Summary
이 프로토콜은 초음파 조영제에 의해 유도된 초음파 조영제에 의해 유도된 초음파 포기화를 통해 세포에 급속한 분자 전달을 위한 저비용 acoustofluidic 장치의 조립 및 작동을 설명합니다.
Abstract
생체 분자의 효율적인 세포 내 전달은 광범위한 생체 의학 연구 및 세포 기반 치료 응용 분야에 필요합니다. 초음파 매개 초음파 매개 초음파 화는 생체 분자의 신속한 세포 내 전달을위한 새로운 기술입니다. 소공증은 가스로 채워진 마이크로 버블의 캐비테이션이 주변 세포막에서 일시적인 모공을 형성할 때 발생하므로 주변 유체에서 생체 분자를 빠르게 섭취할 수 있습니다. 현탁액에서 세포의 체외 초음파 화에 대한 현재 기술은 느린 처리량, 각 세포에 대한 초음파 노출 조건의 가변성 및 높은 비용에 의해 제한됩니다. 이러한 한계를 해결하기 위해 PDMS 기반 유체 장치에 초음파 트랜스듀서를 통합하여 초음파 조영제와 함께 채널을 통해 흐르는 세포의 일관된 초음파 포화를 유도하는 저비용 acoustofluidic 장치가 개발되었습니다. 이 장치는 PDMS 기반 유체 칩을 생산하기 위해 표준 포토리소그래피 기술을 사용하여 제조됩니다. 초음파 압압 디스크 트랜스듀서는 장치에 부착되어 마이크로 컨트롤러에 의해 구동됩니다. 어셈블리는 추가 보호를 위해 3D 프팅 케이스 내부에 통합할 수 있습니다. 세포와 마이크로버블은 PVC 튜빙에 연결된 주사기 펌프 또는 연동 펌프를 사용하여 장치를 통해 밀어낸다. 인간 T 세포및 폐암 세포에 생체 분자의 향상된 전달은 이 부동 유체 시스템으로 입증됩니다. 대량 처리 접근에 비해, 이 acoustofluidic 시스템은 처리량을 증가하고 가변성을 감소시켜 생물 의학 연구 응용 및 세포 기반 치료제 제조를 위한 세포 처리 방법을 향상시킬 수 있습니다.
Introduction
바이러스 성 및 비 바이러스 플랫폼은 세포에 분자 전달을 향상 시키기 위해 활용 되었습니다. 바이러스 성 전달 (트랜스듀션)은 게놈 변형을 요구하는 세포 기반 치료에 활용되는 일반적인 기술입니다. 바이러스 전달에 대한 제한은 잠재적인 삽입 돌연변이 발생, 제한된 형질 전환 능력 및 감염1,2의원치 않는 복합성을 포함한다. 따라서, 비 바이러스 성 분자 전달 기술은 광범위한 생체 의학 및 연구 응용 분야에 대한 개발 중이다. 일반적인 기술은 기계적, 전기적, 유체 역학, 또는 세포로 생체 분자의 섭취를 향상시키기 위해 레이저 기반 에너지의 사용을 포함한다 3. 전기포레이션은 일반적으로 사용되는 비바이러스 분자 전달 플랫폼으로, 분자 화합물4,5,6,7,8,9의세포내 전달을 위해 혈장 막에서 과도 천공을 유도할 수 있는 능력을 갖는다. 그러나, 플라즈마 멤브레인의 일시적인 천공은 전기포공을 통한 좌식 공정 및 분자 조리량은 일반적으로 과도 막 기공4,7,8을가로지르는 수동 확산에 의존한다.
대안적 방법은 초음파 조영제(즉, 가스가 채워진 마이크로버블)의 캐비테이션을 통한 세포내 분자 전달을 위한 초음파의 활용이다. 마이크로버블 캐비테이션은 주변 의 혈장 막("sonoporation")의 일시적인 천공을 유발할 수 있는 주변 매체에서 소류 효과를 유도하여 수동 또는 활성 운송메커니즘(10,11,12)을통해 생체 분자의 세포내 섭취를 급속히 허용한다. 초음파 증식은 세포에 대한 급속한 분자 전달을 위한 효과적인 기술이지만, 이러한 접근법은 종종 초음파 노출 조건에서 더 낮은 처리량과 높은 가변성에 의해 제한된 고가의 장비 및 대량 처리 방법이필요합니다(13) 이러한 한계를 해결하기 위해 현탁액에 있는 세포의 일관된 sonoporation를 가능하게 하는 acoustofluidic 장치는 현재 개발 중입니다.
Acoustofluidics는 다양한 응용 분야에 초음파 및 미세 유체 기술을 통합하는 확장 분야입니다. 이러한 접근법은 이전에 유체채널(14,15,16,17)내에서 서 있는 음향파를 유도하기 위해 연속 초음파 에너지를 적용하여 입자분리에사용되어 왔다. 입자는중간(16)에비해 입자 크기, 밀도 및 압축성 과 같은 다양한 특성에 따라 장치의 상이한 부분으로 정렬된다. 또한 Acoustofluidic 기술은 세포 치료제18의연구 응용 및 제조를 위한 다양한 세포 유형에 대한 신속한 분자 전달을 가능하게 하기 위해 개발 중이다. 최근에는 PDMS 기반 의 부동 유체장치(19)를사용하여 적혈구에 대한 향상된 분자 전달을 시연했다. 유동적인 플랫폼에서 세포 및 마이크로 버블 역학은 생체 분자의 향상된 전달을 가능하게 하는 물리적 상호 작용을 유도하기 위해 조작될 수 있습니다. 세포 내 분자 전달의 효율성과 일관성은 세포와 마이크로 버블 사이의 거리를 최적화하여 잠재적으로 증가 될 수 있습니다.
유동유체 중재 된 소공포화를위한 하나의 중요한 응용 프로그램은 1 차인간 T 세포로 생체 분자의 수송을 포함한다. 키메라 항원 수용체 T 세포(CAR T) 요법과 같은 입양 T 세포 전달에 기초한 면역요법은 HIV20과같은 암 및 바이러스를 포함한 다양한 질병의 치료를 위해 급속히 부상하고 있다. CAR T 요법은 소아 급성 림프구성 백혈병(ALL) 환자에서 특히 효과적이며, 70-90%21의완전한 완화율을 갖는다. 그러나, 이러한 치료법을 위한 T 세포 제조는 일반적으로 단백질 또는 소분자 와 같은 비유전적 생체분자를 전달하는 잠재적 인 삽입 돌연변이 발생, 긴 처리 시간 및 과제에 의해 제한된 바이러스 성전염에 의존한다. 수학적 유체 매개 분자 전달 방법은 잠재적으로 이러한 한계를 극복하고 T 세포 치료의 제조를 향상시킬 수 있습니다.
유동유체 매개 편광에 대한 또 다른 중요한 응용 프로그램은 동결 및 건조 시 세포를 보호하는 trehalose와 같은 방부제 화합물의 세포 내 전달을 포함합니다. Trehalose는 자연에서 일부 유기체에 의해 생성 되며 그들의 세포 막을 보호 하 여 동결 및 건조를 용납 하는 데 도움이22,23. 그러나, 트레할로오스는 포유류 세포에 의해 생성되지 않으며 포유류 세포막에 침투할 수 없다. 따라서, 세포화와 같은 효과적인 분자 전달 기술은 내부 세포 막을 보호하는 데 필요한 충분한 세포내 trehalose 수준을 달성하기 위해 필요합니다. 이 접근법은 현재 다양한 세포 유형의 건조 보존을 위해 개발 중입니다.
이 프로토콜은 마이크로 컨트롤러에 의해 구동 상대적으로 저렴한 비용 acoustofluidic 시스템의 조립 및 작동에 대한 자세한 설명을 제공합니다. 초음파 조영제는 유체 채널 내의 초음파 포화를 유도하고 T 세포 및 암세포를 포함한 다양한 세포 유형에 대한 신속한 분자 전달을 가능하게하는 데 활용됩니다. 이러한 아쿠스토유체 시스템은 다양한 연구 응용 분야에 사용될 수 있으며, 또한 세포 치료 제조 공정을 향상시키기 위한 소노포화 방법을 평가하는 프로토타입 시스템으로도 유용할 수 있다.
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Protocol
전체 혈액 기부는 루이빌 대학의 기관 검토 위원회에 의해 승인 된 프로토콜에 따라 건강한 기증자로부터 수집되었습니다.
1. 유동유체 장치 제조
- 직경 500 μm의 채널을 포함하는 동심 나선형 디자인의 포토마스크를 가져옵니다. CAD 파일은 보조 파일에 예로 제공됩니다. 사용자 지정 포토마스크는 상용 공급업체에서 주문하거나 마스크 라이터를 사용하여 패턴화할 수 있습니다.
- 표준 포토리스소그래피 기술을 사용하여 포토레지스트 코팅 실리콘 웨이퍼에 동심 나선형 디자인의 금형을 준비합니다.
- SU-8 2100의 약 2 테이블스푼(~30mL)을 100mm 실리콘 웨이퍼에 넣습니다.
- 30s가 포토레지스트를 퍼뜨리기 위해 스피너에 웨이퍼를 스핀 코팅한 다음 60s의 속도를 1,200rpm으로 늘려 200 μm의 두께를 산출합니다.
- 포토레지스트 코팅 웨이퍼를 폴리이미드 진공 오븐에서 30분 램프 위로, 115°C에 30분 간 투숙한 다음 30분 동안 아래로 경사를 이드합니다.
- 1.1 단계에서 포토마스크와 마스크 정렬기를 사용하여 포토레지스트 코팅 웨이퍼를 130s에 노출시합니다.
- 1.2.3 단계에서 설명된 동일한 과정을 따라 노출 후 웨이퍼를 굽습니다.
- SU-8 개발자 솔루션에서 약 8분 동안 포토레지스트를 개발합니다.
주의: 통풍이 잘 되는 화학 연기 후드에만 개발자 솔루션을 사용하십시오.
- 표면을 더 소수성으로 만들기 위해 금형을 실란화합니다. 포토레지스트 코팅 웨이퍼를 데시카이터에 넣고 클로로실레인 20 μL 드롭(C8H4Cl3F13Si)을 추가합니다. 진공을 챔버에 30s로 적용한 다음 챔버를 밀봉하고 하룻밤 동안 둡니다.
주의: 클로로실란은 매우 위험하고 인화성입니다. 노출로 인해 심한 화상과 눈 손상이 발생합니다. - 폴리디메실록산(PDMS) 베이스 54g과 경화제 6g을 컵에 섞어 주걱과 1분 이상 힘차게 섞어줍니다.
- PDMS 용액이 포함된 컵을 약 30분 동안 건조기또는 잔재기 기포가 용액에서 제거될 때까지 건조기에 넣습니다.
- 포토레지스트 코팅 웨이퍼를 150mm 페트리 접시에 위쪽으로 향하는 패턴으로 놓습니다.
- 150mm 페트리 접시 안에 있는 금형 위에 PDMS 용액을 붓습니다.
- 필요한 경우 150mm 페트리 접시를 건조기 안에 놓고 잔재된 기포가 사라질 때까지 진공을 적용합니다.
- 150mm 페트리 접시를 실험실 오븐에 옮기고 60°C에서 2시간 동안 구워 PDMS를 치료합니다.
- 경화 후 면도날을 사용하여 웨이퍼의 가장자리를 잘려 페트리 접시에서 PDMS를 조심스럽게 제거하십시오.
- 칼이나 면도날을 사용하여 각 개별 장치를 잘라냅니다.
- 2.5mm 생검 펀치를 사용하여 각 장치의 입구 및 콘센트 포트를 통해 구멍을 뚫습니다.
- 각 PDMS 장치를 플라즈마 애셔에 배치하여 채널이 노출되어(위쪽으로 향)합니다. 산소 플라즈마 처리(45s 100W, 500mbar O2)를적용한 다음 각 PDMS 장치를 유리 표면을 향한 채널이 있는 깨끗한 소다 라임 유리 현미경 슬라이드(75mm x 25mm x 1mm)에 즉시 배치합니다.
- 장치가 실온에서 하룻밤 동안 결합하도록 합니다.
- 1cm 직경의 압전 트랜스듀서 표면에 실리콘을 부드럽게 적용한 다음- 1-2mm 두께로 트랜스듀서를 동심 나선형으로 조심스럽게 정렬하고 유리 현미경 슬라이드의 바닥(PDMS 장치에서 반대쪽)으로 부드럽게 누릅니다.
2. 유동체유체 시스템의 조립 및 운영
- USB A ~ B 케이블을 사용하여 컴퓨터에 마이크로 컨트롤러를 연결합니다. 녹색 전원 LED 표시기(레이블이 지정된 PWR)가 켜져야 합니다.
- 컴퓨터에서 연결된 프로그램을 사용하여 8MHz 신호를 생성하는 프로그램을 업로드합니다. 보조 F 일체에예제 프로그램이 제공됩니다. 프로그램을 업로드한 후 마이크로프로세서 메모리에 저장되며 다시 업로드할 필요가 없습니다.
- PZT 트랜스듀서의 각 와이어 의 끝까지 1" 22G 와이어를 납땜합니다.
- PZT 트랜스듀서의 음수(검은색) 단말 와이어를 납땜 와이어를 통해 GND 핀에 연결합니다.
- PZT 트랜스듀서의 양수(빨간색) 단말 와이어를 납땜 와이어를 통해 출력 핀(제공된 예제 프로그램의 #9)에 연결합니다.
- 선택적으로, 3D 인쇄 케이스에 acoustofluidic 장치 및 마이크로 컨트롤러를 장착합니다. CAD 파일은 S고진 F일체에 예로 제공됩니다. 추가 와이어를 다른 마이크로 컨트롤러 핀에 연결하여 외부 LED 표시기를 제어하고 원하는 경우 온/오프 푸시 버튼을 제어할 수 있습니다.
- 타이곤 PVC 소프트 플라스틱 튜브 (1/16"ID, 1/8"OD)의 3-6"섹션을 잘라 입구 및 콘센트 포트에 튜브를 밀어 넣습니다. 개구부에 맞을 때까지 압력을 가하면서 튜브를 회전해야 할 수도 있습니다. 선택적으로, 각 포트에 튜브를 삽입 한 후, 접착제는 PDMS와 함께 튜브를 결합하기 위해 접합에 적용 할 수 있습니다.
- 제조업체의 지침에 따라 미세 유체 저장소를 조립합니다.
- 타이곤 PVC 소프트 플라스틱 튜브 (1/16" ID, 1/8" OD)의 3-6" 섹션을 잘라 미세 유체 저장소 출력 튜브에서 1/32" ID 튜브를 통해 튜브를 밀어 넣습니다. 선택적으로, 누출을 방지하기 위해 파라핀 필름으로 접합을 감쌉니다.
- 주변 공기(선택적으로, 0.2μm 필터로 공기를 필터링)로 60mL 주사기를 채우고 미세유체 저장소 측면에 있는 타이곤 PVC 튜브(1/16" ID, 1/8" OD)에 연결합니다.
