Summary
Dieses Protokoll beschreibt den Aufbau und Betrieb eines kostengünstigen akustofluidischen Geräts für die schnelle molekulare Abgabe an Zellen durch Sonoporation, die durch Ultraschallkontrastmittel induziert wird.
Abstract
Eine effiziente intrazelluläre Abgabe von Biomolekülen ist für ein breites Spektrum biomedizinischer Forschung und zellbasierter therapeutischer Anwendungen erforderlich. Die ultraschallvermittelte Sonoporation ist eine neue Technik zur schnellen intrazellulären Abgabe von Biomolekülen. Sonoporation tritt auf, wenn kavitation von gasgefüllten Mikroblasen transiente Poren in nahe gelegenen Zellmembranen bildet, was eine schnelle Aufnahme von Biomolekülen aus der umgebenden Flüssigkeit ermöglicht. Aktuelle Techniken zur In-vitro-Sonoporation von Zellen in Suspension sind durch langsamen Durchsatz, Variabilität der Ultraschall-Expositionsbedingungen für jede Zelle und hohe Kosten begrenzt. Um diese Einschränkungen zu beheben, wurde ein kostengünstiges akustofluidisches Gerät entwickelt, das einen Ultraschallwandler in ein PDMS-basiertes fluidisches Gerät integriert, um eine konsistente Sonogenierung der Zellen zu induzieren, während sie in Kombination mit Ultraschallkontrastmitteln durch die Kanäle fließen. Das Gerät wird mit Standard-Photolithographietechniken hergestellt, um den PDMS-basierten fluidischen Chip herzustellen. Ein Ultraschall-Piezoscheibenaufnehmer ist am Gerät befestigt und wird von einem Mikrocontroller angetrieben. Die Baugruppe kann für zusätzlichen Schutz in ein 3D-gedrucktes Gehäuse integriert werden. Zellen und Mikroblasen werden mit einer Spritzenpumpe oder einer peristaltischen Pumpe, die mit PVC-Schläuchen verbunden ist, durch das Gerät geschoben. Eine verbesserte Abgabe von Biomolekülen an menschliche T-Zellen und Lungenkrebszellen wird mit diesem akustofluidischen System nachgewiesen. Im Vergleich zu Massenbehandlungsansätzen erhöht dieses akustofluidische System den Durchsatz und reduziert die Variabilität, was die Zellverarbeitungsmethoden für biomedizinische Forschungsanwendungen und die Herstellung zellbasierter Therapeutika verbessern kann.
Introduction
Virale und nicht-virale Plattformen wurden verwendet, um die molekulare Abgabe an Zellen zu verbessern. Virale Abgabe (Transduktion) ist eine gängige Technik, die in zellbasierten Therapien verwendet wird, die eine genomische Modifikation erfordern. Zu den Einschränkungen bei der viralen Verabreichung gehören eine potenzielle insertionelle Mutagenese, eine begrenzte transgene Kapazität und eine unerwünschte Vielzahl von Infektionen1,2. Daher sind nicht-virale molekulare Verabreichungstechniken für ein breites Spektrum von biomedizinischen und Forschungsanwendungen in der Entwicklung. Zu den gängigen Techniken gehören mechanische, elektrische, hydrodynamische oder die Verwendung laserbasierter Energie, um die Aufnahme von Biomolekülen in Zellen zu verbessern 3. Elektroporation ist eine häufig verwendete nicht-virale molekulare Verabreichungsplattform, die die Fähigkeit hat, eine transiente Perforation in der Plasmamembran für die intrazelluläreAbgabemolekularer Verbindungen 4,5,6,7 ,8,9zuinduzieren. Die transiente Perforation der Plasmamembran ist jedoch ein stochastischer Prozess und die molekulare Aufnahme durch Elektroporation ist im Allgemeinen abhängig von der passiven Diffusion über die transienten Membranporen4,7,8.
Eine alternative Methode ist die Verwendung von Ultraschall zur verbesserten intrazellulären molekularen Abgabe durch Kavitation von Ultraschallkontrastmitteln (d.h. gasgefüllte Mikroblasen). Mikroblasenkavitation induziert Mikrostromeffekte in den umgebenden Medien, die eine vorübergehende Perforation benachbarter Plasmamembranen ("Sonoporation") verursachenkönnen,die eine schnelle intrazelluläre Aufnahme von Biomolekülen über passive oder aktive Transportmechanismen ermöglicht10,11,12. Sonoporation ist eine effektive Technik für die schnelle molekulare Abgabe an Zellen, aber dieser Ansatz erfordert oft teure Geräte und Massenbehandlungsmethoden, die durch einen geringeren Durchsatz und eine höhere Variabilität der Ultraschallexpositionsbedingungen begrenzt sind13. Um diese Einschränkungen zu beheben, werden derzeit akustofluidische Geräte entwickelt, die eine konsistente Sonoporation von Zellen in Suspension ermöglichen.
Akustofluidik ist ein expandierendes Feld, das Ultraschall- und Mikrofluidik-Technologien für eine Vielzahl von Anwendungen integriert. Dieser Ansatz wurde bisher zur Partikeltrennung durch Anwendung kontinuierlicher Ultraschallenergie verwendet, um stehende akustische Wellen innerhalb der fluidischen Kanäle14,15,16,17zu induzieren. Partikel werden basierend auf einer Vielzahl von Eigenschaften wie Partikelgröße, Dichte und Kompressibilität relativ zum Medium16in verschiedene Teile des Geräts sortiert. Akustofluidische Technologien sind ebenfalls in der Entwicklung, um eine schnelle molekulare Verabreichung an eine Vielzahl von Zelltypen für Forschungsanwendungen und die Herstellung von Zelltherapien zu ermöglichen18. Vor kurzem haben wir eine verbesserte molekulare Abgabe an Erythrozyten mit einem PDMS-basierten akustofluidischen Gerät19demonstriert. In der akustofluidischen Plattform können Zell- und Mikroblasendynamiken manipuliert werden, um physikalische Wechselwirkungen zu induzieren, die eine verbesserte Abgabe von Biomolekülen ermöglichen. Die Effizienz und Konsistenz der intrazellulären molekularen Abgabe kann möglicherweise durch die Optimierung des Abstands zwischen Zellen und Mikroblasen erhöht werden.
Eine wichtige Anwendung für die akustofluidisch vermittelte Sonoporation ist der Transport von Biomolekülen in primäre menschliche T-Zellen. Immuntherapien, die auf adoptivem T-Zell-Transfer basieren, wie die Chimeric Antigen Receptor T Cell (CAR T) -Therapie, entwickeln sich schnell zur Behandlung verschiedener Krankheiten, einschließlich Krebs und Viren wie HIV20. Die CAR-T-Therapie war besonders wirksam bei Patienten mit akuter lymphatischer Leukämie (ALL) bei Kindern mit vollständigen Remissionsraten von 70-90%21. Die Herstellung von T-Zellen für diese Therapien hängt jedoch im Allgemeinen von der viralen Transduktion ab, die durch eine potenzielle insertionelle Mutagenese, lange Verarbeitungszeiten und Herausforderungen bei der Bereitstellung nicht-genetischer Biomoleküle wie Proteine oder kleine Moleküle begrenzt ist1. Akustofluidisch vermittelte molekulare Verabreichungsmethoden können diese Einschränkungen möglicherweise überwinden und die Herstellung von T-Zell-Therapien verbessern.
Eine weitere wichtige Anwendung für die akustofluidisch vermittelte Sonoporation ist die intrazelluläre Abgabe von Konservierungsmitteln wie Trehalose, die die Zellen beim Einfrieren und Austränken schützen. Trehalose wird von einigen Organismen in der Natur produziert und hilft ihnen, Das einfrieren und austränken zutolerieren,indem sie ihre Zellmembranen schützen22,23. Trehalose wird jedoch nicht von Säugetierzellen produziert und ist für Säugetierzellmembranen undurchlässig. Daher sind wirksame molekulare Verabreichungstechniken wie sonoporation notwendig, um ausreichende intrazelluläre Trehalosespiegel zu erreichen, die zum Schutz der inneren Zellmembranen erforderlich sind. Dieser Ansatz befindet sich derzeit in der Entwicklung zur Trockenkonservierung verschiedener Zelltypen.
Dieses Protokoll bietet eine detaillierte Beschreibung der Montage und des Betriebs eines relativ kostengünstigen akustofluidischen Systems, das von einem Mikrocontroller angetrieben wird. Ultraschallkontrastmittel werden verwendet, um Sonoporation innerhalb der fluidischen Kanäle zu induzieren und eine schnelle molekulare Abgabe an verschiedene Zelltypen, einschließlich T-Zellen und Krebszellen, zu ermöglichen. Dieses akustofluidische System kann für eine Vielzahl von Forschungsanwendungen verwendet werden und kann auch als Prototypsystem zur Bewertung von Sonoporationsmethoden für verbesserte Zelltherapie-Herstellungsprozesse nützlich sein.
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Protocol
Vollblutspenden wurden von gesunden Spendern nach Protokollen gesammelt, die vom institutionellen Prüfungsausschuss der University of Louisville genehmigt wurden.
1. Herstellung von akustofluidischen Geräten
- Erhalten Sie eine Fotomaske mit einem konzentrischen Spiraldesign, das Kanäle mit einem Durchmesser von 500 μm enthält. Eine CAD-Datei wird in den Zusatzdateien als Beispiel bereitgestellt. Eine benutzerdefinierte Fotomaske kann bei einem kommerziellen Anbieter bestellt oder mit einem Maskenschreiber gemustert werden.
- Bereiten Sie eine Form des konzentrischen Spiraldesigns auf einem fotolackbeschichteten Siliziumwafer mit Standard-Photolithographietechniken vor.
- Fügen Sie ca. 2 EL (~30 ml) SU-8 2100 zu einem 100 mm Siliziumwafer hinzu.
- Spin-Coat den Wafer auf einem Spinner mit einer Geschwindigkeit von 150 U / min für 30 s, um den Fotolack zu verteilen, und erhöhen Sie dann die Geschwindigkeit auf 1.200 U / min für 60 s, um eine Dicke von 200 μm zu erhalten.
- Härten Sie die fotolackbeschichtete Waffel in einem Polyimid-Vakuumofen mit einem 30-minütigen Hochlauf und 30 minuten Verweildauer bei 115 °C aus und fahren Sie dann für 30 minuten herunter.
- Belichten Sie den fotolackbeschichteten Wafer für 130 s mit einem Mask aligner mit der Fotomaske aus Schritt 1.1.
- Der Waffel wird nach der Belichtung nach dem gleichen Verfahren wie in Schritt 1.2.3 beschrieben gebacken.
- Entwickeln Sie den Fotolack in der SU-8-Entwicklerlösung für ca. 8 Min.
ACHTUNG: Verwenden Sie die Entwicklerlösung nur in einem gut belüfteten chemischen Abzug.
- Silanisieren Sie die Form, um die Oberfläche hydrophober zu machen. Legen Sie den fotolackbeschichteten Wafer in einen Trockener und fügen Sie einen 20 μL Tropfen Chlorsilan(C8H4Cl3F13 Si) hinzu. 30 s Vakuum auf die Kammer auftragen, dann die Kammer versiegeln und über Nacht stehen lassen.
ACHTUNG: Chlorsilan ist sehr gefährlich und brennbar. Die Exposition verursacht schwere Verbrennungen und Augenschäden. - 54 g Polydimethsiloxan (PDMS)-Basis und 6 g Härter in einer Tasse vermischen und mindestens 1 min kräftig und gründlich mit einem Spatel mischen.
- Stellen Sie den Becher mit der PDMS-Lösung für ca. 30 Minuten in einen Trockenschrank oder bis die verbleibenden Luftblasen aus der Lösung entfernt sind.
- Fotolackbeschichtete Wafer mit den nach oben gerichteten Mustern in eine 150-mm-Petrischale legen.
- Gießen Sie die PDMS-Lösung über die Form in der 150-mm-Petrischale.
- Legen Sie die 150-mm-Petrischale bei Bedarf in einen Trockenmittel und wenden Sie Vakuum an, bis die verbleibenden Luftblasen verschwinden.
- Die 150-mm-Petrischale in einen Laborofen geben und 2 h bei 60 °C backen, um das PDMS auszuhärten.
- Entfernen Sie nach dem Aushärten vorsichtig das PDMS aus der Petrischale, indem Sie mit einer Rasierklinge um die Ränder des Wafers schneiden.
- Schneiden Sie jedes einzelne Gerät mit einem Messer oder einer Rasierklinge aus.
- Stanzen Sie Löcher durch die Ein- und Auslassöffnungen jedes Geräts mit einem 2,5-mm-Biopsiestempel.
- Legen Sie jedes PDMS-Gerät in einen Plasma-Asher mit freiliegenden Kanälen (nach oben gerichtet). Sauerstoffplasmabehandlung (100 W für 45 s, 500 mbar O2)auftragen und dann jedes PDMS-Gerät sofort auf einen sauberen Kalknatronglas-Objektträger (75 mm x 25 mm x 1 mm) mit Kanälen zur Glasoberfläche legen.
- Lassen Sie Geräte über Nacht bei Raumtemperatur verbinden.
- Tragen Sie Silikon vorsichtig auf die Oberfläche des Piezowandlers mit einem Durchmesser von 1 cm mit einer Dicke von ~ 1-2 mm auf, richten Sie den Wandler dann vorsichtig mit der konzentrischen Spirale aus und drücken Sie ihn vorsichtig auf den Boden des Glasmikroskopobjektträgers (gegenüberliegende Seite des PDMS-Geräts).
2. Montage und Betrieb des akustofluidischen Systems
- Schließen Sie einen Mikrocontroller über ein USB-A-zu-B-Kabel an einen Computer an. Eine grüne LED-Betriebsanzeige (pwR) sollte aufleuchten.
- Verwenden Sie das zugehörige Programm auf dem Computer, um ein Programm hochzuladen, das ein 8-MHz-Signal erzeugt. Ein Beispielprogramm finden Sie in den Ergänzenden Files. Nach dem Hochladen des Programms wird es im Mikroprozessorspeicher gespeichert und muss nicht erneut hochgeladen werden.
- Löten Sie einen 1"22G-Draht an das Ende jedes Drahtes am PZT-Wandler.
- Verbinden Sie den negativen (schwarzen) Klemmendraht des PZT-Wandlers über den gelöten Draht mit einem GND-Pin.
- Verbinden Sie den positiven (roten) Klemmendraht des PZT-Wandlers über den lötbaren Draht mit dem Ausgangspin (#9 im mitgelieferten Beispielprogramm).
- Optional montieren Sie das akustofluidische Gerät und den Mikrocontroller in einem 3D-gedruckten Gehäuse. CAD-Dateien werden in denS-Upplemental Files als Beispiele zur Verfügung gestellt. Zusätzliche Kabel können an andere Mikrocontroller-Pins angeschlossen werden, um eine externe LED-Anzeige und auf Wunsch einen Ein- / Aus-Taster zu steuern.
- Schneiden Sie 3-6" Abschnitte aus Tygon PVC Weichplastikschläuchen (1/16" ID, 1/8" OD) und schieben Sie den Schlauch in die Ein- und Auslassöffnungen. Es kann notwendig sein, den Schlauch beim Ausüben von Druck zu drehen, bis er in die Öffnung passt. Optional kann nach dem Einsetzen des Schlauchs in jeden Anschluss an der Verbindung Klebstoff aufgetragen werden, um pdMS und Schlauch miteinander zu verbinden.
- Montieren Sie das mikrofluidische Reservoir gemäß den Anweisungen des Herstellers.
- Schneiden Sie einen 3-6" Abschnitt aus Tygon PVC Weichplastikrohr (1/16" ID, 1/8" OD) und schieben Sie den Schlauch über den 1/32" ID-Schlauch aus dem mikrofluidischen Reservoir-Ausgangsschlauch. Optional wickeln Sie die Verbindung mit Paraffinfolie um, um ein Auslaufen zu verhindern.
- Füllen Sie eine 60-ml-Spritze mit Umgebungsluft (optional filtern Sie die Luft mit einem 0,2-μm-Filter) und verbinden Sie sie mit einem Tygon-PVC-Schlauch (1/16" ID, 1/8" OD) an der Seite des mikrofluidischen Reservoirs.
- Stellen Sie die Spritzenpumpe auf eine Geschwindigkeit von 200 ml / h ein, um die Zell- / Ultraschallkontrastmittellösungen mit einem Volumenstrom von 50 ml / h durch das akustofluidische Gerät zu drücken und die Proben vom Ausgang des akustofluidischen Geräts in ein 50 ml-Zentrifugenrohr zu sammeln. Optional spülen Sie den Kanal vor der akustofluidischen Behandlung mit 15 ml 70% iger Ethanollösung, um die Sterilität der fluidischen Kanäle zu erhöhen. Zusätzlich können Kanäle mit 15 ml entionisiertem Wasser gespült werden, um Ethanolreste im Gerät zu entfernen, bevor Zellen durch das System gepumpt werden.
3. Herstellung von Ultraschallkontrastmitteln
HINWEIS: Ultraschallkontrastmittel verbessern signifikant die akustofluidische Abgabe molekularer Verbindungen durch vorübergehende Erhöhung der Permeabilisierung nahegelegener Zellmembranen19. Die molekulare Abgabe ist ohne Ultraschallkontrastmittel in diesem System sehr begrenzt.
- Bereiten Sie eine Phospholipidlösung in einer 20-ml-Szintillationsfläschchen vor, die die folgende Mischung enthält:
- Fügen Sie 25 mg 1,2-Distearoyl-sn-glycero-3-phosphocholin (DSPC) hinzu.
- Fügen Sie 11,6 mg 1,2-Distearoyl-sn-glycero-3-ethylphosphocholin (DSEPC) hinzu.
- Fügen Sie 0,26 mg 1,2-Distearoyl-sn-glycero-3-phosphoglycerin (DSPG) hinzu.
- Fügen Sie 0,88 mg Polyoxyethylen40-Stearat hinzu.
- Chloroform hinzufügen, bis alle Phospholipide gelöst sind (z. B. 3 ml Chloroform).
- Chloroform in einem Trockenmittel 48 h verdampfen, um einen trockenen Lipidfilm zu bilden (Verdampfung unter Argon oder mit einem Rotationsverdampfer kann verwendet werden, um den Trocknungsprozess zu beschleunigen).
- Rehydrieren Sie den Lipidfilm mit 10 ml steriler phosphatgepufferter Kochsalzlösung (PBS).
- Die Lipidlösung wird 3 min lang bei 40% Amplitude beschallt, um eine kationische mizellare Lösung zu bilden.
- Nach der Beschallung die Phospholipidlösung bei 2-6 °C bis zu 1 Monat lagern.
- Zur Herstellung von Ultraschallkontrastmitteln werden 200 μL kationische mizellare Lösung und 600 μL steriles PBS in eine 2 ml Glasseptumfläschchen-Durchstechflasche geben.
- Verschließen Sie die Durchstechflasche, indem Sie die Kappe crimpen.
- Verwenden Sie eine 1,5"20G-Nadel, um den Kopfraum der Durchstechflasche 30 s lang mit Decafluorbutangas zu füllen.
- Amalgamieren Sie die Durchstechflasche für 45 s bei 4.350 cpm zu perfluorbutangasgefüllten Ultraschallkontrastmitteln.
- Fügen Sie 25 μL Ultraschallkontrastmittellösung pro 1 ml Zelllösung hinzu, bevor Sie das kombinierte Kontrastmittel/Zellgemisch durch das akustofluidische Gerät pumpen. Die Zelllösung kann vom Benutzer nach Wunsch modifiziert werden, aber in unseren Studien bestand die Zelllösung aus primären T-Zellen in Schritt 4.21 bzw. A549-Lungenkrebszellen in Schritt 5.7.
4. Herstellung von primären Tcells
- Isolieren Sie periphere mononukleäre Blutzellen (PBMCs) aus Vollblutlösungen und lagern Sie sie bei -150 °C. Die Dichtegradiententrennung, die ein Substrat enthält, wird üblicherweise verwendet, um PBMCs von Vollblut24,25,26zu trennen.
- Gefrorene Durchstechflasche im 37 °C Wasserbad auftauen.
- Aufgetaute PBMCs 1:10 mit PBS in einem 15mL Zentrifugenröhrchen verdünnen. Jede 1-ml-Durchstechflasche enthält etwa 10 Millionen PBMCs.
- Zentrifuge verdünnte PBMCs bei 580 x g für 11 min bei 4 °C.
- Saugen Sie den Überstand an und fügen Sie 13 ml MACs hinzu, die einen Puffer laufen, um die Zellen wieder aufzustellen.
- Zählen Sie die PBMCs mit einem automatisierten Zellzähler oder Hämozytometer.
- Zentrifugieren Sie die PBMCs erneut bei 580 x g für 11 min bei 4 °C und saugen Sie den Überstand an.
- Fügen Sie 40 μL gekühlten Laufpuffer pro 10 Millionen PBMCs hinzu.
- Um T-Zellen zu isolieren, fügen Sie 10 μL Pan T-Cell Biotin Antikörper-Cocktail pro 10 Millionen PBMCs hinzu.
- Rühren Sie die PBMCs vorsichtig und lagern Sie die Lösung bei 4 °C für 5 min pro 10 Millionen Zellen.
- Fügen Sie 30 μL Laufpuffer und 20 μL Pan T-Cell MicroBead Cocktail pro 10 Millionen PBMCs hinzu.
- PBMCs und Perlen gründlich vermischen und weitere 15 min bei 4 °C inkubieren.
- Fügen Sie einen laufenden Puffer hinzu, um ein Gesamtvolumen von 500 μL zu erreichen.
- Trennen Sie primäre T-Zellen mit einem handelsüblichen magnetischen Tischsortiergerät unter Verwendung der Einstellung "Depletes Separation" gemäß dem Protokoll des Herstellers. Dieser Schritt sollte nach der Zellsortierung zwischen 5-10 Millionen T-Zellen ergeben.
- Zählen Sie T-Zellen mit einem automatisierten Zellzähler oder Hämozytometer.
- T-Zellen in 10 ml sterilem PBS verdünnen und bei 580 x g zentrifugieren für 10 min bei 4 °C, um die Zellen zu pelletieren.
- Saugen Sie den Überstand an und resuspend T-Zellen in 1 ml PBS.
- Zählen Sie T-Zellen mit einem automatisierten Zellzähler oder Hämozytometer und aliquot 1 Million / ml für Experimente.
- Bereiten Sie eine 1 mg / ml Fluoreszeinlösung in PBS vor.
- Unmittelbar vor der Verarbeitung werden 100 μL 1 mg/ml Fluoreszeinlösung pro 1 ml T-Zelllösung (endgültige Fluoresceinkonzentration = 100 μg/ml) hinzugefügt.
- Fügen Sie 25 μL Ultraschall-Kontrastmittellösung hinzu, wie zuvor in Schritt 3.11 beschrieben.
- Verarbeiten Sie 1 ml Aliquoten von Zellen mit dem akustofluidischen System (siehe Schritte 2.10-2.11). Dieser Schritt verbessert die Abgabe von Fluorescein in primäre T-Zellen.
- Unmittelbar nach der Behandlung die Zellen dreimal durch Zentrifugation bei 580 x g für 10 min mit 500 μL PBS waschen, um extrazelluläres Fluoreszein zu entfernen. Die Zellen sollten innerhalb von 10 Minuten nach Zugabe von Fluoreszeinlösung gewaschen werden.
- Nach dem letzten Waschschritt die Zellen in 250 μL PBS resuspendieren und die Fluoreszenz auf dem Durchflusszytometer messen.
5. Herstellung von A549-Lungenkrebszellen
- Kultur-A549-Zellen (adenokarzinome humane alveoläre Basalepithelzellen) in vollständigen DMEM-Medien (10% fetales Rinderserum, 1% Penicillin/Streptomycin) bei 37 °C und 5% CO 2 ineinem Flachboden-Gewebekulturkolben.
- Ernten Sie A549-Zellen, wenn sie 70-90% Konfluenz erreichen. Aspiratieren Sie Medien aus dem Kolben und waschen Sie die Zellen einmal mit PBS, um Serumproteine zu entfernen.
- Trypsin (0,25%) EDTA in den Kolben geben und 5 min bei 37 °C inkubieren. Trypsin ist ein Verdauungsenzym, das bewirkt, dass sich die Zellen von der Unterseite des Gewebekulturkolbens lösen.
- Geben Sie die Trypsinlösung in ein 15-ml-Zentrifugenröhrchen und neutralisieren Sie es, indem Sie vollständige DMEM-Medien im Verhältnis 1: 3 hinzufügen.
- Pelletieren Sie die Zellen durch Zentrifugation bei 1.500 x g für 5 min bei 4 °C.
- Saugen Sie den Überstand an und brauen Sie das Pellet in einer Konzentration von 100.000/ml in PBS-Lösung mit 200 mM Trehalose in 15-ml-konischer Durchstechflasche wieder auf.
- Fügen Sie 25 μL Ultraschall-Kontrastmittellösung hinzu, wie zuvor in Schritt 3.11 beschrieben.
- Verarbeiten Sie 1 ml Aliquoten von Zellen mit dem akustofluidischen System (siehe Schritte 2.10-2.11). Dieser Schritt verbessert die Abgabe von Trehalose in A549-Lungenkrebszellen.
- Unmittelbar nach der Behandlung waschen Sie die Zellen dreimal per Zentrifugation mit 500 μL PBS, um extrazelluläre Trehalose zu entfernen. Die Zellen sollten innerhalb von 10 Minuten nach Zugabe von Trehaloselösung gewaschen werden.
- Nach dem letzten Waschschritt die Zellen in 100 μL PBS wieder aufschnüsen.
- Fügen Sie 11 μL 1% Triton X-100-Lösung hinzu, um Zellen zu lysieren und intrazelluläre Trehalose freizusetzen.
- Wirbel für 15 s, dann für 30 min bei Raumtemperatur inkubieren.
- Vortex erneut für 15 s, dann messen Sie die Trehalose-Konzentration mit dem kommerziell erhältlichen Trehalose-Assay gemäß der Empfehlung des Herstellers.
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Representative Results
Abbildung 1zeigt ein Bild des akustofluidischen Systems, das in einem 3D-gedruckten Gehäuse montiert ist. Dieses Protokoll erzeugt ein akustofluidisches System, das verwendet werden kann, um die intrazelluläre molekulare Abgabe in mehreren Zelllinien mit Ultraschallkontrastmitteln zu verbessern.
Abbildung 2 zeigt eine verbesserte intrazelluläre Abgabe einer fluoreszierenden Verbindung, Fluorescein, an primäre menschliche T-Zellen mit akustofluidischer Behandlung im Vergleich zu einer unbehandelten Kontrollgruppe (p<0,05, n = 3 / Gruppe). T-Zellen wurden in einer Konzentration von 1 Million/ml in PBS mit 100 μg/ml Fluoreszeinlösung und 25 μL/ml Ultraschallkontrastmittellösung suspendiert, und die Mischung wurde zur Ultraschallbehandlung durch das akustofluidische Gerät geleitet. Die intrazelluläre Fluoreszeinabgabe und die Zelllebensfähigkeit wurden mit Durchflusszytometrie nach dem Waschen der Zellen durch Zentrifugation zur Entfernung von extrazellulärem Fluoreszein gemessen. T-Zellen in der unbehandelten Kontrollgruppe wurden ebenfalls bei 1 Million/ml in PBS mit 100 μg/ml Fluoreszeinlösung suspendiert, aber Ultraschall-Kontrastmittellösung wurde nicht hinzugefügt und Zellen wurden nicht durch das akustofluidische Gerät geleitet. Die Fluoreszenzintensität von T-Zellen erhöhte sich nach akustofluidischer Behandlung um das 5-fache im Verhältnis zur Fluoreszenzintensität von T-Zellen in der unbehandelten Kontrollgruppe, was auf eine verbesserte Abgabe von Fluoreszein hinweist. Die Zelllebensfähigkeit nahm nach akustofluidischer Behandlung leicht ab, blieb aber über 80% (p<0,05, n = 3 / Gruppe).
Abbildung 3 zeigt eine verbesserte intrazelluläre Abgabe einer konservierungsmittelhaltigen Verbindung, Trehalose, an menschliche A549-Lungenkarzinomzellen mit akustofluidischer Behandlung im Vergleich zu Flow allein (keine Ultraschallkontrastmittel oder Ultraschallexposition) und im Vergleich zu Zellen in der unbehandelten Kontrollgruppe (ANOVA p<0,05, n= 3/Gruppe). A549-Zellen wurden in einer Konzentration von 100.000/ml in PBS mit 200 mM Trehaloselösung und 25 μL/ml Ultraschallkontrastmittellösung suspendiert und die Mischung zur Ultraschallbehandlung durch das akustofluidische Gerät geleitet. A549-Zellen in den Kontrollgruppen ("Flow Only" und "No Treatment") wurden ebenfalls bei 100.000 /ml in PBS mit 200 mM Trehalose suspendiert, aber Ultraschall-Kontrastmittellösung wurde nicht hinzugefügt und die Zellen wurden keiner Ultraschallbehandlung ausgesetzt. Intrazelluläre Trehalose wurde mit einem Trehalose-Assay-Kit quantifiziert und auf die unbehandelte Kontrollgruppe normalisiert. Die Zelllebensfähigkeit wurde mit dem Trypan-Blau-Assay gemessen. Es gab keinen statistischen Unterschied in der Zelllebensfähigkeit zwischen den Gruppen (n=3-7/Gruppe).
Abbildung 1: Foto des akustofluidischen Systems. Das akustofluidische Strömungssystem enthält eine PDMS-basierte Durchflusskammer mit einem integrierten PZT-Wandler, der von einem Mikrocontroller angetrieben wird. Ein 3D-gedrucktes Gehäuse mit LED-Anzeige und Ein-/Aus-Taster sind optionale Zusatzfunktionen. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.
Abbildung 2: Die akustofluidische Behandlung verbessert die Abgabe vonLuorescein an menschliche T-Zellen. (A) Die Fluoreszenzintensität in primären T-Zellen nahm nach akustofluidischer Behandlung mit Fluorescein im Vergleich zur unbehandelten Kontrollgruppe zu (keine Akustofluidik und keine Mikroblasen) (p<0,05, n=3/Gruppe). (B) Die Zelllebensfähigkeit nahm nach akustofluidischer Behandlung leicht ab, blieb aber über 80%, gemessen durch Durchflusszytometrie (p<0,05, n = 3 / Gruppe). (C) Repräsentatives Durchflusszytometrie-Histogramm, das eine höhere Fluoreszenz in der akustofluidischen Behandlungsgruppe anzeigt. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.
Abbildung 3: Die akustofluidische Behandlung verbessert dieVerabreichungan menschliche Lungenkrebszellen. (A) Die Trehalose-Aufnahme stieg in A549-Lungenkarzinomzellen im Vergleich zu nur durchfluss (kein Ultraschall und keine Mikroblasen) und der unbehandelten Kontrollgruppe (ANOVA p<0,05, n=3/Gruppe). (B) Die Zelllebensfähigkeit blieb nach akustofluidischer Behandlung, gemessen mit Trypan-Blau-Assay (n=3-7/Gruppe), über 90%. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.
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Discussion
Dieses Protokoll beschreibt den Aufbau und Betrieb eines kostengünstigen akustofluidischen Systems, das die intrazelluläre Abgabe von Biomolekülen für Forschungsanwendungen verbessert. Es gibt mehrere wichtige Faktoren, die bei der Montage und dem Betrieb dieses Systems zu berücksichtigen sind. Das akustofluidische Gerät wird in PDMS hergestellt, einem biokompatiblen Material, das leicht mit konsistenten Kanalabmessungen geformt werden kann27. Die Gerätekanäle können vor der akustofluidischen Verarbeitung mit 15 ml 70% iger Ethanollösung gespült werden, um die Sterilität bei der Arbeit mit kultivierten Zellen zu erhöhen. Nach der Ethanolreinigung können 15 ml entionisiertes Wasser verwendet werden, um das Gerät zu spülen, um Ethanolreste aus den Kanälen zu entfernen, bevor Zelllösungen hinzugefügt werden. Kleine akustofluidische Kanäle können leicht durch Ablagerungen oder Zellaggregate blockiert werden, was dies zu einer Einschränkung für die häufige Verwendung des Geräts macht. Das gründliche Spülen der Kanäle zwischen den einzelnen Proben hilft, Probleme mit der Kanalblockade zu vermeiden. Darüber hinaus können in jeder Charge mehrere PDMS-Geräte hergestellt werden, so dass Geräte bei Bedarf schnell ausgetauscht werden können. Für ultraschallbasierte Anwendungen ist es wichtig, PDMS-Geräte mit einer konstanten Dicke herzustellen, da Unterschiede in der PDMS-Dicke die Ultraschalldrücke innerhalb der fluidischen Kanäle beeinflussen können. Ultraschallwellen breiten sich kontinuierlich durch das Gerät aus und übertragene Wellen interagieren mit reflektierten Wellen, um stehende akustische Wellenmuster zu bilden, die sehr empfindlich auf Unterschiede in der PDMS-Dickereagieren 17. Die PDMS-Dicke wird in erster Linie durch die Menge an PDMS bestimmt, die der Form zugesetzt wird (Schritt 1.7), und dieses Protokoll ergibt eine PDMS-Dicke von 3,5 mm.
Die maximale Ausgangsfrequenz des Mikrocontrollers (8 MHz) wurde ausgewählt, um die kleinste akustische Wellenlänge innerhalb des fluidischen Kanals zu erzeugen. Der Mikrocontroller-Ausgang ist typischerweise eine Rechteckwelle, aber Oszilloskopmessungen ergaben, dass der Ausgang bei 8 MHz aufgrund von Slew-Rate-Einschränkungen einer sinusförmigen Wellenform ähnlicher wird. Eine Einschränkung dieses Systems besteht darin, dass die maximale Spannungsabgabe des Mikrocontrollers 5V beträgt und ein externer HF-Verstärker erforderlich ist, wenn höhere Spannungsausgänge gewünscht werden. Der Freifelddruckausgang des Wandlers in diesem System betrug 18 kPa bei 1 cm, gemessen mit einem Nadelhydrophon (Precision Acoustics, Dorchester, Vereinigtes Königreich). Obwohl dieser Druck relativ niedrig ist, können stehende Wellen innerhalb der Kanäle den akustischen Druck erhöhen, dem die Proben ausgesetzt sind, wenn sie den Ultraschallstrahl passieren.
Ultraschallkontrastmittel werden verwendet, um die akustische Kavitation innerhalb der akustofluidischen Kanäle zu nukleieren, was die Abgabe von Biomolekülen über die Zellmembranenverbessert 28,29. Dieses Protokoll beschreibt die Synthese von perfluorierten, gasgefüllten Mikroblasen, die von einer kationischen Phospholipidmembran verkapselt sind. Wie bereits beschrieben, besteht diese Formulierung aus Mikroblasen hauptsächlich zwischen 1-3 μm Durchmesser30. Die positiv geladene Oberfläche der Mikroblasen zieht sie zu negativ geladenen Zellmembranen an, was die durch Sonoporation vermittelte molekulare Abgabe erhöht, wenn sich die Mikroblasen und Zellen in unmittelbarer Nähe befinden. Die Konzentration von Mikroblasen in der Zelllösung ist ein kritischer Faktor, der die Effizienz der molekularen Abgabe und Zelllebensfähigkeit nach akustofluidischer Behandlung beeinflussen kann, und die optimale Mikroblasenkonzentration kann für jeden Zelltyp 19spezifisch sein. Die Konzentration von gasgefüllten Mikroblasen mit einer Lipidhülle kann im Laufe der Zeit nach der Synthese abnehmen, so dass Ultraschallkontrastmittel innerhalb weniger Stunden nach der Synthese verwendet werden sollten.
Wir haben in diesem Protokoll die Abgabe einer fluoreszierenden Verbindung (Fluorescein) an primäre nicht aktivierte menschliche T-Zellen unter Verwendung des akustofluidischen Systems nachgewiesen. Es ist wichtig zu beachten, dass der Aktivierungsstatus primärer menschlicher T-Zellen die Effizienz der intrazellulären molekularen Abgabe beeinflussen kann. Die Fluoreszenzeigenschaften von Fluorescein ermöglichen einen empfindlichen intrazellulären Nachweis mit Durchflusszytometrie, aber auch andere lösliche Verbindungen können mit diesem akustofluidischen System in Zellen abgegeben werden. Zum Beispiel haben wir die akustofluidische Verabreichung von Trehalose in menschliche Lungenkrebszellen gezeigt. Die akustofluidische Abgabe von Trehalose in Zellen kann eine erhöhte Erholung nach gefrorener und trockener Lagerung ermöglichen, was erhebliche Auswirkungen auf eine Reihe von biomedizinischen und Forschungsanwendungen haben könnte 19.
Die akustofluidische Abgabe anderer Biomoleküle, wie Proteine oder DNA-Plasmide, ist ebenfalls möglich, obwohl eine Einschränkung dieses Systems darin besteht, dass die Effizienz der molekularen Abgabe bei größeren Verbindungen geringer sein kann18,31. Die Optimierung der akustofluidischen Durchflussrate, der Konzentrationen von Ultraschallkontrastmitteln, der Zellkonzentrationen und der Medien kann für die Abgabe anderer Biomoleküle erforderlich sein. Darüber hinaus können optimale Parameter zwischen verschiedenen Zelltypen aufgrund von Faktoren wie Zelldurchmesser, Morphologie, Membraneigenschaften und Phänotyp variieren.
Das in diesem Protokoll beschriebene akustofluidische System kann einfach montiert und zu relativ geringen Kosten betrieben werden. Darüber hinaus kann dieses System für andere Anwendungen angepasst werden, indem andere Signalquellen oder Ultraschallwandler verbunden werden, um spezifische Ausgangsdrücke und Frequenzen32,33,34zu erzeugen. Darüber hinaus kann das in diesem Protokoll beschriebene Spritzenpumpensystem auf Wunsch durch Schlauchpumpen ersetzt werden. Bei einer Durchflussrate von 50 ml/h beträgt die Verweilzeit für Zellen innerhalb des Ultraschallstrahls, wenn sie den akustofluidischen Kanal passieren, etwa 1 s, aber diese Verweilzeit kann je nach Bedarf für spezifische Anwendungen durch Anpassung der Flüssigkeitsdurchflussrate geändert werden.
Im Gegensatz zu anderen gängigen Transfektionstechniken können Biomoleküle innerhalb von Minuten statt Stunden in die Zellen abgegeben werden, und dieses System erfordert keine spezielle und teure Ausrüstung. Darüber hinaus ist dieses System mit einer Vielzahl gängiger Zellkulturmedien oder anderer Puffer kompatibel. Zusammenfassend lässt sich sagen, dass dieses akustofluidische System eine schnelle Abgabe von Biomolekülen an Zellen ermöglicht, was für eine Vielzahl von Forschungsanwendungen nützlich sein kann.
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Disclosures
Die Co-Autoren MAM und JAK sind Eigentümer von DesiCorp, die finanziell von Produkten im Zusammenhang mit dieser Forschung profitieren können.
Acknowledgments
Diese Arbeit wurde teilweise durch Mittel der National Science Foundation (#1827521, #1827521, #1450370) und der National Institutes of Health (U01HL127518) unterstützt. Photolithographie-Dienstleistungen wurden vom Micro/ Nano Technology Center der University of Louisville angeboten.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Fabrication of Acoustofluidic Device | |||
| DOW SYLGARD 184 SILICONE ENCAPSULANT CLEAR 0.5 KG KIT | Ellsworth Adhesives | 4019862 (SKU) | https://www.ellsworth.com/products/by-market/consumer-products/encapsulants/silicone/dow-sylgard-184-silicone-encapsulant-clear-0.5-kg-kit/ |
| Harris Uni-Core (2.5 mm) | Electron Microscopy Sciences | 69039-25 | |
| Microfluidic Reservoir for 15 mL Falcon Tube - S (2/4 port) | Darwin Microfluidics | LVF-KPT-S-2 (SKU) | https://darwin-microfluidics.com/products/15-ml-falcon-tube-microfluidic-reservoir-s-2-4-port |
| Microscope Slide | VWR | 16004-430 | https://us.vwr.com/store/product/4646174/vwr-vistavisiontm-microscope-slides-plain-and-frosted-premium |
| trichlorosilane | Gelest | 105732-02-3 (Cas. No.) | Chlorosilane is very hazaradous and flammable. Exposure causes severe burns and eye damage. |
| Tygon PVC soft plastic tubing (1/16" ID, 1/8" OD) | McMaster-Carr | 5233K51 (Part #) | https://www.mcmaster.com/pvc-tubing/soft-tubing-for-air-and-water/ |
| Assembly of Acoustofluidic System | |||
| Arduino Uno | Arduino | 7630049200050 (Barcode) | https://store.arduino.cc/usa/arduino-uno-rev3 |
| Preparation of Ultrasound Contrast Agents | |||
| 1,2-distearoyl-sn-glycero-3-ethylphosphocholine (DSEPC) | Avanti Lipids | 890703P-25mg (SKU) | https://avantilipids.com/product/890703 |
| 1,2-distearoyl-sn-glycero-3-phosphocholine (DSPC) | Avanti Lipids | 850365P-25mg (SKU) | https://avantilipids.com/product/850365 |
| 1,2-distearoyl-sn-glycero-3-phosphoglycerol (DSPG) | Avanti Lipids | 840465P-25mg (SKU) | https://avantilipids.com/product/840465 |
| APF-140HP (decafluorobutate gas) | FlouroMed | 355-25-9 (Cas No.) | http://www.fluoromed.com/products/perfluorodecalin/ |
| DB-338 Amalgamators | COXO | https://www.coxotec.com/coxo/db-338-amalgamators/ | |
| polyoxyethylene 40 stearate | Sigma-Aldrich | P3440-250G (SKU) | https://www.sigmaaldrich.com/catalog/product/sigma/p3440?lang=en®ion=US&gclid= Cj0KCQjwy8f6BRC7ARIsAPIXOjjj Jh_151mYVEUyLZRavt4re9YQMLS vID64X-1KbO3LUKGjVUwb PDAaAqvOEALw_wcB |
| Q125 Sonicator | Qsonica | Q125-110 (Ref.) | https://www.sonicator.com/products/q125-sonicator?_pos=1&_sid=406df3776&_ss=r |
| Preparation of Primarty T Cells | |||
| autoMACs running buffer | Miltenyi Biotec | 130-091-221 (Order No.) | https://www.miltenyibiotec.com/US-en/products/automacs-running-buffer-macs-separation-buffer.html#gref |
| Pan T Cell Isolation Kit, human (Pan T-Cell Biotin Antibody Cocktail & Pan T-Cell MicroBead Cocktail) | Miltenyi Biotec | 130-096-535 (Order No.) | https://www.miltenyibiotec.com/US-en/products/pan-t-cell-isolation-kit-human.html#130-096-535 |
| magnetic cell sorter (autoMACS Pro Separator) | Miltenyi Biotec | 130-092-545 (Order No.) | https://www.miltenyibiotec.com/US-en/products/automacs-pro-separator-starter-kit.html#130-092-545 |
| Preparation of A549 Lung Cancer Cells | |||
| Trehalose Assay Kit | Megazyme | K-TREH (Cat. No.) | https://www.megazyme.com/trehalose-assay-kit |
| Trypan blue (0.4% in aqueous solution Ready-to-Use, sterile) | VWR | 97063-702 (Cat. No.) | https://us.vwr.com/store/product/7437427/trypan-blue-0-4-in-aqueous-solution-ready-to-use-sterile |
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