Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Bioengineering
Click here for the English version

Bioengineering

Сборка и эксплуатация акустофлюидного устройства для улучшенной доставки молекулярных соединений к клеткам

Published: January 21, 2021 doi: 10.3791/62035
Automatic Translation
1, 1, 2, 1, 1, 2, 3, 2, 1
1Department of Bioengineering, University of Louisville, 2School of Medicine, University of Louisville, 3Department of Biology, University of Louisville

Summary

Этот протокол описывает сборку и эксплуатацию недорогого акустофлюидного устройства для быстрой молекулярной доставки к клеткам посредством сонопорации, индуцированной ультразвуковыми контрастными веществами.

Abstract

Эффективная внутриклеточная доставка биомолекул необходима для широкого спектра биомедицинских исследований и клеточных терапевтических применений. Ультразвукопосредовая сонопорация является новым методом быстрой внутриклеточной доставки биомолекул. Сонопорация возникает, когда кавитация газонаполненных микропузырьков образует переходные поры в близлежащих клеточных мембранах, что позволяет быстро поглощать биомолекулы из окружающей жидкости. Современные методы сонопорации клеток in vitro в суспензии ограничены медленной пропускной способностью, изменчивостью условий ультразвукового воздействия для каждой клетки и высокой стоимостью. Для устранения этих ограничений было разработано недорогое акустофлюидное устройство, которое интегрирует ультразвуковой преобразователь в жидкостное устройство на основе PDMS, чтобы индуцировать последовательную сонопорацию клеток, когда они протекают по каналам в сочетании с ультразвуковыми контрастными веществами. Устройство изготовлено с использованием стандартных методов фотолитографии для производства жидкостного чипа на основе PDMS. Ультразвуковой пьезодисковый преобразователь подключается к устройству и приводится в действие микроконтроллером. Сборка может быть интегрирована в 3D-печатный корпус для дополнительной защиты. Клетки и микропузырьки проталкиваются через устройство с помощью шприцевого насоса или перистальтического насоса, подключенного к трубам из ПВХ. Улучшенная доставка биомолекул к Т-клеткам человека и клеткам рака легких демонстрируется с помощью этой акустофлюидной системы. По сравнению с объемными подходами к лечению, эта акустофлюидная система увеличивает пропускную способность и снижает изменчивость, что может улучшить методы обработки клеток для биомедицинских исследований и производства клеточной терапии.

Introduction

Вирусные и невирусные платформы были использованы для улучшения молекулярной доставки к клеткам. Вирусная доставка (трансдукция) является распространенным методом, используемым в клеточной терапии, требующей геномной модификации. Ограничения с вирусной доставкой включают потенциальный вставной мутагенез, ограниченную трансгенную способность и нежелательную множественность инфекции1,2. Поэтому невирусные методы молекулярной доставки находятся в разработке для широкого спектра биомедицинских и исследовательских применений. Общие методы включают механические, электрические, гидродинамические или использование лазерной энергии для усиления поглощения биомолекул клетками 3. Электропорация является широко используемой невирусной молекулярной платформой доставки, которая обладает способностью индуцировать преходящую перфорацию в плазматической мембране для внутриклеточной доставки молекулярных соединений4,5,6,7,8,9. Однако преходящая перфорация плазматической мембраны представляет собой стохастический процесс, и поглощение молекул посредством электропорации обычно зависит от пассивной диффузии через переходные мембранные поры4,7,8.

Альтернативным методом является использование ультразвука для усиленной внутриклеточной молекулярной доставки посредством кавитации ультразвуковых контрастных веществ (т.е. газонаполненных микропузырьков). Кавитация микропузырьков индуцирует микропотоковые эффекты в окружающих средах, которые могут вызвать преходящую перфорацию близлежащих плазматических мембран («сонопорация»), что позволяет быстро внутриклеточным поглощением биомолекул через пассивные или активные транспортные механизмы10,11,12. Сонопорация является эффективным методом для быстрой молекулярной доставки к клеткам, но этот подход часто требует дорогостоящего оборудования и объемных методов обработки, которые ограничены более низкой пропускной способностью и более высокой изменчивостью в условиях ультразвукового воздействия13. Для устранения этих ограничений в настоящее время разрабатываются акустофлюидные устройства, которые обеспечивают последовательную сонопорацию клеток в суспензии.

Акустофлюидика является расширяющейся областью, которая объединяет ультразвуковые и микрофлюидные технологии для широкого спектра применений. Этот подход ранее использовался для разделения частиц путем применения непрерывной ультразвуковой энергии для индуцирования стоячих акустических волн в флюидных каналах14,15,16,17. Частицы сортируются по отношению к различным частям устройства на основе различных свойств, таких как размер частиц, плотность и сжимаемость относительно среды16. Акустофлюидные технологии также находятся в разработке, чтобы обеспечить быструю молекулярную доставку к различным типам клеток для исследовательских применений и производства клеточной терапии18. Недавно мы продемонстрировали улучшенную молекулярную доставку к эритроцитам с использованием акустофлюидного устройства19на основе PDMS. В акустофлюидной платформе можно манипулировать динамикой клеток и микросубблов, чтобы вызвать физические взаимодействия, которые позволяют улучшить доставку биомолекул. Эффективность и консистенция внутриклеточной молекулярной доставки потенциально может быть увеличена за счет оптимизации расстояния между клетками и микропузырьками.

