Summary
Bu protokol, ultrason kontrast ajanları tarafından indüklenen sonoporasyon yoluyla hücrelere hızlı moleküler teslimat için düşük maliyetli bir akostofluidik cihazın montajını ve çalışmasını açıklar.
Abstract
Çok çeşitli biyomedikal araştırmalar ve hücre bazlı terapötik uygulamalar için biyomoleküllerin verimli hücre içi teslimatı gereklidir. Ultrason aracılı sonoporasyon, biyomoleküllerin hızlı hücre içi doğumu için ortaya çıkan bir tekniktir. Sonoporasyon, gaz dolu mikrobubbles kavitasyon yakındaki hücre zarlarında geçici gözenekler oluşturduğunda ortaya çıkar, bu da biyomoleküllerin çevredeki sıvıdan hızlı bir şekilde alınmasını sağlar. Süspansiyondaki hücrelerin in vitro sonoporasyonu için mevcut teknikler yavaş verim, her hücre için ultrason maruz kalma koşullarında değişkenlik ve yüksek maliyet ile sınırlıdır. Bu sınırlamaları gidermek için, ultrason kontrast ajanları ile birlikte kanallardan akarken hücrelerin tutarlı sonoporasyonunu teşvik etmek için PDMS tabanlı akışkan bir cihaza ultrason dönüştürücüsü entegre eden düşük maliyetli bir akostofluidik cihaz geliştirilmiştir. Cihaz, PDMS tabanlı akışkan çipi üretmek için standart fotolithografi teknikleri kullanılarak üretilmiştir. Bir ultrason piezo disk dönüştürücü cihaza takılır ve bir mikrodenetleyici tarafından tahrik edilir. Montaj, daha fazla koruma için 3D baskılı bir kasaya entegre edilebilir. Hücreler ve mikrobubbles bir şırınga pompası veya PVC boruya bağlı peristaltik bir pompa kullanılarak cihazdan itilir. Biyomoleküllerin insan T hücrelerine ve akciğer kanseri hücrelerine gelişmiş teslimatı bu akostofluidik sistemle gösterilmiştir. Toplu tedavi yaklaşımları ile karşılaştırıldığında, bu akostofluidik sistem verimi arttırır ve değişkenliği azaltır, bu da biyomedikal araştırma uygulamaları ve hücre bazlı terapötiklerin üretimi için hücre işleme yöntemlerini geliştirebilir.
Introduction
Hücrelere moleküler teslimatı geliştirmek için viral ve viral olmayan platformlar kullanılmıştır. Viral doğum (transdüksiyon), genomik modifikasyon gerektiren hücre bazlı tedavilerde kullanılan yaygın bir tekniktir. Viral doğumla ilgili sınırlamalar potansiyel eklemeli mutajensis, sınırlı transgenik kapasite ve istenmeyen enfeksiyon çokluğu1,2'yiiçerir. Bu nedenle, çok çeşitli biyomedikal ve araştırma uygulamaları için viral olmayan moleküler iletim teknikleri geliştirilmektedir. Yaygın teknikler arasında mekanik, elektriksel, hidrodinamik veya biyomoleküllerin hücrelere alımını artırmak için lazer tabanlı enerji kullanımı 3. Elektroporasyon, moleküler bileşiklerin hücre içi teslimatı için plazma zarında geçici perforasyona neden olma yeteneğine sahip yaygın olarak kullanılan viral olmayan moleküler iletim platformudur4, 5,6,7,8,9. Bununla birlikte, plazma zarının geçici perforasyonu stokastik bir işlemdir ve elektroporasyon yoluyla moleküler alım genellikle geçici membran gözenekleri4,7,8boyunca pasif difüzyona bağlıdır.
Alternatif bir yöntem, ultrason kontrast ajanlarının kavitasyonu yoluyla gelişmiş hücre içi moleküler iletim için ultrason kullanımıdır (yani gaz dolu mikrobubbles). Mikrobubble kavitasyon, yakındaki plazma membranlarının ("sonoporation") geçici perforasyonuna neden olabilen ve pasif veya aktif taşıma mekanizmaları10 , 11,12aracılığıyla biyomoleküllerin hızlı hücre içi alımına izin veren çevre medyada mikro akış etkilerine neden olur. Sonoporasyon hücrelere hızlı moleküler teslimat için etkili bir tekniktir, ancak bu yaklaşım genellikle ultrason maruz kalma koşullarında daha düşük verim ve daha yüksek değişkenlik ile sınırlı olan pahalı ekipman ve toplu tedavi yöntemleri gerektirir13. Bu sınırlamaları gidermek için, süspansiyondaki hücrelerin tutarlı bir şekilde sonoporasyonunu sağlayan akostofluidik cihazlar şu anda geliştirilmektedir.
Akostofluidikler, çok çeşitli uygulamalar için ultrason ve mikroakışkan teknolojileri entegre eden genişleyen bir alandır. Bu yaklaşım daha önce akışkan kanallar içinde ayakta duran akustik dalgaları teşvik etmek için sürekli ultrason enerjisi uygulanarak partikül ayırma için kullanılmıştır14,15,16,17. Parçacıklar, orta16'yagöre parçacık boyutu, yoğunluk ve sıkıştırılabilirlik gibi çeşitli özelliklere göre cihazın farklı bölümlerine doğru sıralanır. Akostofluidik teknolojiler de araştırma uygulamaları ve hücre tedavilerinin üretimi için çeşitli hücre tiplerine hızlı moleküler teslimat sağlamak için geliştirilmektedir18. Son zamanlarda, PDMS tabanlı bir akostofluidik cihaz kullanarak eritrositlere gelişmiş moleküler teslimat gösterdik19. Akostofluidik platformda, hücre ve mikrobubble dinamikleri, biyomoleküllerin daha iyi sunulmasını sağlayan fiziksel etkileşimleri teşvik etmek için manipüle edilebilir. Hücre içi moleküler teslimatın verimliliği ve tutarlılığı, hücreler ve mikrobubbles arasındaki mesafe optimize edilerek potansiyel olarak artırılabilir.
