פרוטוקול זה מתאר את ההרכבה והתפעול של מכשיר אצוטופלואידי בעלות נמוכה עבור משלוח מולקולרי מהיר לתאים באמצעות sonoporation המושרה על ידי סוכני ניגוד אולטרסאונד.
אספקה תאית יעילה של ביומולקולים נדרשת למגוון רחב של מחקר ביו-רפואי ויישומים טיפוליים מבוססי תאים. sonoporation בתיווך אולטראסאונד היא טכניקה מתפתחת עבור משלוח תאי מהיר של biomolecules. Sonoporation מתרחשת כאשר cavitation של microbubbles מלא גז יוצר נקבוביות חולפות בקרומי התא הסמוכים, המאפשר ספיגה מהירה של biomolecules מהנוזל שמסביב. הטכניקות הנוכחיות עבור in vitro sonoporation של תאים בהשעיה מוגבלים על ידי תפוקה איטית, שונות בתנאי החשיפה אולטרסאונד עבור כל תא, ועלות גבוהה. כדי להתמודד עם מגבלות אלה, מכשיר acoustofluidic בעלות נמוכה פותח אשר משלב מתמר אולטרסאונד במכשיר נוזלים מבוסס PDMS כדי לגרום sonoporation עקבי של תאים כפי שהם זורמים דרך הערוצים בשילוב עם סוכני ניגוד אולטרסאונד. המכשיר מפוברק בטכניקות פוטוליתוגרפיה סטנדרטיות כדי לייצר את השבב הנוזלי מבוסס PDMS. מתמר דיסק פיזו אולטרסאונד מחובר למכשיר ומונע על ידי מיקרו-בקר. ניתן לשלב את ההרכבה בתוך מארז מודפס בתלת-ממד להגנה נוספת. תאים ומיקרו-חלוקים נדחפים דרך המכשיר באמצעות משאבת מזרק או משאבה פרייסטלטית המחוברת לצינורות PVC. משלוח משופר של biomolecules לתאי T אנושיים ותאי סרטן ריאות הוא הודגם עם מערכת אצוטופלואידית זו. בהשוואה לגישות טיפול בתפזורת, מערכת אצוטופלוידית זו מגדילה את התפוקה ומפחיתה את השונות, אשר יכול לשפר את שיטות עיבוד התא עבור יישומי מחקר ביו-רפואי וייצור של טיפולים מבוססי תאים.
פלטפורמות ויראליות ולא ויראליות נוצלו כדי לשפר את המסירה המולקולרית לתאים. משלוח ויראלי (transduction) היא טכניקה נפוצה המשמשת 0000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000 מגבלות עם משלוח ויראלי כוללות mutagenesis החדרה פוטנציאלית, יכולת מהונדסת מוגבלת, ריבוי לא רצוי של זיהום1,2. לכן, טכניקות משלוח מולקולרי לא ויראליות נמצאות בפיתוח עבור מגוון רחב של יישומי ביו-רפואה ומחקר. טכניקות נפוצות כוללות מכני, חשמלי, הידרודינמי, או שימוש באנרגיה מבוססת לייזר כדי לשפר את ספיגת הביומולקולים לתאים 3. Electroporation היא פלטפורמת משלוח מולקולרית לא ויראלית נפוצה אשר יש את היכולת לגרום ניקוב חולף בקרום הפלזמה עבור משלוח תאי שלתרכובות מולקולריות 4,5,6,7,8,9. עם זאת, ניקוב חולף של קרום הפלזמה הוא תהליך סטוכסטי וספיגה מולקולרית באמצעות אלקטרופורציה תלויה בדרך כלל דיפוזיה פסיבית על פני נקבוביות הממברנה החולפת4,7,8.
שיטה חלופית היא ניצול של אולטרסאונד עבור משלוח מולקולרי תאי משופר באמצעות cavitation של סוכני ניגוד אולטרסאונד (כלומר, microbubbles מלא גז). cavitation microbubble גורם אפקטים microstreaming במדיה שמסביב אשר יכול לגרום ניקוב חולף של ממברנות פלזמה סמוכות (“sonoporation”) המאפשר ספיגה תאית מהירה של biomolecules באמצעות מנגנוני תחבורה פסיביים או פעילים10,11,12. Sonoporation היא טכניקה יעילה עבור משלוח מולקולרי מהיר לתאים, אבל גישה זו דורשת לעתים קרובות ציוד יקר ושיטות טיפול בתפזורת אשר מוגבלים על ידי תפוקה נמוכה יותר ושונות גבוהה יותר בתנאיחשיפה אולטרסאונד 13. כדי להתמודד עם מגבלות אלה, התקנים acoustofluidic, המאפשרים sonoporation עקבי של תאים בהשעיה, נמצאים כעת בפיתוח.
