Summary
Detta protokoll beskriver montering och drift av en billig acoustofluidic enhet för snabb molekylär leverans till celler via sonoporation framkallas av ultraljud kontrastmedel.
Abstract
Effektiv intracellulär leverans av biomolekyler krävs för ett brett spektrum av biomedicinsk forskning och cellbaserade terapeutiska tillämpningar. Ultraljud-medierad sonoporation är en framväxande teknik för snabb intracellulär leverans av biomolekyler. Sonoporation sker när kavitation av gasfyllda mikrobubblor bildar övergående porer i närliggande cellmembran, vilket möjliggör snabb användning av biomolekyler från den omgivande vätskan. Nuvarande tekniker för in vitro-sonoporering av celler i suspension begränsas av långsam genomströmning, variabilitet i ultraljudsexponeringsförhållandena för varje cell och höga kostnader. För att hantera dessa begränsningar har en billig akoustofluidic enhet utvecklats som integrerar en ultraljud givare i en PDMS-baserad fluidic enhet för att inducera konsekvent sonoporation av celler när de strömmar genom kanalerna i kombination med ultraljud kontrastmedel. Enheten tillverkas med hjälp av standardfotolitografitekniker för att producera det PDMS-baserade fluidiska chipet. En ultraljud piezo disk givare är ansluten till enheten och drivs av en mikrokontroller. Monteringen kan integreras i ett 3D-printat fodral för extra skydd. Celler och mikrobubblor trycks genom enheten med hjälp av en sprutpump eller en peristaltisk pump ansluten till PVC-slangar. Förbättrad leverans av biomolekyler till mänskliga T-celler och lungcancerceller demonstreras med detta akoustofluidic system. Jämfört med bulkbehandlingsmetoder ökar detta akoustofluidiska system genomströmningen och minskar variationen, vilket kan förbättra cellbearbetningsmetoderna för biomedicinska forskningstillämpningar och tillverkning av cellbaserade terapier.
Introduction
Virala och icke-virala plattformar har använts för att förbättra molekylär leverans till celler. Viral leverans (transduktion) är en vanlig teknik som används i cellbaserade terapier som kräver genomisk modifiering. Begränsningar med viral leverans inkluderar potentiell insertional mutagenes, begränsad transgen kapacitet och oönskade multiplicity av infektion1,2. Därför är icke-virala molekylära leveranstekniker under utveckling för ett brett spektrum av biomedicinska och forskningsapplikationer. Vanliga tekniker inkluderar mekanisk, elektrisk, hydrodynamisk eller användning av laserbaserad energi för att förbättra användningen av biomolekyler i celler 3. Elektroporering är en vanlig icke-viral molekylär leveransplattform som har förmågan att inducera övergående perforering i plasmamembranet för intracellulär leverans avmolekylära föreningar 4,5,6,7,8,9. Den övergående perforeringen av plasmamembranet är dock en stokastisk process och molekylär upptag via elektroporering är i allmänhet beroende av passiv diffusion över de övergående membranporerna4,7,8.
En alternativ metod är användning av ultraljud för förbättrad intracellulär molekylär leverans via kavitation av ultraljud kontrastmedel (dvs gasfyllda mikrobubblor). Mikrobubble cavitation inducerar mikroströmseffekter i det omgivande mediet som kan orsaka övergående perforering av närliggande plasmamembran ("sonoporation") vilket möjliggör snabb intracellulär användning av biomolekyler via passiva eller aktivatransportmekanismer 10,11,12. Sonoporation är en effektiv teknik för snabb molekylär leverans till celler, men detta tillvägagångssätt kräver ofta dyr utrustning och bulkbehandlingsmetoder som begränsas av lägre genomströmning och högre variation i ultraljudsexponeringsförhållanden13. För att hantera dessa begränsningar är acoustofluidic enheter, som möjliggör konsekvent sonoporation av celler i suspension, för närvarande under utveckling.
Acoustofluidics är ett expanderande område som integrerar ultraljud och mikrofluidisk teknik för en mängd olika applikationer. Detta tillvägagångssätt har tidigare använts för partikelseparation genom att applicera kontinuerlig ultraljudsenergi för att inducera stående akustiska vågor inom de fluidiskakanalerna 14,15,16,17. Partiklar sorteras mot olika delar av enheten baserat på en mängd olika egenskaper som partikelstorlek, densitet och kompressibility i förhållande tillmediet 16. Acoustofluidic teknik är också under utveckling för att möjliggöra snabb molekylär leverans till en mängd olika celltyper för forskningsapplikationer och tillverkning av cellterapier18. Nyligen visade vi förbättrad molekylär leverans till erytrocyter med hjälp av en PDMS-baserad acoustofluidic enhet19. I den akoustofluidiska plattformen kan cell- och mikrobubbledynamik manipuleras för att inducera fysiska interaktioner som möjliggör förbättrad leverans av biomolekyler. Effektiviteten och konsekvensen hos intracellulär molekylär leverans kan potentiellt ökas genom att optimera avståndet mellan celler och mikrobubblor.
En viktig applikation för acoustofluidic-medierad sonoporation innebär transport av biomolekyler till primära mänskliga T-celler. Immunterapier baserade på adoptiv T-cellöverföring, såsom chimerisk antigenreceptor T-cell (CAR T) terapi, växer snabbt fram för behandling av olika sjukdomar, inklusive cancer och virus som HIV20. CAR T terapi har varit särskilt effektiv i pediatrisk akut lymfatisk leukemi (ALLA) patienter, med fullständig eftergift priser på 70-90%21. T-cellstillverkning för dessa terapier beror dock i allmänhet på virustransduktion som begränsas av potentiell infognings mutagenes, långa bearbetningstider och utmaningar med att leverera icke-genetiska biomolekyler som proteiner eller små molekyler1. Acoustofluidic-medierade molekylära leveransmetoder kan potentiellt övervinna dessa begränsningar och förbättra tillverkningen av T-cellsterapier.