Akostofluidik aracılı sonoporasyon için önemli bir uygulama, biyomoleküllerin birincil insan T hücrelerine taşınmayı içerir. Chimeric Antijen Reseptör T hücre (CAR T) tedavisi gibi benimsenen T hücre transferine dayanan immünoterapiler, kanser ve HIV20gibi virüsler de dahil olmak üzere çeşitli hastalıkların tedavisi için hızla ortaya çıkıyor. CAR T tedavisi özellikle pediatrik akut lenfoblastik lösemi (ALL) hastalarında% 70-90 oranında tam remisyon oranları ile etkili olmuştur21. Bununla birlikte, bu tedaviler için T hücre üretimi genellikle potansiyel eklemeli mutajensis, uzun işlem süreleri ve proteinler veya küçük moleküller gibi genetik olmayan biyomoleküllerin teslimi ile sınırlı olan viral transdüksiyona bağlıdır1. Akostofluidik aracılı moleküler iletim yöntemleri potansiyel olarak bu sınırlamaların üstesinden gelebilir ve T hücre tedavilerinin üretimini artırabilir.
Akostofluidik aracılı sonoporasyon için bir diğer önemli uygulama, donma ve kurumdan çıkma sırasında hücreleri koruyan trehaloz gibi koruyucu bileşiklerin hücre içi teslimatını içerir. Trehaloz, doğadaki bazı organizmalar tarafından üretilir ve hücresel zarlarını koruyarak donma ve kararma tolere etmelerine yardımcı olur22,23. Bununla birlikte, trehaloz memeli hücreleri tarafından üretilmez ve memeli hücre zarlarına geçirimsizdir. Bu nedenle, iç hücresel zarları korumak için yeterli hücre içi trehaloz seviyelerine ulaşmak için sonoporasyon gibi etkili moleküler iletim teknikleri gereklidir. Bu yaklaşım şu anda çeşitli hücre tiplerinin kuru korunması için geliştirilmektedir.
Bu protokol, bir mikrodenetleyici tarafından yönlendirilen nispeten düşük maliyetli bir akostofluidik sistemin montajı ve çalışmasının ayrıntılı bir açıklamasını sağlar. Ultrason kontrast ajanları akışkan kanallar içinde sonoporasyon indükleme teşvik etmek ve T hücreleri ve kanser hücreleri de dahil olmak üzere çeşitli hücre tiplerine hızlı moleküler teslimat sağlamak için kullanılır. Bu akostofluidik sistem çeşitli araştırma uygulamaları için kullanılabilir ve aynı zamanda geliştirilmiş hücre tedavisi üretim süreçleri için sonoporasyon yöntemlerini değerlendirmek için bir prototip sistem olarak yararlı olabilir.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Louisville Üniversitesi'ndeki kurumsal inceleme kurulu tarafından onaylanan protokollerin ardından sağlıklı bağışçılardan tam kan bağışı toplandı.
1. Akostofluidik cihazın imalatı
- 500 μm çapında kanallar içeren eşmerkezli spiral tasarımlı bir fotomask elde edin. Örnek olarak ek dosyalarda bir CAD dosyası sağlanır. Özel bir foto maskesi ticari bir satıcıdan sipariş edilebilir veya maske yazıcısı kullanılarak desenlenebilir.
- Standart fotolithografi tekniklerini kullanarak fotoresist kaplı silikon gofret üzerine eşmerkezli spiral tasarımın bir kalıbını hazırlayın.
- 100 mm'lik silikon gofrete yaklaşık 2 yemek kaşığı (~30 mL) SU-8 2100 ekleyin.
- Fotoresisti yaymak için 30 s için 150 rpm hızında bir spinner üzerinde gofreti döndürün, ardından 200 μm kalınlığında bir kalınlık elde etmek için hızı 60 s için 1.200 rpm'ye çıkarın.
- Fotoresist kaplı gofreti 30 dk rampa yukarı ve 115 °C'de 30 dk oturma ile poliimid vakum fırınında tedavi edin, ardından 30 dakika rampa aşağı.
- Fotoresist kaplı gofreti, 1.1.
- Gofret, 1.2.3 adımında açıklanan işlemi izleyerek pozlamadan sonra pişirin.
- Fotoresisti SU-8 geliştirici çözümünde yaklaşık 8 dakika geliştirin.
DİkKAT: Geliştirici çözümünü yalnızca iyi havalandırılmış bir kimyasal duman başlığında kullanın.
- Yüzeyi daha hidrofobik hale getirmek için kalıbı silanize edin. Fotoresist kaplı gofreti bir kurutucuya yerleştirin ve 20 μL'lik bir klorosilane damlası ekleyin (C8H4Cl3F13Si). Odaya 30 s için vakum uygulayın, ardından odayı kapatın ve gece boyunca bırakın.
DİkKAT: Klorosilane çok tehlikeli ve yanıcıdır. Maruz kalma ciddi yanıklara ve göz hasarına neden olur. - 54 g polidimethsiloxane (PDMS) tabanı ve 6 g kür maddesini bir bardakta birleştirin ve en az 1 dakika boyunca bir spatula ile kuvvetlice ve iyice karıştırın.
- PDMS çözeltisini içeren kabı yaklaşık 30 dakika boyunca veya çözeltiden kalıntı hava kabarcıkları çıkarılana kadar bir kurutucuya yerleştirin.
- Fotoresist kaplı gofreti, desenleri yukarı bakacak şekilde 150 mm Petri kabına yerleştirin.
- PDMS çözeltisini 150 mm Petri kabının içindeki kalıbın üzerine dökün.
- Gerekirse, 150 mm Petri kabını bir kurutucunun içine yerleştirin ve kalıntı hava kabarcıkları kaybolana kadar vakum uygulayın.
- 150 mm'lik Petri kabını bir laboratuvar fırınına aktarın ve PDMS'yi iyileştirmek için 60 °C'de 2 saat pişirin.
- Kürlemeden sonra, bir jilet kullanarak gofretin kenarlarını keserek PDMS'yi Petri kabından dikkatlice çıkarın.
- Her bir cihazı bir bıçak veya jilet kullanarak kesin.
- 2,5 mm biyopsi zımba kullanarak her cihazın giriş ve çıkış bağlantı noktalarında delikler açın.
