Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Bioengineering
Click here for the English version

Bioengineering

הרכבה ותפעול של מכשיר אצוטופלואידי לאספקה משופרת של תרכובות מולקולריות לתאים

Published: January 21, 2021 doi: 10.3791/62035
Automatic Translation
1, 1, 2, 1, 1, 2, 3, 2, 1
1Department of Bioengineering, University of Louisville, 2School of Medicine, University of Louisville, 3Department of Biology, University of Louisville

Summary

פרוטוקול זה מתאר את ההרכבה והתפעול של מכשיר אצוטופלואידי בעלות נמוכה עבור משלוח מולקולרי מהיר לתאים באמצעות sonoporation המושרה על ידי סוכני ניגוד אולטרסאונד.

Abstract

אספקה תאית יעילה של ביומולקולים נדרשת למגוון רחב של מחקר ביו-רפואי ויישומים טיפוליים מבוססי תאים. sonoporation בתיווך אולטראסאונד היא טכניקה מתפתחת עבור משלוח תאי מהיר של biomolecules. Sonoporation מתרחשת כאשר cavitation של microbubbles מלא גז יוצר נקבוביות חולפות בקרומי התא הסמוכים, המאפשר ספיגה מהירה של biomolecules מהנוזל שמסביב. הטכניקות הנוכחיות עבור in vitro sonoporation של תאים בהשעיה מוגבלים על ידי תפוקה איטית, שונות בתנאי החשיפה אולטרסאונד עבור כל תא, ועלות גבוהה. כדי להתמודד עם מגבלות אלה, מכשיר acoustofluidic בעלות נמוכה פותח אשר משלב מתמר אולטרסאונד במכשיר נוזלים מבוסס PDMS כדי לגרום sonoporation עקבי של תאים כפי שהם זורמים דרך הערוצים בשילוב עם סוכני ניגוד אולטרסאונד. המכשיר מפוברק בטכניקות פוטוליתוגרפיה סטנדרטיות כדי לייצר את השבב הנוזלי מבוסס PDMS. מתמר דיסק פיזו אולטרסאונד מחובר למכשיר ומונע על ידי מיקרו-בקר. ניתן לשלב את ההרכבה בתוך מארז מודפס בתלת-ממד להגנה נוספת. תאים ומיקרו-חלוקים נדחפים דרך המכשיר באמצעות משאבת מזרק או משאבה פרייסטלטית המחוברת לצינורות PVC. משלוח משופר של biomolecules לתאי T אנושיים ותאי סרטן ריאות הוא הודגם עם מערכת אצוטופלואידית זו. בהשוואה לגישות טיפול בתפזורת, מערכת אצוטופלוידית זו מגדילה את התפוקה ומפחיתה את השונות, אשר יכול לשפר את שיטות עיבוד התא עבור יישומי מחקר ביו-רפואי וייצור של טיפולים מבוססי תאים.

Introduction

פלטפורמות ויראליות ולא ויראליות נוצלו כדי לשפר את המסירה המולקולרית לתאים. משלוח ויראלי (transduction) היא טכניקה נפוצה המשמשת 0000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000 מגבלות עם משלוח ויראלי כוללות mutagenesis החדרה פוטנציאלית, יכולת מהונדסת מוגבלת, ריבוי לא רצוי של זיהום1,2. לכן, טכניקות משלוח מולקולרי לא ויראליות נמצאות בפיתוח עבור מגוון רחב של יישומי ביו-רפואה ומחקר. טכניקות נפוצות כוללות מכני, חשמלי, הידרודינמי, או שימוש באנרגיה מבוססת לייזר כדי לשפר את ספיגת הביומולקולים לתאים 3. Electroporation היא פלטפורמת משלוח מולקולרית לא ויראלית נפוצה אשר יש את היכולת לגרום ניקוב חולף בקרום הפלזמה עבור משלוח תאי שלתרכובות מולקולריות 4,5,6,7,8,9. עם זאת, ניקוב חולף של קרום הפלזמה הוא תהליך סטוכסטי וספיגה מולקולרית באמצעות אלקטרופורציה תלויה בדרך כלל דיפוזיה פסיבית על פני נקבוביות הממברנה החולפת4,7,8.

שיטה חלופית היא ניצול של אולטרסאונד עבור משלוח מולקולרי תאי משופר באמצעות cavitation של סוכני ניגוד אולטרסאונד (כלומר, microbubbles מלא גז). cavitation microbubble גורם אפקטים microstreaming במדיה שמסביב אשר יכול לגרום ניקוב חולף של ממברנות פלזמה סמוכות ("sonoporation") המאפשר ספיגה תאית מהירה של biomolecules באמצעות מנגנוני תחבורה פסיביים או פעילים10,11,12. Sonoporation היא טכניקה יעילה עבור משלוח מולקולרי מהיר לתאים, אבל גישה זו דורשת לעתים קרובות ציוד יקר ושיטות טיפול בתפזורת אשר מוגבלים על ידי תפוקה נמוכה יותר ושונות גבוהה יותר בתנאיחשיפה אולטרסאונד 13. כדי להתמודד עם מגבלות אלה, התקנים acoustofluidic, המאפשרים sonoporation עקבי של תאים בהשעיה, נמצאים כעת בפיתוח.

Acoustofluidics הוא תחום מתרחב המשלב אולטרסאונד וטכנולוגיות microfluidic עבור מגוון רחב של יישומים. גישה זו שימשה בעבר להפרדת חלקיקים על ידי החלת אנרגיית אולטרסאונד רציפה כדי לגרום לגלים אקוסטיים עומדים בתוך הערוצים הנוזליים14,15,16,17. חלקיקים ממוינים לחלקים שונים של המכשיר בהתבסס על מגוון מאפיינים כגון גודל החלקיקים, צפיפות ודחיסה ביחס למדיום16. טכנולוגיות Acoustofluidic נמצאים גם בפיתוח כדי לאפשר אספקה מולקולרית מהירה למגוון סוגי תאים עבור יישומי מחקר וייצור של שירותי תאים18. לאחרונה, הדגמנו משלוח מולקולרי משופר לאריתרוציטים באמצעות מכשיר אצוטופלואידי מבוסס PDMS19. בפלטפורמה האקוסטופולידית, ניתן לתמרן את הדינמיקה של התא והמיקרו-יבלים כדי לגרום לאינטראקציות פיזיות המאפשרות אספקה משופרת של ביומולקולים. היעילות והעקביות של אספקה מולקולרית תאית יכולות להיות מוגברות על ידי אופטימיזציה של המרחק בין תאים ומיקרו-יבלים.

יישום חשוב אחד עבור sonoporation בתיווך אצוטופלואידי כרוך הובלה של biomolecules לתוך תאי T אנושיים ראשוניים. אימונותרפיות המבוססות על העברת תאי T מאמצת, כגון טיפול בתא T קולטן אנטיגן כימרי (CAR T), מתעוררות במהירות לטיפול במחלות שונות, כולל סרטן ווירוסים כגון HIV20. טיפול CAR T היה יעיל במיוחד בחולי לוקמיה לימפובלסטית חריפה בילדים (ALL), עם שיעורי הפוגה מלאה של 70-90%21. עם זאת, ייצור תאי T לטיפולים אלה תלוי בדרך כלל בהתמרות ויראלית המוגבלת על ידי מוטגנזה פוטנציאלית, זמני עיבוד ארוכים ואתגרים של אספקת ביומולקולות לא גנטיות כגון חלבונים או מולקולות קטנות1. שיטות אספקה מולקולריות בתיווך אצטופולי יכול להתגבר על מגבלות אלה ולשפר את הייצור של טיפולים בתאי T.

יישום חשוב נוסף עבור sonoporation בתיווך אצוטופלואידי כרוך משלוח תאי של תרכובות משמרות, כגון trehalose, אשר להגן על תאים במהלך הקפאה וייבוש. Trehalose מיוצר על ידי כמה אורגניזמים בטבע ומסייע להם לסבול הקפאה וייבוש על ידי הגנה על הממברנות התאיות שלהם22,23. עם זאת, trehalose אינו מיוצר על ידי תאים יונקים והוא אטום קרום התא יונקים. לכן, טכניקות משלוח מולקולרי יעיל, כגון sonoporation, נחוצים על מנת להשיג רמות טרהלוז תאיות מספיק הנדרש כדי להגן על ממברנות תאיות פנימיות. גישה זו נמצאת כעת בפיתוח לשימור יבש של סוגי תאים שונים.

פרוטוקול זה מספק תיאור מפורט של ההרכבה וההפעלה של מערכת אקוסטופלואידית בעלות נמוכה יחסית המונעת על ידי מיקרו-בקר. סוכני ניגודיות אולטראסאונד מנוצלים כדי לגרום sonoporation בתוך הערוצים הנוזליים ולאפשר משלוח מולקולרי מהיר לסוגי תאים שונים, כולל תאי T ותאים סרטניים. מערכת אצוטופלוידית זו יכולה לשמש עבור מגוון יישומי מחקר, עשוי גם להיות שימושי כמערכת אב טיפוס להערכת שיטות sonoporation עבור תהליכי ייצור טיפול בתאים משופרים.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

תרומות דם שלמות נאספו מתורמים בריאים בעקבות פרוטוקולים שאושרו על ידי ועדת הבדיקה המוסדית באוניברסיטת לואיוויל.

1. ייצור של מכשיר אצוטופלואידי

  1. להשיג מסכת פוטו עם עיצוב ספירלה קונצנטרי המכיל ערוצים עם קוטר של 500 מיקרומטר. קובץ CAD מסופק בקבצים המשלימים כדוגמה. ניתן להזמין מסכת צילום מותאמת אישית מספק מסחרי או בדוגמת תבנית באמצעות כותב מסיכות.
  2. הכן תבנית של העיצוב הספירלי הקונצנטרי על רקיק סיליקון מצופה פוטוארסיסט בטכניקות פוטוליתוגרפיה סטנדרטיות.
    1. יש להוסיף כ-2 כפות (כ-30 מ"ל) של SU-8 2100 לופל סיליקון 100 מ"מ.
    2. ספין-מצופה את הוופל על ספינר במהירות של 150 סל"ד עבור 30 s כדי לפזר את photoresist, ולאחר מכן להגדיל את המהירות ל 1,200 סל"ד עבור 60 s כדי להניב עובי של 200 מיקרומטר.
    3. רפאו את הוופל מצופה הפוטורסיסט בתנור ואקום פולימיד עם רמפה של 30 דקות למעלה ו-30 דקות התעכבו ב-115 מעלות צלזיוס, ואז רמפה במשך 30 דקות.
    4. חשוף את הוופל מצופה הצילום במשך 130 s באמצעות מיישר מסיכה עם מסכת הצילום מהשלב 1.1.
    5. אופים את הוופל לאחר החשיפה לאחר אותו תהליך המתואר בשלב 1.2.3.
    6. לפתח את photoresist בפתרון מפתח SU-8 במשך כ 8 דקות.
      אזהרה: השתמש בתמיסת מפתח רק במכסה אדים כימי מאוורר היטב.
  3. סילאניזציה התבנית כדי להפוך את פני השטח הידרופובי יותר. מניחים את הוופל מצופה הפוטורסיסט לתוך חיטוי ומוסיפים טיפה של 20 μL של כלורוסילן (C8H4Cl3F13Si). יש למרוח ואקום על התא למשך 30, ואז לאטום את התא ולהשאיר למשך הלילה.
    זהירות: כלורוסילאן מסוכן מאוד ודליק. חשיפה גורמת לכוויות קשות ולנזק לעיניים.
  4. שלבו 54 גרם של בסיס פולידימתסילוקסן (PDMS) ו-6 גרם של חומר ריפוי בכוס וערבבו במרץ וביסודיות עם מרית למשך דקה אחת לפחות.
  5. מניחים את הכוס המכילה את פתרון PDMS לתוך חיטוי במשך כ -30 דקות או עד בועות אוויר שריד מוסרים מהפתרון.
  6. מניחים רקיק מצופה פוטוארסיסט עם התבניות הפונות כלפי מעלה בצלחת פטרי 150 מ"מ.
  7. יוצקים את תמסת PDMS על התבנית בתוך צלחת פטרי 150 מ"מ.
  8. במידת הצורך, מניחים את צלחת הפטרי 150 מ"מ בתוך חיטוי ולהחיל ואקום עד בועות אוויר שריד להיעלם.
  9. מעבירים את צלחת הפטרי 150 מ"מ לתנור מעבדה ואופים במשך 2 שעות ב 60 °C (60 °F) כדי לרפא את PDMS.
  10. לאחר הריפוי, יש להסיר בזהירות את ה-PDMS מצלחת הפטרי על ידי חיתוך בשולי הוופל באמצעות סכין גילוח.
  11. חותכים כל מכשיר בודד באמצעות סכין או סכין גילוח.
  12. ניקוב חורים דרך יציאות המפרצון והשקע של כל מכשיר באמצעות אגרוף ביופסיה 2.5 מ"מ.
  13. מקם כל התקן PDMS באשר פלזמה עם ערוצים חשופים (עם הפנים כלפי מעלה). החל טיפול פלזמה חמצן (100 W עבור 45 s, 500 mbar O2) ולאחר מכן מיד למקם כל מכשיר PDMS על שקופית מיקרוסקופ זכוכית סודה ליים נקי (75 מ"מ x 25 מ"מ x 1 מ"מ) עם ערוצים מול פני הזכוכית.
  14. אפשרו למכשירים להתחבר למשך הלילה בטמפרטורת החדר.
  15. יש למרוח בעדינות סיליקון על פני השטח של מתמר פיזו בקוטר 1 ס"מ בעובי של ~ 1-2 מ"מ, ולאחר מכן ליישר בזהירות את המתמר עם הספירלה הקונצנטרית ולחץ עליו בעדינות על החלק התחתון של שקופית מיקרוסקופ הזכוכית (הצד הנגדי מהתקן PDMS).

2. הרכבה ותפעול של מערכת אצוטופלוידית

  1. חבר מיקרו-בקר למחשב באמצעות כבל USB A עד B. מחוון LED בהספק ירוק (שכותרתו PWR) אמור להאיר.
  2. השתמש בתוכנית המשויכת במחשב כדי להעלות תוכנית היוצרת אות 8 MHz. תוכנית לדוגמה מסופקת ב- Files המשלים . לאחר העלאת התוכנית, הוא יאוחסן בזיכרון מיקרו מעבד ולא יהיה צורך להעלות אותו שוב.
  3. הלחמה חוט 1"22G עד סוף כל חוט על מתמר PZT.
  4. חבר את חוט המסוף השלילי (השחור) של מתמר PZT לפין GND באמצעות החוט המולחם.
  5. חבר את חוט המסוף החיובי (האדום) של מתמר PZT לפין הפלט (#9 בתוכנית הדוגמה שסופקה) באמצעות החוט המולחם.
  6. לחלופין, התקן את ההתקן האצוטופלואידי ואת המיקרו-בקר במארז מודפס בתלת-ממד. קבצי CAD מסופקים ב-Splemental Files כדוגמאות. חוטים נוספים יכולים להיות מחוברים לפינים מיקרו-בקר אחרים כדי לשלוט מחוון LED חיצוני וכפתור הפעלה / כיבוי אם תרצה.
  7. חותכים קטעים בגודל 3-6 אינץ' של צינורות פלסטיק רכים מסוג Tygon PVC (מזהה בגודל 1/16 אינץ', מנת יתר של 1/8 אינץ') ודוחפים את הצינורות לתוך יציאות הכניסה והשקע. ייתכן שיהיה צורך לסובב את הצינורות תוך הפעלת לחץ עד שהוא מתאים לפתיחה. לחלופין, לאחר הכנסת הצינורות לכל יציאה, ניתן להחיל דבק בצומת כדי לחבר את ה- PDMS והצינורות יחד.
  8. להרכיב את המאגר microfluidic על פי הוראות היצרן.
  9. חותכים קטע בגודל 3-6 אינץ' של צינורות פלסטיק רכים מסוג Tygon PVC (מזהה בגודל 1/16 אינץ', מנת יתר של 1/8 אינץ') ודוחפים את הצינורות מעל צינורות הזיהוי בגודל 1/32 אינץ' מצינורות תפוקת המאגר המיקרופלואידי. לחלופין, לעטוף את הצומת עם סרט פרפין כדי למנוע דליפה.
  10. מלא מזרק בגודל 60 מ"ל באוויר הסביבה (אופציונלי, סנן את האוויר עם מסנן 0.2 מיקרומטר) וחבר אותו לצינורות PVC מסוג טייגון (מזהה 1/16 אינץ', מנת יתר של 1/8 אינץ') בצד המאגר המיקרופלואידי.
  11. הגדר את משאבת המזרק לקצב של 200 מ"ל / שעה כדי לדחוף את פתרונות סוכן ניגודיות התא / אולטרסאונד באמצעות המכשיר acoustofluidic בקצב זרימה נפחית של 50 מ"ל / שעה ולאסוף את הדגימות מן הפלט של המכשיר acoustofluidic לתוך צינור צנטריפוגה 50mL. לחלופינית, יש לשטוף את הערוץ לפני הטיפול האקוסטופולידי עם 15 מ"ל של 70% תמיסת אתנול כדי להגביר את הסטריליות של תעלות נוזלים. בנוסף, ערוצים ניתן לשטוף עם 15 מ"ל של מים deionized כדי להסיר אתנול שיורית במכשיר לפני שאיבת תאים דרך המערכת.

3. הכנת סוכני ניגודיות אולטרסאונד

הערה: סוכני ניגודיות אולטראסאונד לשפר באופן משמעותי את המסירה האצוטופלואידית של תרכובות מולקולריות על ידי הגדלה חולפת של רמבנות הסלולר הסמוכות19. משלוח מולקולרי מוגבל מאוד ללא סוכני ניגוד אולטרסאונד במערכת זו.

  1. הכן פתרון פוספוליפיד ב 20mL בווינאל נוצץ המכיל את התערובת הבאה:
    1. הוסיפו 25 מ"ג של 1,2-דיסטרויל-סן-גליצרי-3-פוספוזולין (DSPC).
    2. הוסיפו 11.6 מ"ג של 1,2-דיסטרויל-סן-גליצרי-3-אתילפוסכולין (DSEPC).
    3. הוסיפו 0.26 מ"ג של 1,2-דיסטרויל-סן-גליצרי-3-פוספוגליצרל (DSPG).
    4. יש להוסיף 0.88 מ"ג פוליאוקסיאתילן40 סטארט.
  2. מוסיפים כלורופורם עד שכל הפוספוליפידים מומסים (למשל, 3 מ"ל של כלורופורם).
  3. לאדות כלורופורם בייבוש במשך 48 שעות כדי ליצור סרט שומנים יבש (אידוי תחת ארגון או עם מאייד סיבובי יכול לשמש כדי להאיץ את תהליך הייבוש).
  4. Rehydrate סרט השומנים עם 10 מ"ל של תמיסת מלח סטרילית חוצץ פוספט (PBS).
  5. Sonicate פתרון השומנים במשך 3 דקות ב 40% משרעת כדי ליצור פתרון מיצלר קטי.
  6. לאחר sonication לאחסן את פתרון פוספוליפיד ב 2-6 °C (6 °F) עד חודש אחד.
  7. כדי להכין סוכני ניגודיות אולטרסאונד, להוסיף 200 μL של פתרון מיסלר קטי ו 600 μL של PBS סטרילי בקבוקון מחיצת זכוכית 2 מ"ל.
  8. אוטמים את הקרבון על ידי קיצור הכובע.
  9. השתמש מחט 1.5 " 20G כדי למלא את שטח ראש הוויאלי עם גז decafluorobutane עבור 30 s.
  10. Amalgamate את הנקיל עבור 45 s ב 4,350 סל"ד כדי ליצור סוכני ניגודיות אולטרסאונד מלא גז perfluorobutane.
  11. הוסף 25 μL של פתרון סוכן ניגודיות אולטרסאונד לכל 1 מ"ל של פתרון התא מיד לפני שאיבת סוכן ניגודיות משולבת / תערובת תא באמצעות המכשיר acoustofluidic. פתרון התא יכול להשתנות כרצונו על ידי המשתמש, אבל במחקרים שלנו הפתרון התא כלל תאי T ראשוניים בשלב 4.21, ותאי סרטן ריאות A549 בשלב 5.7, בהתאמה.

4. הכנת Tcells עיקרי

  1. לבודד תאים מונונוקלאריים בדם היקפי (PBMCs) מפתרונות דם שלמים ולאחסן ב -150 °C (50 °F). הפרדת הדרגתית בצפיפות המכילה מצע משמשת בדרך כלל להפרדת מחשבים אישיים מדם שלם24,25,26.
  2. להפשיר את הנקניקיון הקפוא באמבט מים 37 מעלות צלזיוס.
  3. לדלל PBMCs מופשר 1: 10 עם PBS בצינור צנטריפוגה 15mL. כל בקבוקון 1mL מכיל כ -10 מיליון PBMCs.
  4. מחשבי PBMCs מדוללים צנטריפוגה ב 580 x גרם במשך 11 דקות ב 4 °C (70 °F).
  5. שאף את supernatant ולהוסיף 13 מ"ל של MACs פועל חוצץ כדי resuspend התאים.
  6. ספר את מחשבי ה-PBMCs עם מונה תאים אוטומטי או המוציטומטר אוטומטי.
  7. צנטריפוגות PBMCs שוב ב 580 x g במשך 11 דקות ב 4 °C (70 °F) ושאף את supernatant.
  8. הוסף 40 μL של מאגר ריצה צונן לכל 10 מיליון מחשבים אישיים.
  9. כדי לבודד תאי T, להוסיף 10 μL של קוקטייל נוגדן ביוטין תא Pan לכל 10 מיליון PBMCs.
  10. בעדינות להסעיר את PBMCs ולאחסן את הפתרון ב 4 °C (5 דקות לכל 10 מיליון תאים.
  11. הוסף 30 μL של חוצץ פועל ו 20 μL של קוקטייל חיידקים תא T פאן לכל 10 מיליון PBMCs.
  12. מערבבים היטב את מחשבי ה-PBMCs והחרוזים ודגר במשך 15 דקות נוספות ב-4 מעלות צלזיוס.
  13. הוסף מאגר פועל כדי להגיע לאמצעי אחסון כולל של 500 μL.
  14. הפרד תאי T ראשיים עם מכשיר מיון מגנטי זמין מסחרית באמצעות ההגדרה "מרוקן הפרדה" בהתאם לפרוטוקול היצרן. שלב זה אמור להניב בין 5-10 מיליון תאי T לאחר מיון תאים.
  15. ספירת תאי T באמצעות מונה תאים אוטומטי או המוציטומטר.
  16. לדלל תאי T ב 10 מ"ל של PBS סטרילי וצנטריפוגה ב 580 x גרם במשך 10 דקות ב 4 °C (70 °F) כדי כדורי התאים.
  17. שאפו את תאי ה-T הסופר-טבעיים והמתנדפים מחדש ב-1 מ"ל של PBS.
  18. ספירת תאי T באמצעות מונה תאים אוטומטי או המוציטומטר ו aliquot 1 מיליון / מ"ל לניסויים.
  19. הכן פתרון פלואורסצ'ין 1 מ"ג /מ"ל ב- PBS.
  20. הוסף 100 μL של פתרון פלואורסצאין 1 מ"ג / מ"ל לכל 1 מ"ל של פתרון תא T (ריכוז פלואורסצ'ין סופי = 100 מיקרוגרם / מ"ל) מיד לפני העיבוד.
  21. הוסף 25 μL של פתרון סוכן ניגודיות אולטרסאונד כפי שתואר בעבר בשלב 3.11.
  22. תהליך aliquots 1mL של תאים באמצעות המערכת האצוטופלוידית (ראה שלבים 2.10-2.11). שלב זה משפר את המסירה של פלואורסצ'ין לתאי T ראשוניים.
  23. מיד לאחר הטיפול, לשטוף תאים שלוש פעמים באמצעות צנטריפוגה ב 580 x גרם במשך 10 דקות עם 500 μL של PBS כדי להסיר פלואורסצין חוץ תאי. תאים צריכים להיות שטף בתוך 10 דקות לאחר הוספת פתרון פלואורסצ'ין.
  24. לאחר שלב הכביסה הסופי, resuspend תאים ב 250 μL של PBS ולמדוד פלואורסצנטיות על cytometer זרימה.

5. הכנת תאי סרטן ריאות A549

  1. תרבות A549 (אפיתל מבסאלי אנושי אדנו-קרצינומי) בתאים במדיה DMEM מלאה (סרום בקר עוברי 10%, 1% פניצילין/סטרפטומיצין) ב-37 °C (5% CO2 בבקבוק תרבית רקמות שטוחה.
  2. קציר תאי A549 כאשר הם מגיעים 70-90% השפעה. שאפו מדיה מהבקבוק ושטפו את התאים פעם אחת עם PBS כדי להסיר חלבונים בסרום.
  3. הוסף טריפסין (0.25%) EDTA לבקבוקון ודגרה במשך 5 דקות ב 37 °C (57 °F). טריפסין הוא אנזים עיכול שגורם לתאים להתנתק מפני השטח התחתונים של בקבוקון תרבית הרקמה.
  4. העבר פתרון טריפסין לצינור צנטריפוגה 15mL ולנטרל אותו על ידי הוספת מדיה DMEM מלאה ביחס של 1:3.
  5. גלולה את התאים באמצעות צנטריפוגה ב 1,500 x גרם במשך 5 דקות ב 4 °C (70 °F).
  6. שאפו את supernatant ו resuspend הכדור בריכוז של 100,000 /mL בתמיסת PBS המכיל 200 mM trehalose ב 15 מ"ל בפלה חרוטית 15 מ"ל.
  7. הוסף 25 μL של פתרון סוכן ניגודיות אולטרסאונד כפי שתואר בעבר בשלב 3.11.
  8. תהליך aliquots 1mL של תאים באמצעות המערכת האצוטופלוידית (ראה שלבים 2.10-2.11). שלב זה משפר את המסירה של trehalose לתוך תאי סרטן ריאות A549.
  9. מיד לאחר הטיפול, לשטוף תאים שלוש פעמים באמצעות צנטריפוגה עם 500 μL של PBS כדי להסיר trehalose חוץ תאי. תאים יש לשטוף בתוך 10 דקות לאחר הוספת פתרון trehalose.
  10. לאחר שלב הכביסה הסופי, respend תאים ב 100 μL של PBS.
  11. הוסף 11 μL של פתרון Triton X-100 1% לתאי ליזה ולשחרר trehalose תאי.
  12. מערבולת ל-15 מעלות, ואז דגירה למשך 30 דקות בטמפרטורת החדר.
  13. מערבולת שוב עבור 15 s, ולאחר מכן למדוד ריכוז trehalose באמצעות בדיקת trehalose זמין מסחרית בעקבות המלצת היצרן.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

תמונה של המערכת האקוסטופולידית המורכבת בתוך מארז מודפס בתלת-ממד מוצגת באיור 1. פרוטוקול זה מייצר מערכת acoustofluidic שניתן להשתמש בה כדי לשפר את המסירה המולקולרית התאית בקווי תאים מרובים באמצעות סוכני ניגודיות אולטרסאונד.

איור 2   מדגים משלוח תאי משופר של תרכובת פלואורסצנטית, פלואורסצ'ין, לתאי T אנושיים ראשוניים עם טיפול אצוטופלואידי בהשוואה לקבוצת ביקורת לא מטופלת (p<0.05, n = 3/group). תאי T הושעו בריכוז של 1 מיליון /מ"ל ב- PBS עם פתרון פלואורסצין 100 מיקרוגרם / מ"ל ופתרון סוכן ניגודיות אולטרסאונד 25 μL / mL, והתערובת הועברה דרך המכשיר האקוסטופולידי לטיפול באולטרסאונד. אספקת פלואורסצין תאית וכימות התא נמדדו עם ציטומטריית זרימה לאחר שטיפת תאים באמצעות צנטריפוגה כדי להסיר פלואורסצין חוץ תאי. תאי T בקבוצת הביקורת שלא טופלה הושעו גם ב 1 מיליון / מ"ל ב- PBS עם פתרון פלואורסצין 100 מיקרוגרם / mL, אך פתרון סוכן ניגודיות אולטרסאונד לא נוספה ותאים לא הועברו דרך המכשיר האצוטופלואידי. עוצמת הפלואורסצנטיות של תאי T גדלה פי 5 לאחר טיפול אצוטופלואידי ביחס לעוצמת הפלואורסצנטיות של תאי T בקבוצת הביקורת הלא מטופלת, מה שמצביע על אספקה משופרת של פלואורסצין. הכדאיות של התא ירדה מעט לאחר טיפול אצוטופלואידי אך נשארה מעל 80% (p<0.05, n = 3 / קבוצה).

איור 3 מדגים משלוח תאי משופר של תרכובת משמרת, trehalose, לתאי קרצינומה אנושיים A549 ריאות עם טיפול אצוטופלואידי בהשוואה לזרימה לבד (ללא סוכני ניגודיות אולטרסאונד או חשיפה לאולטרה סאונד) בהשוואה לתאים בקבוצת הביקורת הלא מטופלת (ANOVA p<0.05, n = 3 /group). תאי A549 הושעו בריכוז של 100,000/מ"ל ב- PBS עם פתרון טרהלוז 200 מ"מ ופתרון סוכן ניגודיות אולטרסאונד 25 μL / mL, והתערובת הועברה דרך המכשיר האצוטופלואידי לטיפול אולטרסאונד. A549 תאים בקבוצות הביקורת ("זרימה בלבד" ו "אין טיפול") הושעו גם ב 100,000 /mL ב PBS עם 200 mM trehalose, אבל פתרון סוכן ניגוד אולטרסאונד לא נוספה ותאים לא נחשפו לטיפול אולטרסאונד. טרהלוז תאי היה מנוטרל באמצעות ערכת טיפול בטרהלוז ונורמל לקבוצת הביקורת שלא טופלה. הכדאיות של התא נמדדה עם צ'ייס כחול טריפן. לא היה הבדל סטטיסטי ביכולת התאים בין קבוצות (n = 3-7 /קבוצה).

Figure 1
איור 1:תמונה של מערכת האקוסטופולידית. מערכת הזרימה האקוסטופולידית מכילה תא זרימה מבוסס PDMS עם מתמר PZT משולב המונע על ידי מיקרו-בקר. מארז מודפס בתלת-ממד עם מחוון LED ולחצן הפעלה/כיבוי הן תכונות נוספות אופציונליות. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.

Figure 2
איור 2: טיפול אצוטופלוידי משפר את אספקת ה-fluorescein לתאי T אנושיים. (A)עוצמת הפלואורסצנטיות בתאי T ראשוניים גדלה לאחר טיפול אצוטופלואידי עם פלואורסצ'ין בהשוואה לקבוצת הביקורת הלא מטופלת (ללא אצוטופלואידיקה וללא מיקרו-יבלים) (p<0.05, n = 3/group). (B)הכדאיות התא ירדה מעט לאחר טיפול אצוטופלואידי אך נשארה מעל 80% כפי שנמדד על ידי cytometry זרימה (p<0.05, n = 3 / קבוצה). (C)היסטוגרמה ציטומטריית זרימה מייצגת המצביעה על פלואורסצנטיות גבוהה יותר בקבוצת הטיפול האקוסטופולידית. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.

Figure 3
איור 3: טיפול אצוטופלואידי משפר אתאספקתה-t rehalose לתאי סרטן ריאות אנושיים. (A) ספיגתTrehalose גדלה בתאי קרצינומת ריאות A549 בהשוואה לזרימה בלבד (ללא אולטרסאונד וללא מיקרו-יבלים) וקבוצת הביקורת הלא מטופלת (ANOVA p<0.05, n = 3/group). (B)הכדאיות התא נשאר מעל 90% לאחר טיפול acoustofluidic כפי שנמדד על ידי נסייפון כחול (n = 3-7 / קבוצה). אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.

קבצים משלימים. נא לחץ כאן כדי להוריד קובץ זה. 

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

פרוטוקול זה מתאר את ההרכבה והתפעול של מערכת אצוטופלוידית בעלות נמוכה אשר משפרת את המסירה התאית של biomolecules עבור יישומי מחקר. ישנם מספר גורמים חשובים שיש לקחת בחשבון בעת הרכבה והפעלה של מערכת זו. המכשיר acoustofluidic הוא מפוברק PDMS, שהוא חומר תואם ביולוגית שניתן לעצב בקלות עם מידות ערוץעקביות 27. ערוצי המכשיר ניתן לשטוף עם 15 מ"ל של 70% פתרון אתנול לפני עיבוד אצוטופלואידי על מנת להגביר את הסטריליות בעת עבודה עם תאים בתרבית. לאחר ניקוי אתנול, 15 מ"ל של מים deionized יכול לשמש לשטוף את המכשיר כדי להסיר אתנול שיורית מן הערוצים לפני הוספת פתרונות התא. ערוצי אצוטופלואידים קטנים יכולים בקלות להיחסם על ידי פסולת או אגרגטים של תאים, מה שהופך את זה למגבלה לשימוש התכוף של המכשיר. שטיפה יסודית של הערוצים בין כל מדגם תסייע במניעת בעיות בחסימת ערוץ. בנוסף, ניתן לפברק התקני PDMS מרובים בכל אצווה, כך שניתן יהיה להחליף התקנים במהירות במידת הצורך. עבור יישומים מבוססי אולטרסאונד, חשוב לייצר מכשירי PDMS עם עובי עקבי, כמו הבדלים בעובי PDMS יכול להשפיע על לחצי אולטרסאונד בתוך הערוצים הנוזליים. גלי אולטרסאונד מתפשטים ברציפות דרך המכשיר וגלים משודרים אינטראקציה עם גלים משתקפים כדי ליצור דפוסי גל אקוסטי עומדים כי הם רגישים מאוד להבדלים בעובי PDMS17. עובי PDMS נקבע בעיקר על ידי כמות PDMS שנוספה לתבנית (שלב 1.7) ופרוטוקול זה מניב עובי PDMS של 3.5 מ"מ.

תדר הפלט המרבי של המיקרו-בקר (8 מגה-הרץ) נבחר כדי לייצר את אורך הגל האקוסטי הקטן ביותר בתוך הערוץ הנוזלי. פלט המיקרו-בקר הוא בדרך כלל גל מרובע, אך מדידות אוסצילוסקופ גילו כי הפלט ב- 8 מגה-הרץ הופך לדומה יותר לצורת גל סינוסואידית עקב מגבלות קצב רדומות. מגבלה של מערכת זו היא כי יציאת המתח המרבית של microcontroller הוא 5V ומגבר RF חיצוני נדרש אם יציאות מתח גבוה יותר הרצויות. תפוקת הלחץ בשדה החופשי של המתמר במערכת זו הייתה 18 kPa ב 1 ס"מ כפי שנמדד עם הידרופון מחט (דיוק אקוסטיקה, דורצ'סטר, בריטניה). למרות לחץ זה הוא נמוך יחסית, גלים עומדים בתוך הערוצים יכול להגביר את הלחצים האקוסטיים אשר דגימות חשופים כפי שהם עוברים דרך קרן אולטרסאונד.

סוכני ניגודיות אולטראסאונד משמשים גרעין cavitation אקוסטי בתוך הערוצים acoustofluidic אשר משפר את המסירה של biomolecules על פני קרום התא28,29. פרוטוקול זה מתאר סינתזה של microbubbles מלא גז perfluorocarbon encapsulated על ידי קרום פוספוליפיד קטיקטי. כפי שתואר בעבר, ניסוח זה מורכב microbubbles בעיקר בין 1-3 מיקרומטר בקוטר30. המשטח הטעון באופן חיובי של microbubbles מושך אותם לכיוון קרום התא טעון שלילית, אשר מגביר את ההספקה המולקולרית בתיווך sonoporation כאשר microbubbles ותאים נמצאים בסמיכות. הריכוז של microbubbles בתמיסת התא הוא גורם קריטי שיכול להשפיע על היעילות של מסירה מולקולרית ואת הכדאיות התא לאחר טיפול acoustofluidic, ואת ריכוז microbubble אופטימלי עשוי להיות ספציפי לכל סוג תא 19. הריכוז של microbubbles מלא גז עם קליפת שומנים יכול להקטין עם הזמן לאחר סינתזה ולכן סוכני ניגוד אולטרסאונד יש להשתמש בתוך כמה שעות לאחר הסינתזה.

הדגמנו משלוח של תרכובת פלואורסצנטית (פלואורסצאין) לתאי T אנושיים ראשוניים שאינם מופעלים באמצעות מערכת האקוסטופולידית בפרוטוקול זה. חשוב לציין כי מצב ההפעלה של תאי T אנושיים ראשוניים עשוי להשפיע על היעילות של משלוח מולקולרי תאי. תכונות הפלואורסצנטיות של פלואורסצין מאפשרות זיהוי תאי רגיש עם ציטומטריית זרימה, אך תרכובות מסיסות אחרות יכולות גם להיות מועברות לתאים באמצעות מערכת אצוטופלוידית זו. לדוגמה, הדגמנו משלוח אצוטופלואידי של טרהלוז לתאי סרטן ריאות אנושיים. אספקה אצטופולידית של טרהלוז לתאים עשויה לאפשר התאוששות מוגברת לאחר אחסון קפוא ויבש, אשר יכול להיות השפעות משמעותיות על מגוון של יישומי ביו-רפואה ומחקר 19.

אספקה אצוטופלוידית של ביומולקולות אחרות, כגון חלבונים או פלסמידים DNA, אפשרית גם, אם כי מגבלה של מערכת זו היא כי היעילות של משלוח מולקולרי עשוי להיות נמוך יותר עבור תרכובות גדולות יותר18,31. אופטימיזציה של קצב זרימה acoustofluidic, ריכוזים של סוכני ניגוד אולטרסאונד, ריכוזי תאים, ומדיה עשוי להיות נחוץ למסירה של biomolecules אחרים. בנוסף, הפרמטרים האופטימליים עשויים להשתנות בין סוגי תאים שונים עקב גורמים כגון קוטר התא, מורפולוגיה, תכונות ממברנה, פנוטיפ.

ניתן להרכיב ולהפעיל בקלות את המערכת האקוסטופולידית המתוארת בפרוטוקול זה ובעלות נמוכה יחסית. בנוסף, מערכת זו יכולה להיות מותאמת אישית עבור יישומים אחרים על ידי חיבור מקורות איתות אחרים או מתמרים אולטרסאונד כדי ליצור לחצי פלט ספציפיים ותדרים32,33,34. בנוסף, ניתן להחליף את מערכת משאבת המזרק המתוארת בפרוטוקול זה במשאבות פריסטרליות במידת הרצון. בקצב זרימה של 50 מ"ל / שעה זמן המגורים של תאים בתוך קרן האולטרסאונד כשהם עוברים דרך הערוץ האצוטופלואידי הוא כ 1 s, אבל זמן מגורים זה ניתן לשנות לפי הצורך עבור יישומים ספציפיים על ידי התאמת קצב זרימת הנוזלים.

שלא כמו טכניקות transfection נפוצות אחרות, biomolecules ניתן להעביר לתאים בתוך דקות במקום שעות ומערכת זו אינה דורשת ציוד מיוחד ויקר. בנוסף, מערכת זו תואמת למגוון רחב של מדיה נפוצה של תרבית תאים או מאגרים אחרים. לסיכום, מערכת אצוטופלוידית זו מאפשרת אספקה מהירה של ביומולקולים לתאים, אשר עשוי להיות שימושי עבור מגוון רחב של יישומי מחקר.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

מחברים שותפים MAM ו JAK להחזיק בעלות DesiCorp אשר עשוי להפיק תועלת כספית ממוצרים הקשורים למחקר זה.

Acknowledgments

עבודה זו נתמכה בחלקה במימון הקרן הלאומית למדע (#1827521, #1827521, #1450370) ומכוני הבריאות הלאומיים (U01HL127518). שירותי פוטוליתוגרפיה ניתנו על ידי המרכז הטכנולוגי מיקרו / ננו של אוניברסיטת לואיוויל.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Fabrication of Acoustofluidic Device
DOW SYLGARD 184 SILICONE ENCAPSULANT CLEAR 0.5 KG KIT Ellsworth Adhesives 4019862 (SKU) https://www.ellsworth.com/products/by-market/consumer-products/encapsulants/silicone/dow-sylgard-184-silicone-encapsulant-clear-0.5-kg-kit/
Harris Uni-Core (2.5 mm) Electron Microscopy Sciences 69039-25
Microfluidic Reservoir for 15 mL Falcon Tube - S (2/4 port) Darwin Microfluidics LVF-KPT-S-2 (SKU) https://darwin-microfluidics.com/products/15-ml-falcon-tube-microfluidic-reservoir-s-2-4-port
Microscope Slide VWR 16004-430 https://us.vwr.com/store/product/4646174/vwr-vistavisiontm-microscope-slides-plain-and-frosted-premium
trichlorosilane Gelest 105732-02-3 (Cas. No.) Chlorosilane is very hazaradous and flammable. Exposure causes severe burns and eye damage. 
Tygon PVC soft plastic tubing (1/16" ID, 1/8" OD) McMaster-Carr 5233K51 (Part #) https://www.mcmaster.com/pvc-tubing/soft-tubing-for-air-and-water/
Assembly of Acoustofluidic System
Arduino Uno Arduino 7630049200050 (Barcode) https://store.arduino.cc/usa/arduino-uno-rev3
Preparation of Ultrasound Contrast Agents
1,2-distearoyl-sn-glycero-3-ethylphosphocholine (DSEPC) Avanti Lipids 890703P-25mg (SKU) https://avantilipids.com/product/890703
1,2-distearoyl-sn-glycero-3-phosphocholine (DSPC) Avanti Lipids 850365P-25mg (SKU) https://avantilipids.com/product/850365
1,2-distearoyl-sn-glycero-3-phosphoglycerol (DSPG) Avanti Lipids 840465P-25mg (SKU) https://avantilipids.com/product/840465
APF-140HP (decafluorobutate gas) FlouroMed 355-25-9 (Cas No.) http://www.fluoromed.com/products/perfluorodecalin/
DB-338 Amalgamators  COXO https://www.coxotec.com/coxo/db-338-amalgamators/
polyoxyethylene 40 stearate  Sigma-Aldrich P3440-250G (SKU) https://www.sigmaaldrich.com/catalog/product/sigma/p3440?lang=en&region=US&gclid=
Cj0KCQjwy8f6BRC7ARIsAPIXOjjj
Jh_151mYVEUyLZRavt4re9YQMLS
vID64X-1KbO3LUKGjVUwb
PDAaAqvOEALw_wcB
Q125 Sonicator Qsonica Q125-110 (Ref.) https://www.sonicator.com/products/q125-sonicator?_pos=1&_sid=406df3776&_ss=r
Preparation of Primarty T Cells
autoMACs running buffer Miltenyi Biotec 130-091-221 (Order No.) https://www.miltenyibiotec.com/US-en/products/automacs-running-buffer-macs-separation-buffer.html#gref
Pan T Cell Isolation Kit, human (Pan T-Cell Biotin Antibody Cocktail & Pan T-Cell MicroBead Cocktail)  Miltenyi Biotec 130-096-535 (Order No.) https://www.miltenyibiotec.com/US-en/products/pan-t-cell-isolation-kit-human.html#130-096-535
magnetic cell sorter (autoMACS Pro Separator) Miltenyi Biotec 130-092-545 (Order No.) https://www.miltenyibiotec.com/US-en/products/automacs-pro-separator-starter-kit.html#130-092-545
Preparation of A549 Lung Cancer Cells
Trehalose Assay Kit  Megazyme K-TREH (Cat. No.) https://www.megazyme.com/trehalose-assay-kit
Trypan blue (0.4% in aqueous solution Ready-to-Use, sterile) VWR 97063-702 (Cat. No.) https://us.vwr.com/store/product/7437427/trypan-blue-0-4-in-aqueous-solution-ready-to-use-sterile

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Gardlik, R., et al. Vectors and delivery systems in gene therapy. Medical Science Monitor. 11 (4), 110-121 (2005).
  2. Wahlers, A., et al. Influence of multiplicity of infection and protein stability on retroviral vector-mediated gene expression in hematopoietic cells. Gene Therapy. 8 (6), 477-486 (2001).
  3. Nayerossadat, N., Maedeh, T., Ali, P. A. Viral and nonviral delivery systems for gene delivery. Advanced Biomedical Research. 1, 27 (2012).
  4. Chen, C., Smye, S. W., Robinson, M. P., Evans, J. A. Membrane electroporation theories: a review. Medical & Biological Engineering & Computing. 44 (1-2), 5-14 (2006).
  5. Gehl, J. Electroporation: theory and methods, perspectives for drug delivery, gene therapy and research. Acta Physiologica Scandinavica. 177 (4), 437-447 (2003).
  6. Lin, Y. C., Li, M., Wu, C. C. Simulation and experimental demonstration of the electric field assisted electroporation microchip for in vitro gene delivery enhancement. Lab on a Chip. 4 (2), 104-108 (2004).
  7. Sugar, I. P., Neumann, E. Stochastic model for electric field-induced membrane pores. Electroporation. Biophysical Chemistry. 19 (3), 211-225 (1984).
  8. Weaver, J. C. Electroporation: a general phenomenon for manipulating cells and tissues. Journal of Cellular Biochemistry. 51 (4), 426-435 (1993).
  9. Hashimoto, M., Takemoto, T. Electroporation enables the efficient mRNA delivery into the mouse zygotes and facilitates CRISPR/Cas9-based genome editing. Scientific Reports. 5, 11315 (2015).
  10. Klibanov, A. L. Microbubble contrast agents: targeted ultrasound imaging and ultrasound-assisted drug-delivery applications. Investigative Radiology. 41 (3), 354-362 (2006).
  11. Klibanov, A. L., Shevchenko, T. I., Raju, B. I., Seip, R., Chin, C. T. Ultrasound-triggered release of materials entrapped in microbubble-liposome constructs: a tool for targeted drug delivery. Journal of Controlled Release. 148 (1), 13-17 (2010).
  12. Fan, Z., Kumon, R. E., Deng, C. X. Mechanisms of microbubble-facilitated sonoporation for drug and gene delivery. Therapeutic Delivery. 5 (4), 467-486 (2014).
  13. Secomski, W., et al. In vitro ultrasound experiments: Standing wave and multiple reflections influence on the outcome. Ultrasonics. 77, 203-213 (2017).
  14. Gedge, M., Hill, M. Acoustofluidics 17: theory and applications of surface acoustic wave devices for particle manipulation. Lab on a Chip. 12 (17), 2998-3007 (2012).
  15. Shi, J., et al. Acoustic tweezers: patterning cells and microparticles using standing surface acoustic waves (SSAW). Lab on a Chip. 9 (20), 2890-2895 (2009).
  16. Shi, J., Huang, H., Stratton, Z., Huang, Y., Huang, T. J. Continuous particle separation in a microfluidic channel via standing surface acoustic waves (SSAW). Lab on a Chip. 9 (23), 3354-3359 (2009).
  17. Shields, C. W. t, Cruz, D. F., Ohiri, K. A., Yellen, B. B., Lopez, G. P. Fabrication and operation of acoustofluidic devices supporting bulk acoustic standing waves for sheathless focusing of particles. Journal of Visualized Experiments. (109), e53861 (2016).
  18. Belling, J. N., et al. Acoustofluidic sonoporation for gene delivery to human hematopoietic stem and progenitor cells. Proceedings of the National Academy of Sciences. 117 (20), 10976-10982 (2020).
  19. Centner, C. S., et al. Ultrasound-induced molecular delivery to erythrocytes using a microfluidic system. Biomicrofluidics. 14 (2), 024114 (2020).
  20. Qi, J., Ding, C., Jiang, X., Gao, Y. Advances in developing CAR T-cell therapy for HIV cure. Frontiers in Immunology. 11, 361 (2020).
  21. Annesley, C. E., Summers, C., Ceppi, F., Gardner, R. A. The evolution and future of CAR T cells for B-Cell Acute lymphoblastic leukemia. Clinical Pharmacology & Therapeutics. 103 (4), 591-598 (2018).
  22. Hand, S. C., Menze, M. A. Molecular approaches for improving desiccation tolerance: insights from the brine shrimp Artemia franciscana. Planta. 242 (2), 379-388 (2015).
  23. Zhang, M., et al. Freeze-drying of mammalian cells using trehalose: preservation of DNA integrity. Scientific Reports. 7 (1), 6198 (2017).
  24. Grievink, H. W., Luisman, T., Kluft, C., Moerland, M., Malone, K. E. Comparison of three isolation techniques for human peripheral blood mononuclear cells: Cell recovery and viability, population composition, and cell functionality. Biopreserv Biobank. 14 (5), 410-415 (2016).
  25. Jaatinen, T., Laine, J. Isolation of mononuclear cells from human cord blood by Ficoll-Paque density gradient. Current Protocol in Stem Cell Biology. , Chapter 2, Unit 2A 1 (2007).
  26. Ulmer, A. J., Scholz, W., Ernst, M., Brandt, E., Flad, H. D. Isolation and subfractionation of human peripheral blood mononuclear cells (PBMC) by density gradient centrifugation on Percoll. Immunobiology. 166 (3), 238-250 (1984).
  27. Halldorsson, S., Lucumi, E., Gomez-Sjoberg, R., Fleming, R. M. T. Advantages and challenges of microfluidic cell culture in polydimethylsiloxane devices. Biosensors and Bioelectronics. 63, 218-231 (2015).
  28. Helfield, B., Chen, X., Watkins, S. C., Villanueva, F. S. Biophysical insight into mechanisms of sonoporation. Proceedings of the National Academy of Sciences. 113 (36), 9983-9988 (2016).
  29. Hu, Y., Wan, J. M., Yu, A. C. Membrane perforation and recovery dynamics in microbubble-mediated sonoporation. Ultrasound in Medicine and Biology. 39 (12), 2393-2405 (2013).
  30. Kopechek, J. A., et al. Ultrasound targeted microbubble destruction-mediated delivery of a transcription factor decoy inhibits STAT3 signaling and tumor growth. Theranostics. 5 (12), 1378-1387 (2015).
  31. Bhutto, D. F., et al. Effect of molecular weight on sonoporation-mediated uptake in human cells. Ultrasound in Medical Biology. 44 (12), 2662-2672 (2018).
  32. Forbes, M. M., Steinberg, R. L., O'Brien, W. D. Frequency-dependent evaluation of the role of definity in producing sonoporation of Chinese hamster ovary cells. Journal of Ultrasound in Medicine. 30 (1), 61-69 (2011).
  33. Helfield, B., Chen, X., Watkins, S. C., Villanueva, F. S. Biophysical insight into mechanisms of sonoporation. Proceedings of National Academy of Science U. S. A. 113 (36), 9983-9988 (2016).
  34. Miller, D. L., Bao, S., Morris, J. E. Sonoporation of cultured cells in the rotating tube exposure system. Ultrasound in Medical Biology. 25 (1), 143-149 (1999).

Tags

ביו-הנדסה גיליון 167 אצוטו-פלודיטיקה אולטרסאונד חומרי ניגודיות משלוח מולקולרי סנופורציה תאים
הרכבה ותפעול של מכשיר אצוטופלואידי לאספקה משופרת של תרכובות מולקולריות לתאים
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Centner, C. S., Murphy, E. M.,… More

Centner, C. S., Murphy, E. M., Stamp, B. F., Priddy, M. C., Moore, J. T., Bates, P. J., Menze, M. A., Yaddanapudi, K., Kopechek, J. A. Assembly and Operation of an Acoustofluidic Device for Enhanced Delivery of Molecular Compounds to Cells. J. Vis. Exp. (167), e62035, doi:10.3791/62035 (2021).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter