Aufbau und Betrieb eines akustofluidischen Geräts zur verbesserten Abgabe molekularer Verbindungen an Zellen
Summary
Dieses Protokoll beschreibt den Aufbau und Betrieb eines kostengünstigen akustofluidischen Geräts für die schnelle molekulare Abgabe an Zellen durch Sonoporation, die durch Ultraschallkontrastmittel induziert wird.
Abstract
Eine effiziente intrazelluläre Abgabe von Biomolekülen ist für ein breites Spektrum biomedizinischer Forschung und zellbasierter therapeutischer Anwendungen erforderlich. Die ultraschallvermittelte Sonoporation ist eine neue Technik zur schnellen intrazellulären Abgabe von Biomolekülen. Sonoporation tritt auf, wenn kavitation von gasgefüllten Mikroblasen transiente Poren in nahe gelegenen Zellmembranen bildet, was eine schnelle Aufnahme von Biomolekülen aus der umgebenden Flüssigkeit ermöglicht. Aktuelle Techniken zur In-vitro-Sonoporation von Zellen in Suspension sind durch langsamen Durchsatz, Variabilität der Ultraschall-Expositionsbedingungen für jede Zelle und hohe Kosten begrenzt. Um diese Einschränkungen zu beheben, wurde ein kostengünstiges akustofluidisches Gerät entwickelt, das einen Ultraschallwandler in ein PDMS-basiertes fluidisches Gerät integriert, um eine konsistente Sonogenierung der Zellen zu induzieren, während sie in Kombination mit Ultraschallkontrastmitteln durch die Kanäle fließen. Das Gerät wird mit Standard-Photolithographietechniken hergestellt, um den PDMS-basierten fluidischen Chip herzustellen. Ein Ultraschall-Piezoscheibenaufnehmer ist am Gerät befestigt und wird von einem Mikrocontroller angetrieben. Die Baugruppe kann für zusätzlichen Schutz in ein 3D-gedrucktes Gehäuse integriert werden. Zellen und Mikroblasen werden mit einer Spritzenpumpe oder einer peristaltischen Pumpe, die mit PVC-Schläuchen verbunden ist, durch das Gerät geschoben. Eine verbesserte Abgabe von Biomolekülen an menschliche T-Zellen und Lungenkrebszellen wird mit diesem akustofluidischen System nachgewiesen. Im Vergleich zu Massenbehandlungsansätzen erhöht dieses akustofluidische System den Durchsatz und reduziert die Variabilität, was die Zellverarbeitungsmethoden für biomedizinische Forschungsanwendungen und die Herstellung zellbasierter Therapeutika verbessern kann.
Introduction
Virale und nicht-virale Plattformen wurden verwendet, um die molekulare Abgabe an Zellen zu verbessern. Virale Abgabe (Transduktion) ist eine gängige Technik, die in zellbasierten Therapien verwendet wird, die eine genomische Modifikation erfordern. Zu den Einschränkungen bei der viralen Verabreichung gehören eine potenzielle insertionelle Mutagenese, eine begrenzte transgene Kapazität und eine unerwünschte Vielzahl von Infektionen1,2. Daher sind nicht-virale molekulare Verabreichungstechniken für ein breites Spektrum von biomedizinischen und Forschungsanwendungen in der Entwicklung. Zu den gängigen Techniken gehören mechanische, elektrische, hydrodynamische oder die Verwendung laserbasierter Energie, um die Aufnahme von Biomolekülen in Zellen zu verbessern 3. Elektroporation ist eine häufig verwendete nicht-virale molekulare Verabreichungsplattform, die die Fähigkeit hat, eine transiente Perforation in der Plasmamembran für die intrazelluläreAbgabemolekularer Verbindungen 4,5,6,7 ,8,9zuinduzieren. Die transiente Perforation der Plasmamembran ist jedoch ein stochastischer Prozess und die molekulare Aufnahme durch Elektroporation ist im Allgemeinen abhängig von der passiven Diffusion über die transienten Membranporen4,7,8.