- Her PDMS cihazını, kanalları açıkta (yukarı bakacak şekilde) bir plazma asher içine yerleştirin. Oksijen plazması tedavisi uygulayın (45 s için 100 W, 500 mbar O2)ardından her PDMS cihazını derhal cam yüzeye bakan kanallarla temiz bir soda kireç camı mikroskop kaydırağı (75 mm x 25 mm x 1 mm) üzerine yerleştirin.
- Cihazların oda sıcaklığında gece boyunca bağlanmasına izin verin.
- 1 cm çapındaki piezo dönüştürücünün yüzeyine ~1-2 mm kalınlığında silikon uygulayın, ardından dönüştürücüsü eşmerkezli spiralle dikkatlice hizalayın ve cam mikroskop slaydının altına (PDMS cihazının karşı tarafı) hafifçe bastırın.
2. Akostofluidik sistemin montajı ve işletilmesi
- USB A-B kablosu kullanarak bir mikrodenetleyiciyi bilgisayara bağlayın. Yeşil güç LED göstergesi (PWR etiketli) yanmalıdır.
- 8 MHz sinyal üreten bir program yüklemek için bilgisayardaki ilişkili programı kullanın. Ek Files alanında örnek bir programsağlanmıştır. Programı yükledikten sonra mikroişlemci belleğine depolanacak ve tekrar yüklenmesi gerekmeyecektir.
- PZT dönüştürücüs üzerindeki her telin sonuna 1" 22G tel lehimleyin.
- PZT dönüştürücünün negatif (siyah) terminal telini lehimli tel üzerinden bir GND pimine bağlayın.
- PZT dönüştürücünün pozitif (kırmızı) terminal telini lehimli tel üzerinden çıkış pimine (sağlanan örnek programda #9) bağlayın.
- İsteğe bağlı olarak, akostofluidik cihazı ve mikrodenetleyiciyi 3D baskılı bir kasaya monte edin. CAD dosyaları örnek olarak Supplemental Files sağlanmaktadır. Harici bir LED göstergesini ve istenirse açma/kapa basma düğmesini kontrol etmek için diğer mikrodenetleyici pimlerine ek kablolar bağlanabilir.
- Tygon PVC yumuşak plastik borunun 3-6" bölümlerini kesin (1/16" ID, 1/8" OD) ve boruyu giriş ve çıkış bağlantı noktalarına itin. Açıklığa oturana kadar basınç uygularken boruyu döndürmek gerekebilir. İsteğe bağlı olarak, boruyu her bağlantı noktasına yerleştirdikten sonra, PDMS ve boruyu birbirine yapıştırmak için kavşakta tutkal uygulanabilir.
- Mikroakışkan rezervuarı üreticinin talimatlarına göre monte edin.
- Tygon PVC yumuşak plastik borunun 3-6" bölümünü kesin (1/16" ID, 1/8" OD) ve boruyu mikroakışkan rezervuar çıkış borusundan 1/32" kimlik tüpünün üzerine itin. İsteğe bağlı olarak, sızıntıyı önlemek için kavşağı parafin filmi ile sarın.
- 60 mL'lik bir şırıngayı ortam havasıyla doldurun (isteğe bağlı olarak, havayı 0,2-μm filtre ile filtreleyin) ve mikroakışkan rezervuarın yan tarafındaki tygon PVC boruya (1/16" ID, 1/8" OD) bağlayın.
- Hücre/ultrason kontrast maddesi çözümlerini akostofluidik cihaz üzerinden 50 mL/s hacimsel akış hızında itmek ve akostofluidik cihazın çıkışından alınan numuneleri 50mL santrifüj tüpüne toplamak için şırıng pompasını 200 mL/s hıza ayarlayın. İsteğe bağlı olarak, akışkan kanalların sterilitesini artırmak için 15 mL%70 etanol çözeltisi ile akostofluidik tedaviden önce kanalı durulayın. Ek olarak, kanallar, sistem üzerinden hücre pompalamadan önce cihazdaki artık etanolleri gidermek için 15 mL deiyonize su ile durulanabilir.
3. Ultrason kontrast ajanlarının hazırlanması
NOT: Ultrason kontrast ajanları, yakındaki hücresel zarların kalıcılaşmasını geçici olarak artırarak moleküler bileşiklerin akostofluidik teslimatını önemli ölçüde arttırır19. Bu sistemde ultrason kontrast ajanları olmadan moleküler teslimat çok sınırlıdır.
- Aşağıdaki karışımı içeren 20mL scintillation şişesinde bir fosfolipid çözeltisi hazırlayın:
- 25 mg 1,2-distearoyl-sn-glisero-3-fosfokolin (DSPC) ekleyin.
- 11,6 mg 1,2-distearoyl-sn-glisero-3-etilfosfokolin (DSEPC) ekleyin.
- 0.26 mg 1,2-distearoyl-sn-glisero-3-fosfoglillerol (DSPG) ekleyin.
- 0.88 mg polioksitilen40 stearat ekleyin.
- Tüm fosfolipidler çözülene kadar kloroform ekleyin (örneğin, 3 mL kloroform).
- Kuru bir lipid filmi oluşturmak için 48 saat boyunca bir kurutucuda buharlaşma kloroformu (kurutma işlemini hızlandırmak için argon altında veya döner evaporatör ile buharlaşma kullanılabilir).
- Lipid filmini 10 mL steril fosfat tamponlu salin (PBS) ile yeniden sulandırın.
- Katyonik bir misel çözeltisi oluşturmak için lipid çözeltisini% 40 genlikte 3 dakika boyunca sonicate edin.
- Sonication sonra fosfolipid çözeltisini 2-6 ° C'de 1 aya kadar saklayın.
- Ultrason kontrast ajanları hazırlamak için, 2 mL cam septum şişesine 200 μL katyonik misel çözeltisi ve 600 μL steril PBS ekleyin.
- Kapağı kırparak şişeyi kapatın.
- Şişe kafası alanını 30 sn için kafeinsiz gazla doldurmak için 1,5" 20G iğne kullanın.
- Şişeyi 45 sn 4.350 cpm'de bir araya toplayarak perflorobütane gaz dolu ultrason kontrast ajanları oluşturur.
