細胞をペレット化する。
- 上清を吸引し、Pbsの1mLでT細胞を再懸濁する。
- T細胞を数える実験のために、自動化された細胞カウンターまたはヘモサイトメーターとアリコート100万/mLを使用します。
- PBSで1mg/mLフルオレセイン溶液を調製します。
- 処理直前に、1 mg/mLフルオレセイン溶液をT細胞溶液1 mLあたり1mL(最終フルオレセイン濃度=100μg/mL)添加します。
- ステップ3.11で前述したように超音波造影剤溶液の25 μLを加える。
- アクロス流体系を用いた細胞の1mLアリコートを処理する(ステップ2.10-2.11参照)。このステップは、原発性T細胞へのフルオレセインの送達を増強する。
- 処理直後に、580 x gで500 μLのPBSで500 μinの遠心分離を経て細胞を3回洗浄し、細胞外フルオレセインを除去します。フルオレセイン溶液を添加した後、細胞を10分以内に洗浄する必要があります。
- 最終洗浄工程の後、250μLのPBSで細胞を再懸濁し、フローサイトメーターの蛍光を測定します。
5. A549肺癌細胞の調製
- 培養A549(腺癌性ヒト肺胞基底上皮)細胞は、完全なDMEM培地(10%ウシ血清、1%ペニシリン/ストレプトマイシン)で37°C及び5%CO2を平底組織培養フラスコで。
- A549細胞は70~90%の合流に達すると収穫します。フラスコから吸引媒体を吸引し、細胞をPBSで一度洗浄して血清タンパク質を除去する。
- トリプシン(0.25%)EDTAをフラスコに加え、37°Cで5分間インキュベートします。 トリプシンは、細胞が組織培養フラスコの底面から剥離する消化酵素である。
- トリプシン溶液を15mL遠心管に移し、完全なDMEM培地を1:3比で添加して中和します。
- 4°Cで5分間1,500xgで遠心分離を介して細胞をペレット化する。
- 上清を吸引し、15 mL円錐バイアルで200 mMトレハロースを含むPBS溶液中の100,000/mLの濃度でペレットを再懸濁します。
- ステップ3.11で前述したように超音波造影剤溶液の25 μLを加える。
- アクロス流体系を用いた細胞の1mLアリコートを処理する(ステップ2.10-2.11参照)。このステップは、A549肺癌細胞へのトレハロースの送達を増強する。
- 処理直後に、500μLのPBSで遠心分離を経て細胞を3回洗浄し、細胞外トレハロースを除去する。細胞はトレハロース溶液を添加した後、10分以内に洗浄する必要があります。
- 最終洗浄工程後、100μLのPBSで細胞を再懸濁します。
- 1%トリトンX-100溶液の11 μLを溶解細胞に加え、細胞内トレハロースを放出します。
- ボルテックスを15sで、室温で30分間インキュベートする。
- ボルテックスを再び15sに対して、製造者の勧告に従って市販のトレハロースアッセイを用いてトレハロース濃度を測定する。
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
図 1に、3D プリントされたケースの内部に組み立てられたアクロス流体システムの画像を示します。このプロトコルは、超音波造影剤を使用して複数の細胞株における細胞内分子送達を増強するために使用することができるアキュソース流体システムを生成する。
図 2 は、未治療の対照群(p<0.05,n=3/群)と比較して、アヌースト流体処理を行う原発ヒトT細胞への蛍光化合物フルオレセインの細胞内送達を強化したものである。T細胞は、100μg/mLフルオレセイン溶液と25μL/mL超音波造影剤溶液を用いてPBS中で100万/mLの濃度で懸濁し、混合物を超音波治療用のアキソース流体装置を通過させた。細胞内フルオレセイン送達及び細胞生存率を遠心分離を介して細胞を洗浄した後のフローサイトメトリーで測定し、細胞外フルオレセインを除去した。未治療対照群のT細胞も100μg/mLフルオレセイン溶液でPBSで100万/mLで懸濁されたが、超音波造影剤溶液は添加されず、細胞はアソ流体装置を通過しなかった。T細胞の蛍光強度は、未治療対照群におけるT細胞の蛍光強度に対してアユースト流体治療後5倍増加し、フルオレセインの送達が増強されたことを示す。細胞生存率は、アキトー流体治療後にわずかに減少したが、80%を超えたままであった(p<0.05、n=3/群)。
図3は、血液単独(超音波造影剤または超音波暴露なし)と比較して、アソ流体治療を有するヒトA549肺癌細胞への防腐剤化合物(トレハロース)の細胞内送達を強化し、未治療対照群(ANOVA p<0.05、n=3/群)と比較した。 A549細胞は、200 mMトレハロース溶液と25μL/mL超音波造影剤溶液を用いてPBS中で100,000/mLの濃度で懸濁し、混合物を超音波治療用のアキスト流体装置を通過させた。対照群のA549細胞(「フローのみ」および「治療なし」)も200 mMトレハロースでPBSで100,000/mLで懸濁していたが、超音波造影剤溶液は添加されず、細胞は超音波治療にさらされなかった。細胞内トレハロースをトレハロースアッセイキットを用いて定量化し、未処理の対照群に正規化した。細胞生存率はトリパンブルーアッセイで測定した。グループ間の細胞生存率に統計的な差はなかった(n=3-7/グループ)。
図1:アソス流体系の写真アクロス流体流動システムは、マイクロコントローラによって駆動される統合されたPZTトランスデューサを備えたPDMSベースの流れチャンバを含んでいる。LEDインジケータとオン/オフプッシュボタンを備えた3Dプリントケースは、オプションの追加機能です。 この図の大きなバージョンを表示するには、ここをクリックしてください。
図2:アクソースト流体治療は、ヒトT細胞へのfルオレセイン送達を増強する。(A)原発性T細胞の蛍光強度は、未治療の対照群(アユースト流体およびマイクロバブルなし)と比較してフルオレセインによるアユースト流体治療後に増加した(p<0.05、n=3/群)。(B)細胞生存率は、アブートー流体治療後にわずかに減少したが、フローサイトメトリー(p<0.05、n=3/群)で測定すると80%を超えたままであった。(C)アクト流体処置群においてより高い蛍光を示す代表的なフローサイトメトリーヒストグラム。この図の大きなバージョンを表示するには、ここをクリックしてください。
図3: アクトース流体治療はヒト肺癌細胞へのリハロース送達を増強する。(A)A549肺癌細胞におけるトレハロースの取り込みが、流れ(超音波なし、マイクロバブルなし)および未治療対照群(ANOVA p<0.05、n=3/群)と比較して増加した。 (B)細胞生存率は、トリパンブルーアッセイ(n=3-7/群)で測定したアクロス流体処理後も90%を超えたままであった。この図の大きなバージョンを表示するには、ここをクリックしてください。
補助ファイル。 このファイルをダウンロードするには、ここをクリックしてください。
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
このプロトコルは、研究用途のための生体分子の細胞内送達を増強する低コストのアクロス流体系の組み立てと動作を記述する。このシステムを組み立てて操作する際に考慮すべき重要な要素がいくつかあります。このアヌースト流体デバイスはPDMSで製造されており、これは一貫したチャネル寸法27で容易に成形できる生体適合性材料である。装置チャネルは培養細胞との作業の際に無菌性を高めるために、アヌースト流体処理の前に15 mLの70%エタノール溶液でリンスすることができる。エタノール洗浄後、15 mLの脱イオン水を使用して、細胞溶液を添加する前にチャネルから残留エタノールを除去するために装置をすすいでください。小さいアフューソー流体チャネルは、破片や細胞凝集体によって容易にブロックされ、これは装置の頻繁な使用のための制限を作る。各サンプル間のチャネルを十分にすすい取ると、チャネルの閉塞の問題を防ぐことができます。さらに、各バッチで複数のPDMSデバイスを製造できるため、必要に応じて迅速に交換できます。超音波ベースのアプリケーションでは、PDMSの厚さの違いが流体チャネル内の超音波圧力に影響を与える可能性がありますので、一貫した厚さのPDMSデバイスを生成することが重要です。超音波波はデバイスを通して連続的に伝播し、透過波は反射波と相互作用して、PDMS厚さ17の差に非常に敏感な立っている音響波パターンを形成する。PDMSの厚さは、主に金型に添加されるPDMSの量(ステップ1.7)によって決定され、このプロトコルは3.5mmのPDMS厚さを生み出します。
マイクロコントローラの最大出力周波数(8MHz)を選択し、流体チャネル内で最小の音響波長を生成した。マイクロコントローラの出力は一般的に方形波ですが、オシロスコープの測定により、8MHzの出力はスルーレートの制限により正弦波波形に似ていることがわかりました。このシステムの制限は、より高い電圧出力が必要な場合、マイクロコントローラの最大電圧出力が5Vであり、外部RFアンプが必要な場合です。このシステムのトランスデューサの自由場圧力出力は、針ハイドロフォン(精密音響、ドーチェスター、英国)で測定された1cmで18kPaであった。この圧力は比較的低いが、チャネル内の立っている波は、サンプルが超音波ビームを通過する時に露出する音響圧力を増加させることができる。
超音波造影剤は、細胞膜28、29を横切る生体分子の送達を増強するアクロス流体チャネル内の音響キャビテーションを核形成するために使用される。このプロトコルは、カチオンリン脂質膜によってカプセル化されたパーフルオロカーボンガス充填マイクロバブルの合成を記述する。前述のように、この製剤は、主に直径30の1〜3μmの間のマイクロバブルから構成される。マイクロバブルの正に帯電した表面は、負に帯電した細胞膜に引き付け、マイクロバブルと細胞が近接している場合にソノポレーション媒介性分子送達を増加させる。細胞溶液中のマイクロバブルの濃度は、アシュート流体処理後の分子送達および細胞生存率の効率に影響を及ぼし得る重要な因子であり、最適なマイクロバブル濃度は、各細胞型19に特異的であり得る。脂質シェルを含むガス充填マイクロバブルの濃度は、合成後時間の経過とともに減少する可能性があるため、超音波造影剤は合成後数時間以内に使用する必要があります。