Одно из важных применений акустофлюидно-опосредоточной сонопорации включает транспорт биомолекул в первичные Т-клетки человека. Иммунотерапия, основанная на переносе приемных Т-клеток, такая как терапия Т-клетками рецептора химерного антигена (CAR T), быстро появляется для лечения различных заболеваний, включая рак и вирусы, такие как ВИЧ20. Терапия CAR T была особенно эффективна у детей с острым лимфобластным лейкозом (ОЛЛ), с полной частотой ремиссии 70-90%21. Однако производство Т-клеток для этих методов лечения обычно зависит от вирусной трансдукции, которая ограничена потенциальным инкруционным мутагенезом, длительным временем обработки и проблемами доставки негенетических биомолекул, таких как белки или малые молекулы1. Акустофлюидно-опосредованные молекулярные методы доставки могут потенциально преодолеть эти ограничения и улучшить производство Т-клеточной терапии.

Другое важное применение акустофлюидно-опосредоточной сонопорации включает внутриклеточную доставку консервантных соединений, таких как трегалоза, которые защищают клетки во время замораживания и высыхания. Трегалоза вырабатывается некоторыми организмами в природе и помогает им переносить замерзание и высыхание, защищая их клеточные мембраны22,23. Однако трегалоза не вырабатывается клетками млекопитающих и непроницаема для клеточных мембран млекопитающих. Поэтому эффективные методы молекулярной доставки, такие как сонопорация, необходимы для достижения достаточных внутриклеточных уровней трегалозы, необходимых для защиты внутренних клеточных мембран. Этот подход в настоящее время находится в разработке для сухого сохранения различных типов клеток.

Этот протокол предоставляет подробное описание сборки и работы относительно недорогой акустофлюидной системы, управляемой микроконтроллером. Ультразвуковые контрастные вещества используются для индуцирования сонопорации в жидких каналах и обеспечивают быструю молекулярную доставку к различным типам клеток, включая Т-клетки и раковые клетки. Эта акустофлюидная система может быть использована для различных исследовательских приложений, а также может быть полезна в качестве прототипа системы для оценки методов сонопорации для улучшения производственных процессов клеточной терапии.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

Донорство цельной крови было собрано у здоровых доноров в соответствии с протоколами, утвержденными институциональным наблюдательным советом в Университете Луисвилля.

1. Изготовление акустофлюидного устройства

  1. Получите фотомаску с концентрической спиральной конструкцией, содержащую каналы диаметром 500 мкм. Файл САПР приведен в дополнительных файлах в качестве примера. Пользовательскую фотомаску можно заказать у коммерческого поставщика или создать с помощью модуля записи масок.
  2. Подготовьте форму концентрической спиральной конструкции на кремниевой пластине с фоторезистическим покрытием, используя стандартные методы фотолитографии.
    1. Добавьте приблизительно 2 столовые ложки (~30 мл) SU-8 2100 на кремниевую пластину 100 мм.
    2. Раскрутите пластину на спиннере со скоростью 150 об/мин в течение 30 с, чтобы разложить фоторезист, затем увеличьте скорость до 1 200 об/мин в течение 60 с, чтобы получить толщину 200 мкм.
    3. Отвержите пластину с фоторезистичным покрытием в полиимидной вакуумной печи с 30-минутным наращиванием и 30-минутным належным сроком при 115 °C, затем опустите вниз на 30 минут.
    4. Экспонируйте пластину с покрытием фоторезиста в течение 130 с с помощью выравнивателя маски с фотомаской из шага 1.1.
    5. Выпекать после воздействия следует тому же процессу, описанному на этапе 1.2.3.
    6. Разработка фоторезиста в решении разработчика СУ-8 в течение примерно 8 минут.
      ВНИМАНИЕ: Используйте только раствор разработчика в хорошо вентилируемом химическом вытяжном вытяжке.
  3. Силанизируйте форму, чтобы сделать поверхность более гидрофобной. Поместите пластину с фоторезистическим покрытием в адсорбатор и добавьте каплю хлорсилана в 20 мкл (C8H4Cl3F13Si). Приложите вакуум к камере в течение 30 с, затем запечатайте камеру и оставьте на ночь.
    ВНИМАНИЕ: Хлорсилан очень опасен и легковоспламеняется. Воздействие вызывает сильные ожоги и повреждение глаз.
  4. Смешайте 54 г основы полидиметсилоксана (PDMS) и 6 г отверждающего агента в чашке и энергично и тщательно перемешайте шпателем в течение не менее 1 мин.
  5. Поместите чашку, содержащую раствор PDMS, в адсорбатор примерно на 30 мин или до тех пор, пока из раствора не будут удалены остатки пузырьков воздуха.
  6. Поместите пластину с фоторезистической оболочкой с узорами, обращенными вверх, в 150-миллиметровую чашку Петри.
  7. Вылейте раствор PDMS на форму внутри 150-миллиметровой чашки Петри.
  8. При необходимости поместите 150-миллиметровую чашку Петри внутрь адсорбатора и применяйте вакуум до тех пор, пока не исчезнут остаточные пузырьки воздуха.
  9. Переложите 150-миллиметровую чашку Петри в лабораторную печь и выпекайте в течение 2 ч при 60 °C, чтобы вылечить PDMS.
  10. После отверждения аккуратно извлеките PDMS из чашки Петри, разрезав по краям пластины лезвием бритвы.
  11. Вырежьте каждое отдельное устройство с помощью ножа или лезвия бритвы.
  12. Пробивьте отверстия через впускные и выходные порты каждого устройства с помощью 2,5-мм биопсийного перфоратора.
  13. Поместите каждое устройство PDMS в плазменный ашер с открытыми каналами (обращенными вверх). Нанесите кислородно-плазменную обработку (100 Вт в течение 45 с, 500 мбар O2),затем немедленно поместите каждое устройство PDMS на чистый накладной известковый стеклянный микроскоп (75 мм x 25 мм x 1 мм) с каналами, обращенными к поверхности стекла.
  14. Дайте устройствам склеиться на ночь при комнатной температуре.
  15. Аккуратно нанесите силикон на поверхность пьезооформителей диаметром 1 см толщиной ~1-2 мм, затем аккуратно выровняйте преобразователь с концентрической спиралью и осторожно прижмите его к нижней части стекла микроскопа (противоположная сторона от прибора PDMS).