- Kombine kontrast maddesi/hücre karışımını akostofluidik cihaz üzerinden pompalamadan hemen önce 1 mL hücre çözeltisi başına 25 μL ultrason kontrast maddesi çözeltisi ekleyin. Hücre çözeltisi kullanıcı tarafından istenildiği gibi değiştirilebilir, ancak çalışmalarımızda hücre çözeltisi sırasıyla adım 4.21'deki birincil T hücrelerinden ve 5.7.
4. Birincil Tcell'lerin hazırlanması
- Periferik kan mononükleer hücrelerini (PBMC' ler) tam kan çözeltilerinden izole edin ve -150 °C'de saklayın. Bir substrat içeren yoğunluk gradyan ayrımı, PBMC'leri tam kandan ayırmak için yaygın olarak kullanılır24,25,26.
- Donmuş şişeyi 37 °C su banyosunda çözün.
- Çözülen PBMC'leri 15mL santrifüj tüpünde PBS ile 1:10 seyreltin. Her 1mL şişe yaklaşık 10 milyon PBMC içerir.
- Santrifüj seyreltilmiş PBMC'ler 580 x g'da 4 °C'de 11 dakika boyunca seyreltilmiştir.
- Üst katmanı aspire edin ve hücreleri yeniden canlandırmak için arabellek çalıştıran 13 mL MAC ekleyin.
- PBMC'leri otomatik hücre sayacı veya hemositometre ile sayın.
- PBMC'leri 4 °C'de 11 dakika boyunca 580 x g'da tekrar santrifüj edin ve süpernatantı aspire edin.
- 10 milyon PBMC başına 40 μL soğutulmuş çalışan tampon ekleyin.
- T hücrelerini izole etmek için, 10 milyon PBMC başına 10 μL Pan T Hücreli Biotin Antikor Kokteyli ekleyin.
- PBMC'leri hafifçe ajite edin ve çözeltiyi 10 milyon hücre başına 5 dakika boyunca 4 °C'de saklayın.
- 10 milyon PBMC başına 30 μL çalışan tampon ve 20 μL Pan T Hücreli MikroBead Kokteyli ekleyin.
- PBMC'leri ve boncukları iyice karıştırın ve 4 °C'de 15 dakika daha kuluçkaya yatırın.
- Toplam 500 μL hacme ulaşmak için çalışan arabellek ekleyin.
- Birincil T hücrelerini, üreticinin protokolünü izleyen "ayırmayı tüketir" ayarını kullanarak ticari olarak kullanılabilen tezgah üstü manyetik sıralama cihazıyla ayırın. Bu adım hücre sıralamadan sonra 5-10 milyon T hücre arasında verim vermelidir.
- Otomatik bir hücre sayacı veya hemositometre kullanarak T hücrelerini sayın.
- T hücrelerini 10 mL steril PBS'de seyreltin ve hücreleri peletmek için 4 °C'de 10 dakika boyunca 580 x g'da santrifüj.
- Üst tınıyı apire edin ve T hücrelerini 1 mL PBS'de yeniden diriler.
- Deneyler için otomatik hücre sayacı veya hemositometre ve aliquot 1 milyon/mL kullanarak T hücrelerini sayın.
- PBS'de 1 mg/mL floresan çözeltisi hazırlayın.
- İşlemeden hemen önce 1 mL T hücre çözeltisi başına 100 μL 1 mg/mL floresan çözeltisi (son floresan konsantrasyonu = 100 μg/mL) ekleyin.
- Adım 3.11'de daha önce açıklandığı gibi 25 μL ultrason kontrast maddesi çözeltisi ekleyin.
- Akostofluidik sistemi kullanarak hücrelerin 1mL aliquotlarını işleyin (bkz. adımlar 2.10-2.11). Bu adım, floresanin birincil T hücrelerine teslimini artırır.
- Tedaviden hemen sonra, hücre dışı floresan çıkarmak için hücreleri 500 μL PBS ile 10 dakika boyunca 580 x g'da santrifüjleme yoluyla üç kez yıkayın. Hücreler floresan çözeltisi ekledikten sonra 10 dakika içinde yıkanmalıdır.
- Son yıkama adımından sonra, hücreleri 250 μL PBS'de yeniden biriktirin ve akış sitometresunda floresan ölçün.
5. A549 akciğer kanseri hücrelerinin hazırlanması
- Kültür A549 (adenokarsinomik insan alveolar bazal epitel) hücreleri tam DMEM ortamlarında (%10 fetal sığır serumu, %1 penisilin/streptomisin) 37 °C'de ve%5 CO 2 düz-dip doku kültürü şişesinde.
- %70-90 izdiah süresine ulaştıklarında A549 hücrelerini hasat edin. Medyayı şişeden aspire edin ve serum proteinlerini çıkarmak için hücreleri PBS ile bir kez yıkayın.
- Şişeye tripsin (%0,25) EDTA ekleyin ve 37 °C'de 5 dakika kuluçkaya yatırın. Tripsin, hücrelerin doku kültürü şişesinin alt yüzeyinden kopmasını sağlayan bir sindirim enzimidir.
- Tripsin çözeltisini 15mL santrifüj tüpüne aktarın ve 1:3 oranında komple DMEM ortam ekleyerek nötralize edin.
- Hücreleri santrifüjleme yoluyla 4 °C'de 5 dakika boyunca 1.500 x g'da peletle.
- 15 mL konik şişede 200 mM trehaloz içeren PBS çözeltisinde 100.000/mL konsantrasyonda peleti epire edin ve yeniden kullanın.
- Adım 3.11'de daha önce açıklandığı gibi 25 μL ultrason kontrast maddesi çözeltisi ekleyin.
- Akostofluidik sistemi kullanarak hücrelerin 1mL aliquotlarını işleyin (bkz. adımlar 2.10-2.11). Bu adım, trehalozun A549 akciğer kanseri hücrelerine teslimini artırır.
- Tedaviden hemen sonra, hücre dışı trehalozu çıkarmak için hücreleri 500 μL PBS ile santrifüjleme yoluyla üç kez yıkayın. Hücreler trehaloz çözeltisi ekledikten sonra 10 dakika içinde yıkanmalıdır.
- Son yıkama adımından sonra, hücreleri 100 μL PBS'de yeniden biriktirin.