このプロトコルでは、このプロトコルでアクロス流体系を用いて蛍光化合物(フルオレセイン)を一次非活性化ヒトT細胞に送達することを実証した。一次ヒトT細胞の活性化状態が細胞内分子送達の効率に影響を及ぼす可能性があることに注意することが重要です。フルオレセインの蛍光特性は、フローサイトメトリーを用いた細胞内の高感度検出を可能にするが、他の可溶性化合物もこのアソ流体系を用いて細胞内に送達することができる。例えば、トレハロースをヒト肺癌細胞に分液性分娩することを実証した。細胞内へのトレハロースのアヌースト流体送達は、凍結および乾燥貯蔵後の回復の増加を可能にし、生物医学および研究用途の範囲に大きな影響を及ぼす可能性がある19。
タンパク質やDNAプラスミドなどの他の生体分子のアキュスト流体送達も可能であるが、この系の制限は、より大きな化合物18,31に対して分子送達の効率が低い可能性があることである。他の生体分子の送達には、アガス流体流量、超音波造影剤の濃度、細胞濃度、および媒体の最適化が必要となる。また、最適なパラメータは、細胞の直径、形態、膜特性、表現型などの要因により、異なる細胞タイプによって異なる場合があります。
このプロトコルに記載されているアヌースト流体システムは、比較的低コストで容易に組み立て、操作することができます。さらに、このシステムは、特定の出力圧力と周波数32、33、34を生成するために他の信号源または超音波トランスデューサを接続することにより、他のアプリケーションのためにカスタマイズすることができます。さらに、本プロトコルに記載されたシリンジポンプシステムは、必要に応じて蠕動ポンプに置き換えることができる。50 mL/hの流速では、超音波ビーム内の細胞がアヌースト流体チャネルを通過する際の滞留時間は約1秒間ですが、この滞留時間は流体流量を調整することで、必要に応じて特定の用途に合わせて変更できます。
他の一般的なトランスフェクション技術とは異なり、生体分子は数時間以内に細胞に送達することができ、このシステムは特殊で高価な機器を必要としません。さらに、このシステムは、一般的に使用される細胞培養培地または他のバッファーの広い範囲と互換性があります。要約すると、このアキウス流体系は、細胞への生体分子の迅速な送達を可能にし、幅広い研究用途に有用である可能性がある。
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
共著者のMAMとJAKは、この研究に関連する製品から財政的に利益を得る可能性のあるDesiCorpの所有権を保有しています。
Acknowledgments
この研究は、国立科学財団(#1827521、#1827521、#1450370)と国立衛生研究所(U01HL127518)からの資金提供によって部分的に支援されました。フォトリソグラフィーサービスは、ルイビル大学マイクロ/ナノテクノロジーセンターによって提供されました。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Fabrication of Acoustofluidic Device | |||
| DOW SYLGARD 184 SILICONE ENCAPSULANT CLEAR 0.5 KG KIT | Ellsworth Adhesives | 4019862 (SKU) | https://www.ellsworth.com/products/by-market/consumer-products/encapsulants/silicone/dow-sylgard-184-silicone-encapsulant-clear-0.5-kg-kit/ |
| Harris Uni-Core (2.5 mm) | Electron Microscopy Sciences | 69039-25 | |
| Microfluidic Reservoir for 15 mL Falcon Tube - S (2/4 port) | Darwin Microfluidics | LVF-KPT-S-2 (SKU) | https://darwin-microfluidics.com/products/15-ml-falcon-tube-microfluidic-reservoir-s-2-4-port |
| Microscope Slide | VWR | 16004-430 | https://us.vwr.com/store/product/4646174/vwr-vistavisiontm-microscope-slides-plain-and-frosted-premium |
| trichlorosilane | Gelest | 105732-02-3 (Cas. No.) | Chlorosilane is very hazaradous and flammable. Exposure causes severe burns and eye damage. |
| Tygon PVC soft plastic tubing (1/16" ID, 1/8" OD) | McMaster-Carr | 5233K51 (Part #) | https://www.mcmaster.com/pvc-tubing/soft-tubing-for-air-and-water/ |
| Assembly of Acoustofluidic System | |||
