Summary
Ce protocole décrit l’assemblage et le fonctionnement d’un dispositif acoustofluidic à faible coût pour la livraison moléculaire rapide aux cellules par l’intermédiaire du sonoporation induit par des agents de contraste d’ultrason.
Abstract
L’administration intracellulaire efficace de biomolécules est nécessaire pour un large éventail de recherches biomédicales et d’applications thérapeutiques cellulaires. la sonoporation Ultrason-négociée est une technique émergente pour la livraison intracellulaire rapide des biomolécules. La sonoporation se produit lorsque la cavitation de microbulles remplies de gaz forme des pores transitoires dans les membranes cellulaires voisines, ce qui permet une absorption rapide des biomolécules du fluide environnant. Les techniques actuelles de sonoporation in vitro des cellules en suspension sont limitées par un débit lent, une variabilité des conditions d’exposition aux ultrasons pour chaque cellule et un coût élevé. Pour remédier à ces limitations, un dispositif acoustofluidique à faible coût a été développé qui intègre un transducteur à ultrasons dans un dispositif fluidique à base de PDMS pour induire une sonoporation cohérente des cellules lorsqu’elles circulent à travers les canaux en combinaison avec des agents de contraste à ultrasons. L’appareil est fabriqué à l’aide de techniques de photolithographie standard pour produire la puce fluidique à base de PDMS. Un transducteur de disque piézo-ultrasonore est fixé à l’appareil et piloté par un microcontrôleur. L’assemblage peut être intégré à l’intérieur d’un boîtier imprimé en 3D pour une protection supplémentaire. Les cellules et les microbulles sont poussées à travers l’appareil à l’aide d’une pompe à seringue ou d’une pompe péristaltique connectée à un tube en PVC. L’administration améliorée des biomolécules aux lymphocytes T humains et aux cellules cancéreuses du poumon est démontrée avec ce système acoustofluidique. Comparé aux approches de traitement en vrac, ce système acoustofluidique augmente le débit et réduit la variabilité, ce qui peut améliorer les méthodes de traitement cellulaire pour les applications de recherche biomédicale et la fabrication de thérapies cellulaires.
Introduction
Des plateformes virales et non virales ont été utilisées pour améliorer la livraison moléculaire aux cellules. L’administration virale (transduction) est une technique couramment utilisée dans les thérapies cellulaires nécessitant une modification génomique. Les limites de l’administration virale comprennent la mutagenèse insertionnelle potentielle, la capacité transgénique limitée et la multiplicité indésirable de l’infection1,2. Par conséquent, des techniques d’administration moléculaire non virale sont en cours de développement pour un large éventail d’applications biomédicales et de recherche. Les techniques courantes comprennent la mécanique, l’électricité, l’hydrodynamique ou l’utilisation de l’énergie laser pour améliorer l’absorption des biomolécules dans les cellules 3. L’électroporation est une plate-forme d’administration moléculaire non virale couramment utilisée qui a la capacité d’induire une perforation transitoire dans la membrane plasmique pour l’administration intracellulaire de composés moléculaires4,5,6,7,8,9. Cependant, la perforation transitoire de la membrane plasmique est un processus stochastique et l’absorption moléculaire par électroporation dépend généralement de la diffusion passive à travers les pores transitoires de la membrane4,7,8.
Une méthode alternative est l’utilisation de l’ultrason pour la livraison moléculaire intracellulaire améliorée par l’intermédiaire de la cavitation des agents de contraste d’ultrason (c.-à-d., microbulles remplies de gaz). La cavitation par microbulles induit des effets de microstreaming dans les milieux environnants qui peuvent provoquer une perforation transitoire des membranes plasmiques voisines (« sonoporation ») permettant une absorption intracellulaire rapide des biomolécules via des mécanismes de transport passifs ou actifs10,11,12. La sonoporation est une technique efficace pour l’administration moléculaire rapide aux cellules, mais cette approche nécessite souvent un équipement coûteux et des méthodes de traitement en vrac qui sont limitées par un débit plus faible et une plus grande variabilité dans les conditions d’exposition aux ultrasons13. Pour remédier à ces limitations, des dispositifs acoustofluidiques, qui permettent une sonoporation cohérente des cellules en suspension, sont actuellement en cours de développement.
L’acoustofluidique est un domaine en expansion qui intègre les technologies ultrasonores et microfluidiques pour une grande variété d’applications. Cette approche a déjà été utilisée pour la séparation des particules en appliquant une énergie ultrasonore continue pour induire des ondes acoustiques stationnaires dans les canaux fluidiques14,15,16,17. Les particules sont triées vers différentes parties du dispositif en fonction d’une variété de propriétés telles que la taille des particules, la densité et la compressibilité par rapport au milieu16. Des technologies acoustofluidiques sont également en cours de développement pour permettre une livraison moléculaire rapide à une variété de types de cellules pour des applications de recherche et la fabrication de thérapies cellulaires18. Récemment, nous avons démontré l’administration moléculaire améliorée aux érythrocytes utilisant un dispositif acoustofluidic PDMS-basé19. Dans la plate-forme acoustofluidique, la dynamique des cellules et des microbulles peut être manipulée pour induire des interactions physiques qui permettent une meilleure administration des biomolécules. L’efficacité et la cohérence de l’administration moléculaire intracellulaire peuvent potentiellement être augmentées en optimisant la distance entre les cellules et les microbulles.
Une application importante pour la sonoporation à médiation acoustofluidique implique le transport des biomolécules dans les cellules T humaines primaires. Les immunothérapies basées sur le transfert de lymphocytes T adoptifs, telles que la thérapie à base de lymphocytes T du récepteur de l’antigène chimérique (CAR T), émergent rapidement pour le traitement de diverses maladies, y compris le cancer et les virus tels que le VIH20. La thérapie de CAR T a été particulièrement efficace dans les patients pédiatriques de leucémie lymphoblastique aiguë (LAL), avec des taux complets de remise de 70-90%21. Cependant, la fabrication de lymphocytes T pour ces thérapies dépend généralement de la transduction virale qui est limitée par la mutagenèse insertionnelle potentielle, les longs délais de traitement et les défis liés à la fourniture de biomolécules non génétiques telles que des protéines ou de petites molécules1. Les méthodes d’administration moléculaire à médiation acoustofluidique peuvent potentiellement surmonter ces limites et améliorer la fabrication de thérapies à base de cellules T.
Une autre application importante pour la sonoporation à médiation acoustofluidique implique l’administration intracellulaire de composés conservateurs, tels que le tréhalose, qui protègent les cellules pendant la congélation et la dessiccation. Le tréhalose est produit par certains organismes dans la nature et les aide à tolérer la congélation et la dessiccation en protégeant leurs membranes cellulaires22,23. Cependant, le tréhalose n’est pas produit par les cellules de mammifères et est imperméable aux membranes cellulaires des mammifères. Par conséquent, des techniques efficaces de livraison moléculaire, telles que la sonoporation, sont nécessaires afin d’atteindre des niveaux intracellulaires suffisants de tréhalose requis pour protéger les membranes cellulaires internes. Cette approche est actuellement en cours de développement pour la préservation à sec de divers types de cellules.
Ce protocole fournit une description détaillée de l’assemblage et du fonctionnement d’un système acoustofluidique relativement peu coûteux piloté par un microcontrôleur. Les agents de contraste d’ultrason sont utilisés pour induire la sonoporation dans les canaux fluidiques et permettre la livraison moléculaire rapide à divers types de cellules, y compris les cellules T et les cellules cancéreuses. Ce système acoustofluidique peut être utilisé pour une variété d’applications de recherche et peut également être utile comme système prototype pour évaluer les méthodes de sonoporation pour améliorer les processus de fabrication de thérapie cellulaire.
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Protocol
Les dons de sang total ont été recueillis auprès de donneurs en bonne santé conformément aux protocoles approuvés par le comité d’examen institutionnel de l’Université de Louisville.
1. Fabrication d’un dispositif acoustofluidique
- Obtenir un photomasque avec un dessin en spirale concentrique contenant des canaux d’un diamètre de 500 μm. Un fichier CAO est fourni dans les fichiers supplémentaires à titre d’exemple. Un photomasque personnalisé peut être commandé auprès d’un fournisseur commercial ou modelé à l’aide d’un enregistreur de masques.
- Préparez un moule de la conception en spirale concentrique sur une plaquette de silicium revêtue de photorésine en utilisant des techniques de photolithographie standard.
- Ajouter environ 2 c. à soupe (~30 mL) de SU-8 2100 à une plaquette de silicium de 100 mm.
- Faites tourner la plaquette sur une toupie à une vitesse de 150 tr/min pendant 30 s pour étaler la photorésine, puis augmentez la vitesse à 1 200 tr/min pendant 60 s pour obtenir une épaisseur de 200 μm.
- Durcir la plaquette revêtue de photorésine dans un four à vide en polyimide avec une rampe de 30 minutes et un séjour de 30 minutes à 115 °C, puis descendre en rampe pendant 30 minutes.
- Exposez la plaquette revêtue de photorésine pendant 130 s à l’aide d’un aligneur de masque avec le photomasque de l’étape 1.1.
- Cuire la plaquette après exposition selon le même procédé décrit à l’étape 1.2.3.
- Développer la photorésine dans la solution de développement SU-8 pendant environ 8 min.
ATTENTION : N’utilisez qu’une solution de développement dans une hotte chimique bien ventilée.
- Silaniser le moule pour rendre la surface plus hydrophobe. Placer la plaquette revêtue de photorésine dans un dessicateur et ajouter une goutte de chlorosilane de 20 μL(C8H4Cl3F13Si). Appliquez du vide sur la chambre pendant 30 s, puis scellez la chambre et laissez-le pendant la nuit.
ATTENTION : Le chlorosilane est très dangereux et inflammable. L’exposition provoque de graves brûlures et des lésions oculaires. - Mélanger 54 g de base de polymiméthsiloxane (PDMS) et 6 g d’agent de durcissement dans une tasse et mélanger vigoureusement et soigneusement avec une spatule pendant au moins 1 min.