- Lyse hücrelerine 11 μL%1 Triton X-100 çözeltisi ekleyin ve hücre içi trehaloz salgıleyin.
- 15 sn için girdap, daha sonra oda sıcaklığında 30 dakika kuluçkaya yaslanın.
- 15 s için tekrar girdap, daha sonra üreticinin tavsiyesine uyarak ticari olarak mevcut trehaloz testini kullanarak trehaloz konsantrasyonunu ölçün.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
3D baskılı bir kasanın içine monte edilmiş akostofluidik sistemin bir görüntüsü Şekil 1'de gösterilmiştir. Bu protokol, ultrason kontrast ajanları kullanarak birden fazla hücre hattında hücre içi moleküler teslimatı geliştirmek için kullanılabilecek bir akostofluidik sistem üretir.
Şekil 2 tedavi edilmemiş bir kontrol grubuna kıyasla akostofluidik tedavi ile birincil insan T hücrelerine floresan bileşik olan floresan bileşiğin gelişmiş hücre içi doğumunun göstermektedir(p<0.05, n=3/grup). T hücreleri PBS'de 100 μg/mL floresan çözeltisi ve 25 μL/mL ultrason kontrast maddesi çözeltisi ile 1 milyon/mL konsantrasyonda askıya alındı ve karışım ultrason tedavisi için akostofluidik cihazdan geçirildi. Hücre içi floresan iletimi ve hücre canlılığı, hücre dışı floresanları gidermek için santrifüjleme yoluyla hücreleri yıkadıktan sonra akış sitometrisi ile ölçüldü. Tedavi edilmeyen kontrol grubundaki T hücreleri de 100 μg/mL floresan çözelti ile PBS'de 1 milyon/mL'de askıya alınmış, ancak ultrason kontrast ajan çözeltisi eklenmemiş ve hücreler akostofluidik cihazdan geçirilmemiştir. T hücrelerinin floresan yoğunluğu, tedavi edilmeyen kontrol grubundaki T hücrelerinin floresan yoğunluğuna göre akostofluidik tedaviden sonra 5 kat artarak floresanların gelişmiş doğumunun sağlandığını gösterir. Akostofluidik tedaviden sonra hücre canlılığı biraz azaldı, ancak %80'in üzerinde kaldı (p<0.05, n=3/grup).
Şekil 3, koruyucu bileşik trehalozun, tek başına akışa kıyasla akostofluidik tedavi ile insan A549 akciğer karsinom hücrelerine (ultrason kontrast ajanları veya ultrason maruziyeti yoktur) ve tedavi edilmemiş kontrol grubundaki hücrelere (ANOVA p<0.05, n=3/grup) karşılaştırıldığında gelişmiş hücre içi doğumunu göstermektedir. A549 hücreleri PBS'de 200 mM trehaloz çözeltisi ve 25 μL/mL ultrason kontrast maddesi çözeltisi ile 100.000/mL konsantrasyonda askıya alındı ve karışım ultrason tedavisi için akostofluidik cihazdan geçirildi. Kontrol gruplarındaki A549 hücreleri ("Sadece Akış" ve "Tedavi Yok") da PBS'de 200 mM trehaloz ile 100.000/mL'de askıya alınmış, ancak ultrason kontrast ajan çözeltisi eklenmemiş ve hücreler ultrason tedavisine maruz kalmamıştır. Hücre içi trehaloz, trehaloz test kiti kullanılarak ölçüldü ve tedavi edilmeyen kontrol grubuna normalleştirildi. Hücre canlılığı trypan mavisi test ile ölçüldü. Gruplar arasında hücre canlılığında istatistiksel bir fark yoktu (n=3-7/grup).
Şekil 1: Akostofluidik sistemin fotoğrafı. Akostofluidik akış sistemi, bir mikrodenetleyici tarafından tahrik edilen entegre bir PZT dönüştürücüye sahip PDMS tabanlı bir akış odası içerir. LED göstergesine ve açma/kapa düğmesine sahip 3D baskılı kasa isteğe bağlı ek özelliklerdir. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.
Şekil 2: Akostofluidik tedavi insan T hücrelerine fluorescein doğumunu artırır. (A) Primer T hücrelerinde floresan yoğunluğu, tedavi edilmeyen kontrol grubuna (akostoflüidik ve mikrobubbles yok) kıyasla floresan ile akostoflüidik tedaviden sonra artmıştır (p<0.05, n=3/grup). (B) Aktostofluidik tedaviden sonra hücre canlılığı biraz azaldı, ancak akış sitometrisi ile ölçüldüğünde% 80'in üzerinde kaldı(p<0.05, n=3/grup). (C) Akostofluidik tedavi grubunda daha yüksek floresan gösteren temsili akış sitometri histogramı. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.
Şekil 3: Akostofluidik tedavi,insan akciğer kanseri hücrelerine t rehaloz doğumunu artırır. (A) Trehalose alımı A549 akciğer karsinom hücrelerinde sadece akışa (ultrason ve mikrobubbles yok) ve tedavi edilmemiş kontrol grubuna (ANOVA p<0.05, n=3/grup) göre artmıştır. (B) Trippan mavisi test (n=3-7/grup) ile ölçülen akostofluidik tedaviden sonra hücre canlılığı %90'ın üzerinde kaldı. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.