En annan viktig applikation för acoustofluidic-medierad sonoporation innebär intracellulär leverans av konserveringsmedel föreningar, såsom trehalose, som skyddar celler under frysning och uttorkning. Trehalose produceras av vissa organismer i naturen och hjälper dem att tolerera frysning och uttorkning genom att skydda sina cellmembran22,23. Trehalos produceras dock inte av däggdjursceller och är ogenomtränglig för däggdjurscellmembran. Därför är effektiva molekylära leveranstekniker, såsom sonoporation, nödvändiga för att uppnå tillräckliga intracellulära trehalosnivåer som krävs för att skydda interna cellulära membran. Detta tillvägagångssätt är för närvarande under utveckling för torr bevarande av olika celltyper.
Detta protokoll ger en detaljerad beskrivning av montering och drift av ett relativt billigt acoustofluidic system drivs av en mikrokontroller. Ultraljud kontrastmedel används för att inducera sonoporation inom de fluidiska kanalerna och möjliggöra snabb molekylär leverans till olika celltyper, inklusive T-celler och cancerceller. Detta akoustofluidic system kan användas för en mängd olika forskningsapplikationer och kan också vara användbart som ett prototypsystem för att utvärdera sonoporationsmetoder för förbättrade cellterapi tillverkningsprocesser.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Helblodsdonationer samlades in från friska donatorer efter protokoll som godkänts av den institutionella granskningsnämnden vid University of Louisville.
1. Tillverkning av acoustofluidic anordning
- Skaffa en fotomask med en koncentrisk spiraldesign som innehåller kanaler med en diameter på 500 μm. En CAD-fil finns i tilläggsfilerna som ett exempel. En anpassad fotomask kan beställas från en kommersiell leverantör eller mönstras med hjälp av en maskskrivare.
- Förbered en form av den koncentriska spiraldesignen på en fotoresistbelagd kiselskiva med hjälp av standardfotolitografitekniker.
- Tillsätt cirka 2 msk (~30 ml) SU-8 2100 till en 100 mm kiselskiva.
- Snurra wafern på en spinnare med en hastighet av 150 varv/min i 30 s för att sprida ut fotoresisten och öka sedan hastigheten till 1 200 varv/min i 60 varv/min för att ge en tjocklek på 200 μm.
- Härda den fotoresistbelagda skivan i en polyimidvakuumugn med en 30 minuters ramp upp och 30 min bor vid 115 °C och rampa sedan ner i 30 min.
- Exponera den fotoresistbelagda skivan i 130 s med hjälp av en maskjusterare med fotomasken från steg 1.1.
- Grädda skivan efter exponering enligt samma process som beskrivs i steg 1.2.3.
- Utveckla fotoresisten i SU-8 utvecklarlösning i ca 8 min.
VARNING: Använd endast utvecklarlösning i en välventilerad kemisk rökhuv.
- Silanisera formen för att göra ytan mer hydrofobisk. Placera den fotoresistbelagda skivan i en sugdaptor och tillsätt en 20 μL droppe klorosilan (C8H4Cl3F13Si). Applicera vakuum på kammaren i 30 s, försegla sedan kammaren och lämna över natten.
VARNING: Klorosilan är mycket farligt och brandfarligt. Exponering orsakar svåra brännskador och ögonskador. - Kombinera 54 g pdmsbas (polydimetimethsiloxane) och 6 g härdmedel i en kopp och blanda kraftigt och noggrant med en spatel i minst 1 minut.
- Placera koppen som innehåller PDMS-lösningen i en desiccator i cirka 30 minuter eller tills kvarvarande luftbubblor avlägsnas från lösningen.
- Placera fotoresistbelagd skiva med mönstren uppåt i en 150 mm Petri-skål.
- Häll PDMS-lösningen över formen inuti petriskålen på 150 mm.
- Placera vid behov petriskålen på 150 mm inuti en sugdccator och applicera vakuum tills kvarvarande luftbubblor försvinner.
- Överför petriskålen på 150 mm till en labbugn och grädda i 2 timmar vid 60 °C för att härda PDMS.
- Efter härdning, ta försiktigt bort PDMS från Petri-skålen genom att skära runt kanterna på skivan med ett rakblad.
- Skär ut varje enskild enhet med en kniv eller ett rakblad.
- Stansa hål genom inlopps- och utloppsportarna på varje enhet med en 2,5 mm biopsi stans.
- Placera varje PDMS-enhet i en plasmabricka med exponerade kanaler (uppåt). Applicera syreplasmabehandling (100 W för 45 s, 500 mbar O2) placera sedan omedelbart varje PDMS-enhet på en ren soda limeglasmikroskoprutschbana (75 mm x 25 mm x 1 mm) med kanalerna vända mot glasytan.
- Låt enheterna bindas över natten vid rumstemperatur.
- Applicera försiktigt silikon på ytan av piezo-givaren med en diameter på 1 cm med en tjocklek av ~ 1-2 mm, rikta sedan försiktigt in givaren med den koncentriska spiralen och tryck försiktigt den på botten av glasmikroskoprutschbanan (motsatt sida från PDMS-enheten).