Eine alternative Methode ist die Verwendung von Ultraschall zur verbesserten intrazellulären molekularen Abgabe durch Kavitation von Ultraschallkontrastmitteln (d.h. gasgefüllte Mikroblasen). Mikroblasenkavitation induziert Mikrostromeffekte in den umgebenden Medien, die eine vorübergehende Perforation benachbarter Plasmamembranen (“Sonoporation”) verursachenkönnen,die eine schnelle intrazelluläre Aufnahme von Biomolekülen über passive oder aktive Transportmechanismen ermöglicht10,11,12. Sonoporation ist eine effektive Technik für die schnelle molekulare Abgabe an Zellen, aber dieser Ansatz erfordert oft teure Geräte und Massenbehandlungsmethoden, die durch einen geringeren Durchsatz und eine höhere Variabilität der Ultraschallexpositionsbedingungen begrenzt sind13. Um diese Einschränkungen zu beheben, werden derzeit akustofluidische Geräte entwickelt, die eine konsistente Sonoporation von Zellen in Suspension ermöglichen.
Akustofluidik ist ein expandierendes Feld, das Ultraschall- und Mikrofluidik-Technologien für eine Vielzahl von Anwendungen integriert. Dieser Ansatz wurde bisher zur Partikeltrennung durch Anwendung kontinuierlicher Ultraschallenergie verwendet, um stehende akustische Wellen innerhalb der fluidischen Kanäle14,15,16,17zu induzieren. Partikel werden basierend auf einer Vielzahl von Eigenschaften wie Partikelgröße, Dichte und Kompressibilität relativ zum Medium16in verschiedene Teile des Geräts sortiert. Akustofluidische Technologien sind ebenfalls in der Entwicklung, um eine schnelle molekulare Verabreichung an eine Vielzahl von Zelltypen für Forschungsanwendungen und die Herstellung von Zelltherapien zu ermöglichen18. Vor kurzem haben wir eine verbesserte molekulare Abgabe an Erythrozyten mit einem PDMS-basierten akustofluidischen Gerät19demonstriert. In der akustofluidischen Plattform können Zell- und Mikroblasendynamiken manipuliert werden, um physikalische Wechselwirkungen zu induzieren, die eine verbesserte Abgabe von Biomolekülen ermöglichen. Die Effizienz und Konsistenz der intrazellulären molekularen Abgabe kann möglicherweise durch die Optimierung des Abstands zwischen Zellen und Mikroblasen erhöht werden.
Eine wichtige Anwendung für die akustofluidisch vermittelte Sonoporation ist der Transport von Biomolekülen in primäre menschliche T-Zellen. Immuntherapien, die auf adoptivem T-Zell-Transfer basieren, wie die Chimeric Antigen Receptor T Cell (CAR T) -Therapie, entwickeln sich schnell zur Behandlung verschiedener Krankheiten, einschließlich Krebs und Viren wie HIV20. Die CAR-T-Therapie war besonders wirksam bei Patienten mit akuter lymphatischer Leukämie (ALL) bei Kindern mit vollständigen Remissionsraten von 70-90%21. Die Herstellung von T-Zellen für diese Therapien hängt jedoch im Allgemeinen von der viralen Transduktion ab, die durch eine potenzielle insertionelle Mutagenese, lange Verarbeitungszeiten und Herausforderungen bei der Bereitstellung nicht-genetischer Biomoleküle wie Proteine oder kleine Moleküle begrenzt ist1. Akustofluidisch vermittelte molekulare Verabreichungsmethoden können diese Einschränkungen möglicherweise überwinden und die Herstellung von T-Zell-Therapien verbessern.
Eine weitere wichtige Anwendung für die akustofluidisch vermittelte Sonoporation ist die intrazelluläre Abgabe von Konservierungsmitteln wie Trehalose, die die Zellen beim Einfrieren und Austränken schützen. Trehalose wird von einigen Organismen in der Natur produziert und hilft ihnen, Das einfrieren und austränken zutolerieren,indem sie ihre Zellmembranen schützen22,23. Trehalose wird jedoch nicht von Säugetierzellen produziert und ist für Säugetierzellmembranen undurchlässig. Daher sind wirksame molekulare Verabreichungstechniken wie sonoporation notwendig, um ausreichende intrazelluläre Trehalosespiegel zu erreichen, die zum Schutz der inneren Zellmembranen erforderlich sind. Dieser Ansatz befindet sich derzeit in der Entwicklung zur Trockenkonservierung verschiedener Zelltypen.