Ek dosyalar. Bu dosyayı indirmek için lütfen tıklayınız.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Bu protokol, araştırma uygulamaları için biyomoleküllerin hücre içi teslimatını geliştiren düşük maliyetli bir akostofluidik sistemin montajını ve çalışmasını açıklar. Bu sistemi kurarken ve çalıştırırken göz önünde bulundurulacak birkaç önemli faktör vardır. Akostofluidik cihaz, tutarlı kanal boyutları27ile kolayca kalıplanabilen biyouyumlu bir malzeme olan PDMS'de üretilmiştir. Cihaz kanalları, kültürlü hücrelerle çalışırken steriliteyi artırmak için akostofluidik işlemden önce 15 mL%70 etanol çözeltisi ile durulanabilir. Etanol temizliğinden sonra, hücre çözeltileri eklemeden önce kanallardan artık etanolleri çıkarmak için cihazı durulamak için 15 mL deiyonize su kullanılabilir. Küçük akostofluidik kanallar enkaz veya hücre agregaları tarafından kolayca engellenebilir, bu da bunu cihazın sık kullanımı için bir sınırlama haline getirir. Kanalları her numune arasında iyice durulamak, kanal tıkanıklığı ile ilgili sorunların önlenmesine yardımcı olacaktır. Ayrıca, gerektiğinde cihazların hızlı bir şekilde değiştirilebilmesi için her partide birden fazla PDMS cihazı üretilebilir. Ultrason tabanlı uygulamalar için, PDMS kalınlığındaki farklılıklar akışkan kanallardaki ultrason basınçlarını etkileyebileceği için tutarlı bir kalınlıkta PDMS cihazlarının üretilmesi önemlidir. Ultrason dalgaları cihaz boyunca sürekli yayılır ve iletilen dalgalar yansıyan dalgalarla etkileşime girerek PDMS kalınlığındaki farklılıklara karşı çok hassas duran akustik dalga desenleri oluşturur17. PDMS kalınlığı öncelikle kalıba eklenen PDMS miktarına göre belirlenir (adım 1.7) ve bu protokol 3,5 mm PDMS kalınlığı verir.
Mikrodenetleyicinin maksimum çıkış frekansı (8 MHz), akışkan kanal içindeki en küçük akustik dalga boyunun üretilmesi için seçildi. Mikrodenetleyici çıkışı tipik olarak kare bir dalgadır, ancak osiloskop ölçümleri, 8 MHz'deki çıkışın sürtünme hızı sınırlamaları nedeniyle sinüzoid dalga formuna daha benzer hale geldiğini ortaya koydu. Bu sistemin bir sınırlaması, mikrodenetleyicinin maksimum voltaj çıkışının 5V olması ve daha yüksek voltaj çıkışları isteniyorsa harici bir RF amplifikatörün gerekli olmasıdır. Bu sistemdeki dönüştürücünün serbest alan basınç çıkışı, iğneli hidrofonla (Precision Acoustics, Dorchester, Birleşik Krallık) ölçüldüğü gibi 1 cm'de 18 kPa idi. Bu basınç nispeten düşük olmasına rağmen, kanallar içindeki ayakta duran dalgalar, örneklerin ultrason ışınlarından geçerken maruz kaldıkları akustik basınçları artırabilir.
Ultrason kontrast ajanları hücre zarları arasında biyomoleküllerin teslimini artıran akostofluidik kanallar içinde akustik kavitasyon nucleate için kullanılır28,29. Bu protokol, katyonik fosfolipid membran ile kapsüllenmiş perflorokarbon gaz dolu mikrobubbles sentezini açıklar. Daha önce açıklandığı gibi, bu formülasyon öncelikle30çapı 1-3 μm arasında mikrobubbles oluşur. Mikrobubbles pozitif yüklü yüzey negatif yüklü hücre zarlarına doğru onları çeker, bu da mikrobubbles ve hücreler yakın olduğunda sonoporasyon aracılı moleküler teslimatı artırır. Hücre çözeltislerindeki mikrobubbles konsantrasyonu, akostofluidik tedaviden sonra moleküler iletim ve hücre canlılığının verimliliğini etkileyebilecek kritik bir faktördür ve optimal mikrobubble konsantrasyonu her hücre tipine özgü olabilir 19. Lipid kabuğu ile gaz dolu mikrobubbles konsantrasyonu sentezden sonra zamanla azalabilir, bu nedenle ultrason kontrast ajanları sentezden sonraki birkaç saat içinde kullanılmalıdır.
Bu protokolde akostofluidik sistemi kullanarak birincil aktive edilmemiş insan T hücrelerine floresan bileşik (floresan) teslim edildiğini gösterdik. Birincil insan T hücrelerinin aktivasyon durumunun hücre içi moleküler teslimatın verimliliğini etkileyebileceğini belirtmek önemlidir. Floresanin floresan özellikleri akış sitometrisi ile hassas hücre içi tespiti sağlar, ancak diğer çözünür bileşikler de bu akostofluidik sistem kullanılarak hücrelere teslim edilebilir. Örneğin, trehalozun insan akciğer kanseri hücrelerine akostofluidik doğumunu gösterdik. Trehalozun hücrelere akostofluidik olarak teslimi, dondurulmuş ve kuru depolamadan sonra daha fazla geri kazanım sağlayabilir, bu da bir dizi biyomedikal ve araştırma uygulaması üzerinde önemli etkilere sahip olabilir 19.
Proteinler veya DNA plazmidleri gibi diğer biyomoleküllerin akostofluidik teslimatı da mümkündür, ancak bu sistemin bir sınırlaması moleküler teslimatın verimliliğinin daha büyük bileşikler için daha düşük olabileceğidir18,31. Diğer biyomoleküllerin teslimi için akostofluidik akış hızının optimizasyonu, ultrason kontrast ajanlarının konsantrasyonları, hücre konsantrasyonları ve ortam gerekebilir. Ek olarak, optimal parametreler hücre çapı, morfoloji, membran özellikleri ve fenotip gibi faktörler nedeniyle farklı hücre tipleri arasında değişebilir.
Bu protokolde açıklanan akostofluidik sistem kolayca monte edilebilir ve nispeten düşük maliyetle çalıştırılabilir. Ek olarak, bu sistem belirli çıkış basınçları ve frekansları32 , 33,34oluşturmak için diğer sinyal kaynakları veya ultrason dönüştürücüleri bağlanarak diğer uygulamalar için özelleştirilebilir. Ayrıca bu protokolde açıklanan şırınna pompa sistemi istenirse peristaltik pompalarla değiştirilebilir. 50 mL/h akış hızında, akostofluidik kanaldan geçerken ultrason ışını içindeki hücrelerin oturma süresi yaklaşık 1 s'dir, ancak bu oturma süresi sıvı akış hızını ayarlayarak belirli uygulamalar için gerektiği gibi değiştirilebilir.