- 주사기 펌프를 200mL/h의 비율로 설정하여 50mL/h의 체적 유량으로 수혈 장치를 통해 세포/초음파 조영제 용액을 밀어 내고 50mL 원심분리기 튜브로 유동체 장치의 출력으로부터 샘플을 수집한다. 선택적으로, 15mL의 70% 에탄올 용액으로 아쿠스토유체 처리 전에 헹구는 채널은 유체 채널의 멸균을 증가시다. 또한, 채널을 15mL의 탈온화물로 헹구어 시스템을 통해 세포를 펌핑하기 전에 장치에서 잔류 에탄올을 제거할 수 있다.
3. 초음파 조영제 준비
참고: 초음파 조영제는 인근세포막(19)의과구화를 일시적으로 증가시킴으로써 분자 화합물의 유동적 전달을 현저히 향상시킵니다. 분자 전달은 이 시스템에서 초음파 조영제 없이 매우 제한됩니다.
- 다음 혼합물을 포함하는 20mL 신경병 유리병에 인지질 용액을 준비하십시오.
- 1,2-distearoyl-sn-glycero-3-인포콜린 (DSPC)의 25 mg을 추가합니다.
- 1,2-distearoyl-sn-glycero-3-ethylphosphocholine (DSEPC)의 11.6 mg을 추가합니다.
- 추가 0.26 mg의 1,2-distearoyl-sn-글리세로-3-인지질세롤 (DSPG).
- 추가 0.88 폴리 옥세틸렌40 stearate의 mg.
- 모든 인지질이 용해될 때까지 클로로폼을 추가하십시오(예: 클로로폼 3mL).
- 건조지질필름을 형성하기 위해 48시간 동안 건조기에서 엽록체를 증발시(아르곤 아래 또는 회전 증발기로 증발하여 건조 공정을 가속화할 수 있음).
- 멸균 인산염 완충식식염(PBS)의 10mL로 지질 필름을 재수화합니다.
- 지질 용액을 40% 진폭으로 3분 동안 초음파 처리하여 양이온 미셀라 용액을 형성합니다.
- 초음파 처리 후 최대 1 개월 동안 2-6 °C에서 인지질 용액을 저장합니다.
- 초음파 조영제를 준비하려면 2mL 유리 중격 바이알에 200 μL의 양이온 미셀라 용액과 멸균 PBS 600 μL을 추가하십시오.
- 캡을 압착하여 바이알을 밀봉합니다.
- 1.5" 20G 바늘을 사용하여 바이알 헤드 공간을 데카플루오로부탄 가스로 30s에 채웁니다.
- Amalga는 4,350 cpm에서 45s의 유리병을 상무하여 퍼플루오로부탄 가스로 채워진 초음파 조영제입니다.
- 결합된 조영제/세포 혼합물을 유동유체 장치를 통해 펌핑하기 직전에 1mL의 세포 용액당 초음파 조영제 용액 25μL을 추가합니다. 세포 용액은 사용자가 원하는 대로 변형될 수 있지만, 당사의 연구에서 세포 용액은 각각 5.7단계에서 단계 4.21 및 A549 폐암 세포로 구성되었다.
4. 1차 Tcells 준비
- 전혈 용액에서 말초 혈액 단핵 세포 (PBMC)를 분리하고 -150 °C에 저장합니다. 기판을 포함하는 밀도 그라데이션 분리는 일반적으로전혈24,25,26에서PBMC를 분리하는 데 활용된다.
- 37 °C 수조에서 냉동 유리병을 해동하십시오.
- 15mL 원심분리기 튜브에 PBS로 해동된 PBMC 1:10을 희석시하십시오. 각 1mL 바이알에는 약 1,000만 개의 PBMC가 포함되어 있습니다.
- 원심분리기는 4°C에서 11분 동안 580 x g에서 PBMC를 희석시켰습니다.
- 슈퍼나티를 흡인하고 13mL의 MAC실행 버퍼를 추가하여 셀을 다시 일시 중지합니다.
- 자동화된 셀 카운터 또는 혈변계로 PBMC를 계산합니다.
- 4°C에서 11분 동안 580 x g에서 PBMC를 다시 원심분리하고 수퍼나티를 흡인시합니다.
- 1,000만 PBMC당 40μL의 냉장 실행 버퍼를 추가합니다.
- T 세포를 분리하려면 1,000만 PBMC당 팬 T 셀 비오틴 항체 칵테일 10 μL을 추가합니다.
- PbMC를 부드럽게 교반하고 1,000만 세포당 5분 동안 용액을 4°C로 저장합니다.
- 러닝 버퍼 30μL과 1,000만 PBMC당 팬 T 셀 MicroBead 칵테일 20 μL을 추가합니다.
- PBMC와 구슬을 철저히 섞고 4°C에서 15분 동안 추가로 배양합니다.
- 실행 중인 버퍼를 추가하여 총 500 μL에 도달합니다.
- 제조업체의 프로토콜에 따라 "분리 고갈" 설정을 사용하여 시판되는 벤치탑 자기 선별 계측기를 사용하여 기본 T 셀을 분리합니다. 이 단계는 세포 정렬 후 5-10000만 T 셀 사이에 산출해야 합니다.
- 자동 세포 카운터 또는 혈혈계를 사용하여 T 세포를 계산합니다.
- 멸균 PBS및 원심분리기의 10mL에서 T 세포를 4°C에서 10분 동안 580 x g에서 희석하여 세포를 펠릿합니다.
- 슈퍼나탈을 흡인시키고 PBS의 1mL에서 T 세포를 재중단한다.
- 실험용 자동 세포 카운터 또는 혈류계 및 알리쿼트 1백만/mL를 사용하여 T 세포를 계산합니다.
- PBS에서 1 mg/mL 형광액을 준비합니다.
- 처리 직전에 1 ml의 T 세포 용액(최종 형광 농도 = 100 μg/mL)에 1 mg/mL 형광액 100 μL을 추가합니다.
- 3.11 단계에서 이전에 설명된 바와 같이 초음파 조영제 용액의 25 μL을 추가합니다.
- acoustofluidic 시스템을 사용하여 세포의 1mL 알리쿼트 처리 (단계 2.10-2.11 참조). 이 단계는 1 차적인 T 세포로 형광의 납품을 향상합니다.
- 치료 직후, 세포 외 형광을 제거하기 위해 PBS의 500 μL로 10 분 동안 580 x g에서 원심 분리를 통해 세포를 세 번 씻으면 세포를 세 번 씻으면 됩니다. 세포는 형광액을 첨가한 후 10분 이내에 세척해야 합니다.
- 최종 세척 단계 후, PBS의 250 μL에서 세포를 다시 중단하고 유동 세포계에 형광을 측정합니다.
5. A549 폐암 세포 준비
- 문화 A549 (아데노카르시노믹 인간 폐포기 상피) 세포는 완전한 DMEM 매체에서 (10% 태아 소 혈청, 1% 페니실린/연쇄 절제술신) 37°C및 5%CO2에서 평평한 바닥 조직 배양 플라스크에서.
- 그들은 70-90 %의 합류에 도달 할 때 A549 세포를 수확. 플라스크에서 미디어를 흡인하고 혈청 단백질을 제거하기 위해 PBS로 한 번 세포를 씻으세요.
- 트립신 (0.25%) EDTA를 플라스크에 넣고 37 °C에서 5 분 동안 배양하십시오. 트립신은 조직 배양 플라스크의 바닥 표면에서 분리하는 세포를 일으키는 소화 효소입니다.
- 트립신 용액을 15mL 원심분리기 튜브로 전송하고 1:3 비율로 완전한 DMEM 미디어를 추가하여 중화합니다.
- 4°C에서 5분 동안 1,500 x g에서 원심분리를 통해 세포를 펠렛합니다.
- 15mL 원물 바이알에서 200mM trehalose를 포함하는 PBS 용액에서 100,000/mL의 농도로 체퍼를 흡인하고 재중단한다.
- 3.11 단계에서 이전에 설명된 바와 같이 초음파 조영제 용액의 25 μL을 추가합니다.
- acoustofluidic 시스템을 사용하여 세포의 1mL 알리쿼트 처리 (단계 2.10-2.11 참조). 이 단계는 A549 폐암 세포로 트레할로오스의 전달을 향상시킵니다.
- 치료 직후, 세포 외 트레할로오스를 제거하기 위해 PBS의 500 μL로 원심분리를 통해 세포를 세 번 세척합니다. 세포는 트레할로오스 용액을 추가한 후 10분 이내에 세척해야 합니다.
- 최종 세척 단계 후, PBS의 100 μL에서 세포를 다시 중단합니다.
- 1% 트리톤 X-100 용액의 11μL을 추가하여 세포를 리스하고 세포 내 트레할로오스를 방출합니다.
- 15s의 소용돌이를 위해, 다음 실온에서 30 분 동안 배양.
- 15s에 대한 소용돌이, 다음 제조 업체의 권고에 따라 시판 가능한 trehalose 분석체를 사용하여 트레할로스 농도를 측정합니다.
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Representative Results
3D 프린팅 케이스 내부에 조립된 유동적 시스템의 이미지가 도 1에도시되어 있다. 이 프로토콜은 초음파 조영제를 사용하여 다중 세포주에서 세포내 분자 전달을 향상시키는 데 사용할 수있는 acoustofluidic 시스템을 생성합니다.
그림 2 형광 화합물의 세포내 전달을 입증, 형광, 처리되지 않은 대조군에 비해 acoustofluidic 치료를 가진 1 차적인 인간 T 세포에(p<0.05, n=3/그룹). T세포는 100 μg/mL 형광용액과 25 μL/mL 초음파 조영제 용액을 가진 PBS에서 100만/mL의 농도로 중단되었고, 혼합물은 초음파 처리를 위한 유동적인 장치를 통과하였다. 세포 내 형광 전달 및 세포 생존가능성은 세포 외 형광을 제거하기 위해 원심분리를 통해 세포를 세척한 후 유동 세포측정으로 측정하였다. 처리되지 않은 대조군내T 세포도 100μg/mL 형광액을 가진 PBS에서 100만/mL로 일시 중단되었지만 초음파 조영제 용액은 첨가되지 않았고 세포는 유동유체 장치를 통과하지 않았다. T 세포의 형광 강도는 치료되지 않은 대조군에서 T 세포의 형광 강도에 비해 부동 유체 처리 후 5 배 증가하여 형광의 향상된 전달을 나타냅니다. 세포 생존력은 혼수상태치료 후 소폭 감소했으나 80%(p<0.05, n=3/그룹)를 상회했다.
도 3은 방부제 화합물, trehalose, 유동에 비해 유동 (초음파 조영제 또는 초음파 노출 없음)에 비해 유동에 비해 유동 (초음파 조영제 또는 초음파 노출 없음)을 가진 인간 A549 폐 암종 세포의 향상된 세포 내 전달을 입증하고 치료되지 않은 대조군 (ANOVA p<0.05, n =3/그룹)에 있는 세포에 비해. A549 세포는 PBS에서 200mM trehalose 용액과 25 μL/mL 초음파 조영제 용액으로 100,000/mL의 농도로 중단되었고, 혼합물은 초음파 처리를 위한 부동유체 장치를 통과하였다. 대조군내 A549 세포("유동만"과 "치료 없음")도 PBS에서 200mM trehalose로 100,000/mL로 일시 중단되었지만 초음파 조영제 용액이 첨가되지 않았고 세포는 초음파 치료에 노출되지 않았다. 세포내 트레할로오스는 트레할로오스 분석 키트를 사용하여 정량화하고 처리되지 않은 대조군으로 정규화하였다. 셀 생존력은 트라이판 블루 분석으로 측정되었습니다. 그룹(n=3-7/그룹) 간의 세포 생존가능성에는 통계적인 차이가 없었습니다.
그림 1: 부동 유체 시스템의 사진. 유동 시스템에는 마이크로 컨트롤러가 구동하는 통합 PZT 트랜스듀서가 있는 PDMS 기반 유량 챔버가 포함되어 있습니다. LED 표시기와 온/오프 푸시 버튼이 있는 3D 프팅 케이스는 추가 기능의 선택 사항입니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
그림 2: Acoustofluidic 치료는 인간 T 세포에 f루오레세인 전달을 향상시킵니다. (A)1차 T 세포에서형광 강도는 처리되지 않은 대조군(유동유체및 마이크로버블 없음)에 비해 형광체로 부동유체 처리 후 증가(p<0.05, n=3/그룹). (B)세포 생존가능성은 혼수상태치료 후 약간 감소했으나 유동 세포측정(p <0.05, n=3/group)으로 측정된 80% 이상을 유지했다. (C)유동 세포혈성 히스토그램은 유동유체 치료 군에서 더 높은 형광을 나타낸다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
그림 3: 부동 유체 치료는 인간 폐암 세포에 대한t rehalose 전달을 향상시킵니다. (A)트레할로스 섭취량은 A549 폐 암종 세포에서 유동(초음파 및 마이크로버블 없음)과 치료되지 않은 대조군(ANOVA p<0.05, n=3/group)에 비해 증가하였다. (B)세포 생존가능성은 트립판 블루 분석(n=3-7/그룹)에 의해 측정된 바와 같이 부동유체 처리 후 90% 이상 남아 있었다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
추가 파일. 이 파일을 다운로드하려면 여기를 클릭하십시오.
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Discussion
이 프로토콜은 연구 응용을 위한 생체 분자의 세포내 전달을 강화하는 저비용 acoustofluidic 시스템의 조립 그리고 작동을 설명합니다. 이 시스템을 조립하고 운영할 때 고려해야 할 몇 가지 중요한 요소가 있습니다. 이 부동 유체 장치는 일관된 채널치수(27)로쉽게 성형할 수 있는 생체 적합성 물질인 PDMS로 제조된다. 장치 채널은 배양 된 세포와 함께 작업 할 때 멸균을 높이기 위해 acoustofluidic 처리 전에 70 % 에탄올 용액의 15 mL로 헹구 수 있습니다. 에탄올 세척에 이어, 15mL의 탈이온화된 물을 사용하여 세포 용액을 첨가하기 전에 채널에서 잔류 에탄올을 제거하는 장치를 헹구수 있습니다. 작은 부동 유체 채널은 파편이나 세포 응고에 의해 쉽게 차단될 수 있으므로 장치의 빈번한 사용에 제한이 있습니다. 각 샘플 사이의 채널을 철저히 헹구면 채널 차단 문제를 방지하는 데 도움이 됩니다. 또한 여러 PDMS 장치를 각 배치로 제작하여 필요한 경우 장치를 신속하게 교체할 수 있습니다. 초음파 기반 응용 프로그램의 경우 PDMS 두께의 차이가 유체 채널 내의 초음파 압력에 영향을 줄 수 있으므로 일관된 두께의 PDMS 장치를 생산하는 것이 중요합니다. 초음파파는 장치를 통해 지속적으로 전파되고 전달된 파도는 반사된 파와 상호 작용하여 PDMS두께(17)의차이에 매우 민감한 서 있는 음향파 패턴을 형성한다. PDMS 두께는 주로 금형(1.7단계)에 추가된 PDMS의 양에 의해 결정되며, 이 프로토콜은 3.5mm의 PDMS 두께를 산출한다.
마이크로 컨트롤러(8MHz)의 최대 출력 주파수를 선택하여 유체 채널 내에서 가장 작은 음향 파장을 생성하였다. 마이크로 컨트롤러 출력은 일반적으로 제곱파이지만 오실로스코프 측정결과 8MHz의 출력이 슬루속도 제한으로 인해 부비동파형과 더 유사하다는 것이 밝혀졌습니다. 이 시스템의 한계는 마이크로 컨트롤러의 최대 전압 출력이 5V이고 높은 전압 출력이 원하는 경우 외부 RF 증폭기가 필요하다는 것입니다. 이 시스템에서 트랜스듀서의 자유 필드 압력 출력은 바늘 하이드로폰 (정밀 음향, 도체스터, 영국)으로 측정된 1cm에서 18 kPa였습니다. 이 압력은 상대적으로 낮지만 채널 내의 서 있는 파도는 초음파 빔을 통과할 때 샘플이 노출되는 음향 압력을 증가시킬 수 있습니다.
초음파 조영제는세포막(28,29)에걸쳐 생체 분자의 전달을 향상시키는 부동 유체 채널 내에서 음향 캐비테이션을 핵에 사용하는 데 사용된다. 이 프로토콜은 변온 인지질 막에 의해 캡슐화된 퍼플루오로카본 가스 채워진 마이크로버블의 합성을 설명합니다. 앞서 설명한 바와 같이, 이 제제는 주로 직경30에서1-3 μm 사이의 마이크로 버블로 구성된다. 마이크로 버블의 양전하 표면은 마이크로 버블과 세포가 가까이 있을 때 소공포화 매개 분자 전달을 증가시키는 음전하 세포막을 향해 그들을 끌어들입니다. 세포 용액에서 마이크로버블의 농도는 부유동처리 후 분자 전달 및 세포 생존가능성의 효율에 영향을 미칠 수 있는 중요한 인자이며, 최적의 마이크로버블 농도는 각 세포유형(19)에특이할 수 있다. 지질 껍질이 있는 가스 로 채워진 마이크로 버블의 농도는 합성 후 시간이 지남에 따라 감소할 수 있으므로 초음파 조영제는 합성 후 몇 시간 이내에 사용되어야합니다.
우리는 이 프로토콜에서 유동적 시스템을 사용하여 1차 비활성화 인간 T 세포에 형광 화합물(형광체)의 전달을 시연했다. 1 차인간 T 세포의 활성화 상태는 세포 내 분자 전달의 효율성에 영향을 미칠 수 있다는 점에 유의하는 것이 중요합니다. 형광의 형광 특성은 유동 세포측정을 이용한 민감한 세포내 검출을 가능하게 하지만, 다른 수용성 화합물도 이 부동유체 시스템을 사용하여 세포로 전달될 수 있다. 예를 들어, 우리는 인간 폐암 세포로 트레할로오스의 유동적 전달을 시연했습니다. 세포로 트레할로오스의 부유동화적 전달은 냉동 및 건조 저장 후 증가 된 회복을 가능하게 할 수 있으며, 이는 생물 의학 및 연구 응용 프로그램의 범위에 상당한 영향을 미칠 수 있습니다 19.
단백질 이나 DNA 플라스미드와 같은 다른 생체 분자의 부유동화 전달도 가능하지만, 이 시스템의 한계는 분자 전달의 효율이 더 큰화합물(18,31)에대해 낮을 수 있다는 것이다. 다른 생체 분자의 전달을 위해 부유동 유량, 초음파 조영제, 세포 농도 및 매체의 농도의 최적화가 필요할 수 있습니다. 또한, 최적의 파라미터는 세포 직경, 형태학, 막 특성 및 표현형과 같은 요인으로 인해 다른 세포 유형 마다 다를 수 있다.
이 프로토콜에 기재된 acoustofluidic 시스템은 비교적 저렴한 비용으로 쉽게 조립및 작동할 수 있습니다. 또한, 이 시스템은 다른 신호소스 또는 초음파 트랜스듀서를 연결하여 특정 출력 압력 및주파수(32,33,34)를생성하여 다른 애플리케이션을 위해 사용자 정의할 수 있다. 또한, 이 프로토콜에 기재된 주사기 펌프 시스템은 원하는 경우 연동 펌프로 대체될 수 있다. 50mL/h의 유량에서 유동량을 50mL/h로 초음파 빔 내의 세포에 대한 체류 시간은 약 1s이지만, 이 체류 시간은 유체 유량을 조정하여 특정 용도에 필요에 따라 수정될 수 있다.
다른 일반적인 형질 전환 기술과는 달리 생체 분자는 몇 시간 대신 몇 분 이내에 세포로 전달 될 수 있으며이 시스템은 전문적이고 비싼 장비를 필요로하지 않습니다. 또한, 이 시스템은 일반적으로 사용되는 광범위한 세포 배양 매체 또는 기타 완충제와 호환된다. 요약하자면, 이 부동 유체 시스템은 세포에 생체 분자를 신속하게 전달할 수 있게 해주며, 이는 광범위한 연구 응용 분야에 유용할 수 있습니다.
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Disclosures
공동 저자 MAM과 JAK는 이 연구와 관련된 제품에서 재정적으로 이익을 얻을 수 있는 DesiCorp의 소유권을 보유하고 있습니다.
Acknowledgments
이 작품은 국립 과학 재단 (#1827521, #1827521, #1450370)과 국립 보건 원 (U01HL127518)의 자금 으로 부분적으로 지원되었습니다. 포토리스그래피 서비스는 루이빌 마이크로/나노 기술 센터에서 제공되었습니다.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Fabrication of Acoustofluidic Device | |||
| DOW SYLGARD 184 SILICONE ENCAPSULANT CLEAR 0.5 KG KIT | Ellsworth Adhesives | 4019862 (SKU) | https://www.ellsworth.com/products/by-market/consumer-products/encapsulants/silicone/dow-sylgard-184-silicone-encapsulant-clear-0.5-kg-kit/ |
| Harris Uni-Core (2.5 mm) | Electron Microscopy Sciences | 69039-25 | |
| Microfluidic Reservoir for 15 mL Falcon Tube - S (2/4 port) | Darwin Microfluidics | LVF-KPT-S-2 (SKU) | https://darwin-microfluidics.com/products/15-ml-falcon-tube-microfluidic-reservoir-s-2-4-port |
| Microscope Slide | VWR | 16004-430 | https://us.vwr.com/store/product/4646174/vwr-vistavisiontm-microscope-slides-plain-and-frosted-premium |
| trichlorosilane | Gelest | 105732-02-3 (Cas. No.) | Chlorosilane is very hazaradous and flammable. Exposure causes severe burns and eye damage. |
| Tygon PVC soft plastic tubing (1/16" ID, 1/8" OD) | McMaster-Carr | 5233K51 (Part #) | https://www.mcmaster.com/pvc-tubing/soft-tubing-for-air-and-water/ |
| Assembly of Acoustofluidic System | |||
| Arduino Uno | Arduino | 7630049200050 (Barcode) | https://store.arduino.cc/usa/arduino-uno-rev3 |
| Preparation of Ultrasound Contrast Agents | |||
| 1,2-distearoyl-sn-glycero-3-ethylphosphocholine (DSEPC) | Avanti Lipids | 890703P-25mg (SKU) | https://avantilipids.com/product/890703 |
| 1,2-distearoyl-sn-glycero-3-phosphocholine (DSPC) | Avanti Lipids | 850365P-25mg (SKU) | https://avantilipids.com/product/850365 |
| 1,2-distearoyl-sn-glycero-3-phosphoglycerol (DSPG) | Avanti Lipids | 840465P-25mg (SKU) | https://avantilipids.com/product/840465 |
| APF-140HP (decafluorobutate gas) | FlouroMed | 355-25-9 (Cas No.) | http://www.fluoromed.com/products/perfluorodecalin/ |
| DB-338 Amalgamators | COXO | https://www.coxotec.com/coxo/db-338-amalgamators/ | |
| polyoxyethylene 40 stearate | Sigma-Aldrich | P3440-250G (SKU) | https://www.sigmaaldrich.com/catalog/product/sigma/p3440?lang=en®ion=US&gclid= Cj0KCQjwy8f6BRC7ARIsAPIXOjjj Jh_151mYVEUyLZRavt4re9YQMLS vID64X-1KbO3LUKGjVUwb PDAaAqvOEALw_wcB |
| Q125 Sonicator | Qsonica | Q125-110 (Ref.) | https://www.sonicator.com/products/q125-sonicator?_pos=1&_sid=406df3776&_ss=r |
| Preparation of Primarty T Cells | |||
| autoMACs running buffer | Miltenyi Biotec | 130-091-221 (Order No.) | https://www.miltenyibiotec.com/US-en/products/automacs-running-buffer-macs-separation-buffer.html#gref |
| Pan T Cell Isolation Kit, human (Pan T-Cell Biotin Antibody Cocktail & Pan T-Cell MicroBead Cocktail) | Miltenyi Biotec | 130-096-535 (Order No.) | https://www.miltenyibiotec.com/US-en/products/pan-t-cell-isolation-kit-human.html#130-096-535 |
| magnetic cell sorter (autoMACS Pro Separator) | Miltenyi Biotec | 130-092-545 (Order No.) | https://www.miltenyibiotec.com/US-en/products/automacs-pro-separator-starter-kit.html#130-092-545 |
| Preparation of A549 Lung Cancer Cells | |||
| Trehalose Assay Kit | Megazyme | K-TREH (Cat. No.) | https://www.megazyme.com/trehalose-assay-kit |
| Trypan blue (0.4% in aqueous solution Ready-to-Use, sterile) | VWR | 97063-702 (Cat. No.) | https://us.vwr.com/store/product/7437427/trypan-blue-0-4-in-aqueous-solution-ready-to-use-sterile |
References
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