Summary
Questo protocollo descrive l'assemblaggio e il funzionamento di un dispositivo accostofluidico a basso costo per la consegna molecolare rapida alle cellule tramite sonoporazione indotta da agenti di contrasto ad ultrasuoni.
Abstract
Per un'ampia gamma di ricerche biomediche e applicazioni terapeutiche a base cellulare è necessaria un'efficiente fornitura intracellulare di biomolecole. La sonoporazione mediata da ultrasuoni è una tecnica emergente per la rapida consegna intracellulare di biomolecole. La sonoporazione si verifica quando la cavitazione di microbolle riempite di gas forma pori transitori nelle membrane cellulari vicine, il che consente un rapido assorbimento delle biomolecole dal fluido circostante. Le attuali tecniche per la sonoporazione in vitro delle cellule in sospensione sono limitate dalla bassa produttività, dalla variabilità delle condizioni di esposizione agli ultrasuoni per ogni cellula e dall'elevato costo. Per risolvere queste limitazioni, è stato sviluppato un dispositivo acoustofluidico a basso costo che integra un trasduttore ad ultrasuoni in un dispositivo fluido basato su PDMS per indurre una sonoporazione coerente delle cellule mentre scorrono attraverso i canali in combinazione con agenti di contrasto ad ultrasuoni. Il dispositivo è fabbricato utilizzando tecniche di fotolitografia standard per produrre il chip fluido basato su PDMS. Un trasduttore a disco piezografico ad ultrasuoni è collegato al dispositivo e guidato da un microcontrollore. L'assieme può essere integrato all'interno di una custodia stampata in 3D per una maggiore protezione. Cellule e microbolle vengono spinte attraverso il dispositivo utilizzando una pompa per siringa o una pompa peristaltica collegata ai tubi in PVC. Con questo sistema apodtofluidico è dimostrato un migliore recapito di biomolecole alle cellule T umane e alle cellule tumorali polmonari. Rispetto agli approcci di trattamento alla rinfusa, questo sistema acoustofluidico aumenta la produttività e riduce la variabilità, che può migliorare i metodi di lavorazione cellulare per applicazioni di ricerca biomedica e la produzione di terapie a base cellulare.
Introduction
Piattaforme virali e non virali sono state utilizzate per migliorare la consegna molecolare alle cellule. La somministrazione virale (trasduzione) è una tecnica comune utilizzata nelle terapie cellulari che richiedono modifiche genomiche. Le limitazioni con la consegna virale includono potenziale mutagenesi inserimento, capacità transgenica limitata e molteplicità indesiderata diinfezione 1,2. Pertanto, le tecniche di somministrazione molecolare non virale sono in fase di sviluppo per un'ampia gamma di applicazioni biomediche e di ricerca. Le tecniche comuni includono l'energia meccanica, elettrica, idrodinamica o l'uso di energia a base laser per migliorare l'assorbimento delle biomolecole nelle celle 3. L'elettroporazione è una piattaforma di somministrazione molecolare non virale comunemente usata che ha la capacità di indurre perforazione transitoria nella membrana plasmatica per la consegna intracellularedi composti molecolari 4,5,6,7,8,9. Tuttavia, la perforazione transitoria della membrana plasmatica è un processo stocastico e l'assorbimento molecolare tramite elettroporazione dipende generalmente dalla diffusione passiva attraverso i pori della membranatransitoria 4,7,8.
Un metodo alternativo è l'utilizzo degli ultrasuoni per una maggiore erogazione molecolare intracellulare attraverso la cavitazione di agenti di contrasto ad ultrasuoni (cioè microbolle riempite di gas). La cavitazione microbolle induce effetti di microstreaming nei mezzi circostanti che possono causare perforazione transitoria delle membrane plasmatiche vicine ("sonoporazione") consentendo un rapido assorbimento intracellulare delle biomolecole attraverso meccanismi ditrasporto passivi o attivi 10,11,12. La sonoporazione è una tecnica efficace per la rapida consegna molecolare alle cellule, ma questo approccio richiede spesso attrezzature costose e metodi di trattamento alla rinfusa che sono limitati da una minore produttività e da una maggiore variabilità nelle condizioni di esposizione agli ultrasuoni13. Per risolvere queste limitazioni, sono attualmente in fase di sviluppo dispositivi aoustofluididi che consentono una sonoporazione coerente delle cellule in sospensione.
Acoustofluidics è un campo in espansione che integra tecnologie ecografiche e microfluidiche per un'ampia varietà di applicazioni. Questo approccio è stato precedentemente utilizzato per la separazione delle particelle applicando energia ultrasonica continua per indurre onde acustiche stanteall'interno dei canali fluidici 14,15,16,17. Le particelle vengono ordinate verso diverse parti del dispositivo in base a una varietà di proprietà come la dimensione delle particelle, la densità e la comprimibilità rispetto almezzo 16. Sono inoltre in fase di sviluppo tecnologie acoustofluidiche per consentire una rapida consegna molecolare a una varietà di tipi di cellule per applicazioni di ricerca e produzione di terapie cellulari18. Recentemente, abbiamo dimostrato una maggiore consegna molecolare agli erytrociti utilizzando un dispositivo acoustofluidico basato su PDMS19. Nella piattaforma apodtofluidale, la dinamica cellulare e microbolle può essere manipolata per indurre interazioni fisiche che consentono una migliore consegna di biomolecole. L'efficienza e la coerenza dell'erogazione molecolare intracellulare possono potenzialmente essere aumentate ottimizzando la distanza tra cellule e microbolle.