2. Montering och drift av acoustofluidic system
- Anslut en mikrokontroller till en dator med en USB A till B-kabel. En grön strömindikator (märkt PWR) ska lysa.
- Använd det associerade programmet på datorn för att ladda upp ett program som genererar en 8 MHz-signal. Ett exempelprogram finns i kompletterande Files. Efter att ha laddat upp programmet lagras det i mikroprocessorminne och behöver inte laddas upp igen.
- Löd en 1"22G-tråd till slutet av varje tråd på PZT-givaren.
- Anslut den negativa (svarta) kopplingskabeln för PZT-givare till en GND-stift via lödtråden.
- Anslut den positiva (röda) kopplingskabeln för PZT-givare till utgångsstiftet (#9 i det medföljande exempelprogrammet) via lödtråden.
- Montera eventuellt den acoustofluidiska enheten och mikrokontrolleren i ett 3D-utskrivet fodral. CAD-filer finns i Supplemental Files som exempel. Ytterligare ledningar kan anslutas till andra mikrokontrollerstift för att styra en extern LED-indikator och tryckknapp på/av om så önskas.
- Skär 3-6" sektioner av tygon PVC mjuka plaströr (1/16" ID, 1/8" OD) och tryck slangen i inlopps- och utloppsportarna. Det kan vara nödvändigt att rotera slangen samtidigt som trycket tryck appliceras tills det passar i öppningen. Alternativt, efter att slangen har satts in i varje port, kan lim appliceras vid korsningen för att binda IHOP PDMS och slangarna.
- Montera mikrofluidbehållaren enligt tillverkarens instruktioner.
- Kapa en 3-6" sektion av tygon PVC mjuka plaströr (1/16" ID, 1/8" OD) och tryck slangen över 1/32" ID-slangen från mikrofluidiska reservoarens utgångsrör. Om du vill kan du slå in korsningen med paraffinfilm för att förhindra läckage.
- Fyll en 60 ml spruta med omgivande luft (eventuellt filtrera luften med ett 0,2-μm-filter) och anslut den till tygon PVC-slangar (1/16" ID, 1/8" OD) på sidan av den mikrofluidiska behållaren.
- Ställ in sprutpumpen på en hastighet av 200 ml/h för att trycka cellen/ultraljudskontrastmedellösningarna genom den acoustofluidiska enheten med en volymetrisk flödeshastighet på 50 ml/h och samla in proverna från den akoustofluidiska enhetens utgång i ett 50 mL centrifugerör. Alternativt kan du skölja kanalen före acoustofluidic behandling med 15 ml 70% etanollösning för att öka steriliteten i flytande kanaler. Dessutom kan kanaler sköljas med 15 ml avjoniserat vatten för att avlägsna restetanol i enheten innan celler pumpas genom systemet.
3. Beredning av ultraljudskontrastmedel
OBS: Ultraljud kontrastmedel avsevärt förbättra acoustofluidic leverans av molekylära föreningar genom att tillfälligt öka permeabilisering av närliggande celluläramembran 19. Molekylär leverans är mycket begränsad utan ultraljud kontrastmedel i detta system.
- Bered en fosfolipidlösning i en 20mL scintillationsflaska som innehåller följande blandning:
- Tillsätt 25 mg 1,2-distearoyl-sn-glycero-3-fosfokolin (DSPC).
- Tillsätt 11,6 mg 1,2-distearoyl-sn-glycero-3-etylfosfokolin (DSEPC).
- Tillsätt 0,26 mg 1,2-distearoyl-sn-glycero-3-fosfoglycerol (DSPG).
- Tillsätt 0,88 mg polyoxyetylen40 stearat.
- Tillsätt kloroform tills alla fosfolipider är upplösta (t.ex. 3 ml kloroform).
- Avdunsta kloroform i en desiccator i 48 timmar för att bilda en torr lipidfilm (avdunstning under argon eller med en roterande förångare kan användas för att påskynda torkningsprocessen).
- Återfukta lipidfilmen med 10 ml steril fosfatbuffrad saltlösning (PBS).
- Sonicate lipidlösningen i 3 min vid 40% amplitud för att bilda en katjonisk micellarlösning.
- Efter ultraljudsbehandling lagra fosfolipidlösningen vid 2-6 °C i upp till 1 månad.
- För att förbereda ultraljudskontrastmedel, tillsätt 200 μL katjonisk micellär lösning och 600 μL steril PBS till en 2 ml glas septumflaska.
- Försegla injektionsflaskan genom att pressa locket.
- Använd en 1,5"20G nål för att fylla injektionsflaskans huvudutrymme med dekafluorbutangas i 30 s.
- Amalgamate injektionsflaskan för 45 s vid 4,350 cpm för att bilda perfluorbutan gasfyllda ultraljud kontrastmedel.
- Tillsätt 25 μL ultraljudskontrastmedellösning per 1 ml celllösning omedelbart innan du pumpar det kombinerade kontrastmedlet/cellblandningen genom den acoustofluidiska enheten. Celllösningen kan modifieras efter önskemål av användaren, men i våra studier bestod celllösningen av primära T-celler i steg 4.21 respektive A549 lungcancerceller i steg 5.7.
4. Beredning av primära Tcells
- Isolera perifert blod mononukleära celler (PBMCs) från helblod lösningar och lagra vid -150 °C. Densitetsgradientseparation som innehåller ett substrat används ofta för att separera PBMCs från helblod24,25,26.
- Tina fryst flaska i 37 °C vattenbad.
- Utspädda tinade PBMCs 1:10 med PBS i ett 15mL centrifugeringsrör. Varje 1mL injektionsflaska innehåller cirka 10 miljoner PBMCs.
- Centrifugerade PBMCs vid 580 x g i 11 min vid 4 °C.
- Aspirera supernaten och tillsätt 13 ml MAC som kör buffert för att återanvända cellerna.
- Räkna PBMCs med en automatiserad cellräknare eller hemocytometer.
- Centrifugera PBMCs igen vid 580 x g i 11 min vid 4 °C och aspirera supernaten.
- Tillsätt 40 μL kyld löpbuffert per 10 miljoner PBMCs.
- För att isolera T-celler, tillsätt 10 μL Pan T-Cells Biotin Antibody Cocktail per 10 miljoner PBMCs.
- Omrör försiktigt PBMCs och förvara lösningen vid 4 °C i 5 min per 10 miljoner celler.
- Tillsätt 30 μL löpbuffert och 20 μL Pan T-Cells MicroBead Cocktail per 10 miljoner PBMCs.
- Blanda PBMCs och pärlor noggrant och inkubera i ytterligare 15 minuter vid 4 °C.
- Lägg till löpbuffert för att nå en total volym på 500 μL.
- Separera primära T-celler med ett kommersiellt tillgängligt magnetiskt sorteringsinstrument på bänkskivan med inställningen "utarmar separation" enligt tillverkarens protokoll. Detta steg bör ge mellan 5-10 miljoner T-celler efter cellsortering.
- Räkna T-celler med hjälp av en automatiserad cellräknare eller hemocytometer.
- Späd T-celler i 10 ml steril PBS och centrifugera vid 580 x g i 10 min vid 4 °C för att pelleta cellerna.
- Aspirera supernatant och återanvändA T-celler i 1 ml PBS.
- Räkna T-celler med hjälp av en automatiserad cellräknare eller hemocytometer och alikvot 1 miljon/ml för experiment.
- Förbered en 1 mg/ml fluoresceinlösning i PBS.
- Tillsätt 100 μL 1 mg/ml fluoresceinlösning per 1 ml T-cellslösning (slutlig fluoresceinkoncentration = 100 μg/ml) omedelbart före bearbetning.
- Tillsätt 25 μL ultraljudskontrastmedellösning enligt vad som tidigare beskrivits i steg 3.11.
- Bearbeta 1mL alikvoter av celler med hjälp av det acoustofluidiska systemet (se steg 2.10-2.11). Detta steg förbättrar leveransen av fluorescein till primära T-celler.
- Omedelbart efter behandlingen, tvätta cellerna tre gånger via centrifugering vid 580 x g i 10 min med 500 μL PBS för att avlägsna extracellulär fluorescein. Cellerna ska tvättas inom 10 minuter efter tillsats av fluoresceinlösning.
- Efter slutlig tvättsteg, återanvända celler i 250 μL PBS och mät fluorescens på flödescytometer.
5. Beredning av A549 lungcancerceller
- Kultur A549 (adenocarcinomiska humana alveolära basala epitelceller) celler i komplett DMEM-media (10% fetala nötkreatur serum, 1% penicillin/streptomycin) vid 37 °C och 5% CO2 i en platt-botten vävnad kulturkolv.
- Skörda A549 celler när de når 70-90% sammanflöde. Aspirera media från kolven och tvätta cellerna en gång med PBS för att avlägsna serumproteiner.
- Tillsätt trypsin (0,25%) EDTA till kolven och inkubera i 5 min vid 37 °C. Trypsin är ett matsmältningsenzym som gör att cellerna lossnar från vävnadskulturkolvens bottenyta.
- Överför trypsinlösning till ett 15mL centrifugeringsrör och neutralisera det genom att lägga till komplett DMEM-media med ett 1:3-förhållande.
- Pellet cellerna via centrifugering vid 1500 x g i 5 min vid 4 °C.
- Aspirera supernatanten och återanvänd pelleten i en koncentration av 100 000/ml i PBS-lösning som innehåller 200 mM trehalos i 15 ml konisk injektionsflaska.
- Tillsätt 25 μL ultraljudskontrastmedellösning enligt vad som tidigare beskrivits i steg 3.11.
- Bearbeta 1mL alikvoter av celler med hjälp av det acoustofluidiska systemet (se steg 2.10-2.11). Detta steg förbättrar leveransen av trehalose till A549 lungcancerceller.
- Omedelbart efter behandlingen, tvätta cellerna tre gånger via centrifugation med 500 μL PBS för att avlägsna extracellulär trehalos. Cellerna ska tvättas inom 10 minuter efter tillsats av trehaloslösning.
- Efter slutlig tvättsteg, återanvända celler i 100 μL PBS.
- Tillsätt 11 μL 1% Triton X-100-lösning till lysceller och släpp ut intracellulär trehalos.
- Virvel i 15 s och inkubera sedan i 30 minuter vid rumstemperatur.
- Virvel igen för 15 s, mät sedan trehaloskoncentrationen med hjälp av kommersiellt tillgänglig trehalosanalys enligt tillverkarens rekommendation.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
En bild av det akroptumfluidiska systemet som monterats inuti ett 3D-utskrivet fodral visas i figur 1. Detta protokoll producerar ett acoustofluidic system som kan användas för att förbättra intracellulära molekylär leverans i flera cellinjer med hjälp av ultraljud kontrastmedel.
Figur 2 visar förbättrad intracellulär leverans av en fluorescerande förening, fluorescein, till primära mänskliga T-celler med acoustofluidic behandling jämfört med en obehandlad kontrollgrupp (p<0,05, n=3/grupp). T-celler suspenderades vid en koncentration av 1 miljon/ml i PBS med 100 μg/mL fluoresceinlösning och 25 μL/ml ultraljud kontrast agent lösning, och blandningen passerades genom acoustofluidic enheten för ultraljud behandling. Intracellulära fluorescein leverans och cell livskraft mättes med flöde cytometri efter tvätt celler via centrifugering för att ta bort extracellulära fluorescein. T-celler i den obehandlade kontrollgruppen suspenderades också vid 1 miljon/ml i PBS med 100 μg/mL fluoresceinlösning, men ultraljud kontrast agent lösning lades inte till och celler inte passerades genom acoustofluidic enheten. Fluorescensintensiteten hos T-celler ökade med 5 gånger efter acoustofluidic behandling i förhållande till fluorescens intensiteten hos T-celler i den obehandlade kontrollgruppen, vilket indikerar förbättrad leverans av fluorescein. Cellens livskraft minskade något efter acoustofluidic behandling men förblev över 80% (p<0,05, n=3/grupp).
Figur 3 visar förbättrad intracellulär leverans av en konserveringsmedel, trehalos, till humana A549 lungkarcinomceller med acoustofluidic behandling jämfört med enbart flöde (inga ultraljud kontrastmedel eller ultraljud exponering) och jämfört med celler i den obehandlade kontrollgruppen (ANOVA p<0,05, n=3/grupp). A549 celler suspenderades vid en koncentration av 100,000/ml i PBS med 200 mM trehalose lösning och 25 μL/mL ultraljud kontrast agent lösning, och blandningen passerades genom acoustofluidic enhet för ultraljud behandling. A549 celler i kontrollgrupperna ("Endast flöde" och "Ingen behandling") suspenderades också vid 100 000/ml i PBS med 200 mM trehalos, men ultraljud kontrast agent lösning lades inte till och celler var inte utsatta för ultraljud behandling. Intracellulära trehalose kvantifierades med hjälp av en trehalose analys kit och normaliserades till obehandlade kontroll gruppen. Cellens livskraft mättes med trypanblå analys. Det fanns ingen statistisk skillnad i cell livskraft mellan grupper (n=3-7/grupp).
Figur 1: Foto av acoustofluidic system. Det acoustofluidic flödessystemet innehåller en PDMS-baserad flödeskammare med en integrerad PZT-givare driven av en mikrokontroller. Ett 3D-utskrivet fodral med led-indikator och tryckknapp på/av är ytterligare funktioner som tillval. Klicka här om du vill visa en större version av den här figuren.
Figur 2: Acoustofluidic behandling förbättrar fluorescein leverans till mänskliga T celler. (A) Fluorescensintensiteten i primära T-celler ökade efter acoustofluidisk behandling med fluorescein jämfört med den obehandlade kontrollgruppen (inga akoustofluidics och inga mikrobubblor) (p<0,05, n=3/grupp). (B) Cellens livskraft minskade något efter acoustofluidic behandling men förblev över 80% mätt med flödescytometri(p<0,05, n=3/grupp). C)Representativt flöde cytometri histogram som anger högre fluorescens i acoustofluidic behandlingsgruppen. Klicka här om du vill visa en större version av den här figuren.
Figur 3: Acoustofluidic behandling förbättrar trehalose leverans till mänskliga lungcancerceller. (A) Trehalose upptag ökade i A549 lung carcinom celler jämfört med flöde endast (inget ultraljud och inga mikrobubblor) och obehandlad kontrollgrupp (ANOVA p<0,05, n=3/grupp). (B) Cellens livskraft förblev över 90% efter acoustofluidic behandling mätt med trypan blå analys (n=3-7/grupp). Klicka här om du vill visa en större version av den här figuren.
Kompletterande filer. Klicka här för att ladda ner den här filen.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Detta protokoll beskriver montering och drift av ett lågkostnads acoustofluidic system som förbättrar intracellulär leverans av biomolekyler för forskningsapplikationer. Det finns flera viktiga faktorer att tänka på när du monterar och använder det här systemet. Den acoustofluidic enheten är tillverkad i PDMS, som är ett biokompatierbart material som enkelt kan gjutas med konsekventakanaldimensioner 27. Enhetens kanaler kan sköljas med 15 ml 70% etanollösning före acoustofluidisk bearbetning för att öka steriliteten vid arbete med odlade celler. Efter etanolrengöring kan 15 ml avjoniserat vatten användas för att skölja enheten för att avlägsna restetanol från kanalerna innan celllösningar tillsätts. Små akoustofluidic kanaler kan lätt blockeras av skräp eller cellaggregat, vilket gör detta till en begränsning för frekvent användning av enheten. Att noggrant skölja kanalerna mellan varje prov hjälper till att förhindra problem med kanalblockering. Dessutom kan flera PDMS-enheter tillverkas i varje batch så att enheter snabbt kan bytas ut om det behövs. För ultraljudsbaserade applikationer är det viktigt att producera PDMS-enheter med en konsekvent tjocklek, eftersom skillnader i PDMS-tjocklek kan påverka ultraljudstrycket i de fluidiska kanalerna. Ultraljudsvågor sprider sig kontinuerligt genom enheten och överförda vågor interagerar med reflekterade vågor för att bilda stående akustiska vågmönster som är mycket känsliga för skillnader iPDMS-tjocklek 17. PDMS-tjockleken bestäms främst av mängden PDMS som tillsätts formen (steg 1.7) och detta protokoll ger en PDMS-tjocklek på 3,5 mm.
Mikrokontrollerns maximala uteffektfrekvens (8 MHz) valdes för att producera den minsta akustiska våglängden i den fluidiska kanalen. Mikrokontrollerutgången är vanligtvis en fyrkantig våg men oscilloskopmätningar visade att utgången vid 8 MHz blir mer lik en sinusformad vågform på grund av slew rate-begränsningar. En begränsning av detta system är att mikrokontrollerens maximala spänningsutgång är 5V och en extern RF-förstärkare krävs om högre spänningsutgångar önskas. Frifältstryckseffekten för givaren i detta system var 18 kPa vid 1 cm mätt med en nålhydrofon (Precision Acoustics, Dorchester, Storbritannien). Även om detta tryck är relativt lågt, kan stående vågor i kanalerna öka det akustiska trycket som proverna utsätts för när de passerar genom ultraljudsstrålen.
Ultraljud kontrastmedel används för att nukleera akustisk kavitation inom de acoustofluidic kanalerna som förbättrar leveransen av biomolekyler över cellmembran28,29. Detta protokoll beskriver syntesen av perfluorkarbon gasfyllda mikrobubblor inkapslade av en katjonisk fosfolipid membran. Som tidigare beskrivits består denna formulering av mikrobubblor främst mellan 1-3 μm i diameter30. Mikrobubblornas positivt laddade yta lockar dem mot negativt laddade cellmembran, vilket ökar sonoporationsmedierad molekylär leverans när mikrobubblorna och cellerna är i närheten. Koncentrationen av mikrobubblor i celllösningen är en kritisk faktor som kan påverka effektiviteten av molekylär leverans och cell livskraft efter acoustofluidic behandling, och den optimala mikrobubble koncentrationen kan vara specifik för varje cell typ 19. Koncentrationen av gasfyllda mikrobubblor med ett lipidskal kan minska med tiden efter syntesen så ultraljudskontrastmedel bör användas inom några timmar efter syntesen.
Vi visat leverans av en fluorescerande förening (fluorescein) till primära icke-aktiverade mänskliga T celler med hjälp av acoustofluidic systemet i detta protokoll. Det är viktigt att notera att aktiveringsstatusen för primära mänskliga T-celler kan påverka effektiviteten hos intracellulär molekylär leverans. Fluorescensegenskaperna hos fluorescein möjliggör känslig intracellulär detektion med flödescytometri, men andra lösliga föreningar kan också levereras till celler med hjälp av detta akoustofluidiska system. Till exempel visade vi acoustofluidic leverans av trehalose i mänskliga lungcancer celler. Acoustofluidic leverans av trehalose i celler kan möjliggöra ökad återhämtning efter fryst och torr lagring, vilket kan ha betydande inverkan på en rad biomedicinska och forskningsapplikationer 19.
Acoustofluidic leverans av andra biomolekyler, såsom proteiner eller DNA-plasmider, är också möjligt, även om en begränsning av detta system är att effektiviteten av molekylär leverans kan vara lägre för större föreningar18,31. Optimering av acoustofluidic flöde hastighet, koncentrationer av ultraljud kontrastmedel, cell koncentrationer och media kan behövas för leverans av andra biomolekyler. Dessutom kan optimala parametrar variera mellan olika celltyper på grund av faktorer som celldiameter, morfologi, membranegenskaper och fenotyp.
Det acoustofluidic systemet som beskrivs i detta protokoll kan enkelt monteras och drivas till relativt låg kostnad. Dessutom kan detta system anpassas för andra applikationer genom att ansluta andra signalkällor eller ultraljudsgivare för att generera specifika utgångstryck och frekvenser32,33,34. Dessutom kan det sprutpumpsystem som beskrivs i detta protokoll bytas ut mot peristaltiska pumpar om så önskas. Vid ett flöde på 50 ml/h är uppehållstiden för celler i ultraljudsstrålen när de passerar genom den akoustofluidiska kanalen cirka 1 s, men denna uppehållstid kan ändras efter behov för specifika applikationer genom att justera vätskeflödet.
Till skillnad från andra vanliga transfection tekniker, biomolekyler kan levereras till celler inom några minuter istället för timmar och detta system kräver inte specialiserad och dyr utrustning. Dessutom är detta system kompatibelt med ett brett spektrum av vanliga cellkulturmedier eller andra buffertar. Sammanfattningsvis möjliggör detta akromatofluidiska system snabb leverans av biomolekyler till celler, vilket kan vara användbart för ett brett spektrum av forskningstillämpningar.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Medförfattare MAM och JAK äger i DesiCorp som kan dra ekonomisk nytta av produkter relaterade till denna forskning.
Acknowledgments
Detta arbete stöddes delvis av finansiering från National Science Foundation (#1827521, #1827521, #1450370) och National Institutes of Health (U01HL127518). Fotolitografitjänster tillhandahölls av University of Louisville Micro/Nano Technology Center.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Fabrication of Acoustofluidic Device | |||
| DOW SYLGARD 184 SILICONE ENCAPSULANT CLEAR 0.5 KG KIT | Ellsworth Adhesives | 4019862 (SKU) | https://www.ellsworth.com/products/by-market/consumer-products/encapsulants/silicone/dow-sylgard-184-silicone-encapsulant-clear-0.5-kg-kit/ |
| Harris Uni-Core (2.5 mm) | Electron Microscopy Sciences | 69039-25 | |
| Microfluidic Reservoir for 15 mL Falcon Tube - S (2/4 port) | Darwin Microfluidics | LVF-KPT-S-2 (SKU) | https://darwin-microfluidics.com/products/15-ml-falcon-tube-microfluidic-reservoir-s-2-4-port |
| Microscope Slide | VWR | 16004-430 | https://us.vwr.com/store/product/4646174/vwr-vistavisiontm-microscope-slides-plain-and-frosted-premium |
| trichlorosilane | Gelest | 105732-02-3 (Cas. No.) | Chlorosilane is very hazaradous and flammable. Exposure causes severe burns and eye damage. |
| Tygon PVC soft plastic tubing (1/16" ID, 1/8" OD) | McMaster-Carr | 5233K51 (Part #) | https://www.mcmaster.com/pvc-tubing/soft-tubing-for-air-and-water/ |
| Assembly of Acoustofluidic System | |||
| Arduino Uno | Arduino | 7630049200050 (Barcode) | https://store.arduino.cc/usa/arduino-uno-rev3 |
| Preparation of Ultrasound Contrast Agents | |||
| 1,2-distearoyl-sn-glycero-3-ethylphosphocholine (DSEPC) | Avanti Lipids | 890703P-25mg (SKU) | https://avantilipids.com/product/890703 |
| 1,2-distearoyl-sn-glycero-3-phosphocholine (DSPC) | Avanti Lipids | 850365P-25mg (SKU) | https://avantilipids.com/product/850365 |
| 1,2-distearoyl-sn-glycero-3-phosphoglycerol (DSPG) | Avanti Lipids | 840465P-25mg (SKU) | https://avantilipids.com/product/840465 |
| APF-140HP (decafluorobutate gas) | FlouroMed | 355-25-9 (Cas No.) | http://www.fluoromed.com/products/perfluorodecalin/ |
| DB-338 Amalgamators | COXO | https://www.coxotec.com/coxo/db-338-amalgamators/ | |
| polyoxyethylene 40 stearate | Sigma-Aldrich | P3440-250G (SKU) | https://www.sigmaaldrich.com/catalog/product/sigma/p3440?lang=en®ion=US&gclid= Cj0KCQjwy8f6BRC7ARIsAPIXOjjj Jh_151mYVEUyLZRavt4re9YQMLS vID64X-1KbO3LUKGjVUwb PDAaAqvOEALw_wcB |
| Q125 Sonicator | Qsonica | Q125-110 (Ref.) | https://www.sonicator.com/products/q125-sonicator?_pos=1&_sid=406df3776&_ss=r |
| Preparation of Primarty T Cells | |||
| autoMACs running buffer | Miltenyi Biotec | 130-091-221 (Order No.) | https://www.miltenyibiotec.com/US-en/products/automacs-running-buffer-macs-separation-buffer.html#gref |
| Pan T Cell Isolation Kit, human (Pan T-Cell Biotin Antibody Cocktail & Pan T-Cell MicroBead Cocktail) | Miltenyi Biotec | 130-096-535 (Order No.) | https://www.miltenyibiotec.com/US-en/products/pan-t-cell-isolation-kit-human.html#130-096-535 |
| magnetic cell sorter (autoMACS Pro Separator) | Miltenyi Biotec | 130-092-545 (Order No.) | https://www.miltenyibiotec.com/US-en/products/automacs-pro-separator-starter-kit.html#130-092-545 |
| Preparation of A549 Lung Cancer Cells | |||
| Trehalose Assay Kit | Megazyme | K-TREH (Cat. No.) | https://www.megazyme.com/trehalose-assay-kit |
| Trypan blue (0.4% in aqueous solution Ready-to-Use, sterile) | VWR | 97063-702 (Cat. No.) | https://us.vwr.com/store/product/7437427/trypan-blue-0-4-in-aqueous-solution-ready-to-use-sterile |
References
- Gardlik, R., et al. Vectors and delivery systems in gene therapy. Medical Science Monitor. 11 (4), 110-121 (2005).
- Wahlers, A., et al. Influence of multiplicity of infection and protein stability on retroviral vector-mediated gene expression in hematopoietic cells. Gene Therapy. 8 (6), 477-486 (2001).
- Nayerossadat, N., Maedeh, T., Ali, P. A. Viral and nonviral delivery systems for gene delivery. Advanced Biomedical Research. 1, 27 (2012).
- Chen, C., Smye, S. W., Robinson, M. P., Evans, J. A. Membrane electroporation theories: a review. Medical & Biological Engineering & Computing. 44 (1-2), 5-14 (2006).
- Gehl, J. Electroporation: theory and methods, perspectives for drug delivery, gene therapy and research. Acta Physiologica Scandinavica. 177 (4), 437-447 (2003).
- Lin, Y. C., Li, M., Wu, C. C. Simulation and experimental demonstration of the electric field assisted electroporation microchip for in vitro gene delivery enhancement. Lab on a Chip. 4 (2), 104-108 (2004).
- Sugar, I. P., Neumann, E. Stochastic model for electric field-induced membrane pores. Electroporation. Biophysical Chemistry. 19 (3), 211-225 (1984).
- Weaver, J. C. Electroporation: a general phenomenon for manipulating cells and tissues. Journal of Cellular Biochemistry. 51 (4), 426-435 (1993).
- Hashimoto, M., Takemoto, T. Electroporation enables the efficient mRNA delivery into the mouse zygotes and facilitates CRISPR/Cas9-based genome editing. Scientific Reports. 5, 11315 (2015).
- Klibanov, A. L. Microbubble contrast agents: targeted ultrasound imaging and ultrasound-assisted drug-delivery applications. Investigative Radiology. 41 (3), 354-362 (2006).
- Klibanov, A. L., Shevchenko, T. I., Raju, B. I., Seip, R., Chin, C. T. Ultrasound-triggered release of materials entrapped in microbubble-liposome constructs: a tool for targeted drug delivery. Journal of Controlled Release. 148 (1), 13-17 (2010).
- Fan, Z., Kumon, R. E., Deng, C. X. Mechanisms of microbubble-facilitated sonoporation for drug and gene delivery. Therapeutic Delivery. 5 (4), 467-486 (2014).
- Secomski, W., et al. In vitro ultrasound experiments: Standing wave and multiple reflections influence on the outcome. Ultrasonics. 77, 203-213 (2017).
- Gedge, M., Hill, M. Acoustofluidics 17: theory and applications of surface acoustic wave devices for particle manipulation. Lab on a Chip. 12 (17), 2998-3007 (2012).
- Shi, J., et al. Acoustic tweezers: patterning cells and microparticles using standing surface acoustic waves (SSAW). Lab on a Chip. 9 (20), 2890-2895 (2009).
- Shi, J., Huang, H., Stratton, Z., Huang, Y., Huang, T. J. Continuous particle separation in a microfluidic channel via standing surface acoustic waves (SSAW). Lab on a Chip. 9 (23), 3354-3359 (2009).
- Shields, C. W. t, Cruz, D. F., Ohiri, K. A., Yellen, B. B., Lopez, G. P. Fabrication and operation of acoustofluidic devices supporting bulk acoustic standing waves for sheathless focusing of particles. Journal of Visualized Experiments. (109), e53861 (2016).
- Belling, J. N., et al. Acoustofluidic sonoporation for gene delivery to human hematopoietic stem and progenitor cells. Proceedings of the National Academy of Sciences. 117 (20), 10976-10982 (2020).
- Centner, C. S., et al. Ultrasound-induced molecular delivery to erythrocytes using a microfluidic system. Biomicrofluidics. 14 (2), 024114 (2020).
- Qi, J., Ding, C., Jiang, X., Gao, Y. Advances in developing CAR T-cell therapy for HIV cure. Frontiers in Immunology. 11, 361 (2020).
- Annesley, C. E., Summers, C., Ceppi, F., Gardner, R. A. The evolution and future of CAR T cells for B-Cell Acute lymphoblastic leukemia. Clinical Pharmacology & Therapeutics. 103 (4), 591-598 (2018).
- Hand, S. C., Menze, M. A. Molecular approaches for improving desiccation tolerance: insights from the brine shrimp Artemia franciscana. Planta. 242 (2), 379-388 (2015).
- Zhang, M., et al. Freeze-drying of mammalian cells using trehalose: preservation of DNA integrity. Scientific Reports. 7 (1), 6198 (2017).
- Grievink, H. W., Luisman, T., Kluft, C., Moerland, M., Malone, K. E. Comparison of three isolation techniques for human peripheral blood mononuclear cells: Cell recovery and viability, population composition, and cell functionality. Biopreserv Biobank. 14 (5), 410-415 (2016).
- Jaatinen, T., Laine, J. Isolation of mononuclear cells from human cord blood by Ficoll-Paque density gradient. Current Protocol in Stem Cell Biology. , Chapter 2, Unit 2A 1 (2007).
- Ulmer, A. J., Scholz, W., Ernst, M., Brandt, E., Flad, H. D. Isolation and subfractionation of human peripheral blood mononuclear cells (PBMC) by density gradient centrifugation on Percoll. Immunobiology. 166 (3), 238-250 (1984).
- Halldorsson, S., Lucumi, E., Gomez-Sjoberg, R., Fleming, R. M. T. Advantages and challenges of microfluidic cell culture in polydimethylsiloxane devices. Biosensors and Bioelectronics. 63, 218-231 (2015).
- Helfield, B., Chen, X., Watkins, S. C., Villanueva, F. S. Biophysical insight into mechanisms of sonoporation. Proceedings of the National Academy of Sciences. 113 (36), 9983-9988 (2016).
- Hu, Y., Wan, J. M., Yu, A. C. Membrane perforation and recovery dynamics in microbubble-mediated sonoporation. Ultrasound in Medicine and Biology. 39 (12), 2393-2405 (2013).
- Kopechek, J. A., et al. Ultrasound targeted microbubble destruction-mediated delivery of a transcription factor decoy inhibits STAT3 signaling and tumor growth. Theranostics. 5 (12), 1378-1387 (2015).
- Bhutto, D. F., et al. Effect of molecular weight on sonoporation-mediated uptake in human cells. Ultrasound in Medical Biology. 44 (12), 2662-2672 (2018).
- Forbes, M. M., Steinberg, R. L., O'Brien, W. D. Frequency-dependent evaluation of the role of definity in producing sonoporation of Chinese hamster ovary cells. Journal of Ultrasound in Medicine. 30 (1), 61-69 (2011).
- Helfield, B., Chen, X., Watkins, S. C., Villanueva, F. S. Biophysical insight into mechanisms of sonoporation. Proceedings of National Academy of Science U. S. A. 113 (36), 9983-9988 (2016).
- Miller, D. L., Bao, S., Morris, J. E. Sonoporation of cultured cells in the rotating tube exposure system. Ultrasound in Medical Biology. 25 (1), 143-149 (1999).