Diğer yaygın transfeksiyon tekniklerinin aksine, biyomoleküller saatler yerine dakikalar içinde hücrelere teslim edilebilir ve bu sistem özel ve pahalı ekipman gerektirmez. Buna ek olarak, bu sistem yaygın olarak kullanılan hücre kültürü ortamları veya diğer arabellekler çok çeşitli ile uyumludur. Özetle, bu akostofluidik sistem, biyomoleküllerin hücrelere hızlı bir şekilde ulaştırılmasını sağlar ve bu da çok çeşitli araştırma uygulamaları için yararlı olabilir.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Ortak yazarlar MAM ve JAK, bu araştırmayla ilgili ürünlerden finansal olarak yararlanabilecek DesiCorp'un mülkiyetine sahiptir.
Acknowledgments
Bu çalışma kısmen Ulusal Bilim Vakfı (#1827521, #1827521, #1450370) ve Ulusal Sağlık Enstitüleri (U01HL127518) tarafından finanse edildi. Louisville Üniversitesi Mikro/Nano Teknoloji Merkezi tarafından fotolithografi hizmeti verildi.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Fabrication of Acoustofluidic Device | |||
| DOW SYLGARD 184 SILICONE ENCAPSULANT CLEAR 0.5 KG KIT | Ellsworth Adhesives | 4019862 (SKU) | https://www.ellsworth.com/products/by-market/consumer-products/encapsulants/silicone/dow-sylgard-184-silicone-encapsulant-clear-0.5-kg-kit/ |
| Harris Uni-Core (2.5 mm) | Electron Microscopy Sciences | 69039-25 | |
| Microfluidic Reservoir for 15 mL Falcon Tube - S (2/4 port) | Darwin Microfluidics | LVF-KPT-S-2 (SKU) | https://darwin-microfluidics.com/products/15-ml-falcon-tube-microfluidic-reservoir-s-2-4-port |
| Microscope Slide | VWR | 16004-430 | https://us.vwr.com/store/product/4646174/vwr-vistavisiontm-microscope-slides-plain-and-frosted-premium |
| trichlorosilane | Gelest | 105732-02-3 (Cas. No.) | Chlorosilane is very hazaradous and flammable. Exposure causes severe burns and eye damage. |
| Tygon PVC soft plastic tubing (1/16" ID, 1/8" OD) | McMaster-Carr | 5233K51 (Part #) | https://www.mcmaster.com/pvc-tubing/soft-tubing-for-air-and-water/ |
| Assembly of Acoustofluidic System | |||
| Arduino Uno | Arduino | 7630049200050 (Barcode) | https://store.arduino.cc/usa/arduino-uno-rev3 |
| Preparation of Ultrasound Contrast Agents | |||
| 1,2-distearoyl-sn-glycero-3-ethylphosphocholine (DSEPC) | Avanti Lipids | 890703P-25mg (SKU) | https://avantilipids.com/product/890703 |
| 1,2-distearoyl-sn-glycero-3-phosphocholine (DSPC) | Avanti Lipids | 850365P-25mg (SKU) | https://avantilipids.com/product/850365 |
| 1,2-distearoyl-sn-glycero-3-phosphoglycerol (DSPG) | Avanti Lipids | 840465P-25mg (SKU) | https://avantilipids.com/product/840465 |
| APF-140HP (decafluorobutate gas) | FlouroMed | 355-25-9 (Cas No.) | http://www.fluoromed.com/products/perfluorodecalin/ |
| DB-338 Amalgamators | COXO | https://www.coxotec.com/coxo/db-338-amalgamators/ | |
| polyoxyethylene 40 stearate | Sigma-Aldrich | P3440-250G (SKU) | https://www.sigmaaldrich.com/catalog/product/sigma/p3440?lang=en®ion=US&gclid= Cj0KCQjwy8f6BRC7ARIsAPIXOjjj Jh_151mYVEUyLZRavt4re9YQMLS vID64X-1KbO3LUKGjVUwb PDAaAqvOEALw_wcB |
| Q125 Sonicator | Qsonica | Q125-110 (Ref.) | https://www.sonicator.com/products/q125-sonicator?_pos=1&_sid=406df3776&_ss=r |
| Preparation of Primarty T Cells | |||
| autoMACs running buffer | Miltenyi Biotec | 130-091-221 (Order No.) | https://www.miltenyibiotec.com/US-en/products/automacs-running-buffer-macs-separation-buffer.html#gref |
| Pan T Cell Isolation Kit, human (Pan T-Cell Biotin Antibody Cocktail & Pan T-Cell MicroBead Cocktail) | Miltenyi Biotec | 130-096-535 (Order No.) | https://www.miltenyibiotec.com/US-en/products/pan-t-cell-isolation-kit-human.html#130-096-535 |
| magnetic cell sorter (autoMACS Pro Separator) | Miltenyi Biotec | 130-092-545 (Order No.) | https://www.miltenyibiotec.com/US-en/products/automacs-pro-separator-starter-kit.html#130-092-545 |
| Preparation of A549 Lung Cancer Cells | |||
| Trehalose Assay Kit | Megazyme | K-TREH (Cat. No.) | https://www.megazyme.com/trehalose-assay-kit |
| Trypan blue (0.4% in aqueous solution Ready-to-Use, sterile) | VWR | 97063-702 (Cat. No.) | https://us.vwr.com/store/product/7437427/trypan-blue-0-4-in-aqueous-solution-ready-to-use-sterile |
References
- Gardlik, R., et al. Vectors and delivery systems in gene therapy. Medical Science Monitor. 11 (4), 110-121 (2005).
- Wahlers, A., et al. Influence of multiplicity of infection and protein stability on retroviral vector-mediated gene expression in hematopoietic cells. Gene Therapy. 8 (6), 477-486 (2001).
- Nayerossadat, N., Maedeh, T., Ali, P. A. Viral and nonviral delivery systems for gene delivery. Advanced Biomedical Research. 1, 27 (2012).
- Chen, C., Smye, S. W., Robinson, M. P., Evans, J. A. Membrane electroporation theories: a review. Medical & Biological Engineering & Computing. 44 (1-2), 5-14 (2006).
- Gehl, J. Electroporation: theory and methods, perspectives for drug delivery, gene therapy and research. Acta Physiologica Scandinavica. 177 (4), 437-447 (2003).