- Placer la tasse contenant la solution PDMS dans un dessicateur pendant environ 30 min ou jusqu’à ce que les bulles d’air résiduelles soient éliminées de la solution.
- Placez la plaquette revêtue de photorésine avec les motifs orientés vers le haut dans une boîte de Pétri de 150 mm.
- Versez la solution PDMS sur le moule à l’intérieur de la boîte de Pétri de 150 mm.
- Si nécessaire, placez la boîte de Petri de 150 mm à l’intérieur d’un dessiçateur et appliquez du vide jusqu’à ce que les bulles d’air résiduelles disparaissent.
- Transférer la boîte de Petri de 150 mm dans un four de laboratoire et la cuire pendant 2 h à 60 °C pour durcir le PDMS.
- Après durcissement, retirez soigneusement le PDMS de la boîte de Pétri en coupant autour des bords de la plaquette à l’aide d’une lame de rasoir.
- Découpez chaque appareil à l’aide d’un couteau ou d’une lame de rasoir.
- Percer des trous à travers les orifices d’entrée et de sortie de chaque appareil à l’aide d’un poinçon de biopsie de 2,5 mm.
- Placez chaque dispositif PDMS dans un ensemble plasma avec des canaux exposés (orientés vers le haut). Appliquez un traitement au plasma d’oxygène (100 W pendant 45 s, 500 mbarO2)puis placez immédiatement chaque dispositif PDMS sur une lame de microscope en verre de chaux soude propre (75 mm x 25 mm x 1 mm) avec des canaux orientés vers la surface du verre.
- Laissez les appareils se lier pendant la nuit à température ambiante.
- Appliquez doucement du silicone sur la surface du transducteur piézo-piézo-1 cm de diamètre à une épaisseur d’environ 1 à 2 mm, puis alignez soigneusement le transducteur avec la spirale concentrique et appuyez doucement sur le fond de la lame du microscope en verre (côté opposé au dispositif PDMS).
2. Assemblage et fonctionnement du système acoustofluidique
- Connectez un microcontrôleur à un ordinateur à l’aide d’un câble USB A vers B. Un voyant d’alimentation vert (étiqueté PWR) devrait s’allumer.
- Utilisez le programme associé sur l’ordinateur pour télécharger un programme qui génère un signal de 8 MHz. Un exemple de programme est fourni dans les Files supplémentaires . Après avoir téléchargé le programme, il sera stocké dans la mémoire du microprocesseur et n’aura pas besoin d’être téléchargé à nouveau.
- Souder un fil 1 » 22G à l’extrémité de chaque fil sur le transducteur PZT.
- Connectez le fil de borne négatif (noir) du transducteur PZT à une broche GND via le fil soudé.
- Connectez le fil de borne positif (rouge) du transducteur PZT à la broche de sortie (#9 dans l’exemple de programme fourni) via le fil soudé.
- En option, montez le dispositif acoustofluidique et le microcontrôleur dans un boîtier imprimé en 3D. Les fichiers CAO sont fournis dans les F iles Supplemental à titred’exemples. Des fils supplémentaires peuvent être connectés à d’autres broches de microcontrôleur pour contrôler un indicateur LED externe et un bouton-poussoir marche / arrêt si vous le souhaitez.
- Coupez des sections de 3-6 " de tubes en plastique souple tygon PVC (1/16 " ID, 1/8 " OD) et poussez le tube dans les ports d’entrée et de sortie. Il peut être nécessaire de faire pivoter le tube tout en appliquant une pression jusqu’à ce qu’il s’adapte à l’ouverture. Éventuellement, après avoir inséré le tube dans chaque port, du colle peut être appliqué à la jonction pour lier le PDMS et le tube ensemble.
- Assemblez le réservoir microfluidique conformément aux instructions du fabricant.
- Couper une section de 3-6 « de tygon PVC tube en plastique souple (1/16 « ID, 1/8 » OD) et pousser le tube sur le tube ID 1/32 « à partir du tube de sortie du réservoir microfluidique. Si vous le souhaitez, enroulez la jonction avec un film de paraffine pour éviter les fuites.
- Remplissez une seringue de 60 mL avec de l’air ambiant (éventuellement, filtrez l’air avec un filtre de 0,2 μm) et connectez-la à un tube en PVC tygon (1/16 « ID, 1/8 » OD) sur le côté du réservoir microfluidique.
- Régler la pompe à seringue à un débit de 200 mL/h pour pousser les solutions d’agent de contraste cellulaire/ultrasonore à travers le dispositif acoustofluidique à un débit volumétrique de 50 mL/h et prélever les échantillons de la sortie du dispositif acoustofluidique dans un tube de centrifugation de 50 mL. Éventuellement, rincer le canal avant le traitement acoustofluidique avec 15 mL de solution d’éthanol à 70% pour augmenter la stérilité des canaux fluidiques. De plus, les canaux peuvent être rincés avec 15 mL d’eau désionisée pour éliminer l’éthanol résiduel dans l’appareil avant de pomper les cellules à travers le système.
3. Préparation d’agents de contraste à ultrasons
REMARQUE: Les agents de contraste à ultrasons améliorent considérablement l’administration acoustofluidique de composés moléculaires en augmentant transitoirement la perméabilisation des membranes cellulaires voisines19. L’administration moléculaire est très limitée sans agents de contraste à ultrasons dans ce système.
- Préparer une solution de phospholipide dans un flacon de scintillation de 20 ml contenant le mélange suivant :
- Ajouter 25 mg de 1,2-distearoyl-sn-glycero-3-phosphocholine (DSPC).
- Ajouter 11,6 mg de 1,2-distearoyl-sn-glycero-3-éthylphosphocholine (DSEPC).
- Ajouter 0,26 mg de 1,2-distearoyl-sn-glycero-3-phosphoglycérol (DSPG).
- Ajouter 0,88 mg de stéarate de polyoxyéthylène40.
- Ajouter le chloroforme jusqu’à ce que tous les phospholipides soient dissous (p. ex. 3 mL de chloroforme).
- Évaporer le chloroforme dans un desséchant pendant 48 h pour former un film lipidique sec (l’évaporation sous argon ou avec un évaporateur rotatif peut être utilisée pour accélérer le processus de séchage).
- Réhydratez le film lipidique avec 10 mL de solution saline stérile tamponnée au phosphate (PBS).
- Soniquez la solution lipidique pendant 3 min à 40% d’amplitude pour former une solution micellaire cationique.
- Après la sonication, conservez la solution de phospholipide à 2-6 °C jusqu’à 1 mois.
- Pour préparer des agents de contraste à ultrasons, ajouter 200 μL de solution micellaire cationique et 600 μL de PBS stérile à un flacon de septum en verre de 2 mL.
- Scellez le flacon en sertissant le capuchon.
- Utilisez une aiguille 1,5 » 20G pour remplir l’espace de tête du flacon avec du décafluorobutane gazeux pendant 30 s.
- Amalgamer le flacon pendant 45 s à 4 350 cpm pour former des agents de contraste à ultrasons remplis de perfluorobutane remplis de gaz.
- Ajouter 25 μL de solution d’agent de contraste à ultrasons par 1 mL de solution cellulaire immédiatement avant de pomper le mélange combiné agent de contraste/cellule à travers le dispositif acoustofluidique. La solution cellulaire peut être modifiée comme désiré par l’utilisateur, mais dans nos études la solution cellulaire s’est composée des cellules T primaires à l’étape 4.21, et des cellules cancéreuses du poumon A549 à l’étape 5.7, respectivement.
4. Préparation des cellules T primaires
- Isoler les cellules mononucléaires du sang périphérique (PBMC) des solutions de sang total et les conserver à -150 °C. La séparation par gradient de densité contenant un substrat est couramment utilisée pour séparer les PBMC du sang total24,25,26.
- Décongeler le flacon congelé dans un bain-marie à 37 °C.
- Diluer les PBMC décongelés 1:10 avec du PBS dans un tube à centrifuger de 15 ml. Chaque flacon de 1 ml contient environ 10 millions de PBMC.
- Pbmcs dilués par centrifugeuse à 580 x g pendant 11 min à 4 °C.
- Aspirez le surnageant et ajoutez 13 mL de tampon d’exécution de MACs pour ressusciter les cellules.
- Comptez les PBMC avec un compteur de cellules automatisé ou un hémocytomètre.
- Centrifuger à nouveau les PBMC à 580 x g pendant 11 min à 4 °C et aspirer le surnageant.
- Ajouter 40 μL de tampon d’exploitation réfrigéré par 10 millions de PBMC.
- Pour isoler les lymphocytes T, ajoutez 10 μL de cocktail d’anticorps pan-cellulaires à la biotine par 10 millions de PBMC.
- Agiter doucement les PBMC et conserver la solution à 4 °C pendant 5 min pour 10 millions de cellules.
- Ajouter 30 μL de tampon en cours d’exécution et 20 μL de Cocktail micro-bouilles pan-T-cell par 10 millions de PBMC.
- Mélanger soigneusement les PBMC et les billes et incuber pendant 15 min supplémentaires à 4 °C.
- Ajoutez la mémoire tampon en cours d’exécution pour atteindre un volume total de 500 μL.
- Séparez les lymphocytes T primaires à l’aide d’un instrument de tri magnétique de paillasse disponible dans le commerce à l’aide du paramètre « épuise la séparation » suivant le protocole du fabricant. Cette étape devrait produire entre 5 et 10 millions de lymphocytes T après le tri cellulaire.
- Comptez les lymphocytes T à l’aide d’un compteur cellulaire automatisé ou d’un hémocytomètre.
- Diluer les lymphocytes T dans 10 mL de PBS stérile et centrifuger à 580 x g pendant 10 min à 4 °C pour granuler les cellules.
- Aspirer les lymphocytes T surnageants et remises en suspension dans 1 ml de PBS.
- Comptez les lymphocytes T à l’aide d’un compteur cellulaire automatisé ou d’un hémocytomètre et aliquote 1 million/mL pour les expériences.
- Préparer une solution de fluorescéine à 1 mg/mL dans du PBS.
- Ajouter 100 μL de solution de fluorescéine à 1 mg/mL par 1 mL de solution à cellules T (concentration finale de fluorescéine = 100 μg/mL) immédiatement avant le traitement.
- Ajouter 25 μL de solution d’agent de contraste à ultrasons comme décrit précédemment à l’étape 3.11.
- Traiter des aliquotes de 1 ml de cellules à l’aide du système acoustofluidique (voir les étapes 2.10 à 2.11). Cette étape améliore l’administration de la fluorescéine dans les cellules T primaires.
- Immédiatement après le traitement, laver les cellules trois fois par centrifugation à 580 x g pendant 10 min avec 500 μL de PBS pour éliminer la fluorescéine extracellulaire. Les cellules doivent être lavées dans les 10 minutes suivant l’ajout d’une solution de fluorescéine.
- Après l’étape finale de lavage, ressusciter les cellules dans 250 μL de PBS et mesurer la fluorescence sur le cytomètre de flux.
5. Préparation des cellules cancéreuses du poumon A549
- Culturez des cellules A549 (épithéliales basales alvéolaires humaines adénocarcinomiques) dans des milieux DMEM complets (10 % de sérum fœtal bovin, 1 % de pénicilline/streptomycine) à 37 °C et 5 % deCO2 dans une fiole de culture de tissu à fond plat.
- Récoltez les cellules A549 lorsqu’elles atteignent une confluence de 70 à 90%. Aspirer les milieux du ballon et laver les cellules une fois avec du PBS pour éliminer les protéines sériques.
- Ajouter de la trypsine (0,25 %) d’EDTA dans le ballon et incuber pendant 5 min à 37 °C. La trypsine est une enzyme digestive qui provoque le détachement des cellules de la surface inférieure du ballon de culture tissulaire.
- Transférer la solution de trypsine dans un tube à centrifuger de 15 ml et la neutraliser en ajoutant un support DMEM complet à un rapport de 1:3.
- Granuler les cellules par centrifugation à 1 500 x g pendant 5 min à 4 °C.
- Aspirer le surnageant et le ressusciter à une concentration de 100 000/mL dans une solution de PBS contenant 200 mM de tréhalose dans un flacon conique de 15 mL.
- Ajouter 25 μL de solution d’agent de contraste à ultrasons comme décrit précédemment à l’étape 3.11.
- Traiter des aliquotes de 1 ml de cellules à l’aide du système acoustofluidique (voir les étapes 2.10 à 2.11). Cette étape améliore l’administration du tréhalose dans les cellules cancéreuses du poumon A549.
- Immédiatement après le traitement, laver les cellules trois fois par centrifugation avec 500 μL de PBS pour éliminer le tréhalose extracellulaire. Les cellules doivent être lavées dans les 10 minutes après l’ajout d’une solution de tréhalose.
- Après l’étape finale de lavage, ressusciter les cellules dans 100 μL de PBS.
- Ajouter 11 μL de solution de Triton X-100 à 1 % aux cellules de lyse et libérer du tréhalose intracellulaire.
- Vortex pendant 15 s, puis incuber pendant 30 min à température ambiante.
- Vortex à nouveau pendant 15 s, puis mesurer la concentration de tréhalose en utilisant le test de tréhalose disponible dans le commerce suivant la recommandation du fabricant.
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Representative Results
Une image du système acoustofluidique assemblé à l’intérieur d’un boîtier imprimé en 3D est illustrée à la figure 1. Ce protocole produit un système acoustofluidic qui peut être employé pour augmenter la livraison moléculaire intracellulaire dans des variétés de cellule multiples utilisant des agents de contraste d’ultrason.
Graphique 2 démontre l’administration intracellulaire augmentée d’un composé fluorescent, fluorescéine, aux cellules de T humaines primaires avec le traitement acoustofluidic comparé à un groupe témoin non traité (p<0,05, n=3/groupe). Les lymphocytes T ont été mis en suspension à une concentration de 1 million/mL dans du PBS avec une solution de fluorescéine de 100 μg/mL et une solution d’agent de contraste à ultrasons de 25 μL/mL, et le mélange a été passé à travers le dispositif acoustofluidique pour le traitement par ultrasons. La livraison intracellulaire de fluorescéine et la viabilité de cellules ont été mesurées avec l’écoulement cytometry après lavage de cellules par l’intermédiaire de la centrifugation pour enlever la fluorescéine extracellulaire. Les lymphocytes T du groupe témoin non traité ont également été mis en suspension à 1 million/mL dans du PBS avec une solution de fluorescéine de 100 μg/mL, mais aucune solution d’agent de contraste à ultrasons n’a été ajoutée et les cellules n’ont pas été passées à travers le dispositif acoustofluidique. L’intensité de fluorescence des cellules de T a augmenté de 5 fois après traitement acoustofluidic relativement à l’intensité de fluorescence des cellules de T dans le groupe témoin non traité, indiquant la livraison augmentée du fluorescéine. La viabilité de cellules a diminué légèrement après traitement acoustofluidic mais est demeurée au-dessus de 80% (p<0,05, n=3/groupe).
La figure 3 montre une meilleure administration intracellulaire d’un composé conservateur, le tréhalose, aux cellules humaines du carcinome pulmonaire A549 avec traitement acoustofluidique par rapport à l’écoulement seul (pas d’agents de contraste échographique ou exposition aux ultrasons) et par rapport aux cellules du groupe témoin non traité (ANOVA p<0,05, n = 3/groupe). Les cellules A549 ont été suspendues à une concentration de 100 000/mL dans du PBS avec une solution de tréhalose de 200 mM et une solution d’agent de contraste à ultrasons de 25 μL/mL, et le mélange a été passé à travers le dispositif acoustofluidique pour le traitement par ultrasons. Des cellules d’A549 dans les groupes témoins (« écoulement seulement » et « aucun traitement ») ont été également suspendues à 100.000/mL dans pbs avec le tréhalose de 200 mM, mais la solution d’agent de contraste d’ultrason n’a pas été ajoutée et les cellules n’ont pas été exposées au traitement ultrasonore. Le tréhalose intracellulaire a été mesuré utilisant un kit d’analyse de tréhalose et normalisé au groupe témoin non traité. La viabilité de cellules a été mesurée avec l’analyse bleue de trypan. Il n’y avait aucune différence statistique dans la viabilité cellulaire entre les groupes (n = 3-7/groupe).
Figure 1: Photo du système acoustofluidique. Le système d’écoulement acoustofluidique contient une chambre d’écoulement basée sur PDMS avec un transducteur PZT intégré entraîné par un microcontrôleur. Un boîtier imprimé en 3D avec un indicateur LED et un bouton-poussoir marche/ arrêt sont des fonctionnalités supplémentaires en option. Veuillez cliquer ici pour voir une version plus grande de cette figure.
Figure 2: Le traitement acoustofluidique améliore l’administration de fluorescéine aux lymphocytes T humains. (A) L’intensité de fluorescence dans les lymphocytes T primaires a augmenté après traitement acoustofluidique avec de la fluorescéine par rapport au groupe témoin non traité (pas d’acoustofluidics et pas de microbulles) (p<0,05, n=3/groupe). (B) La viabilité de cellules a diminué légèrement après traitement acoustofluidic mais est demeurée au-dessus de 80% comme mesuré par cytométrie d’écoulement(p<0,05, n=3/groupe). (C) Histogramme représentatif de cytométrie de flux indiquant une fluorescence plus élevée dans le groupe de traitement acoustofluidic. Veuillez cliquer ici pour voir une version plus grande de cette figure.
Figure 3: Le traitement acoustofluidique améliore l’administration deréhalose aux cellules cancéreuses du poumon humain. (A) L’absorption de tréhalose a augmenté dans les cellules de carcinome de poumon A549 comparées à l’écoulement seulement (pas d’ultrason et pas de microbulles) et au groupe témoin non traité (ANOVA p<0,05, n=3/groupe). (B) La viabilité de cellules est demeurée au-dessus de 90% après traitement acoustofluidic comme mesuré par analyse de bleu de trypan (n=3-7/groupe). Veuillez cliquer ici pour voir une version plus grande de cette figure.
Fichiers supplémentaires. Veuillez cliquer ici pour télécharger ce fichier.
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Discussion
Ce protocole décrit l’assemblage et le fonctionnement d’un système acoustofluidique à faible coût qui améliore l’administration intracellulaire de biomolécules pour des applications de recherche. Il existe plusieurs facteurs importants à prendre en compte lors de l’assemblage et de l’exploitation de ce système. Le dispositif acoustofluidique est fabriqué en PDMS, qui est un matériau biocompatible qui peut facilement être moulé avec des dimensions de canal cohérentes27. Les canaux de l’appareil peuvent être rincés avec 15 mL de solution d’éthanol à 70% avant le traitement acoustofluidique afin d’augmenter la stérilité lorsque vous travaillez avec des cellules cultivées. Après le nettoyage à l’éthanol, 15 mL d’eau désionisée peuvent être utilisés pour rincer l’appareil afin d’éliminer l’éthanol résiduel des canaux avant d’ajouter des solutions cellulaires. Les petits canaux acoustofluidiques peuvent facilement être bloqués par des débris ou des agrégats cellulaires, ce qui en fait une limitation de l’utilisation fréquente de l’appareil. Un rinçage complet des canaux entre chaque échantillon aidera à prévenir les problèmes de blocage des canaux. En outre, plusieurs dispositifs PDMS peuvent être fabriqués dans chaque lot afin que les appareils puissent être rapidement remplacés si nécessaire. Pour les applications à ultrasons, il est important de produire des dispositifs PDMS avec une épaisseur constante, car les différences d’épaisseur PDMS peuvent affecter les pressions ultrasonores dans les canaux fluidiques. Les ondes ultrasonores se propagent continuellement à travers le dispositif et les ondes transmises interagissent avec les ondes réfléchies pour former des motifs d’ondes acoustiques stationnaires très sensibles aux différences d’épaisseur PDMS17. L’épaisseur PDMS est principalement déterminée par la quantité de PDMS ajoutée au moule (étape 1.7) et ce protocole donne une épaisseur PDMS de 3,5 mm.
La fréquence de sortie maximale du microcontrôleur (8 MHz) a été choisie pour produire la plus petite longueur d’onde acoustique dans le canal fluidique. La sortie du microcontrôleur est généralement une onde carrée, mais les mesures de l’oscilloscope ont révélé que la sortie à 8 MHz devient plus similaire à une forme d’onde sinusoïdale en raison des limitations de vitesse de fléa. Une limitation de ce système est que la sortie de tension maximale du microcontrôleur est de 5V et qu’un amplificateur RF externe est nécessaire si des sorties de tension plus élevées sont souhaitées. La pression en champ libre du transducteur dans ce système était de 18 kPa à 1 cm, mesurée avec un hydrophone à aiguille (Precision Acoustics, Dorchester, Royaume-Uni). Bien que cette pression soit relativement faible, les ondes stationnaires à l’intérieur des canaux peuvent augmenter les pressions acoustiques auxquelles les échantillons sont exposés lors de leur passage à travers le faisceau ultrasonore.
Les agents de contraste ultrasonores sont utilisés pour nucléer la cavitation acoustique dans les canaux acoustofluidiques ce qui améliore l’administration de biomolécules à travers les membranes cellulaires28,29. Ce protocole décrit la synthèse des microbulles remplies de gaz perfluorocarbone encapsulées par une membrane cationique de phospholipide. Comme décrit précédemment, cette formulation est constituée de microbulles principalement comprises entre 1-3 μm de diamètre30. La surface chargée positivement des microbulles les attire vers les membranes cellulaires chargées négativement, ce qui augmente la livraison moléculaire médiée par sonoporation lorsque les microbulles et les cellules sont à proximité. La concentration de microbulles dans la solution cellulaire est un facteur critique qui peut influencer l’efficacité de la livraison moléculaire et la viabilité cellulaire après le traitement acoustofluidique, et la concentration optimale de microbulles peut être spécifique à chaque type de cellule 19. La concentration de microbulles remplies de gaz avec une coquille lipidique peut diminuer au fil du temps après la synthèse, de sorte que les agents de contraste à ultrasons doivent être utilisés quelques heures après la synthèse.
Nous avons démontré la livraison d’un composé fluorescent (fluorescéine) aux cellules de T humaines non-activées primaires utilisant le système acoustofluidic dans ce protocole. Il est important de noter que le statut d’activation des cellules T humaines primaires peut affecter l’efficacité de la livraison moléculaire intracellulaire. Les propriétés de fluorescence de la fluorescéine permettent une détection intracellulaire sensible avec cytométrie en flux, mais d’autres composés solubles peuvent également être administrés dans les cellules à l’aide de ce système acoustofluidique. Par exemple, nous avons démontré l’administration acoustofluidique de tréhalose dans les cellules cancéreuses du poumon humain. L’administration acoustofluidique de tréhalose dans les cellules peut permettre une récupération accrue après un stockage congelé et sec, ce qui pourrait avoir des impacts importants sur une gamme d’applications biomédicales et de recherche 19.
L’administration acoustofluidique d’autres biomolécules, telles que des protéines ou des plasmides d’ADN, est également possible, bien qu’une limitation de ce système soit que l’efficacité de l’administration moléculaire puisse être inférieure pour les composés plus grands18,31. L’optimisation du débit acoustofluidique, des concentrations des agents de contraste d’ultrason, des concentrations de cellules, et des milieux peut être nécessaire pour l’administration d’autres biomolécules. En outre, les paramètres optimaux peuvent varier entre différents types de cellules en raison de facteurs tels que le diamètre de la cellule, la morphologie, les propriétés de la membrane et le phénotype.
Le système acoustofluidique décrit dans ce protocole peut être facilement assemblé et exploité à un coût relativement faible. De plus, ce système peut être personnalisé pour d’autres applications en connectant d’autres sources de signaux ou transducteurs à ultrasons pour générer des pressions et des fréquences de sortie spécifiques32,33,34. De plus, le système de pompe à seringues décrit dans ce protocole peut être remplacé par des pompes péristaltiques si vous le souhaitez. À un débit de 50 mL/h, le temps de séjour des cellules à l’intérieur du faisceau ultrasonore lors de leur passage dans le canal acoustofluidique est d’environ 1 s, mais ce temps de séjour peut être modifié au besoin pour des applications spécifiques en ajustant le débit du fluide.
Contrairement à d’autres techniques de transfection courantes, les biomolécules peuvent être administrées dans les cellules en quelques minutes au lieu de quelques heures et ce système ne nécessite pas d’équipement spécialisé et coûteux. De plus, ce système est compatible avec une large gamme de milieux de culture cellulaire couramment utilisés ou d’autres tampons. En résumé, ce système acoustofluidique permet l’administration rapide de biomolécules aux cellules, ce qui peut être utile pour un large éventail d’applications de recherche.
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Disclosures
Les coauteurs MAM et JAK détiennent la propriété de DesiCorp, qui pourrait bénéficier financièrement des produits liés à cette recherche.
Acknowledgments
Ce travail a été soutenu en partie par le financement de la National Science Foundation (#1827521, #1827521, #1450370) et des National Institutes of Health (U01HL127518). Les services de photolithographie ont été fournis par le Centre de micro/nanotechnologie de l’Université de Louisville.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Fabrication of Acoustofluidic Device | |||
| DOW SYLGARD 184 SILICONE ENCAPSULANT CLEAR 0.5 KG KIT | Ellsworth Adhesives | 4019862 (SKU) | https://www.ellsworth.com/products/by-market/consumer-products/encapsulants/silicone/dow-sylgard-184-silicone-encapsulant-clear-0.5-kg-kit/ |
| Harris Uni-Core (2.5 mm) | Electron Microscopy Sciences | 69039-25 | |
| Microfluidic Reservoir for 15 mL Falcon Tube - S (2/4 port) | Darwin Microfluidics | LVF-KPT-S-2 (SKU) | https://darwin-microfluidics.com/products/15-ml-falcon-tube-microfluidic-reservoir-s-2-4-port |
| Microscope Slide | VWR | 16004-430 | https://us.vwr.com/store/product/4646174/vwr-vistavisiontm-microscope-slides-plain-and-frosted-premium |
| trichlorosilane | Gelest | 105732-02-3 (Cas. No.) | Chlorosilane is very hazaradous and flammable. Exposure causes severe burns and eye damage. |
| Tygon PVC soft plastic tubing (1/16" ID, 1/8" OD) | McMaster-Carr | 5233K51 (Part #) | https://www.mcmaster.com/pvc-tubing/soft-tubing-for-air-and-water/ |
| Assembly of Acoustofluidic System | |||
| Arduino Uno | Arduino | 7630049200050 (Barcode) | https://store.arduino.cc/usa/arduino-uno-rev3 |
| Preparation of Ultrasound Contrast Agents | |||
| 1,2-distearoyl-sn-glycero-3-ethylphosphocholine (DSEPC) | Avanti Lipids | 890703P-25mg (SKU) | https://avantilipids.com/product/890703 |
| 1,2-distearoyl-sn-glycero-3-phosphocholine (DSPC) | Avanti Lipids | 850365P-25mg (SKU) | https://avantilipids.com/product/850365 |
| 1,2-distearoyl-sn-glycero-3-phosphoglycerol (DSPG) | Avanti Lipids | 840465P-25mg (SKU) | https://avantilipids.com/product/840465 |
| APF-140HP (decafluorobutate gas) | FlouroMed | 355-25-9 (Cas No.) | http://www.fluoromed.com/products/perfluorodecalin/ |
| DB-338 Amalgamators | COXO | https://www.coxotec.com/coxo/db-338-amalgamators/ | |
| polyoxyethylene 40 stearate | Sigma-Aldrich | P3440-250G (SKU) | https://www.sigmaaldrich.com/catalog/product/sigma/p3440?lang=en®ion=US&gclid= Cj0KCQjwy8f6BRC7ARIsAPIXOjjj Jh_151mYVEUyLZRavt4re9YQMLS vID64X-1KbO3LUKGjVUwb PDAaAqvOEALw_wcB |
| Q125 Sonicator | Qsonica | Q125-110 (Ref.) | https://www.sonicator.com/products/q125-sonicator?_pos=1&_sid=406df3776&_ss=r |
| Preparation of Primarty T Cells | |||
| autoMACs running buffer | Miltenyi Biotec | 130-091-221 (Order No.) | https://www.miltenyibiotec.com/US-en/products/automacs-running-buffer-macs-separation-buffer.html#gref |
| Pan T Cell Isolation Kit, human (Pan T-Cell Biotin Antibody Cocktail & Pan T-Cell MicroBead Cocktail) | Miltenyi Biotec | 130-096-535 (Order No.) | https://www.miltenyibiotec.com/US-en/products/pan-t-cell-isolation-kit-human.html#130-096-535 |
| magnetic cell sorter (autoMACS Pro Separator) | Miltenyi Biotec | 130-092-545 (Order No.) | https://www.miltenyibiotec.com/US-en/products/automacs-pro-separator-starter-kit.html#130-092-545 |
| Preparation of A549 Lung Cancer Cells | |||
| Trehalose Assay Kit | Megazyme | K-TREH (Cat. No.) | https://www.megazyme.com/trehalose-assay-kit |
| Trypan blue (0.4% in aqueous solution Ready-to-Use, sterile) | VWR | 97063-702 (Cat. No.) | https://us.vwr.com/store/product/7437427/trypan-blue-0-4-in-aqueous-solution-ready-to-use-sterile |
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