Acoustofluidics הוא תחום מתרחב המשלב אולטרסאונד וטכנולוגיות microfluidic עבור מגוון רחב של יישומים. גישה זו שימשה בעבר להפרדת חלקיקים על ידי החלת אנרגיית אולטרסאונד רציפה כדי לגרום לגלים אקוסטיים עומדים בתוך הערוצים הנוזליים14,15,16,17. חלקיקים ממוינים לחלקים שונים של המכשיר בהתבסס על מגוון מאפיינים כגון גודל החלקיקים, צפיפות ודחיסה ביחס למדיום16. טכנולוגיות Acoustofluidic נמצאים גם בפיתוח כדי לאפשר אספקה מולקולרית מהירה למגוון סוגי תאים עבור יישומי מחקר וייצור של שירותי תאים18. לאחרונה, הדגמנו משלוח מולקולרי משופר לאריתרוציטים באמצעות מכשיר אצוטופלואידי מבוסס PDMS19. בפלטפורמה האקוסטופולידית, ניתן לתמרן את הדינמיקה של התא והמיקרו-יבלים כדי לגרום לאינטראקציות פיזיות המאפשרות אספקה משופרת של ביומולקולים. היעילות והעקביות של אספקה מולקולרית תאית יכולות להיות מוגברות על ידי אופטימיזציה של המרחק בין תאים ומיקרו-יבלים.
יישום חשוב אחד עבור sonoporation בתיווך אצוטופלואידי כרוך הובלה של biomolecules לתוך תאי T אנושיים ראשוניים. אימונותרפיות המבוססות על העברת תאי T מאמצת, כגון טיפול בתא T קולטן אנטיגן כימרי (CAR T), מתעוררות במהירות לטיפול במחלות שונות, כולל סרטן ווירוסים כגון HIV20. טיפול CAR T היה יעיל במיוחד בחולי לוקמיה לימפובלסטית חריפה בילדים (ALL), עם שיעורי הפוגה מלאה של 70-90%21. עם זאת, ייצור תאי T לטיפולים אלה תלוי בדרך כלל בהתמרות ויראלית המוגבלת על ידי מוטגנזה פוטנציאלית, זמני עיבוד ארוכים ואתגרים של אספקת ביומולקולות לא גנטיות כגון חלבונים או מולקולות קטנות1. שיטות אספקה מולקולריות בתיווך אצטופולי יכול להתגבר על מגבלות אלה ולשפר את הייצור של טיפולים בתאי T.
יישום חשוב נוסף עבור sonoporation בתיווך אצוטופלואידי כרוך משלוח תאי של תרכובות משמרות, כגון trehalose, אשר להגן על תאים במהלך הקפאה וייבוש. Trehalose מיוצר על ידי כמה אורגניזמים בטבע ומסייע להם לסבול הקפאה וייבוש על ידי הגנה על הממברנות התאיות שלהם22,23. עם זאת, trehalose אינו מיוצר על ידי תאים יונקים והוא אטום קרום התא יונקים. לכן, טכניקות משלוח מולקולרי יעיל, כגון sonoporation, נחוצים על מנת להשיג רמות טרהלוז תאיות מספיק הנדרש כדי להגן על ממברנות תאיות פנימיות. גישה זו נמצאת כעת בפיתוח לשימור יבש של סוגי תאים שונים.
פרוטוקול זה מספק תיאור מפורט של ההרכבה וההפעלה של מערכת אקוסטופלואידית בעלות נמוכה יחסית המונעת על ידי מיקרו-בקר. סוכני ניגודיות אולטראסאונד מנוצלים כדי לגרום sonoporation בתוך הערוצים הנוזליים ולאפשר משלוח מולקולרי מהיר לסוגי תאים שונים, כולל תאי T ותאים סרטניים. מערכת אצוטופלוידית זו יכולה לשמש עבור מגוון יישומי מחקר, עשוי גם להיות שימושי כמערכת אב טיפוס להערכת שיטות sonoporation עבור תהליכי ייצור טיפול בתאים משופרים.
פרוטוקול זה מתאר את ההרכבה והתפעול של מערכת אצוטופלוידית בעלות נמוכה אשר משפרת את המסירה התאית של biomolecules עבור יישומי מחקר. ישנם מספר גורמים חשובים שיש לקחת בחשבון בעת הרכבה והפעלה של מערכת זו. המכשיר acoustofluidic הוא מפוברק PDMS, שהוא חומר תואם ביולוגית שניתן לעצב בקלות עם מידות ערוץעק?…
The authors have nothing to disclose.
עבודה זו נתמכה בחלקה במימון הקרן הלאומית למדע (#1827521, #1827521, #1450370) ומכוני הבריאות הלאומיים (U01HL127518). שירותי פוטוליתוגרפיה ניתנו על ידי המרכז הטכנולוגי מיקרו / ננו של אוניברסיטת לואיוויל.
Fabrication of Acoustofluidic Device | |||
DOW SYLGARD 184 SILICONE ENCAPSULANT CLEAR 0.5 KG KIT | Ellsworth Adhesives | 4019862 (SKU) | https://www.ellsworth.com/products/by-market/consumer-products/encapsulants/silicone/dow-sylgard-184-silicone-encapsulant-clear-0.5-kg-kit/ |
Harris Uni-Core (2.5 mm) | Electron Microscopy Sciences | 69039-25 | |
Microfluidic Reservoir for 15 mL Falcon Tube – S (2/4 port) | Darwin Microfluidics | LVF-KPT-S-2 (SKU) | https://darwin-microfluidics.com/products/15-ml-falcon-tube-microfluidic-reservoir-s-2-4-port |
Microscope Slide | VWR | 16004-430 | https://us.vwr.com/store/product/4646174/vwr-vistavisiontm-microscope-slides-plain-and-frosted-premium |
trichlorosilane | Gelest | 105732-02-3 (Cas. No.) | Chlorosilane is very hazaradous and flammable. Exposure causes severe burns and eye damage. |
Tygon PVC soft plastic tubing (1/16" ID, 1/8" OD) | McMaster-Carr | 5233K51 (Part #) | https://www.mcmaster.com/pvc-tubing/soft-tubing-for-air-and-water/ |
Assembly of Acoustofluidic System | |||
Arduino Uno | Arduino | 7630049200050 (Barcode) | https://store.arduino.cc/usa/arduino-uno-rev3 |
Preparation of Ultrasound Contrast Agents | |||
1,2-distearoyl-sn-glycero-3-ethylphosphocholine (DSEPC) | Avanti Lipids | 890703P-25mg (SKU) | https://avantilipids.com/product/890703 |
1,2-distearoyl-sn-glycero-3-phosphocholine (DSPC) | Avanti Lipids | 850365P-25mg (SKU) | https://avantilipids.com/product/850365 |
1,2-distearoyl-sn-glycero-3-phosphoglycerol (DSPG) | Avanti Lipids | 840465P-25mg (SKU) | https://avantilipids.com/product/840465 |
APF-140HP (decafluorobutate gas) | FlouroMed | 355-25-9 (Cas No.) | http://www.fluoromed.com/products/perfluorodecalin/ |
DB-338 Amalgamators | COXO | https://www.coxotec.com/coxo/db-338-amalgamators/ | |
polyoxyethylene 40 stearate | Sigma-Aldrich | P3440-250G (SKU) | https://www.sigmaaldrich.com/catalog/product/sigma/p3440?lang=en®ion=US&gclid= Cj0KCQjwy8f6BRC7ARIsAPIXOjjj Jh_151mYVEUyLZRavt4re9YQMLS vID64X-1KbO3LUKGjVUwb PDAaAqvOEALw_wcB |
Q125 Sonicator | Qsonica | Q125-110 (Ref.) | https://www.sonicator.com/products/q125-sonicator?_pos=1&_sid=406df3776&_ss=r |
Preparation of Primarty T Cells | |||
autoMACs running buffer | Miltenyi Biotec | 130-091-221 (Order No.) | https://www.miltenyibiotec.com/US-en/products/automacs-running-buffer-macs-separation-buffer.html#gref |
Pan T Cell Isolation Kit, human (Pan T-Cell Biotin Antibody Cocktail & Pan T-Cell MicroBead Cocktail) | Miltenyi Biotec | 130-096-535 (Order No.) | https://www.miltenyibiotec.com/US-en/products/pan-t-cell-isolation-kit-human.html#130-096-535 |
magnetic cell sorter (autoMACS Pro Separator) | Miltenyi Biotec | 130-092-545 (Order No.) | https://www.miltenyibiotec.com/US-en/products/automacs-pro-separator-starter-kit.html#130-092-545 |
Preparation of A549 Lung Cancer Cells | |||
Trehalose Assay Kit | Megazyme | K-TREH (Cat. No.) | https://www.megazyme.com/trehalose-assay-kit |
Trypan blue (0.4% in aqueous solution Ready-to-Use, sterile) | VWR | 97063-702 (Cat. No.) | https://us.vwr.com/store/product/7437427/trypan-blue-0-4-in-aqueous-solution-ready-to-use-sterile |