- Lin, Y. C., Li, M., Wu, C. C. Simulation and experimental demonstration of the electric field assisted electroporation microchip for in vitro gene delivery enhancement. Lab on a Chip. 4 (2), 104-108 (2004).
- Sugar, I. P., Neumann, E. Stochastic model for electric field-induced membrane pores. Electroporation. Biophysical Chemistry. 19 (3), 211-225 (1984).
- Weaver, J. C. Electroporation: a general phenomenon for manipulating cells and tissues. Journal of Cellular Biochemistry. 51 (4), 426-435 (1993).
- Hashimoto, M., Takemoto, T. Electroporation enables the efficient mRNA delivery into the mouse zygotes and facilitates CRISPR/Cas9-based genome editing. Scientific Reports. 5, 11315 (2015).
- Klibanov, A. L. Microbubble contrast agents: targeted ultrasound imaging and ultrasound-assisted drug-delivery applications. Investigative Radiology. 41 (3), 354-362 (2006).
- Klibanov, A. L., Shevchenko, T. I., Raju, B. I., Seip, R., Chin, C. T. Ultrasound-triggered release of materials entrapped in microbubble-liposome constructs: a tool for targeted drug delivery. Journal of Controlled Release. 148 (1), 13-17 (2010).
- Fan, Z., Kumon, R. E., Deng, C. X. Mechanisms of microbubble-facilitated sonoporation for drug and gene delivery. Therapeutic Delivery. 5 (4), 467-486 (2014).
- Secomski, W., et al. In vitro ultrasound experiments: Standing wave and multiple reflections influence on the outcome. Ultrasonics. 77, 203-213 (2017).
- Gedge, M., Hill, M. Acoustofluidics 17: theory and applications of surface acoustic wave devices for particle manipulation. Lab on a Chip. 12 (17), 2998-3007 (2012).
- Shi, J., et al. Acoustic tweezers: patterning cells and microparticles using standing surface acoustic waves (SSAW). Lab on a Chip. 9 (20), 2890-2895 (2009).
- Shi, J., Huang, H., Stratton, Z., Huang, Y., Huang, T. J. Continuous particle separation in a microfluidic channel via standing surface acoustic waves (SSAW). Lab on a Chip. 9 (23), 3354-3359 (2009).
- Shields, C. W. t, Cruz, D. F., Ohiri, K. A., Yellen, B. B., Lopez, G. P. Fabrication and operation of acoustofluidic devices supporting bulk acoustic standing waves for sheathless focusing of particles. Journal of Visualized Experiments. (109), e53861 (2016).
- Belling, J. N., et al. Acoustofluidic sonoporation for gene delivery to human hematopoietic stem and progenitor cells. Proceedings of the National Academy of Sciences. 117 (20), 10976-10982 (2020).
- Centner, C. S., et al. Ultrasound-induced molecular delivery to erythrocytes using a microfluidic system. Biomicrofluidics. 14 (2), 024114 (2020).
- Qi, J., Ding, C., Jiang, X., Gao, Y. Advances in developing CAR T-cell therapy for HIV cure. Frontiers in Immunology. 11, 361 (2020).
- Annesley, C. E., Summers, C., Ceppi, F., Gardner, R. A. The evolution and future of CAR T cells for B-Cell Acute lymphoblastic leukemia. Clinical Pharmacology & Therapeutics. 103 (4), 591-598 (2018).
- Hand, S. C., Menze, M. A. Molecular approaches for improving desiccation tolerance: insights from the brine shrimp Artemia franciscana. Planta. 242 (2), 379-388 (2015).
- Zhang, M., et al. Freeze-drying of mammalian cells using trehalose: preservation of DNA integrity. Scientific Reports. 7 (1), 6198 (2017).
- Grievink, H. W., Luisman, T., Kluft, C., Moerland, M., Malone, K. E. Comparison of three isolation techniques for human peripheral blood mononuclear cells: Cell recovery and viability, population composition, and cell functionality. Biopreserv Biobank. 14 (5), 410-415 (2016).
- Jaatinen, T., Laine, J. Isolation of mononuclear cells from human cord blood by Ficoll-Paque density gradient. Current Protocol in Stem Cell Biology. , Chapter 2, Unit 2A 1 (2007).
- Ulmer, A. J., Scholz, W., Ernst, M., Brandt, E., Flad, H. D. Isolation and subfractionation of human peripheral blood mononuclear cells (PBMC) by density gradient centrifugation on Percoll. Immunobiology. 166 (3), 238-250 (1984).
- Halldorsson, S., Lucumi, E., Gomez-Sjoberg, R., Fleming, R. M. T. Advantages and challenges of microfluidic cell culture in polydimethylsiloxane devices. Biosensors and Bioelectronics. 63, 218-231 (2015).
- Helfield, B., Chen, X., Watkins, S. C., Villanueva, F. S. Biophysical insight into mechanisms of sonoporation. Proceedings of the National Academy of Sciences. 113 (36), 9983-9988 (2016).
- Hu, Y., Wan, J. M., Yu, A. C. Membrane perforation and recovery dynamics in microbubble-mediated sonoporation. Ultrasound in Medicine and Biology. 39 (12), 2393-2405 (2013).
- Kopechek, J. A., et al. Ultrasound targeted microbubble destruction-mediated delivery of a transcription factor decoy inhibits STAT3 signaling and tumor growth. Theranostics. 5 (12), 1378-1387 (2015).
- Bhutto, D. F., et al. Effect of molecular weight on sonoporation-mediated uptake in human cells. Ultrasound in Medical Biology. 44 (12), 2662-2672 (2018).
- Forbes, M. M., Steinberg, R. L., O'Brien, W. D. Frequency-dependent evaluation of the role of definity in producing sonoporation of Chinese hamster ovary cells. Journal of Ultrasound in Medicine. 30 (1), 61-69 (2011).
- Helfield, B., Chen, X., Watkins, S. C., Villanueva, F. S. Biophysical insight into mechanisms of sonoporation. Proceedings of National Academy of Science U. S. A. 113 (36), 9983-9988 (2016).
- Miller, D. L., Bao, S., Morris, J. E. Sonoporation of cultured cells in the rotating tube exposure system. Ultrasound in Medical Biology. 25 (1), 143-149 (1999).