2. Сборка и эксплуатация акустофлюидной системы

  1. Подключите микроконтроллер к компьютеру с помощью кабеля USB A-B. Должен загоретаться зеленый индикатор питания (с маркировкой PWR).
  2. Используйте связанную программу на компьютере для загрузки программы, которая генерирует сигнал 8 МГц. Пример программы приведен в дополнительном Files. После загрузки программы она будет сохранена в микропроцессорной памяти и не нуждается в повторной загрузке.
  3. Припаять 1" провод 22G к концу каждого провода на датчике PZT.
  4. Подключите отрицательный (черный) клеммный провод датчика PZT к контакту GND через паяный провод.
  5. Подключите положительный (красный) клеммный провод преобразователя PZT к выходному контакту (#9 в представленном примере программы) через паяный провод.
  6. Опционально установите акустофлюидное устройство и микроконтроллер в 3D-печатном корпусе. Файлы CAD представлены в Supplemental Files в качестве примеров. Дополнительные провода могут быть подключены к другим контактам микроконтроллера для управления внешним светодиодным индикатором и кнопкой вкл / выкл, если это необходимо.
  7. Вырежьте 3-6" секции мягких пластиковых трубок из TYGON PVC (1/16" ID, 1/8" OD) и протолкнуйте трубку во впускные и выпускные отверстия. Может потребоваться вращать трубку, применяя давление, пока она не впишется в отверстие. Опционально, после вставки трубки в каждый порт, клей может быть нанесен на соединение для склеивания PDMS и трубки вместе.
  8. Соберите микрофлюидный резервуар в соответствии с инструкциями производителя.
  9. Вырежьте 3-6"-дюймовую секцию мягкой пластиковой трубки из TYGON PVC (1/16" ID, 1/8" OD) и продвиньте трубку над трубкой 1/32" ID из микрофлюидной выходной трубки резервуара. При желании оберните соединение парафиновой пленкой, чтобы предотвратить утечку.
  10. Наполните шприц объемом 60 мл окружающим воздухом (опционально отфильтруйте воздух фильтром 0,2 мкм) и подключите его к трубке из ПВХ из tygon (1/16" ID, 1/8" OD) на стороне микрофлюидного резервуара.
  11. Установите шприцевой насос на скорость 200 мл / ч, чтобы протолкнуть растворы клеточного / ультразвукового контрастного вещества через акустофлюидное устройство с объемной скоростью потока 50 мл / ч и собрать образцы с выхода акустофлюидного устройства в 50-метровую центрифужную трубку. Необязательно промыть канал перед акустофлюидной обработкой 15 мл 70% раствора этанола для повышения стерильности жидких каналов. Кроме того, каналы могут быть промыты 15 мл деионизированной воды для удаления остаточного этанола в устройстве перед перекачкой клеток через систему.

3. Подготовка ультразвуковых контрастных веществ

ПРИМЕЧАНИЕ: Ультразвуковые контрастные вещества значительно усиливают акустофлюидную доставку молекулярных соединений за счет временного увеличения пермеабилизации близлежащих клеточных мембран19. Молекулярная доставка очень ограничена без ультразвуковых контрастных веществ в этой системе.

  1. Приготовьте раствор фосфолипида в сцинтилляционном флаконе 20 мл, содержащем следующую смесь:
    1. Добавьте 25 мг 1,2-дистеароил-sn-глицеро-3-фосфохолина (DSPC).
    2. Добавьте 11,6 мг 1,2-дистеароил-sn-глицеро-3-этилфосфохолина (DSEPC).
    3. Добавляют 0,26 мг 1,2-дистеароил-sn-глицеро-3-фосфоглицерина (ДСПГ).
    4. Добавьте 0,88 мг стеарата полиоксиэтилен40.
  2. Добавляйте хлороформ до тех пор, пока все фосфолипиды не растворятся (например, 3 мл хлороформа).
  3. Выпаривать хлороформ в осушителе в течение 48 ч с образованием сухой липидной пленки (испарение под аргоном или с помощью ротационного испарителя может быть использовано для ускорения процесса сушки).
  4. Регидратировать липидную пленку 10 мл стерильного фосфат-буферного физиологического раствора (PBS).
  5. Ультразвуком раствор липидов в течение 3 мин при 40% амплитуде с образованием катионного мицеллярного раствора.
  6. После ультразвуковой очистки раствор фосфолипида хранят при 2-6 °C до 1 месяца.
  7. Для приготовления ультразвуковых контрастных веществ добавляют 200 мкл катионного мицеллярного раствора и 600 мкл стерильного PBS во флакон со стеклянной перегородкой 2 мл.
  8. Запечатайте флакон, обжав колпачок.
  9. Используйте 1,5-дюймовую иглу 20G, чтобы заполнить пространство головки флакона газом декафторбутаном в течение 30 с.
  10. Амальгамируйте флакон в течение 45 с при 4 350 cpm с образованием перфторбутановых газонаполненных ультразвуковых контрастных веществ.
  11. Добавляют 25 мкл ультразвукового контрастного вещества на 1 мл клеточного раствора непосредственно перед перекачкой комбинированного контрастного вещества/клеточной смеси через акустофлюидное устройство. Клеточный раствор может быть модифицирован по желанию пользователя, но в наших исследованиях клеточный раствор состоял из первичных Т-клеток на этапе 4.21 и клеток рака легких A549 на этапе 5.7 соответственно.

