Ce protocole décrit l’assemblage et le fonctionnement d’un dispositif acoustofluidic à faible coût pour la livraison moléculaire rapide aux cellules par l’intermédiaire du sonoporation induit par des agents de contraste d’ultrason.
L’administration intracellulaire efficace de biomolécules est nécessaire pour un large éventail de recherches biomédicales et d’applications thérapeutiques cellulaires. la sonoporation Ultrason-négociée est une technique émergente pour la livraison intracellulaire rapide des biomolécules. La sonoporation se produit lorsque la cavitation de microbulles remplies de gaz forme des pores transitoires dans les membranes cellulaires voisines, ce qui permet une absorption rapide des biomolécules du fluide environnant. Les techniques actuelles de sonoporation in vitro des cellules en suspension sont limitées par un débit lent, une variabilité des conditions d’exposition aux ultrasons pour chaque cellule et un coût élevé. Pour remédier à ces limitations, un dispositif acoustofluidique à faible coût a été développé qui intègre un transducteur à ultrasons dans un dispositif fluidique à base de PDMS pour induire une sonoporation cohérente des cellules lorsqu’elles circulent à travers les canaux en combinaison avec des agents de contraste à ultrasons. L’appareil est fabriqué à l’aide de techniques de photolithographie standard pour produire la puce fluidique à base de PDMS. Un transducteur de disque piézo-ultrasonore est fixé à l’appareil et piloté par un microcontrôleur. L’assemblage peut être intégré à l’intérieur d’un boîtier imprimé en 3D pour une protection supplémentaire. Les cellules et les microbulles sont poussées à travers l’appareil à l’aide d’une pompe à seringue ou d’une pompe péristaltique connectée à un tube en PVC. L’administration améliorée des biomolécules aux lymphocytes T humains et aux cellules cancéreuses du poumon est démontrée avec ce système acoustofluidique. Comparé aux approches de traitement en vrac, ce système acoustofluidique augmente le débit et réduit la variabilité, ce qui peut améliorer les méthodes de traitement cellulaire pour les applications de recherche biomédicale et la fabrication de thérapies cellulaires.
Des plateformes virales et non virales ont été utilisées pour améliorer la livraison moléculaire aux cellules. L’administration virale (transduction) est une technique couramment utilisée dans les thérapies cellulaires nécessitant une modification génomique. Les limites de l’administration virale comprennent la mutagenèse insertionnelle potentielle, la capacité transgénique limitée et la multiplicité indésirable de l’infection1,2. Par conséquent, des techniques d’administration moléculaire non virale sont en cours de développement pour un large éventail d’applications biomédicales et de recherche. Les techniques courantes comprennent la mécanique, l’électricité, l’hydrodynamique ou l’utilisation de l’énergie laser pour améliorer l’absorption des biomolécules dans les cellules 3. L’électroporation est une plate-forme d’administration moléculaire non virale couramment utilisée qui a la capacité d’induire une perforation transitoire dans la membrane plasmique pour l’administration intracellulaire de composés moléculaires4,5,6,7,8,9. Cependant, la perforation transitoire de la membrane plasmique est un processus stochastique et l’absorption moléculaire par électroporation dépend généralement de la diffusion passive à travers les pores transitoires de la membrane4,7,8.
Une méthode alternative est l’utilisation de l’ultrason pour la livraison moléculaire intracellulaire améliorée par l’intermédiaire de la cavitation des agents de contraste d’ultrason (c.-à-d., microbulles remplies de gaz). La cavitation par microbulles induit des effets de microstreaming dans les milieux environnants qui peuvent provoquer une perforation transitoire des membranes plasmiques voisines (« sonoporation ») permettant une absorption intracellulaire rapide des biomolécules via des mécanismes de transport passifs ou actifs10,11,12. La sonoporation est une technique efficace pour l’administration moléculaire rapide aux cellules, mais cette approche nécessite souvent un équipement coûteux et des méthodes de traitement en vrac qui sont limitées par un débit plus faible et une plus grande variabilité dans les conditions d’exposition aux ultrasons13. Pour remédier à ces limitations, des dispositifs acoustofluidiques, qui permettent une sonoporation cohérente des cellules en suspension, sont actuellement en cours de développement.
L’acoustofluidique est un domaine en expansion qui intègre les technologies ultrasonores et microfluidiques pour une grande variété d’applications. Cette approche a déjà été utilisée pour la séparation des particules en appliquant une énergie ultrasonore continue pour induire des ondes acoustiques stationnaires dans les canaux fluidiques14,15,16,17. Les particules sont triées vers différentes parties du dispositif en fonction d’une variété de propriétés telles que la taille des particules, la densité et la compressibilité par rapport au milieu16. Des technologies acoustofluidiques sont également en cours de développement pour permettre une livraison moléculaire rapide à une variété de types de cellules pour des applications de recherche et la fabrication de thérapies cellulaires18. Récemment, nous avons démontré l’administration moléculaire améliorée aux érythrocytes utilisant un dispositif acoustofluidic PDMS-basé19. Dans la plate-forme acoustofluidique, la dynamique des cellules et des microbulles peut être manipulée pour induire des interactions physiques qui permettent une meilleure administration des biomolécules. L’efficacité et la cohérence de l’administration moléculaire intracellulaire peuvent potentiellement être augmentées en optimisant la distance entre les cellules et les microbulles.
Une application importante pour la sonoporation à médiation acoustofluidique implique le transport des biomolécules dans les cellules T humaines primaires. Les immunothérapies basées sur le transfert de lymphocytes T adoptifs, telles que la thérapie à base de lymphocytes T du récepteur de l’antigène chimérique (CAR T), émergent rapidement pour le traitement de diverses maladies, y compris le cancer et les virus tels que le VIH20. La thérapie de CAR T a été particulièrement efficace dans les patients pédiatriques de leucémie lymphoblastique aiguë (LAL), avec des taux complets de remise de 70-90%21. Cependant, la fabrication de lymphocytes T pour ces thérapies dépend généralement de la transduction virale qui est limitée par la mutagenèse insertionnelle potentielle, les longs délais de traitement et les défis liés à la fourniture de biomolécules non génétiques telles que des protéines ou de petites molécules1. Les méthodes d’administration moléculaire à médiation acoustofluidique peuvent potentiellement surmonter ces limites et améliorer la fabrication de thérapies à base de cellules T.
Une autre application importante pour la sonoporation à médiation acoustofluidique implique l’administration intracellulaire de composés conservateurs, tels que le tréhalose, qui protègent les cellules pendant la congélation et la dessiccation. Le tréhalose est produit par certains organismes dans la nature et les aide à tolérer la congélation et la dessiccation en protégeant leurs membranes cellulaires22,23. Cependant, le tréhalose n’est pas produit par les cellules de mammifères et est imperméable aux membranes cellulaires des mammifères. Par conséquent, des techniques efficaces de livraison moléculaire, telles que la sonoporation, sont nécessaires afin d’atteindre des niveaux intracellulaires suffisants de tréhalose requis pour protéger les membranes cellulaires internes. Cette approche est actuellement en cours de développement pour la préservation à sec de divers types de cellules.
Ce protocole fournit une description détaillée de l’assemblage et du fonctionnement d’un système acoustofluidique relativement peu coûteux piloté par un microcontrôleur. Les agents de contraste d’ultrason sont utilisés pour induire la sonoporation dans les canaux fluidiques et permettre la livraison moléculaire rapide à divers types de cellules, y compris les cellules T et les cellules cancéreuses. Ce système acoustofluidique peut être utilisé pour une variété d’applications de recherche et peut également être utile comme système prototype pour évaluer les méthodes de sonoporation pour améliorer les processus de fabrication de thérapie cellulaire.
Ce protocole décrit l’assemblage et le fonctionnement d’un système acoustofluidique à faible coût qui améliore l’administration intracellulaire de biomolécules pour des applications de recherche. Il existe plusieurs facteurs importants à prendre en compte lors de l’assemblage et de l’exploitation de ce système. Le dispositif acoustofluidique est fabriqué en PDMS, qui est un matériau biocompatible qui peut facilement être moulé avec des dimensions de canal cohérentes27. Les c…
The authors have nothing to disclose.
Ce travail a été soutenu en partie par le financement de la National Science Foundation (#1827521, #1827521, #1450370) et des National Institutes of Health (U01HL127518). Les services de photolithographie ont été fournis par le Centre de micro/nanotechnologie de l’Université de Louisville.
Fabrication of Acoustofluidic Device | |||
DOW SYLGARD 184 SILICONE ENCAPSULANT CLEAR 0.5 KG KIT | Ellsworth Adhesives | 4019862 (SKU) | https://www.ellsworth.com/products/by-market/consumer-products/encapsulants/silicone/dow-sylgard-184-silicone-encapsulant-clear-0.5-kg-kit/ |
Harris Uni-Core (2.5 mm) | Electron Microscopy Sciences | 69039-25 | |
Microfluidic Reservoir for 15 mL Falcon Tube – S (2/4 port) | Darwin Microfluidics | LVF-KPT-S-2 (SKU) | https://darwin-microfluidics.com/products/15-ml-falcon-tube-microfluidic-reservoir-s-2-4-port |
Microscope Slide | VWR | 16004-430 | https://us.vwr.com/store/product/4646174/vwr-vistavisiontm-microscope-slides-plain-and-frosted-premium |
trichlorosilane | Gelest | 105732-02-3 (Cas. No.) | Chlorosilane is very hazaradous and flammable. Exposure causes severe burns and eye damage. |
Tygon PVC soft plastic tubing (1/16" ID, 1/8" OD) | McMaster-Carr | 5233K51 (Part #) | https://www.mcmaster.com/pvc-tubing/soft-tubing-for-air-and-water/ |
Assembly of Acoustofluidic System | |||
Arduino Uno | Arduino | 7630049200050 (Barcode) | https://store.arduino.cc/usa/arduino-uno-rev3 |
Preparation of Ultrasound Contrast Agents | |||
1,2-distearoyl-sn-glycero-3-ethylphosphocholine (DSEPC) | Avanti Lipids | 890703P-25mg (SKU) | https://avantilipids.com/product/890703 |
1,2-distearoyl-sn-glycero-3-phosphocholine (DSPC) | Avanti Lipids | 850365P-25mg (SKU) | https://avantilipids.com/product/850365 |
1,2-distearoyl-sn-glycero-3-phosphoglycerol (DSPG) | Avanti Lipids | 840465P-25mg (SKU) | https://avantilipids.com/product/840465 |
APF-140HP (decafluorobutate gas) | FlouroMed | 355-25-9 (Cas No.) | http://www.fluoromed.com/products/perfluorodecalin/ |
DB-338 Amalgamators | COXO | https://www.coxotec.com/coxo/db-338-amalgamators/ | |
polyoxyethylene 40 stearate | Sigma-Aldrich | P3440-250G (SKU) | https://www.sigmaaldrich.com/catalog/product/sigma/p3440?lang=en®ion=US&gclid= Cj0KCQjwy8f6BRC7ARIsAPIXOjjj Jh_151mYVEUyLZRavt4re9YQMLS vID64X-1KbO3LUKGjVUwb PDAaAqvOEALw_wcB |
Q125 Sonicator | Qsonica | Q125-110 (Ref.) | https://www.sonicator.com/products/q125-sonicator?_pos=1&_sid=406df3776&_ss=r |
Preparation of Primarty T Cells | |||
autoMACs running buffer | Miltenyi Biotec | 130-091-221 (Order No.) | https://www.miltenyibiotec.com/US-en/products/automacs-running-buffer-macs-separation-buffer.html#gref |
Pan T Cell Isolation Kit, human (Pan T-Cell Biotin Antibody Cocktail & Pan T-Cell MicroBead Cocktail) | Miltenyi Biotec | 130-096-535 (Order No.) | https://www.miltenyibiotec.com/US-en/products/pan-t-cell-isolation-kit-human.html#130-096-535 |
magnetic cell sorter (autoMACS Pro Separator) | Miltenyi Biotec | 130-092-545 (Order No.) | https://www.miltenyibiotec.com/US-en/products/automacs-pro-separator-starter-kit.html#130-092-545 |
Preparation of A549 Lung Cancer Cells | |||
Trehalose Assay Kit | Megazyme | K-TREH (Cat. No.) | https://www.megazyme.com/trehalose-assay-kit |
Trypan blue (0.4% in aqueous solution Ready-to-Use, sterile) | VWR | 97063-702 (Cat. No.) | https://us.vwr.com/store/product/7437427/trypan-blue-0-4-in-aqueous-solution-ready-to-use-sterile |