Un'importante applicazione per la sonoporazione mediata dall'acoustofluidico comporta il trasporto di biomolecole nelle cellule T umane primarie. Le immunoterapie basate sul trasferimento adottivo delle cellule T, come la terapia con cellule T del recettore dell'antigene chimerico (CAR T), stanno rapidamente emergendo per il trattamento di varie malattie, tra cui il cancro e virus come l'HIV20. La terapia CAR T è stata particolarmente efficace nei pazienti pediatrici a leucemia linfoblastica acuta (ALL), con tassi di remissione completi del 70-90%21. Tuttavia, la produzione di cellule T per queste terapie dipende generalmente dalla trasduzione virale che è limitata dalla potenziale mutagenesi inserimento, dai lunghi tempi di lavorazione e dalle sfide di fornire biomolecole non genetiche come proteine o piccole molecole1. I metodi di somministrazione molecolare mediati da acoustofluidi possono potenzialmente superare questi limiti e migliorare la produzione di terapie cellulari T.
Un'altra importante applicazione per la sonoporazione mediata dall'austofluidico prevede la somministrazione intracellulare di composti conservanti, come il trealosio, che proteggono le cellule durante il congelamento e l'essiccazione. Il trealosio è prodotto da alcuni organismi in natura e li aiuta a tollerare il congelamento e l'essiccazione proteggendo le loro membrane cellulari22,23. Tuttavia, la trealosio non è prodotta da cellule di mammiferi ed è impermeabile alle membrane cellulari dei mammiferi. Pertanto, sono necessarie efficaci tecniche di somministrazione molecolare, come la sonoporazione, al fine di ottenere livelli di trealosio intracellulari sufficienti necessari per proteggere le membrane cellulari interne. Questo approccio è attualmente in fase di sviluppo per la conservazione a secco di vari tipi di cellule.
Questo protocollo fornisce una descrizione dettagliata dell'assemblaggio e del funzionamento di un sistema acoustofluidico relativamente a basso costo guidato da un microcontrollore. Gli agenti di contrasto ad ultrasuoni vengono utilizzati per indurre la sonoporazione all'interno dei canali fluidici e consentire una rapida consegna molecolare a vari tipi di cellule, tra cui cellule T e cellule tumorali. Questo sistema acoustofluidica può essere utilizzato per una varietà di applicazioni di ricerca e può anche essere utile come sistema prototipo per valutare i metodi di sonoporazione per migliorare i processi di produzione della terapia cellulare.
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Protocol
Le donazioni di sangue intero sono state raccolte da donatori sani a seguito di protocolli approvati dal comitato di revisione istituzionale dell'Università di Louisville.
1. Fabbricazione di dispositivi anotofluidi
- Ottenere una maschera fotografica con un design a spirale concentrico contenente canali con un diametro di 500 μm. Nei file supplementari viene fornito un file CAD come esempio. Una maschera fotografica personalizzata può essere ordinata da un fornitore commerciale o modellata utilizzando uno scrittore di maschere.
- Prepara uno stampo del design a spirale concentrico su un wafer di silicio rivestito di fotoresiste utilizzando tecniche di fotolitografia standard.
- Aggiungere circa 2 Cucchiai (~30 mL) di SU-8 2100 a un wafer di silicio da 100 mm.
- Spin-coat il wafer su uno spinner ad una velocità di 150 giri/min per 30 s per stendere il fotoresist, quindi aumentare la velocità a 1.200 giri/min per 60 s per produrre uno spessore di 200 μm.
- Curare il wafer rivestito di fotoresist in un forno a vuoto in poliimmide con una rampa di 30 minuti e 30 min di retata a 115 °C, quindi scendere per 30 minuti.
- Esporre il wafer rivestito di fotoresist per 130 s utilizzando un allineatore di maschere con la maschera fotografica del passaggio 1.1.
- Cuocere il wafer dopo l'esposizione seguendo lo stesso processo descritto nella fase 1.2.3.
- Sviluppa il fotoresist nella soluzione per sviluppatori SU-8 per circa 8 minuti.
ATTENZIONE: utilizzare la soluzione per sviluppatori solo in una cappa aspirante chimica ben ventilata.
- Sillanizzare lo stampo per rendere la superficie più idrofobica. Posizionare il wafer rivestito di fotoresist in un essiccatore e aggiungere una goccia di 20 μL di clorosilano (C8H4Cl3F13Si). Applicare il vuoto sulla camera per 30 s, quindi sigillare la camera e lasciare durante la notte.