4. Подготовка первичных Тселей

  1. Выделяют мононуклеарные клетки периферической крови (МПК) из растворов цельной крови и хранят при -150 °C. Разделение градиентов плотности, содержащее субстрат, обычно используется для отделения НБМК от цельной крови24,25,26.
  2. Разморозить замороженный флакон на водяной бане при 37 °C.
  3. Разбавлять размороженные НБМК 1:10 с помощью PBS в центрифужной трубке 15 мл. Каждый флакон 1 мл содержит около 10 миллионов НБМК.
  4. Центрифуга разбавленные МПК при 580 х г в течение 11 мин при 4 °C.
  5. Аспирировать супернатант и добавить 13 мл МАК, работающих буфера, чтобы повторно суспендировать клетки.
  6. Подсчитывайте НБМК с помощью автоматизированного счетчика клеток или гемоцитометра.
  7. Центрифугировать PBMC снова при 580 x g в течение 11 мин при 4 °C и аспирировать супернатант.
  8. Добавьте 40 мкл охлажденного работающего буфера на 10 миллионов МПК.
  9. Чтобы изолировать Т-клетки, добавьте 10 мкл коктейля антител к пан-Т-клеткам биотина на 10 миллионов PBMCs.
  10. Осторожно перемешивают МПК и хранят раствор при 4 °C в течение 5 мин на 10 миллионов клеток.
  11. Добавьте 30 мкл работающего буфера и 20 мкл коктейля Pan T-Cell MicroBead на 10 миллионов PBMCs.
  12. Тщательно перемешайте МПК и бусины и инкубировать в течение дополнительных 15 минут при 4 °C.
  13. Добавьте работающий буфер, чтобы достичь общего объема 500 мкл.
  14. Отделите первичные Т-ячейки с помощью коммерчески доступного настоеного магнитного сортировочного прибора с использованием настройки «истощает разделение» в соответствии с протоколом производителя. Этот этап должен дать от 5 до 10 миллионов Т-клеток после сортировки клеток.
  15. Подсчитывайте Т-клетки с помощью автоматизированного счетчика клеток или гемоцитометра.
  16. Разбавляют Т-клетки в 10 мл стерильного PBS и центрифугу при 580 х г в течение 10 мин при 4 °C до гранул клеток.
  17. Аспирировать супернатант и повторно суспендировать Т-клетки в 1 мл PBS.
  18. Подсчитывайте Т-клетки с помощью автоматизированного счетчика клеток или гемоцитометра и аликвот 1 миллион /мл для экспериментов.
  19. Приготовьте раствор флуоресцеина 1 мг/мл в PBS.
  20. Добавьте 100 мкл 1 мг/мл раствора флуоресцеина на 1 мл раствора Т-клеток (конечная концентрация флуоресцеина = 100 мкг/мл) непосредственно перед обработкой.
  21. Добавьте 25 мкл ультразвукового контрастного вещества, как описано ранее на этапе 3.11.
  22. Обработайте 1 мл аликвот клеток с помощью акустофлюидной системы (см. шаги 2.10-2.11). Этот этап улучшает доставку флуоресцеина в первичные Т-клетки.
  23. Сразу после обработки промывайте клетки три раза путем центрифугирования при 580 х г в течение 10 мин с 500 мкл PBS для удаления внеклеточного флуоресцеина. Клетки следует промыть в течение 10 мин после добавления раствора флуоресцеина.
  24. После заключительной промывки повторно суспендируют клетки в 250 мкл PBS и измеряют флуоресценцию на проточном цитометре.

5. Получение клеток рака легких A549

  1. Культивирование клеток А549 (аденокарциномных альвеолярных базальных эпителиальных клеток человека) в полной среде DMEM (10% фетальной бычих сывороток, 1% пенициллина/стрептомицина) при 37 °C и 5% CO2 в флеш-культуральной колбе для тканей.
  2. Собирают клетки А549, когда они достигают 70-90% слияния. Аспирировать мякоть из колбы и промыть клетки один раз PBS для удаления сывороточных белков.
  3. Добавьте трипсин (0,25%) ЭДТА в колбу и инкубировать в течение 5 мин при 37 °C. Трипсин является пищеварительным ферментом, который заставляет клетки отсоединяться от нижней поверхности колбы культуры тканей.
  4. Перенесите раствор трипсина в центрифужную трубку 15 мл и нейтрализуйте его, добавив полную жиму DMEM в соотношении 1:3.
  5. Гранулирование клеток путем центрифугирования при 1,500 х г в течение 5 мин при 4 °C.
  6. Аспирировать супернатант и повторно суспендировать гранулу в концентрации 100 000/мл в растворе PBS, содержащем 200 мМ трегалозы в 15-мл коническом флаконе.
  7. Добавьте 25 мкл ультразвукового контрастного вещества, как описано ранее на этапе 3.11.
  8. Обработайте 1 мл аликвот клеток с помощью акустофлюидной системы (см. шаги 2.10-2.11). Этот этап усиливает доставку трегалозы в клетки рака легких A549.
  9. Сразу после лечения трижды промывайте клетки с помощью центрифугирования 500 мкл PBS для удаления внеклеточной трегалозы. Клетки следует промыть в течение 10 мин после добавления раствора трегалозы.
  10. После заключительной промывки повторно суспендировали клетки в 100 мкл PBS.
  11. Добавьте 11 мкл 1% раствора Triton X-100 для лиза клеток и высвобождения внутриклеточной трегалозы.
  12. Вихрь в течение 15 с, затем инкубировать в течение 30 мин при комнатной температуре.
  13. Снова вихрь в течение 15 с, затем измерьте концентрацию трегалозы, используя коммерчески доступный анализ трегалозы в соответствии с рекомендацией производителя.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

Изображение акустофлюидной системы, собранной внутри 3D-печатного корпуса, показано на рисунке 1. Этот протокол создает акустофлюидную систему, которая может быть использована для усиления внутриклеточной молекулярной доставки в нескольких клеточных линиях с использованием ультразвуковых контрастных веществ.