| Arduino Uno | Arduino | 7630049200050 (Barcode) | https://store.arduino.cc/usa/arduino-uno-rev3 |
| Preparation of Ultrasound Contrast Agents | |||
| 1,2-distearoyl-sn-glycero-3-ethylphosphocholine (DSEPC) | Avanti Lipids | 890703P-25mg (SKU) | https://avantilipids.com/product/890703 |
| 1,2-distearoyl-sn-glycero-3-phosphocholine (DSPC) | Avanti Lipids | 850365P-25mg (SKU) | https://avantilipids.com/product/850365 |
| 1,2-distearoyl-sn-glycero-3-phosphoglycerol (DSPG) | Avanti Lipids | 840465P-25mg (SKU) | https://avantilipids.com/product/840465 |
| APF-140HP (decafluorobutate gas) | FlouroMed | 355-25-9 (Cas No.) | http://www.fluoromed.com/products/perfluorodecalin/ |
| DB-338 Amalgamators | COXO | https://www.coxotec.com/coxo/db-338-amalgamators/ | |
| polyoxyethylene 40 stearate | Sigma-Aldrich | P3440-250G (SKU) | https://www.sigmaaldrich.com/catalog/product/sigma/p3440?lang=en®ion=US&gclid= Cj0KCQjwy8f6BRC7ARIsAPIXOjjj Jh_151mYVEUyLZRavt4re9YQMLS vID64X-1KbO3LUKGjVUwb PDAaAqvOEALw_wcB |
| Q125 Sonicator | Qsonica | Q125-110 (Ref.) | https://www.sonicator.com/products/q125-sonicator?_pos=1&_sid=406df3776&_ss=r |
| Preparation of Primarty T Cells | |||
| autoMACs running buffer | Miltenyi Biotec | 130-091-221 (Order No.) | https://www.miltenyibiotec.com/US-en/products/automacs-running-buffer-macs-separation-buffer.html#gref |
| Pan T Cell Isolation Kit, human (Pan T-Cell Biotin Antibody Cocktail & Pan T-Cell MicroBead Cocktail) | Miltenyi Biotec | 130-096-535 (Order No.) | https://www.miltenyibiotec.com/US-en/products/pan-t-cell-isolation-kit-human.html#130-096-535 |
| magnetic cell sorter (autoMACS Pro Separator) | Miltenyi Biotec | 130-092-545 (Order No.) | https://www.miltenyibiotec.com/US-en/products/automacs-pro-separator-starter-kit.html#130-092-545 |
| Preparation of A549 Lung Cancer Cells | |||
| Trehalose Assay Kit | Megazyme | K-TREH (Cat. No.) | https://www.megazyme.com/trehalose-assay-kit |
| Trypan blue (0.4% in aqueous solution Ready-to-Use, sterile) | VWR | 97063-702 (Cat. No.) | https://us.vwr.com/store/product/7437427/trypan-blue-0-4-in-aqueous-solution-ready-to-use-sterile |
References
- Gardlik, R., et al. Vectors and delivery systems in gene therapy. Medical Science Monitor. 11 (4), 110-121 (2005).
- Wahlers, A., et al. Influence of multiplicity of infection and protein stability on retroviral vector-mediated gene expression in hematopoietic cells. Gene Therapy. 8 (6), 477-486 (2001).
- Nayerossadat, N., Maedeh, T., Ali, P. A. Viral and nonviral delivery systems for gene delivery. Advanced Biomedical Research. 1, 27 (2012).
- Chen, C., Smye, S. W., Robinson, M. P., Evans, J. A. Membrane electroporation theories: a review. Medical & Biological Engineering & Computing. 44 (1-2), 5-14 (2006).
- Gehl, J. Electroporation: theory and methods, perspectives for drug delivery, gene therapy and research. Acta Physiologica Scandinavica. 177 (4), 437-447 (2003).
- Lin, Y. C., Li, M., Wu, C. C. Simulation and experimental demonstration of the electric field assisted electroporation microchip for in vitro gene delivery enhancement. Lab on a Chip. 4 (2), 104-108 (2004).
- Sugar, I. P., Neumann, E. Stochastic model for electric field-induced membrane pores. Electroporation. Biophysical Chemistry. 19 (3), 211-225 (1984).
- Weaver, J. C. Electroporation: a general phenomenon for manipulating cells and tissues. Journal of Cellular Biochemistry. 51 (4), 426-435 (1993).
- Hashimoto, M., Takemoto, T. Electroporation enables the efficient mRNA delivery into the mouse zygotes and facilitates CRISPR/Cas9-based genome editing. Scientific Reports. 5, 11315 (2015).
- Klibanov, A. L. Microbubble contrast agents: targeted ultrasound imaging and ultrasound-assisted drug-delivery applications. Investigative Radiology. 41 (3), 354-362 (2006).
- Klibanov, A. L., Shevchenko, T. I., Raju, B. I., Seip, R., Chin, C. T. Ultrasound-triggered release of materials entrapped in microbubble-liposome constructs: a tool for targeted drug delivery. Journal of Controlled Release. 148 (1), 13-17 (2010).
- Fan, Z., Kumon, R. E., Deng, C. X. Mechanisms of microbubble-facilitated sonoporation for drug and gene delivery. Therapeutic Delivery. 5 (4), 467-486 (2014).
- Secomski, W., et al. In vitro ultrasound experiments: Standing wave and multiple reflections influence on the outcome. Ultrasonics. 77, 203-213 (2017).
- Gedge, M., Hill, M. Acoustofluidics 17: theory and applications of surface acoustic wave devices for particle manipulation. Lab on a Chip. 12 (17), 2998-3007 (2012).
- Shi, J., et al. Acoustic tweezers: patterning cells and microparticles using standing surface acoustic waves (SSAW). Lab on a Chip. 9 (20), 2890-2895 (2009).
- Shi, J., Huang, H., Stratton, Z., Huang, Y., Huang, T. J. Continuous particle separation in a microfluidic channel via standing surface acoustic waves (SSAW). Lab on a Chip. 9 (23), 3354-3359 (2009).
- Shields, C. W. t, Cruz, D. F., Ohiri, K. A., Yellen, B. B., Lopez, G. P. Fabrication and operation of acoustofluidic devices supporting bulk acoustic standing waves for sheathless focusing of particles. Journal of Visualized Experiments. (109), e53861 (2016).
- Belling, J. N., et al. Acoustofluidic sonoporation for gene delivery to human hematopoietic stem and progenitor cells. Proceedings of the National Academy of Sciences. 117 (20), 10976-10982 (2020).
- Centner, C. S., et al. Ultrasound-induced molecular delivery to erythrocytes using a microfluidic system. Biomicrofluidics. 14 (2), 024114 (2020).
- Qi, J., Ding, C., Jiang, X., Gao, Y. Advances in developing CAR T-cell therapy for HIV cure. Frontiers in Immunology. 11, 361 (2020).
- Annesley, C. E., Summers, C., Ceppi, F., Gardner, R. A. The evolution and future of CAR T cells for B-Cell Acute lymphoblastic leukemia. Clinical Pharmacology & Therapeutics. 103 (4), 591-598 (2018).
- Hand, S. C., Menze, M. A. Molecular approaches for improving desiccation tolerance: insights from the brine shrimp Artemia franciscana. Planta. 242 (2), 379-388 (2015).
- Zhang, M., et al. Freeze-drying of mammalian cells using trehalose: preservation of DNA integrity. Scientific Reports. 7 (1), 6198 (2017).
- Grievink, H. W., Luisman, T., Kluft, C., Moerland, M., Malone, K. E. Comparison of three isolation techniques for human peripheral blood mononuclear cells: Cell recovery and viability, population composition, and cell functionality. Biopreserv Biobank. 14 (5), 410-415 (2016).
- Jaatinen, T., Laine, J. Isolation of mononuclear cells from human cord blood by Ficoll-Paque density gradient. Current Protocol in Stem Cell Biology. , Chapter 2, Unit 2A 1 (2007).
- Ulmer, A. J., Scholz, W., Ernst, M., Brandt, E., Flad, H. D. Isolation and subfractionation of human peripheral blood mononuclear cells (PBMC) by density gradient centrifugation on Percoll. Immunobiology. 166 (3), 238-250 (1984).
- Halldorsson, S., Lucumi, E., Gomez-Sjoberg, R., Fleming, R. M. T. Advantages and challenges of microfluidic cell culture in polydimethylsiloxane devices. Biosensors and Bioelectronics. 63, 218-231 (2015).
- Helfield, B., Chen, X., Watkins, S. C., Villanueva, F. S. Biophysical insight into mechanisms of sonoporation. Proceedings of the National Academy of Sciences. 113 (36), 9983-9988 (2016).
- Hu, Y., Wan, J. M., Yu, A. C. Membrane perforation and recovery dynamics in microbubble-mediated sonoporation. Ultrasound in Medicine and Biology. 39 (12), 2393-2405 (2013).
- Kopechek, J. A., et al. Ultrasound targeted microbubble destruction-mediated delivery of a transcription factor decoy inhibits STAT3 signaling and tumor growth. Theranostics. 5 (12), 1378-1387 (2015).
- Bhutto, D. F., et al. Effect of molecular weight on sonoporation-mediated uptake in human cells. Ultrasound in Medical Biology. 44 (12), 2662-2672 (2018).
- Forbes, M. M., Steinberg, R. L., O'Brien, W. D. Frequency-dependent evaluation of the role of definity in producing sonoporation of Chinese hamster ovary cells. Journal of Ultrasound in Medicine. 30 (1), 61-69 (2011).
- Helfield, B., Chen, X., Watkins, S. C., Villanueva, F. S. Biophysical insight into mechanisms of sonoporation. Proceedings of National Academy of Science U. S. A. 113 (36), 9983-9988 (2016).
- Miller, D. L., Bao, S., Morris, J. E. Sonoporation of cultured cells in the rotating tube exposure system. Ultrasound in Medical Biology. 25 (1), 143-149 (1999).