ATTENZIONE: Il clorosilano è molto pericoloso e infiammabile. L'esposizione provoca gravi ustioni e danni agli occhi. - Unire 54 g di base in polidimetilossano (PDMS) e 6 g di agente polimerizzante in una tazza e mescolare vigorosamente e accuratamente con una spatola per almeno 1 minuto.
- Posizionare la tazza contenente la soluzione PDMS in un essiccatore per circa 30 minuti o fino a quando le bolle d'aria residua non vengono rimosse dalla soluzione.
- Posizionare il wafer rivestito di fotoresist con i motivi rivolti verso l'alto in una piastra di Petri da 150 mm.
- Versare la soluzione PDMS sopra lo stampo all'interno della piastra di Petri da 150 mm.
- Se necessario, posizionare la piastra di Petri da 150 mm all'interno di un essiccatore e applicare il vuoto fino a quando le bolle d'aria residuati scompaiono.
- Trasferire la piastra di Petri da 150 mm in un forno da laboratorio e cuocere per 2 ore a 60 °C per curare il PDMS.
- Dopo la polimerizzazione, rimuovere con cura il PDMS dalla piastra di Petri tagliando intorno ai bordi del wafer utilizzando una lama di rasoio.
- Ritagliare ogni singolo dispositivo utilizzando un coltello o una lama di rasoio.
- Fori di punzonatura attraverso le porte di ingresso e uscita di ciascun dispositivo utilizzando un punzone di biopsia da 2,5 mm.
- Posizionare ogni dispositivo PDMS in un asher al plasma con canali esposti (rivolti verso l'alto). Applicare il trattamento al plasma di ossigeno (100 W per 45 s, 500 mbar O 2 ),quindi posizionareimmediatamente ogni dispositivo PDMS su un vetrino in vetro lime soda pulito (75 mm x 25 mm x 1 mm) con canali rivolti verso la superficie del vetro.
- Lascia che i dispositivi si unistano durante la notte a temperatura ambiente.
- Applicare delicatamente il silicone sulla superficie del trasduttore piezo di 1 cm di diametro con uno spessore di ~1-2 mm, quindi allineare attentamente il trasduttore con la spirale concentrica e premerlo delicatamente sul fondo dello scivolo del microscopio di vetro (lato opposto dal dispositivo PDMS).
2. Montaggio e funzionamento del sistema acoustofluidic
- Collegare un microcontroller a un computer utilizzando un cavo USB da A a B. Un indicatore LED di alimentazione verde (etichettato PWR) dovrebbe illuminarsi.
- Utilizzare il programma associato sul computer per caricare un programma che genera un segnale a 8 MHz. Un programma di esempio è fornito nelle F iles supplementari. Dopo aver caricato il programma, verrà memorizzato nella memoria del microprocessore e non dovrà essere caricato di nuovo.
- Saldare un filo da 1" 22G fino all'estremità di ogni filo sul trasduttore PZT.
- Collegare il filo terminale negativo (nero) del trasduttore PZT a un perno GND tramite il filo saldato.
- Collegare il filo terminale positivo (rosso) del trasduttore PZT al pin di uscita (#9 nel programma di esempio fornito) tramite il filo saldato.
- Facoltativamente, montare il dispositivo acoustofluidico e il microcontrollore in una custodia stampata in 3D. I file CAD sono forniti negliSupplemental Files come esempi. Ulteriori fili possono essere collegati ad altri pin del microcontroller per controllare un indicatore LED esterno e, se lo si desidera, premere/spegnere il pulsante.
- Tagliare sezioni da 3-6" di tubi in plastica morbida in PVC tygon (ID da 1/16", 1/8" OD) e spingere il tubo nelle porte di ingresso e uscita. Potrebbe essere necessario ruotare il tubo mentre si applica pressione fino a quando non si adatta all'apertura. Opzionalmente, dopo aver inserito i tubi in ogni porta, la colla può essere applicata alla giunzione per legare il PDMS e i tubi insieme.
- Assemblare il serbatoio microfluidico secondo le istruzioni del produttore.
- Tagliare una sezione da 3-6" di tubi in plastica morbida in PVC tigono (ID da 1/16", 1/8" OD) e spingere i tubi sopra i tubi ID da 1/32" dai tubi di uscita del serbatoio microfluidico. Facoltativamente, avvolgere la giunzione con pellicola di paraffina per evitare perdite.
- Riempire una siringa da 60 mL con aria ambiente (opzionalmente, filtrare l'aria con un filtro da 0,2 μm) e collegarla ai tubi in PVC del tifone (ID da 1/16", 1/8" OD) sul lato del serbatoio microfluidico.
- Impostare la pompa della siringa su una velocità di 200 mL/h per spingere le soluzioni di agenti di contrasto cellulare/ecografico attraverso il dispositivo aoustofluidico a una portata volumetrica di 50 mL/h e raccogliere i campioni dall'uscita del dispositivo acoustofluidico in un tubo di centrifuga da 50 ml. Facoltativamente, risciacquare il canale prima del trattamento aoustofluidico con 15 mL di soluzione di etanolo al 70% per aumentare la sterilità dei canali fluidici. Inoltre, i canali possono essere risciacquati con 15 mL di acqua deionizzata per rimuovere l'etanolo residuo nel dispositivo prima di pompare le cellule attraverso il sistema.
3. Preparazione di agenti di contrasto ecografici
NOTA: Gli agenti di contrasto ad ultrasuoni migliorano significativamente l'erogazione acoustofluidica di composti molecolari aumentando transitoriamente la permeabilizzazione delle membrane cellularivicine 19. La consegna molecolare è molto limitata senza agenti di contrasto ad ultrasuoni in questo sistema.
- Preparare una soluzione fosfolipidica in una fiala a scintillazione da 20 mL contenente la seguente miscela:
- Aggiungere 25 mg di 1,2-distearoil-sn-glicero-3-fosfocolina (DSPC).
- Aggiungere 11,6 mg di 1,2-distearoil-sn-glicero-3-etilcofosfocolina (DSEPC).
- Aggiungere 0,26 mg di 1,2-distearoil-sn-glicero-3-fosfoglicerolo (DSPG).
- Aggiungere 0,88 mg di polietilene40 stearato.
- Aggiungere cloroformio fino a quando tutti i fosfolipidi non vengono sciolti (ad esempio, 3 mL di cloroformio).
- Evaporare il cloroformio in un essiccatore per 48 ore per formare un film lipidico secco (l'evaporazione sotto argon o con un evaporatore rotante può essere utilizzata per accelerare il processo di essiccazione).
- Reidratare il film lipidico con 10 mL di soluzione salina sterile tamponata da fosfati (PBS).
- Sonicare la soluzione lipidica per 3 minuti al 40% di ampiezza per formare una soluzione micellare cationica.
- Dopo la sonicazione conservare la soluzione fosfolipidica a 2-6 °C per un massimo di 1 mese.
- Per preparare agenti di contrasto ad ultrasuoni, aggiungere 200 μL di soluzione micellare cationica e 600 μL di PBS sterile a una fiala di setto di vetro da 2 mL.
- Sigillare la fiala criticando il cappuccio.
- Utilizzare un ago da 1,5" 20G per riempire lo spazio della testa del flaconcino con gas decafluorobutano per 30 s.
- Amalgamare la fiala per 45 s a 4.350 cpm per formare agenti di contrasto ad ultrasuoni riempiti di gas perfluorobutano.
- Aggiungere 25 μL di soluzione di agente di contrasto ecografico per 1 mL di soluzione cellulare immediatamente prima di pompare la miscela combinato agente di contrasto/cella attraverso il dispositivo austofluidico. La soluzione cellulare può essere modificata come desiderato dall'utente, ma nei nostri studi la soluzione cellulare consisteva di cellule T primarie nel passaggio 4.21 e cellule tumorali polmonari A549 nel passaggio 5.7, rispettivamente.
4. Preparazione di cellule primarie
- Isolare le cellule mononucleari del sangue periferico (PBPC) dalle soluzioni ematiche intere e immagazzinare a -150 °C. La separazione del gradiente di densità contenente un substrato viene comunemente utilizzata per separare i PBPCdal sangue intero 24,25,26.
- Scongelare il flaconcino congelato in bagno d'acqua a 37 °C.
- Diluire i PBBC scongelati 1:10 con PBS in un tubo di centrifuga da 15 ml. Ogni flaconcino da 1 mL contiene circa 10 milioni di PBBC.
- Centrifuga i PBBC diluiti a 580 x g per 11 min a 4 °C.
- Aspirare il supernatante e aggiungere 13 mL di MAC che eseguono buffer per rimescolare le celle.
- Contare i PBBC con un contatore di celle automatizzato o un emocitometro.
- Centrifugare nuovamente i PBBC a 580 x g per 11 min a 4 °C e aspirare il supernatante.
- Aggiungere 40 μL di tampone di funzionamento refrigerato per 10 milioni di PBPC.
- Per isolare le cellule T, aggiungere 10 μL di Pan T-Cell Biotin Antibody Cocktail per 10 milioni di PBBC.
- Agitare delicatamente i PBBC e conservare la soluzione a 4 °C per 5 minuti per 10 milioni di celle.
- Aggiungere 30 μL di tampone in esecuzione e 20 μL di Pan T-Cell MicroBead Cocktail per 10 milioni di PBBC.
- Mescolare accuratamente i PBBC e le perline e incubare per altri 15 minuti a 4 °C.
- Aggiungere il buffer di corsa per raggiungere un volume totale di 500 μL.
- Separare le celle T primarie con uno strumento di smistamento magnetico da banco disponibile in commercio utilizzando l'impostazione "separazione degli esauriti" seguendo il protocollo del produttore. Questo passaggio dovrebbe produrre tra 5-10 milioni di cellule T dopo lo smistamento delle celle.
- Contare le cellule T utilizzando un contatore di celle automatizzato o un emocitometro.
- Diluire le cellule T in 10 mL di PBS sterile e centrifugare a 580 x g per 10 min a 4 °C per pellettizzare le cellule.
- Aspirare le cellule T supernatanti e resuspend in 1 mL di PBS.
- Contare le cellule T utilizzando un contatore di cellule automatizzato o un emocitometro e aliquota 1 milione/mL per gli esperimenti.
- Preparare una soluzione di fluoresceina da 1 mg/mL in PBS.
- Aggiungere 100 μL di soluzione di fluoresceina da 1 mg/mL per 1 mL di soluzione cellulare T (concentrazione finale di fluoresceina = 100 μg/mL) immediatamente prima della lavorazione.
- Aggiungere 25 μL di soluzione di agente di contrasto ecografico come descritto in precedenza nel passaggio 3.11.
- Elaborare aliquote 1mL di celle utilizzando il sistema acoustofluidico (vedere i passaggi 2.10-2.11). Questo passaggio migliora la consegna della fluoresceina nelle cellule T primarie.
- Immediatamente dopo il trattamento, lavare le cellule tre volte tramite centrifugazione a 580 x g per 10 min con 500 μL di PBS per rimuovere la fluoresceina extracellulare. Le cellule devono essere lavate entro 10 minuti dopo l'aggiunta di soluzione di fluoresceina.
- Dopo la fase finale di lavaggio, rimescolare le cellule in 250 μL di PBS e misurare la fluorescenza sul citometro a flusso.
5. Preparazione di cellule tumorali polmonari A549
- Coltura A549 (epiteliale basale alveolare umano adenocarcinomico in supporti DMEM completi (10% siero bovino fetale, 1% penicillina/streptomicina) a 37 °C e 5% CO 2 in un pallone dacoltura tissutale a fondo piatto.
- Raccogli le cellule A549 quando raggiungono il 70-90% di confluenza. Aspirare i mezzi dal pallone e lavare le cellule una volta con PBS per rimuovere le proteine del siero.
- Aggiungere la tripsiderina (0,25%) EDTA al pallone e incubare per 5 minuti a 37 °C. La tripside è un enzima digestivo che fa sì che le cellule si distaccino dalla superficie inferiore del pallone di coltura tissutale.
- Trasferire la soluzione di tripina in un tubo di centrifuga da 15 ml e neutralizzarla aggiungendo supporti DMEM completi con un rapporto 1:3.
- Pellettizzare le cellule tramite centrifugazione a 1.500 x g per 5 min a 4 °C.
- Aspirare il supernatante e resospendare il pellet ad una concentrazione di 100.000/mL in soluzione PBS contenente trealosio da 200 mM in flaconcino conico da 15 mL.
- Aggiungere 25 μL di soluzione di agente di contrasto ecografico come descritto in precedenza nel passaggio 3.11.
- Elaborare aliquote 1mL di celle utilizzando il sistema acoustofluidico (vedere i passaggi 2.10-2.11). Questo passaggio migliora la consegna di trealosio nelle cellule tumorali polmonari A549.
- Immediatamente dopo il trattamento, lavare le cellule tre volte tramite centrifugazione con 500 μL di PBS per rimuovere il trealosio extracellulare. Le cellule devono essere lavate entro 10 minuti dopo aver aggiunto la soluzione di trealosio.
- Dopo la fase finale di lavaggio, rimorsiva le cellule in 100 μL di PBS.
- Aggiungere 11 μL di soluzione tritone X-100 all'1% per le cellule di lyse e rilasciare trealosio intracellulare.
- Vortice per 15 s, quindi incubare per 30 minuti a temperatura ambiente.
- Vortice di nuovo per 15 s, quindi misurare la concentrazione di trealosio utilizzando il saggio di trealosio disponibile in commercio su raccomandazione del produttore.
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Representative Results
Un'immagine del sistema acoustofluidico assemblato all'interno di una custodia stampata in 3D è mostrata nella figura 1. Questo protocollo produce un sistema acoustofluidico che può essere utilizzato per migliorare l'erogazione molecolare intracellulare in più linee cellulari utilizzando agenti di contrasto ad ultrasuoni.
Figura 2 dimostra una maggiore somministrazione intracellulare di un composto fluorescente, la fluoresceina, alle cellule T umane primarie con trattamento acoustofluidico rispetto a un gruppo di controllo non trattato(p<0,05, n=3/gruppo). Le cellule T sono state sospese ad una concentrazione di 1 milione/mL in PBS con soluzione di fluoresceina da 100 μg/mL e soluzione di agente di contrasto ad ultrasuoni da 25 μL/mL, e la miscela è stata passata attraverso il dispositivo austofluidico per il trattamento ecografico. La somministrazione intracellulare di fluoresceina e la vitalità cellulare sono state misurate con citometria a flusso dopo aver lavato le cellule tramite centrifugazione per rimuovere la fluoresceina extracellulare. Anche le cellule T del gruppo di controllo non trattato sono state sospese a 1 milione/mL in PBS con soluzione di fluoresceina da 100 μg/mL, ma non è stata aggiunta la soluzione di agente di contrasto ecografico e le cellule non sono state passate attraverso il dispositivo austofluidico. L'intensità di fluorescenza delle cellule T è aumentata di 5 volte dopo il trattamento anotofluidico rispetto all'intensità di fluorescenza delle cellule T nel gruppo di controllo non trattato, indicando una maggiore consegna di fluoresceina. La vitalità cellulare è leggermente diminuita dopo il trattamento anotofluidico, ma è rimasta superiore all'80% (p<0,05, n=3/gruppo).
La figura 3 mostra una maggiore somministrazione intracellulare di un composto conservante, la trealosio, alle cellule del carcinoma polmonare A549 umano con trattamento anotofluidico rispetto al solo flusso (nessun agente di contrasto ecografico o esposizione agli ultrasuoni) e rispetto alle cellule del gruppo di controllo non trattato (ANOVA p<0.05, n=3/gruppo). Le cellule A549 sono state sospese a una concentrazione di 100.000/mL in PBS con soluzione di trealosio da 200 mM e soluzione di agente di contrasto ad ultrasuoni 25 μL/mL, e la miscela è stata passata attraverso il dispositivo austofluidico per il trattamento ecografico. Anche le cellule A549 nei gruppi di controllo ("Flow Only" e "No Treatment") sono state sospese a 100.000/mL in PBS con trealosio da 200 mM, ma non è stata aggiunta una soluzione di agente di contrasto ecografico e le cellule non sono state esposte al trattamento ecografico. Il trealosio intracellulare è stato quantificato utilizzando un kit di dosaggio di trealosio e normalizzato al gruppo di controllo non trattato. La vitalità cellulare è stata misurata con il test blu del tripano. Non vi era alcuna differenza statistica nella vitalità cellulare tra gruppi (n=3-7/gruppo).
Figura 1: Foto del sistema acoustofluidico. Il sistema di flusso anotofluidico contiene una camera di flusso basata su PDMS con un trasduttore PZT integrato guidato da un microcontrollore. Una custodia stampata in 3D con indicatore LED e pulsante di accensione/spegnimento sono funzionalità aggiuntive opzionali. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Figura 2: Il trattamento acoustofluidico migliora l'erogazionedi luoresceina alle cellule T umane. (A) L'intensità di fluorescenza nelle cellule T primarie è aumentata dopo il trattamento anatofluidico con fluoresceina rispetto al gruppo di controllo non trattato (nessuna accostofluidica e nessuna microbolla)(p<0,05, n=3/gruppo). (B) La vitalità cellulare è leggermente diminuita dopo il trattamento anotofluidico, ma è rimasta superiore all'80% misurata dalla citometria delflusso (p<0,05, n=3/gruppo). (C) Istogramma rappresentativo della citometria a flusso che indica una maggiore fluorescenza nel gruppo di trattamento acoustofluidico. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Figura 3: Il trattamento acoustofluidico migliora la somministrazione di trehalose alle cellule tumorali polmonari umane. (A) L'assorbimento di trealosio è aumentato nelle cellule del carcinoma polmonare A549 rispetto al solo flusso (nessun ecografia e nessuna microbolle) e al gruppo di controllo non trattato (ANOVA p<0,05, n=3/gruppo). (B) La vitalità cellulare è rimasta superiore al 90% dopo il trattamento austofluidico misurato dal saggio blu del tripano (n=3-7/gruppo). Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
File supplementari. Clicca qui per scaricare questo file.
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Discussion
Questo protocollo descrive l'assemblaggio e il funzionamento di un sistema acoustofluidico a basso costo che migliora la fornitura intracellulare di biomolecole per applicazioni di ricerca. Ci sono diversi fattori importanti da considerare quando si assembla e si gestisce questo sistema. Il dispositivo acoustofluidico è fabbricato in PDMS, che è un materiale biocompatibile che può essere facilmente modellato con dimensioni del canale coerenti27. I canali del dispositivo possono essere risciacquati con 15 mL di soluzione di etanolo al 70% prima della lavorazione aoustofluidica al fine di aumentare la sterilità quando si lavora con cellule coltivate. Dopo la pulizia dell'etanolo, 15 mL di acqua deionizzata possono essere utilizzati per risciacquare il dispositivo per rimuovere l'etanolo residuo dai canali prima di aggiungere soluzioni cellulari. Piccoli canali anotofluidici possono facilmente essere bloccati da detriti o aggregati cellulari, rendendo questo un limite per l'uso frequente del dispositivo. Risciacquare accuratamente i canali tra ogni campione aiuterà a prevenire problemi con il blocco del canale. Inoltre, più dispositivi PDMS possono essere fabbricati in ogni lotto in modo che i dispositivi possano essere rapidamente sostituiti, se necessario. Per le applicazioni basate su ultrasuoni, è importante produrre dispositivi PDMS con uno spessore costante, poiché le differenze nello spessore del PDMS possono influenzare le pressioni ultrasoniche all'interno dei canali fluidici. Le onde ultrasoniche si propagano continuamente attraverso il dispositivo e le onde trasmesse interagiscono con le onde riflesse per formare modelli di onde acustiche in piedi che sono molto sensibili alle differenze nello spessorePDMS 17. Lo spessore del PDMS è determinato principalmente dalla quantità di PDMS aggiunta allo stampo (passo 1.7) e questo protocollo produce uno spessore PDMS di 3,5 mm.
La frequenza massima di uscita del microcontrollore (8 MHz) è stata selezionata per produrre la più piccola lunghezza d'onda acustica all'interno del canale fluidico. L'uscita del microcontrollore è tipicamente un'onda quadra, ma le misurazioni dell'oscilloscopio hanno rivelato che l'uscita a 8 MHz diventa più simile a una forma d'onda sinusoide a causa delle limitazioni della velocità di slew. Una limitazione di questo sistema è che l'uscita di tensione massima del microcontrollore è 5V ed è necessario un amplificatore RF esterno se si desidera uscite di tensione più elevate. La potenza di pressione a campo libero del trasduttore in questo sistema era di 18 kPa a 1 cm misurata con un idrofono ad ago (Precision Acoustics, Dorchester, Regno Unito). Sebbene questa pressione sia relativamente bassa, le onde stanziali all'interno dei canali possono aumentare le pressioni acustiche a cui i campioni sono esposti mentre passano attraverso il fascio ultrasonico.
Gli agenti di contrasto ad ultrasuoni vengono utilizzati per nucleare la cavitazione acustica all'interno dei canali acustofluidici che migliora la consegna di biomolecole attraverso le membranecellulari 28,29. Questo protocollo descrive la sintesi di microbolle riempite di gas perfluorocarburo incapsulate da una membrana fosfolipidica cationica. Come descritto in precedenza, questa formulazione consiste in microbolle principalmente tra 1-3 μm di diametro30. La superficie carica positiva delle microbolle li attrae verso membrane cellulari cariche negativamente, il che aumenta la somministrazione molecolare mediata dalla sonoporazione quando le microbolle e le cellule sono nelle immediate vicinanze. La concentrazione di microbolle nella soluzione cellulare è un fattore critico che può influenzare l'efficienza della somministrazione molecolare e della vitalità cellulare dopo il trattamento aoustofluidico, e la concentrazione ottimale di microbolle può essere specifica per ogni cellula di tipo 19. La concentrazione di microbolle riempite di gas con un guscio lipidico può diminuire nel tempo dopo la sintesi, quindi gli agenti di contrasto ad ultrasuoni devono essere utilizzati entro poche ore dalla sintesi.
Abbiamo dimostrato la consegna di un composto fluorescente (fluoresceina) alle cellule T umane primarie non attivate utilizzando il sistema acoustofluidic in questo protocollo. È importante notare che lo stato di attivazione delle cellule T umane primarie può influenzare l'efficienza del parto molecolare intracellulare. Le proprietà di fluorescenza della fluoresceina consentono il rilevamento intracellulare sensibile con citometria del flusso, ma altri composti solubili possono anche essere consegnati nelle cellule utilizzando questo sistema acoustofluidico. Ad esempio, abbiamo dimostrato la somministrazione acoustofluidica di trealosio nelle cellule tumorali polmonari umane. L'erogazione acoustofluidica di trealosio nelle cellule può consentire un maggiore recupero dopo lo stoccaggio congelato e secco, che potrebbe avere impatti significativi su una serie di applicazioni biomediche e di ricerca 19.
È anche possibile l'erogazione acoustofluidica di altre biomolecole, come proteine o plasmidi del DNA, anche se una limitazione di questo sistema è che l'efficienza della consegna molecolare può essere inferiore per composti piùgrandi 18,31. L'ottimizzazione della portata aoustofluidica, delle concentrazioni di agenti di contrasto ecografici, delle concentrazioni cellulari e dei mezzi può essere necessaria per la consegna di altre biomolecole. Inoltre, i parametri ottimali possono variare tra i diversi tipi di cellule a causa di fattori come il diametro cellulare, la morfologia, le proprietà della membrana e il fenotipo.
Il sistema acoustofluidic descritto in questo protocollo può essere facilmente assemblato e gestito a costi relativamente bassi. Inoltre, questo sistema può essere personalizzato per altre applicazioni collegando altre sorgenti di segnale o trasduttori ad ultrasuoni per generare pressioni e frequenzedi uscita specifiche 32,33,34. Inoltre, il sistema di pompa per siringhe descritto in questo protocollo può essere sostituito con pompe peristaltiche, se lo si desidera. Con una portata di 50 mL/h il tempo di residenza per le cellule all'interno del fascio ad ultrasuoni mentre passano attraverso il canale aoustofluidico è di circa 1 s, ma questo tempo di residenza può essere modificato in base alle esigenze per applicazioni specifiche regolando la portata del fluido.
A differenza di altre comuni tecniche di trasfezione, le biomolecole possono essere consegnate in celle in pochi minuti anziché in ore e questo sistema non richiede attrezzature specializzate e costose. Inoltre, questo sistema è compatibile con un'ampia gamma di supporti di coltura cellulare comunemente usati o altri buffer. In sintesi, questo sistema acoustofluidico consente la rapida consegna di biomolecole alle cellule, che possono essere utili per un'ampia gamma di applicazioni di ricerca.
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Disclosures
I coautori MAM e JAK detengono la proprietà di DesiCorp che può beneficiare finanziariamente dei prodotti relativi a questa ricerca.
Acknowledgments
Questo lavoro è stato sostenuto in parte dai finanziamenti della National Science Foundation (#1827521, #1827521, #1450370) e dei National Institutes of Health (U01HL127518). I servizi di fotolitografia sono stati forniti dall'University of Louisville Micro/Nano Technology Center.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Fabrication of Acoustofluidic Device | |||
| DOW SYLGARD 184 SILICONE ENCAPSULANT CLEAR 0.5 KG KIT | Ellsworth Adhesives | 4019862 (SKU) | https://www.ellsworth.com/products/by-market/consumer-products/encapsulants/silicone/dow-sylgard-184-silicone-encapsulant-clear-0.5-kg-kit/ |
| Harris Uni-Core (2.5 mm) | Electron Microscopy Sciences | 69039-25 | |
| Microfluidic Reservoir for 15 mL Falcon Tube - S (2/4 port) | Darwin Microfluidics | LVF-KPT-S-2 (SKU) | https://darwin-microfluidics.com/products/15-ml-falcon-tube-microfluidic-reservoir-s-2-4-port |
| Microscope Slide | VWR | 16004-430 | https://us.vwr.com/store/product/4646174/vwr-vistavisiontm-microscope-slides-plain-and-frosted-premium |
| trichlorosilane | Gelest | 105732-02-3 (Cas. No.) | Chlorosilane is very hazaradous and flammable. Exposure causes severe burns and eye damage. |
| Tygon PVC soft plastic tubing (1/16" ID, 1/8" OD) | McMaster-Carr | 5233K51 (Part #) | https://www.mcmaster.com/pvc-tubing/soft-tubing-for-air-and-water/ |
| Assembly of Acoustofluidic System | |||
| Arduino Uno | Arduino | 7630049200050 (Barcode) | https://store.arduino.cc/usa/arduino-uno-rev3 |
| Preparation of Ultrasound Contrast Agents | |||
| 1,2-distearoyl-sn-glycero-3-ethylphosphocholine (DSEPC) | Avanti Lipids | 890703P-25mg (SKU) | https://avantilipids.com/product/890703 |
| 1,2-distearoyl-sn-glycero-3-phosphocholine (DSPC) | Avanti Lipids | 850365P-25mg (SKU) | https://avantilipids.com/product/850365 |
| 1,2-distearoyl-sn-glycero-3-phosphoglycerol (DSPG) | Avanti Lipids | 840465P-25mg (SKU) | https://avantilipids.com/product/840465 |
| APF-140HP (decafluorobutate gas) | FlouroMed | 355-25-9 (Cas No.) | http://www.fluoromed.com/products/perfluorodecalin/ |
| DB-338 Amalgamators | COXO | https://www.coxotec.com/coxo/db-338-amalgamators/ | |
| polyoxyethylene 40 stearate | Sigma-Aldrich | P3440-250G (SKU) | https://www.sigmaaldrich.com/catalog/product/sigma/p3440?lang=en®ion=US&gclid= Cj0KCQjwy8f6BRC7ARIsAPIXOjjj Jh_151mYVEUyLZRavt4re9YQMLS vID64X-1KbO3LUKGjVUwb PDAaAqvOEALw_wcB |
| Q125 Sonicator | Qsonica | Q125-110 (Ref.) | https://www.sonicator.com/products/q125-sonicator?_pos=1&_sid=406df3776&_ss=r |
| Preparation of Primarty T Cells | |||
| autoMACs running buffer | Miltenyi Biotec | 130-091-221 (Order No.) | https://www.miltenyibiotec.com/US-en/products/automacs-running-buffer-macs-separation-buffer.html#gref |
| Pan T Cell Isolation Kit, human (Pan T-Cell Biotin Antibody Cocktail & Pan T-Cell MicroBead Cocktail) | Miltenyi Biotec | 130-096-535 (Order No.) | https://www.miltenyibiotec.com/US-en/products/pan-t-cell-isolation-kit-human.html#130-096-535 |
| magnetic cell sorter (autoMACS Pro Separator) | Miltenyi Biotec | 130-092-545 (Order No.) | https://www.miltenyibiotec.com/US-en/products/automacs-pro-separator-starter-kit.html#130-092-545 |
| Preparation of A549 Lung Cancer Cells | |||
| Trehalose Assay Kit | Megazyme | K-TREH (Cat. No.) | https://www.megazyme.com/trehalose-assay-kit |
| Trypan blue (0.4% in aqueous solution Ready-to-Use, sterile) | VWR | 97063-702 (Cat. No.) | https://us.vwr.com/store/product/7437427/trypan-blue-0-4-in-aqueous-solution-ready-to-use-sterile |
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