Рисунок 2   демонстрирует усиленную внутриклеточную доставку флуоресцентного соединения, флуоресцеина, к первичным Т-клеткам человека при акустофлюидном лечении по сравнению с необработанной контрольной группой(p<0,05, n= 3 /группа). Т-клетки суспендировали в концентрации 1 мл/мл в PBS со 100 мкг/мл флуоресцеина раствором и 25 мкл/мл раствора ультразвукового контрастного вещества, и смесь пропускали через акустофлюидное устройство для ультразвуковой обработки. Внутриклеточную доставку флуоресцеина и жизнеспособность клеток измеряли с помощью проточной цитометрии после промывки клеток с помощью центрифугирования для удаления внеклеточного флуоресцеина. Т-клетки в необработанных контрольных группах также были суспендированы при 1 миллионе / мл в PBS со 100 мкг / мл флуоресцеина раствором, но ультразвуковой контрастный раствор не добавляли и клетки не пропускали через акустофлюидное устройство. Интенсивность флуоресценции Т-клеток увеличилась в 5 раз после акустофлюидного лечения относительно интенсивности флуоресценции Т-клеток в необработанной контрольной группе, что указывает на усиленную доставку флуоресцеина. Жизнеспособность клеток несколько снизилась после акустофлюидного лечения, но оставалась выше 80% (p<0,05, n=3/группа).

Рисунок 3 демонстрирует усиленную внутриклеточную доставку консервантного соединения, трегалозы, к клеткам карциномы легкого A549 человека с акустофлюидным лечением по сравнению с одним потоком (без ультразвуковых контрастных агентов или ультразвукового воздействия) и по сравнению с клетками в необработанной контрольной группе (ANOVA p<0,05, n = 3 / группа). Клетки A549 суспендировали в концентрации 100 000/мл в PBS с 200 мМ раствором трегалозы и раствором ультразвукового контрастного вещества 25 мкл/мл, и смесь пропускали через акустофлюидное устройство для ультразвукового лечения. Клетки A549 в контрольных группах («Только поток» и «Без лечения») также были суспендированы при 100 000 / мл в PBS с трегалозой 200 мМ, но раствор ультразвукового контрастного вещества не добавлялся, и клетки не подвергались ультразвуковому лечению. Внутриклеточную трегалозу количественно оценивали с помощью набора для анализа трегалозы и нормализовали для необработанной контрольной группы. Жизнеспособность клеток измеряли с помощью анализа трипанового синего цвета. Не было статистической разницы в жизнеспособности клеток между группами (n = 3-7 / группа).

Figure 1
Рисунок 1:Фото акустофлюидной системы. Акустофлюидная проточная система содержит проточную камеру на основе PDMS со встроенным датчиком PZT, приводимым в действие микроконтроллером. 3D-печатный корпус со светодиодным индикатором и кнопкой вкл/выкл являются дополнительными функциями. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.

Figure 2
Рисунок 2: Акустофлюидное лечение усиливаетдоставку люоресцеина к Т-клеткам человека. (A)Интенсивность флуоресценции в первичных Т-клетках увеличилась после акустофлюидного лечения флуоресцеином по сравнению с необработанными контрольными группами (без акустофлюидики и без микропузырьков)(p<0,05, n = 3 / группа). (B)Жизнеспособность клеток несколько снизилась после акустофлюидного лечения, но оставалась выше 80%, измеренной с помощью проточной цитометрии(p<0,05, n = 3 / группа). (C) Репрезентативная гистограмма проточной цитометрии, указывающая на более высокую флуоресценцию в группе акустофлюидного лечения. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.

Figure 3
Рисунок 3: Акустофлюидное лечение усиливаетдоставку ингаляции к клеткам рака легких человека. (A)Поглощение трегалозы увеличилось в клетках карциномы легких A549 по сравнению только с потоком (без ультразвука и без микропузырьков) и необработанным контрольной группой (ANOVA p<0,05, n = 3 / группа). (B)Жизнеспособность клеток оставалась выше 90% после акустофлюидной обработки, измеренной с помощью анализа трипан-синего цвета (n = 3-7 / группа). Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.

Дополнительные файлы. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы загрузить этот файл. 

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Этот протокол описывает сборку и работу недорогой акустофлюидной системы, которая улучшает внутриклеточную доставку биомолекул для исследовательских применений. Есть несколько важных факторов, которые следует учитывать при сборке и эксплуатации этой системы. Акустофлюидное устройство изготовлено из PDMS, который представляет собой биосовместимый материал, который может быть легко отлит с последовательными размерами канала27. Каналы устройства могут быть промывлены 15 мл 70% раствора этанола перед акустофлюидной обработкой с целью повышения стерильности при работе с культивируемыми клетками. После очистки этанола 15 мл деионизированной воды можно использовать для промывки устройства для удаления остаточного этанола из каналов перед добавлением клеточных растворов. Небольшие акустофлюидные каналы могут легко блокироваться мусором или клеточными агрегатами, что делает это ограничением для частого использования устройства. Тщательное промывание каналов между каждым образцом поможет предотвратить проблемы с закупоркой каналов. Кроме того, в каждой партии может быть изготовлено несколько устройств PDMS, чтобы при необходимости можно было быстро заменить устройства. Для ультразвуковых применений важно производить устройства PDMS с постоянной толщиной, так как различия в толщине PDMS могут влиять на ультразвуковое давление в флюидных каналах. Ультразвуковые волны непрерывно распространяются через устройство и передаваемые волны взаимодействуют с отраженными волнами, образуя стоячие акустические волновые паттерны, которые очень чувствительны к различиям в толщине PDMS17. Толщина PDMS в первую очередь определяется количеством PDMS, добавленного в форму (этап 1.7), и этот протокол дает толщину PDMS 3,5 мм.

Максимальная выходная частота микроконтроллера (8 МГц) была выбрана для получения наименьшей акустической длины волны в флюидном канале. Выход микроконтроллера обычно представляет собой квадратную волну, но измерения осциллографа показали, что выход на частоте 8 МГц становится более похожим на синусоидальную форму сигнала из-за ограничений скорости нарастания. Ограничением этой системы является то, что максимальное выходное напряжение микроконтроллера составляет 5 В, и при желании требуются внешние радиочастотные усилители. Выходное давление в свободном поле преобразователя в этой системе составляло 18 кПа при 1 см, измеренное с помощью игольчатого гидрофона (Precision Acoustics, Dorchester, United Kingdom). Хотя это давление относительно низкое, стоячие волны в каналах могут увеличивать акустическое давление, которому подвергаются образцы, когда они проходят через ультразвуковой луч.

Ультразвуковые контрастные вещества используются для нуклеации акустической кавитации в акустофлюидных каналах, что усиливает доставку биомолекул через клеточные мембраны28,29. Этот протокол описывает синтез перфторуглеродных газонаполненных микропузырьков, инкапсулированных катионной фосфолипидной мембраной. Как описано ранее, этот состав состоит из микропузырьков преимущественно между 1-3 мкм диаметром30. Положительно заряженная поверхность микропузырьков притягивает их к отрицательно заряженным клеточным мембранам, что увеличивает опосредованную сонопорацией молекулярную доставку, когда микропузырьки и клетки находятся в непосредственной близости. Концентрация микропузырьков в клеточном растворе является критическим фактором, который может влиять на эффективность молекулярной доставки и жизнеспособность клеток после акустофлюидной обработки, а оптимальная концентрация микропузырька может быть специфичной для каждого типа клеток 19. Концентрация газонаполненных микропузырьков с липидной оболочкой может со временем уменьшаться после синтеза, поэтому ультразвуковые контрастные вещества следует использовать в течение нескольких часов после синтеза.

Мы продемонстрировали доставку флуоресцентного соединения (флуоресцеина) к первичным неактивированным Т-клеткам человека с использованием акустофлюидной системы в этом протоколе. Важно отметить, что статус активации первичных Т-клеток человека может влиять на эффективность внутриклеточной молекулярной доставки. Флуоресцентные свойства флуоресцеина обеспечивают чувствительное внутриклеточное обнаружение с помощью проточной цитометрии, но другие растворимые соединения также могут быть доставлены в клетки с использованием этой акустофлюидной системы. Например, мы продемонстрировали акустофлюидную доставку трегалозы в клетки рака легких человека. Акустофлюидная доставка трегалозы в клетки может обеспечить повышенное восстановление после замороженного и сухого хранения, что может оказать значительное влияние на ряд биомедицинских и исследовательских применений 19.

Акустофлюидная доставка других биомолекул, таких как белки или плазмиды ДНК, также возможна, хотя ограничение этой системы заключается в том, что эффективность молекулярной доставки может быть ниже для более крупных соединений18,31. Оптимизация акустофлюидного расхода, концентраций ультразвуковых контрастных веществ, клеточных концентраций и сред может потребоваться для доставки других биомолекул. Кроме того, оптимальные параметры могут варьироваться между различными типами клеток из-за таких факторов, как диаметр клетки, морфология, свойства мембраны и фенотип.

Акустофлюидная система, описанная в этом протоколе, может быть легко собрана и эксплуатироваться при относительно низких затратах. Кроме того, эта система может быть настроена для других применений путем подключения других источников сигнала или ультразвуковых преобразователей для генерации определенных выходных давлений и частот32,33,34. Кроме того, система шприцевых насосов, описанная в этом протоколе, при желании может быть заменена перистальтическими насосами. При скорости потока 50 мл/ч время пребывания ячеек в ультразвуковом луче, когда они проходят через акустофлюидный канал, составляет приблизительно 1 с, но это время пребывания может быть изменено по мере необходимости для конкретных применений путем регулировки расхода жидкости.

В отличие от других распространенных методов трансфекции, биомолекулы могут быть доставлены в клетки в течение нескольких минут, а не часов, и эта система не требует специализированного и дорогостоящего оборудования. Кроме того, эта система совместима с широким спектром широко используемых сред клеточных культур или других буферов. Таким образом, эта акустофлюидная система обеспечивает быструю доставку биомолекул к клеткам, что может быть полезно для широкого спектра исследовательских применений.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Соавторы MAM и JAK владеют DesiCorp, которая может получить финансовую выгоду от продуктов, связанных с этим исследованием.