Dieses Protokoll bietet eine detaillierte Beschreibung der Montage und des Betriebs eines relativ kostengünstigen akustofluidischen Systems, das von einem Mikrocontroller angetrieben wird. Ultraschallkontrastmittel werden verwendet, um Sonoporation innerhalb der fluidischen Kanäle zu induzieren und eine schnelle molekulare Abgabe an verschiedene Zelltypen, einschließlich T-Zellen und Krebszellen, zu ermöglichen. Dieses akustofluidische System kann für eine Vielzahl von Forschungsanwendungen verwendet werden und kann auch als Prototypsystem zur Bewertung von Sonoporationsmethoden für verbesserte Zelltherapie-Herstellungsprozesse nützlich sein.
Protocol
Representative Results
Discussion
Dieses Protokoll beschreibt den Aufbau und Betrieb eines kostengünstigen akustofluidischen Systems, das die intrazelluläre Abgabe von Biomolekülen für Forschungsanwendungen verbessert. Es gibt mehrere wichtige Faktoren, die bei der Montage und dem Betrieb dieses Systems zu berücksichtigen sind. Das akustofluidische Gerät wird in PDMS hergestellt, einem biokompatiblen Material, das leicht mit konsistenten Kanalabmessungen geformt werden kann27. Die Gerätekanäle können vor der akustofluidis…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Diese Arbeit wurde teilweise durch Mittel der National Science Foundation (#1827521, #1827521, #1450370) und der National Institutes of Health (U01HL127518) unterstützt. Photolithographie-Dienstleistungen wurden vom Micro/ Nano Technology Center der University of Louisville angeboten.
Materials
| Fabrication of Acoustofluidic Device | |||
| DOW SYLGARD 184 SILICONE ENCAPSULANT CLEAR 0.5 KG KIT | Ellsworth Adhesives | 4019862 (SKU) | https://www.ellsworth.com/products/by-market/consumer-products/encapsulants/silicone/dow-sylgard-184-silicone-encapsulant-clear-0.5-kg-kit/ |
| Harris Uni-Core (2.5 mm) | Electron Microscopy Sciences | 69039-25 | |
| Microfluidic Reservoir for 15 mL Falcon Tube – S (2/4 port) | Darwin Microfluidics | LVF-KPT-S-2 (SKU) | https://darwin-microfluidics.com/products/15-ml-falcon-tube-microfluidic-reservoir-s-2-4-port |
| Microscope Slide | VWR | 16004-430 | https://us.vwr.com/store/product/4646174/vwr-vistavisiontm-microscope-slides-plain-and-frosted-premium |
| trichlorosilane | Gelest | 105732-02-3 (Cas. No.) | Chlorosilane is very hazaradous and flammable. Exposure causes severe burns and eye damage. |
| Tygon PVC soft plastic tubing (1/16" ID, 1/8" OD) | McMaster-Carr | 5233K51 (Part #) | https://www.mcmaster.com/pvc-tubing/soft-tubing-for-air-and-water/ |
| Assembly of Acoustofluidic System | |||
| Arduino Uno | Arduino | 7630049200050 (Barcode) | https://store.arduino.cc/usa/arduino-uno-rev3 |
| Preparation of Ultrasound Contrast Agents | |||
| 1,2-distearoyl-sn-glycero-3-ethylphosphocholine (DSEPC) | Avanti Lipids | 890703P-25mg (SKU) | https://avantilipids.com/product/890703 |
| 1,2-distearoyl-sn-glycero-3-phosphocholine (DSPC) | Avanti Lipids | 850365P-25mg (SKU) | https://avantilipids.com/product/850365 |
| 1,2-distearoyl-sn-glycero-3-phosphoglycerol (DSPG) | Avanti Lipids | 840465P-25mg (SKU) | https://avantilipids.com/product/840465 |
| APF-140HP (decafluorobutate gas) | FlouroMed | 355-25-9 (Cas No.) | http://www.fluoromed.com/products/perfluorodecalin/ |
| DB-338 Amalgamators | COXO | https://www.coxotec.com/coxo/db-338-amalgamators/ | |
| polyoxyethylene 40 stearate | Sigma-Aldrich | P3440-250G (SKU) | https://www.sigmaaldrich.com/catalog/product/sigma/p3440?lang=en®ion=US&gclid= Cj0KCQjwy8f6BRC7ARIsAPIXOjjj Jh_151mYVEUyLZRavt4re9YQMLS vID64X-1KbO3LUKGjVUwb PDAaAqvOEALw_wcB |
| Q125 Sonicator | Qsonica | Q125-110 (Ref.) | https://www.sonicator.com/products/q125-sonicator?_pos=1&_sid=406df3776&_ss=r |
| Preparation of Primarty T Cells | |||
| autoMACs running buffer | Miltenyi Biotec | 130-091-221 (Order No.) | https://www.miltenyibiotec.com/US-en/products/automacs-running-buffer-macs-separation-buffer.html#gref |
| Pan T Cell Isolation Kit, human (Pan T-Cell Biotin Antibody Cocktail & Pan T-Cell MicroBead Cocktail) | Miltenyi Biotec | 130-096-535 (Order No.) | https://www.miltenyibiotec.com/US-en/products/pan-t-cell-isolation-kit-human.html#130-096-535 |
| magnetic cell sorter (autoMACS Pro Separator) | Miltenyi Biotec | 130-092-545 (Order No.) | https://www.miltenyibiotec.com/US-en/products/automacs-pro-separator-starter-kit.html#130-092-545 |
| Preparation of A549 Lung Cancer Cells | |||
| Trehalose Assay Kit | Megazyme | K-TREH (Cat. No.) | https://www.megazyme.com/trehalose-assay-kit |
| Trypan blue (0.4% in aqueous solution Ready-to-Use, sterile) | VWR | 97063-702 (Cat. No.) | https://us.vwr.com/store/product/7437427/trypan-blue-0-4-in-aqueous-solution-ready-to-use-sterile |
References
- Gardlik, R., et al. Vectors and delivery systems in gene therapy. Medical Science Monitor. 11 (4), 110-121 (2005).
- Wahlers, A., et al. Influence of multiplicity of infection and protein stability on retroviral vector-mediated gene expression in hematopoietic cells. Gene Therapy. 8 (6), 477-486 (2001).
- Nayerossadat, N., Maedeh, T., Ali, P. A. Viral and nonviral delivery systems for gene delivery. Advanced Biomedical Research. 1, 27 (2012).
- Chen, C., Smye, S. W., Robinson, M. P., Evans, J. A. Membrane electroporation theories: a review. Medical & Biological Engineering & Computing. 44 (1-2), 5-14 (2006).
- Gehl, J. Electroporation: theory and methods, perspectives for drug delivery, gene therapy and research. Acta Physiologica Scandinavica. 177 (4), 437-447 (2003).
- Lin, Y. C., Li, M., Wu, C. C. Simulation and experimental demonstration of the electric field assisted electroporation microchip for in vitro gene delivery enhancement. Lab on a Chip. 4 (2), 104-108 (2004).
- Sugar, I. P., Neumann, E. Stochastic model for electric field-induced membrane pores. Electroporation. Biophysical Chemistry. 19 (3), 211-225 (1984).
- Weaver, J. C. Electroporation: a general phenomenon for manipulating cells and tissues. Journal of Cellular Biochemistry. 51 (4), 426-435 (1993).
- Hashimoto, M., Takemoto, T. Electroporation enables the efficient mRNA delivery into the mouse zygotes and facilitates CRISPR/Cas9-based genome editing. Scientific Reports. 5, 11315 (2015).
- Klibanov, A. L. Microbubble contrast agents: targeted ultrasound imaging and ultrasound-assisted drug-delivery applications. Investigative Radiology. 41 (3), 354-362 (2006).
- Klibanov, A. L., Shevchenko, T. I., Raju, B. I., Seip, R., Chin, C. T. Ultrasound-triggered release of materials entrapped in microbubble-liposome constructs: a tool for targeted drug delivery. Journal of Controlled Release. 148 (1), 13-17 (2010).
- Fan, Z., Kumon, R. E., Deng, C. X. Mechanisms of microbubble-facilitated sonoporation for drug and gene delivery. Therapeutic Delivery. 5 (4), 467-486 (2014).
- Secomski, W., et al. In vitro ultrasound experiments: Standing wave and multiple reflections influence on the outcome. Ultrasonics. 77, 203-213 (2017).
- Gedge, M., Hill, M. Acoustofluidics 17: theory and applications of surface acoustic wave devices for particle manipulation. Lab on a Chip. 12 (17), 2998-3007 (2012).
- Shi, J., et al. Acoustic tweezers: patterning cells and microparticles using standing surface acoustic waves (SSAW). Lab on a Chip. 9 (20), 2890-2895 (2009).
- Shi, J., Huang, H., Stratton, Z., Huang, Y., Huang, T. J. Continuous particle separation in a microfluidic channel via standing surface acoustic waves (SSAW). Lab on a Chip. 9 (23), 3354-3359 (2009).
- Shields, C. W. t., Cruz, D. F., Ohiri, K. A., Yellen, B. B., Lopez, G. P. Fabrication and operation of acoustofluidic devices supporting bulk acoustic standing waves for sheathless focusing of particles. Journal of Visualized Experiments. (109), e53861 (2016).
- Belling, J. N., et al. Acoustofluidic sonoporation for gene delivery to human hematopoietic stem and progenitor cells. Proceedings of the National Academy of Sciences. 117 (20), 10976-10982 (2020).
- Centner, C. S., et al. Ultrasound-induced molecular delivery to erythrocytes using a microfluidic system. Biomicrofluidics. 14 (2), 024114 (2020).
- Qi, J., Ding, C., Jiang, X., Gao, Y. Advances in developing CAR T-cell therapy for HIV cure. Frontiers in Immunology. 11, 361 (2020).
- Annesley, C. E., Summers, C., Ceppi, F., Gardner, R. A. The evolution and future of CAR T cells for B-Cell Acute lymphoblastic leukemia. Clinical Pharmacology & Therapeutics. 103 (4), 591-598 (2018).
- Hand, S. C., Menze, M. A. Molecular approaches for improving desiccation tolerance: insights from the brine shrimp Artemia franciscana. Planta. 242 (2), 379-388 (2015).
- Zhang, M., et al. Freeze-drying of mammalian cells using trehalose: preservation of DNA integrity. Scientific Reports. 7 (1), 6198 (2017).
- Grievink, H. W., Luisman, T., Kluft, C., Moerland, M., Malone, K. E. Comparison of three isolation techniques for human peripheral blood mononuclear cells: Cell recovery and viability, population composition, and cell functionality. Biopreserv Biobank. 14 (5), 410-415 (2016).
- Jaatinen, T., Laine, J. Isolation of mononuclear cells from human cord blood by Ficoll-Paque density gradient. Current Protocol in Stem Cell Biology. , (2007).
- Ulmer, A. J., Scholz, W., Ernst, M., Brandt, E., Flad, H. D. Isolation and subfractionation of human peripheral blood mononuclear cells (PBMC) by density gradient centrifugation on Percoll. Immunobiology. 166 (3), 238-250 (1984).
- Halldorsson, S., Lucumi, E., Gomez-Sjoberg, R., Fleming, R. M. T. Advantages and challenges of microfluidic cell culture in polydimethylsiloxane devices. Biosensors and Bioelectronics. 63, 218-231 (2015).
- Helfield, B., Chen, X., Watkins, S. C., Villanueva, F. S. Biophysical insight into mechanisms of sonoporation. Proceedings of the National Academy of Sciences. 113 (36), 9983-9988 (2016).
- Hu, Y., Wan, J. M., Yu, A. C. Membrane perforation and recovery dynamics in microbubble-mediated sonoporation. Ultrasound in Medicine and Biology. 39 (12), 2393-2405 (2013).
- Kopechek, J. A., et al. Ultrasound targeted microbubble destruction-mediated delivery of a transcription factor decoy inhibits STAT3 signaling and tumor growth. Theranostics. 5 (12), 1378-1387 (2015).
- Bhutto, D. F., et al. Effect of molecular weight on sonoporation-mediated uptake in human cells. Ultrasound in Medical Biology. 44 (12), 2662-2672 (2018).
- Forbes, M. M., Steinberg, R. L., O’Brien, W. D. Frequency-dependent evaluation of the role of definity in producing sonoporation of Chinese hamster ovary cells. Journal of Ultrasound in Medicine. 30 (1), 61-69 (2011).
- Helfield, B., Chen, X., Watkins, S. C., Villanueva, F. S. Biophysical insight into mechanisms of sonoporation. Proceedings of National Academy of Science U. S. A. 113 (36), 9983-9988 (2016).
- Miller, D. L., Bao, S., Morris, J. E. Sonoporation of cultured cells in the rotating tube exposure system. Ultrasound in Medical Biology. 25 (1), 143-149 (1999).