Acknowledgments

Эта работа была частично поддержана финансированием Национального научного фонда (#1827521, #1827521, #1450370) и Национальных институтов здравоохранения (U01HL127518). Услуги фотолитографии были предоставлены Центром микро/нанотехнологий Луисвилльского университета.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Fabrication of Acoustofluidic Device
DOW SYLGARD 184 SILICONE ENCAPSULANT CLEAR 0.5 KG KIT Ellsworth Adhesives 4019862 (SKU) https://www.ellsworth.com/products/by-market/consumer-products/encapsulants/silicone/dow-sylgard-184-silicone-encapsulant-clear-0.5-kg-kit/
Harris Uni-Core (2.5 mm) Electron Microscopy Sciences 69039-25
Microfluidic Reservoir for 15 mL Falcon Tube - S (2/4 port) Darwin Microfluidics LVF-KPT-S-2 (SKU) https://darwin-microfluidics.com/products/15-ml-falcon-tube-microfluidic-reservoir-s-2-4-port
Microscope Slide VWR 16004-430 https://us.vwr.com/store/product/4646174/vwr-vistavisiontm-microscope-slides-plain-and-frosted-premium
trichlorosilane Gelest 105732-02-3 (Cas. No.) Chlorosilane is very hazaradous and flammable. Exposure causes severe burns and eye damage. 
Tygon PVC soft plastic tubing (1/16" ID, 1/8" OD) McMaster-Carr 5233K51 (Part #) https://www.mcmaster.com/pvc-tubing/soft-tubing-for-air-and-water/
Assembly of Acoustofluidic System
Arduino Uno Arduino 7630049200050 (Barcode) https://store.arduino.cc/usa/arduino-uno-rev3
Preparation of Ultrasound Contrast Agents
1,2-distearoyl-sn-glycero-3-ethylphosphocholine (DSEPC) Avanti Lipids 890703P-25mg (SKU) https://avantilipids.com/product/890703
1,2-distearoyl-sn-glycero-3-phosphocholine (DSPC) Avanti Lipids 850365P-25mg (SKU) https://avantilipids.com/product/850365
1,2-distearoyl-sn-glycero-3-phosphoglycerol (DSPG) Avanti Lipids 840465P-25mg (SKU) https://avantilipids.com/product/840465
APF-140HP (decafluorobutate gas) FlouroMed 355-25-9 (Cas No.) http://www.fluoromed.com/products/perfluorodecalin/
DB-338 Amalgamators  COXO https://www.coxotec.com/coxo/db-338-amalgamators/
polyoxyethylene 40 stearate  Sigma-Aldrich P3440-250G (SKU) https://www.sigmaaldrich.com/catalog/product/sigma/p3440?lang=en&region=US&gclid=
Cj0KCQjwy8f6BRC7ARIsAPIXOjjj
Jh_151mYVEUyLZRavt4re9YQMLS
vID64X-1KbO3LUKGjVUwb
PDAaAqvOEALw_wcB
Q125 Sonicator Qsonica Q125-110 (Ref.) https://www.sonicator.com/products/q125-sonicator?_pos=1&_sid=406df3776&_ss=r
Preparation of Primarty T Cells
autoMACs running buffer Miltenyi Biotec 130-091-221 (Order No.) https://www.miltenyibiotec.com/US-en/products/automacs-running-buffer-macs-separation-buffer.html#gref
Pan T Cell Isolation Kit, human (Pan T-Cell Biotin Antibody Cocktail & Pan T-Cell MicroBead Cocktail)  Miltenyi Biotec 130-096-535 (Order No.) https://www.miltenyibiotec.com/US-en/products/pan-t-cell-isolation-kit-human.html#130-096-535
magnetic cell sorter (autoMACS Pro Separator) Miltenyi Biotec 130-092-545 (Order No.) https://www.miltenyibiotec.com/US-en/products/automacs-pro-separator-starter-kit.html#130-092-545
Preparation of A549 Lung Cancer Cells
Trehalose Assay Kit  Megazyme K-TREH (Cat. No.) https://www.megazyme.com/trehalose-assay-kit
Trypan blue (0.4% in aqueous solution Ready-to-Use, sterile) VWR 97063-702 (Cat. No.) https://us.vwr.com/store/product/7437427/trypan-blue-0-4-in-aqueous-solution-ready-to-use-sterile

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Gardlik, R., et al. Vectors and delivery systems in gene therapy. Medical Science Monitor. 11 (4), 110-121 (2005).
  2. Wahlers, A., et al. Influence of multiplicity of infection and protein stability on retroviral vector-mediated gene expression in hematopoietic cells. Gene Therapy. 8 (6), 477-486 (2001).
  3. Nayerossadat, N., Maedeh, T., Ali, P. A. Viral and nonviral delivery systems for gene delivery. Advanced Biomedical Research. 1, 27 (2012).
  4. Chen, C., Smye, S. W., Robinson, M. P., Evans, J. A. Membrane electroporation theories: a review. Medical & Biological Engineering & Computing. 44 (1-2), 5-14 (2006).
  5. Gehl, J. Electroporation: theory and methods, perspectives for drug delivery, gene therapy and research. Acta Physiologica Scandinavica. 177 (4), 437-447 (2003).
  6. Lin, Y. C., Li, M., Wu, C. C. Simulation and experimental demonstration of the electric field assisted electroporation microchip for in vitro gene delivery enhancement. Lab on a Chip. 4 (2), 104-108 (2004).
  7. Sugar, I. P., Neumann, E. Stochastic model for electric field-induced membrane pores. Electroporation. Biophysical Chemistry. 19 (3), 211-225 (1984).
  8. Weaver, J. C. Electroporation: a general phenomenon for manipulating cells and tissues. Journal of Cellular Biochemistry. 51 (4), 426-435 (1993).
  9. Hashimoto, M., Takemoto, T. Electroporation enables the efficient mRNA delivery into the mouse zygotes and facilitates CRISPR/Cas9-based genome editing. Scientific Reports. 5, 11315 (2015).
  10. Klibanov, A. L. Microbubble contrast agents: targeted ultrasound imaging and ultrasound-assisted drug-delivery applications. Investigative Radiology. 41 (3), 354-362 (2006).
  11. Klibanov, A. L., Shevchenko, T. I., Raju, B. I., Seip, R., Chin, C. T. Ultrasound-triggered release of materials entrapped in microbubble-liposome constructs: a tool for targeted drug delivery. Journal of Controlled Release. 148 (1), 13-17 (2010).
  12. Fan, Z., Kumon, R. E., Deng, C. X. Mechanisms of microbubble-facilitated sonoporation for drug and gene delivery. Therapeutic Delivery. 5 (4), 467-486 (2014).
  13. Secomski, W., et al. In vitro ultrasound experiments: Standing wave and multiple reflections influence on the outcome. Ultrasonics. 77, 203-213 (2017).
  14. Gedge, M., Hill, M. Acoustofluidics 17: theory and applications of surface acoustic wave devices for particle manipulation. Lab on a Chip. 12 (17), 2998-3007 (2012).
  15. Shi, J., et al. Acoustic tweezers: patterning cells and microparticles using standing surface acoustic waves (SSAW). Lab on a Chip. 9 (20), 2890-2895 (2009).
  16. Shi, J., Huang, H., Stratton, Z., Huang, Y., Huang, T. J. Continuous particle separation in a microfluidic channel via standing surface acoustic waves (SSAW). Lab on a Chip. 9 (23), 3354-3359 (2009).
  17. Shields, C. W. t, Cruz, D. F., Ohiri, K. A., Yellen, B. B., Lopez, G. P. Fabrication and operation of acoustofluidic devices supporting bulk acoustic standing waves for sheathless focusing of particles. Journal of Visualized Experiments. (109), e53861 (2016).
  18. Belling, J. N., et al. Acoustofluidic sonoporation for gene delivery to human hematopoietic stem and progenitor cells. Proceedings of the National Academy of Sciences. 117 (20), 10976-10982 (2020).
  19. Centner, C. S., et al. Ultrasound-induced molecular delivery to erythrocytes using a microfluidic system. Biomicrofluidics. 14 (2), 024114 (2020).
  20. Qi, J., Ding, C., Jiang, X., Gao, Y. Advances in developing CAR T-cell therapy for HIV cure. Frontiers in Immunology. 11, 361 (2020).
  21. Annesley, C. E., Summers, C., Ceppi, F., Gardner, R. A. The evolution and future of CAR T cells for B-Cell Acute lymphoblastic leukemia. Clinical Pharmacology & Therapeutics. 103 (4), 591-598 (2018).
  22. Hand, S. C., Menze, M. A. Molecular approaches for improving desiccation tolerance: insights from the brine shrimp Artemia franciscana. Planta. 242 (2), 379-388 (2015).
  23. Zhang, M., et al. Freeze-drying of mammalian cells using trehalose: preservation of DNA integrity. Scientific Reports. 7 (1), 6198 (2017).
  24. Grievink, H. W., Luisman, T., Kluft, C., Moerland, M., Malone, K. E. Comparison of three isolation techniques for human peripheral blood mononuclear cells: Cell recovery and viability, population composition, and cell functionality. Biopreserv Biobank. 14 (5), 410-415 (2016).
  25. Jaatinen, T., Laine, J. Isolation of mononuclear cells from human cord blood by Ficoll-Paque density gradient. Current Protocol in Stem Cell Biology. , Chapter 2, Unit 2A 1 (2007).
  26. Ulmer, A. J., Scholz, W., Ernst, M., Brandt, E., Flad, H. D. Isolation and subfractionation of human peripheral blood mononuclear cells (PBMC) by density gradient centrifugation on Percoll. Immunobiology. 166 (3), 238-250 (1984).
  27. Halldorsson, S., Lucumi, E., Gomez-Sjoberg, R., Fleming, R. M. T. Advantages and challenges of microfluidic cell culture in polydimethylsiloxane devices. Biosensors and Bioelectronics. 63, 218-231 (2015).
  28. Helfield, B., Chen, X., Watkins, S. C., Villanueva, F. S. Biophysical insight into mechanisms of sonoporation. Proceedings of the National Academy of Sciences. 113 (36), 9983-9988 (2016).
  29. Hu, Y., Wan, J. M., Yu, A. C. Membrane perforation and recovery dynamics in microbubble-mediated sonoporation. Ultrasound in Medicine and Biology. 39 (12), 2393-2405 (2013).
  30. Kopechek, J. A., et al. Ultrasound targeted microbubble destruction-mediated delivery of a transcription factor decoy inhibits STAT3 signaling and tumor growth. Theranostics. 5 (12), 1378-1387 (2015).
  31. Bhutto, D. F., et al. Effect of molecular weight on sonoporation-mediated uptake in human cells. Ultrasound in Medical Biology. 44 (12), 2662-2672 (2018).
  32. Forbes, M. M., Steinberg, R. L., O'Brien, W. D. Frequency-dependent evaluation of the role of definity in producing sonoporation of Chinese hamster ovary cells. Journal of Ultrasound in Medicine. 30 (1), 61-69 (2011).
  33. Helfield, B., Chen, X., Watkins, S. C., Villanueva, F. S. Biophysical insight into mechanisms of sonoporation. Proceedings of National Academy of Science U. S. A. 113 (36), 9983-9988 (2016).
  34. Miller, D. L., Bao, S., Morris, J. E. Sonoporation of cultured cells in the rotating tube exposure system. Ultrasound in Medical Biology. 25 (1), 143-149 (1999).

Tags

Биоинженения выпуск 167 акустофлюидика ультразвук контрастные вещества молекулярная доставка сонопорация клетки
Сборка и эксплуатация акустофлюидного устройства для улучшенной доставки молекулярных соединений к клеткам
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Centner, C. S., Murphy, E. M.,… More

Centner, C. S., Murphy, E. M., Stamp, B. F., Priddy, M. C., Moore, J. T., Bates, P. J., Menze, M. A., Yaddanapudi, K., Kopechek, J. A. Assembly and Operation of an Acoustofluidic Device for Enhanced Delivery of Molecular Compounds to Cells. J. Vis. Exp. (167), e62035, doi:10.3791/62035 (2021).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter