Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Biology
Click here for the English version

Biology

تصوير حي عالي الإنتاجية للمستعمرات الدقيقة لقياس التغايرية في النمو والتعبير الجيني

Published: April 18, 2021 doi: 10.3791/62038
Automatic Translation
1, 1, 1, 1
1Center for Genomics and Systems Biology, Department of Biology, New York University

Summary

يتم قياس الأنماط الظاهرية لنمو الخميرة بدقة من خلال التصوير المتوازي للغاية للفاصل الزمني للخلايا المشلولين التي تنمو إلى مستعمرات صغيرة. وفي الوقت نفسه، يمكن رصد تحمل الإجهاد، والتعبير عن البروتين، وتوطين البروتين، وتوليد مجموعات بيانات متكاملة لدراسة كيفية تعديل النمو بين الاختلافات البيئية والجينية، فضلا عن عدم التجانس بين الخلايا متساوية المنشأ.

Abstract

القياسات الدقيقة للتباين بين وداخل سلالة في معدلات النمو الميكروبية ضرورية لفهم المدخلات الوراثية والبيئية في تحمل الإجهاد، والإمراض، وغيرها من المكونات الرئيسية للياقة البدنية. تصف هذه المخطوطة المقايسة المستندة إلى المجهر التي تتعقب ما يقرب من 105 ساككروميس سيريفيسيا الألوان الدقيقة لكل تجربة. بعد التصوير الآلي الفاصل الزمني للخميرة معطلة في لوحة متعددة بويل ، يتم تحليل معدلات نمو الألوان الدقيقة بسهولة مع برامج تحليل الصور المخصصة. لكل ميكروكولون، والتعبير وتوطين البروتينات الفلورية والبقاء على قيد الحياة من الإجهاد الحاد يمكن أيضا رصدها. ويسمح هذا المقايسة بتقدير دقيق لمتوسط معدلات نمو السلالات، فضلا عن القياس الشامل لعدم التجانس في النمو، والتعبير الجيني، وتحمل الإجهاد داخل المجموعات السكانية اللاستنساخية.

Introduction

الأنماط الظاهرية للنمو تسهم بشكل حاسم في اللياقة البدنية الخميرة. الانتقاء الطبيعي يمكن أن يميز بكفاءة بين الأنساب مع معدلات النمو تختلف عن طريق عكس حجم السكان الفعال، والتي يمكن أن تتجاوز 108 أفراد1. وعلاوة على ذلك، فإن تقلب معدلات النمو بين الأفراد داخل السكان هو المعلمة ذات الصلة تطوريا، لأنها يمكن أن تكون بمثابة الأساس لاستراتيجيات البقاء على قيد الحياة مثل التحوط الرهان2،3،4،5،6. ولذلك، فإن المقايسات التي تسمح بإجراء قياسات دقيقة للغاية للأنماط الظاهرية للنمو وتوزيعاتها هي محورية لدراسة الكائنات الحية الدقيقة. يمكن أن يولد اختبار نمو الألوان الدقيقة الموصوف هنا قياسات معدل النمو الفردي ل ~105 ميكروكولونات لكل تجربة. ولذلك يوفر هذا المقايسة بروتوكولا قويا لدراسة علم الوراثة التطورية الخميرة وعلم الجينوم. فإنه يفسح المجال بشكل جيد بشكل خاص لاختبار كيف يتم إنشاء التباين داخل السكان من الخلايا المفردة متطابقة وراثيا، والحفاظ عليها، ويساهم في اللياقة البدنية للسكان7،8،9،10.

تستخدم الطريقة الموضحة هنا(الشكل 1)صورا ذات حقول ساطعة يتم التقاطها بشكل دوري ومنخفضة التكبير للخلايا التي تنمو في الوسائط السائلة على لوحة زجاجية قاعية من 96 أو 384 بئرا لتتبع النمو في المستعمرات الدقيقة. تلتزم الخلايا بالكونسانفالين الليكتين A ، الذي يغطي الجزء السفلي من لوحة المجهر ، وتشكل مستعمرات ثنائية الأبعاد. لأن المستعمرات الدقيقة تنمو في طبقة واحدة، ترتبط منطقة الكولون الدقيق ارتباطا وثيقا مع الخلية رقم7. لذلك، يمكن إنشاء تقديرات دقيقة لمعدل نمو الألوان الدقيقة ووقت التأخر مع برنامج مخصص لتحليل الصور يتتبع معدل التغيير في منطقة كل مجموعة صغيرة. وعلاوة على ذلك، يمكن للإعداد التجريبي رصد وفرة وحتى توطين دون الخلوية من البروتينات المسمى fluorescently أعرب في هذه المستعمرات الدقيقة. يمكن تحقيق معالجة المصب للبيانات من هذا المقايسة نمو الألوان الدقيقة عن طريق التحليل المخصص أو عن طريق برامج تحليل الصور الحالية ، مثل معالجة الصور بسهولة (PIE)11، خوارزمية للتعرف على منطقة المستعمرة القوية وتحليل النمو عالي الإنتاجية من التكبير المنخفض ، صور brightfield ، والتي تتوفر عبر GitHub12.

ولأن تقديرات معدل النمو المستمدة من مقايسة نمو المستعمرات الدقيقة يتم توليدها من عدد كبير من قياسات المستعمرة الواحدة، فإنها دقيقة للغاية، مع أخطاء قياسية أصغر بعدة أوامر من الحجم من التقديرات نفسها لتجربة معقولة الحجم. ولذلك، فإن قدرة المقايسة على اكتشاف الاختلافات في معدل النمو بين الأنماط الجينية المختلفة أو العلاجات أو الظروف البيئية عالية. يسمح تنسيق لوحة multiwell العديد من تركيبات البيئة والنمط الجيني المختلفة أن تقارن في تجربة واحدة. إذا كانت السلالات تعبر بشكل أساسي عن علامات فلورية مختلفة ، فقد تكون مختلطة في نفس البئر وتتميز بتحليل الصورة اللاحق ، مما قد يزيد من القوة من خلال السماح بتطبيع البيانات بشكل جيد.

Figure 1
الشكل 1: تمثيل تخطيطي للبروتوكول. يتبع هذا البروتوكول خطوتين رئيسيتين ، وهما إعداد اللوحة التجريبية وإعداد الخلايا للصورة. وينبغي إجراء العشوائية لوحات ونمو الخلايا قبل وحتى يوم التجربة. الخلط المتكرر للخلايا في كل خطوة أثناء التخفيف أمر حتمي في الخطوات حتى الطلاء ، وبالتالي ينصح بإعداد اللوحة التجريبية أولا بحيث تكون جاهزة للطلاء فور الانتهاء من تمييع الخلية. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

1. إعداد لوحات معشاة (قبل يوم التجربة)

  1. تخطيط السلالات والظروف التي سيتم اختبارها مع فحص النمو. عند هذه النقطة، تعيين عشوائيا سلالات وشروط إلى أي بئر.
    ملاحظة: عند النظر في إعداد لوحة، فمن المستحسن أن تشمل أكثر من تكرار واحد لكل سلالة وحالة النمو على لوحة واحدة لحساب الضوضاء ذات الصلة جيدا في القياسات. راجع مناقشة لمزيد من التفاصيل.
  2. عشوائيا حسابيا موقع كل سلالة وحالة بيئية لتكرار لوحة التي سيتم تشغيلها في أيام مختلفة.
  3. تنمو جميع الخلايا التي سيتم استخدامها في التجربة للتشبع في الخميرة استخراج بيبتون دكستروز (YEPD؛ 2٪ الجلوكوز) المتوسطة في شاكر في 30 درجة مئوية (أو أي درجة حرارة مناسبة أخرى).
  4. إنشاء لوحات الأسهم العشوائية إما يدويا أو مع الروبوت التعامل مع السائل. أضف 10 ميكرولتر من الخلايا المشبعة المعينة إلى كل بئر من لوحة زراعة الأنسجة المعقمة من أسفل U. إذا سيتم اختبار سلالات متعددة في بئر واحد، لا تجمع بينهما في هذه المرحلة. وسيتم هذا الجمع فقط قبل تخفيف الخلية في يوم التجربة لضمان جميع السلالات هي في التركيزات الصحيحة عندما مطلي كخلايا مؤسس الكولونية الدقيقة.
  5. إضافة 10 ميكرولتر من 30٪ الجلسرين إلى كل بئر من كل لوحة. Pipet صعودا وهبوطا بحيث تصبح الخلايا والجلسرين مختلطة بشكل جيد.
  6. ختم كل لوحة مع غطاء احباط وتجميد على الفور في -70 درجة مئوية حتى تصبح جاهزة للاستخدام.
    ملاحظة: من المهم إنشاء جميع اللوحات العشوائية في نفس اليوم، وتجميدها، بحيث تكون ظروف ما قبل النمو للخلايا في كل لوحة متطابقة ولن تولد تباينا تقنيا في المقايسة لمعدل النمو.

2. ما قبل نمو الخميرة

ملاحظة: عادة، يبدأ هذا قبل يوم التجربة ويعتمد بشكل كبير على السؤال التجريبي. راجع مناقشة للحصول على التفاصيل.

  1. إزالة لوحة الأسهم (10 ميكرولتر الخميرة، 10 ميكرولتر جلسيرول لكل بئر) من الفريزر -70 درجة مئوية وإضافة 180 ميكرولتر من وسائل الإعلام لاستخدامها في التجربة. إذا كانت التجربة ستجرى باستخدام وسائل الإعلام الحد من المواد الغذائية، لا الخميرة قبل النمو لتشبع في وسائل الإعلام الحد من المواد الغذائية كما يمكن أن يحدث sporulation من الخميرة. بدلا من ذلك ، تنمو مسبقا في وسائل الإعلام غير المقيدة.
  2. تنمو الخميرة في حين تهتز في 30 درجة مئوية. النظر في ما إذا كان لتشغيل المقايسة بدءا من الخلايا في مرحلة السجل أو في مرحلة ثابتة لتحديد ما إذا كان تمييع الخلايا عدة مرات قبل التجربة سيكون من الضروري. إذا كان من المتوقع أن يكون لسلالات الخميرة أو الظروف في المقايسة معدلات نمو مختلفة بشكل كبير ، فسيكون من الضروري فترة ما قبل النمو لمدة يومين من أجل أن تصل جميع الظروف المختلفة إلى مرحلة ثابتة.

3. إعداد المجهر

  1. إعداد لوحة المجهر
    1. التأكد من أن حاضنة المجهر على وتدفئة غرفة المجهر لدرجة حرارة النمو المطلوب للظروف التجريبية. بالنسبة للتجارب القياسية باستخدام خلايا Saccharomyces cerevisiae ، يجب على الحاضنة تسخين غرفة المجهر إلى 30 درجة مئوية لضمان أن ظروف نمو الخلايا ستكون صحيحة أثناء فحص معدل النمو.
    2. تعقيم منضدة العمل، ماصة، وغيرها من الأدوات مع الإيثانول 70٪. استرداد لوحة المجهر ووضعه على مقاعد البدلاء على رأس مسح الوبر وثابتة خالية.
      ملاحظة: لا تلمس أبدا الجزء السفلي من لوحة المجهر، حتى مع القفازات على، ودائما تعيين لوحة المجهر إلى أسفل على رأس مسح الوبر وثابتة خالية في أي وقت أنه يمس أي سطح. وهذا يمنع اللطخات أو الخدوش من إعاقة قياسات معدل النمو بمجرد تصوير التجربة.
    3. تذوب 5 مل من محلول 5x concanavalin A ، وتمييعها إلى 1x بالماء ، وتعقيم الفلتر من خلال حقنة مزودة بتصفية 0.2-μm.
    4. تصفية تعقيم جميع السوائل الأخرى التي سيتم استخدامها في المقايسة مع مرشح 0.2 ميكرومتر، بما في ذلك وسائل الإعلام التجريبية، لإزالة أي بلورات أو الحطام التي قد تتحقق في الحلول. وجود بلورات من شأنه أن يقلل من جودة الصور المجهرية.
    5. Pipet 200 ميكرولتر من concanavalin حل في كل بئر من لوحة المجهر.
    6. الطرد المركزي لوحة لمدة 2 دقيقة في 411 × الجاذبية (ز) مع مسح الوبر وثابتة خالية تحت لوحة، لضمان أن الحل concanavalin A يغطي بالتساوي الجزء السفلي من كل بئر وأنه لا توجد فقاعات الهواء.
    7. تغطية لوحة مع غطاء والسماح لها الجلوس لمدة 1-2 ساعة. الوقت الدقيق يجلس لوحة مرنة، ولكن من المهم أن تكون متسقة بين أشواط مختلفة من التجربة.
    8. إزالة كل من concanavalin حل من لوحة إما عن طريق الشفط أو عن طريق تفريغ بقوة بها في الحوض أو وعاء. يجب الحرص على عدم لمس الجزء الزجاجي من لوحة. فمن المقبول إذا كان بعض قطرات من concanavalin حل تبقى في الآبار.
    9. غسل الآبار لوحة المجهر بإضافة 400 ميكرولتر من المياه العقيمة. إزالة المياه كما فعلت مع concanavalin A في الخطوة السابقة. لا تدع لوحة الجلوس الجافة.
    10. إضافة فورا 185 ميكرولتر وسائل الإعلام التجريبية النمو في لوحة. سيتم إضافة 15 ميكرولتر من الخلايا المخففة بشكل صحيح إلى هذه اللوحة.
  2. الخميرة تخفيف الخلية
    ملاحظة: تصف الخطوات أدناه تخفيف الخميرة من ثقافة مشبعة (حوالي 108 خلايا / مل) 400 مرة لتحقيق تركيز 250،000 خلية / مل ، سيتم تخفيف 15 ميكرولتر منها إلى 400 ميكرولتر في لوحة الزجاج السفلي ، مما يعطي عددا نهائيا من حوالي 4000 خلية لكل بئر في لوحة من 96 بئرا. إذا كان استخدام لوحة 384 جيدا يجب أن يكون العدد النهائي للخلايا لكل بئر حوالي 700 وينبغي تعديل التخفيفات وفقا لذلك. وينبغي تعديل هذه النسبة للخلايا التي تم جمعها في مرحلة السجل، وتنمو في وسائل الإعلام قبل النمو أغنى أو أفقر، أو من سلالات مختلفة. وينبغي تخفيض الكثافة النهائية للخلايا لكل بئر عند تشغيل تقييم معدل النمو لفترات زمنية أطول من 10 ساعة.
    1. إعداد اثنين من لوحات الثقافة 96 جيدا لتخفيف المسلسل: التسمية كما لوحة 1 و 2، وإضافة 90 ميكرولتر وسائل الإعلام التجريبية النمو (أي، وسائل الإعلام التي سوف تنمو الخميرة في على المجهر) إلى كل لوحة تخفيف المسلسل.
      ملاحظة: بغض النظر عن ما يتم استخدام التخفيف النهائي، ينصح على الأقل اثنين من التخفيفات التسلسلية من الخلايا، في كل منها يتم أنبوب حجم صغير من الخميرة في حجم أكبر من وسائل الإعلام التجريبية ومن ثم يتم خلط كمية كبيرة من وسائل الإعلام التجريبية في بقوة مع ماصة (كما هو الحال في الخطوات 3.2.5 و 3.2.6 أدناه).
    2. استرداد لوحة من الخلايا من مرحلة ما قبل النمو والطرد المركزي لوحة لمدة 2 دقيقة في 411 × ز.
      ملاحظة: من المهم جدا عدم تلويث الآبار المختلفة في اللوحة. الغرض من هذه الخطوة الطرد المركزي قبل إزالة غطاء احباط من لوحات هو التأكد من أن قطرات مليئة بالخميرة من بئر واحد لا تطير قبالة احباط وينتهي في آبار أخرى. يجب الحرص على عدم إمالة أو هياج لوحات لتجنب الخميرة القادمة في اتصال مع غطاء احباط بعد الطرد المركزي.
    3. قشر بعناية مرة أخرى احباط والخلايا resuspend عن طريق الخلايا pipetting بقوة مع مجموعة pipet إلى ما يقرب من نصف إجمالي حجم في لوحة أثناء تحريك pipet حول البئر لخلط. تأكد من أنه تم إعادة إنفاق جميع الخلايا من أسفل الآبار.
    4. إذا تم استخدام سلالات متعددة داخل الآبار الفردية ، فيجب خلط السلالات في هذا الوقت بالنسبة اللازمة للتجربة. وإذا استخدمت سلالة مرجعية لتوليد قياسات لمعدل النمو، ينبغي أن تكون نسبة المرجع إلى سلالة الاختبار 1:1.
    5. Pipet 10 ميكرولتر من الخميرة من وسائل الإعلام النمو إلى تخفيف لوحة 1. أضف 100 ميكرولتر من وسائط النمو التجريبية إلى كل بئر إلى حجم نهائي قدره 200 ميكرولتر لكل بئر. مابيت صعودا وهبوطا بقوة.
    6. Pipet 10 ميكرولتر من الخميرة من لوحة 1 إلى لوحة 2. إضافة 100 ميكرولتر من وسائل الإعلام التجريبية النمو إلى كل بئر، وماصة صعودا وهبوطا بقوة لخلط.
      ملاحظة: هذه الخطوات تخفيف حاسمة للمساعدة في مجموعات منفصلة من الخميرة التي تمسك معا في نهاية مرحلة ما قبل النمو وضمان أن أعداد متساوية تقريبا من خلايا الخميرة في نهاية المطاف في كل بئر. وجود أعداد متسقة من الخميرة في كل بئر يساعد على إزالة الضوضاء التجريبية والتحيزات في قياسات معدل النمو (انظر النتائج التمثيلية).
  3. سونيكيشن
    ملاحظة: سونيكيشن اختياري، ويحتاج فقط إلى أن يؤديها لسلالات الخميرة التي لديها ميل كبير للالتزام ببعضها البعض (على سبيل المثال ، بعض السلالات البرية). لسلالات المختبر، سونيكيشن عموما ليست ضرورية ويمكن تخطي عن طريق المضي قدما في الخطوة 3.4.
    1. تعقيم رأس سونيكاتور 96 دبوس مع الإيثانول 70٪ عن طريق وضعه في لوحة 96 جيدا مليئة الإيثانول 70٪ والجافة مع مسح الوبر وثابتة خالية.
    2. تعيين برنامج سونيكيشن التي هي قوية بما فيه الكفاية لكسر خلايا الخميرة flocculated، ولكن لا يقتل الخلايا أو يسبب استجابات الإجهاد مرتفعة. قد تكون هناك حاجة إلى بعض الاختبارات لتحديد أفضل برنامج سونيكيشن لتجربة معينة. برنامج سونيكيشن المستخدمة في هذه التجربة هو: السعة = 10، وقت العملية = 10 ق، نبض على = 1 ق، نبض قبالة = 1 ق. هذا البرنامج الدقيق من المرجح أن لا ينطبق على جميع sonicators حتى يتم اقتراح اختبار قبل يوم التجربة.
    3. خلط الخميرة في لوحة تخفيف المسلسل 2 مرة أخرى عن طريق الأنابيب صعودا وهبوطا بقوة خمس مرات.
    4. وضع لوحة التخفيف 2 على المنصة وتأمينه مع دبابيس sonicator في تعليق الخلية ولكن لا تلمس الجزء السفلي من لوحة. تشغيل برنامج سونيكيشن باستخدام حماية الأذن المناسبة.
    5. بعد تشغيل البرنامج ، قم بتنظيف رأس sonicator بإيثانول بنسبة 70٪ ثم بالماء ، ثم انتقل على الفور إلى إعداد لوحة المجهر بحيث لا تتخثر الخلايا مرة أخرى.
  4. إعداد لوحة للمجهر:
    1. Pipet 15 μL من الخميرة من لوحة تخفيف المسلسل 2 في لوحة المجهر إلى حجم 200 ميكرولتر. إضافة 200 ميكرولتر من وسائل الإعلام النمو التجريبي إلى كل بئر إلى حجم نهائي من 400 ميكرولتر لكل بئر، وماصة صعودا وهبوطا بقوة لخلط.
    2. قم بتغطية اللوحة بغشاء قابل للتنفس. من المهم لختم لوحة جيدا مع هذا الغشاء، على سبيل المثال باستخدام بكرة مطاطية.
    3. للالتزام خلايا الخميرة إلى concanavalin A على السطح الزجاجي، والطرد المركزي لوحة مع مسح الوبر وثابتة خالية تحته لمدة 2 دقيقة في 411 × ز.
    4. في المجهر، امسح الجزء العلوي والسفلي من اللوحة بمسحة خالية من الوبر والساكنة، وانفخ الهواء المضغوط على اللوحة للتخلص من الحطام.
    5. ضع اللوحة على المجهر ، مع التأكد من أنها مستوية وأن بئر A1 في الزاوية اليسرى العليا.

4. قياس معدل نمو المجهر الفاصل زمنيا

ملاحظة: أثناء الفحص المجهري الفاصل زمنيا، يتم التحكم في الميزات التالية بالكمبيوتر: x وy وموضع z ومصاريع ومرشحات مضان. نظام التركيز التلقائي القائم على الأجهزة هو الأمثل لمنع انجراف الطائرة البؤرية أثناء التصوير الفاصل الزمني. بدلا من ذلك، يمكن استخدام حلقة التركيز التلقائي المستندة إلى البرامج. للحفاظ على الرطوبة في غرفة المجهر ، ينصح بالحفاظ على كوب مع مياه نقية في الغرفة طوال مدة التجربة.

  1. إنشاء قائمة من المواقف (س، ص) إلى الصورة، بحيث يتم تصوير كل المجهر لوحة بشكل جيد تماما. تجنب تداخل الصور بحيث لا يتم تحليل أي خلية عدة مرات.
  2. صورة في برايتفيلد مع الإضاءة دياسكوبيك (DIA) في تكبير 15x. تعيين التعرض إلى ~ 5 مللي ثانية.
  3. تكبير الصورة رقميا بحيث تكون الخلايا مرئية بوضوح. استخدام المقابض التركيز لتحديد التركيز المثالي للتجربة في الآبار الأربعة على زاوية لوحة وفي بئر واحد في وسط لوحة. التركيز في مثل هذه الطريقة للحصول على أقصى قدر من التباين من الخلايا.
  4. قم بتعيين موضع z (أو موضع التركيز البؤري التلقائي) لتكون التجربة متوسطا لمواضع التركيز البؤري التلقائي /z المحددة لكل بئر من هذه الآبار. إذا كانت لوحة المجهر مصنوعة بشكل جيد والقاع الزجاجي لا يحتوي على عيوب ، فيجب أن تكون أوضاع التركيز المثالية متشابهة لكل بئر.
    ملاحظة: عند تحليل الصور مع معالجة الصور بسهولة (PIE) خط أنابيب تحليل الصور11،12، من المفيد للخلايا أن تكون قليلا من التركيز على المجهر بحيث يكون هناك حافة داكنة خارج الخلية والداخلية ذات الألوان الفاتحة ، مما يساعد في التعرف الدقيق على المستعمرة وتقديرات الحجم.
  5. إذا كنت تستخدم سلالات الفلورسنت، حدد القنوات والتعرض للصورة، مع التأكد من عدم تعرض وحدات البكسل بشكل مفرط. عند تحديد وقت التعرض للقنوات الفلورية ، قم بإيقاف وضع "الالتقاط المباشر" على المجهر لتجنب تعريض الخلايا للإثارة الفلورية لفترات طويلة من الزمن ، لأن هذا يمكن أن يثير الخلايا ويسبب الإجهاد.
  6. قم بإعداد الحصول على تسلسل زمني لالتقاط الصور في الفاصل الزمني المطلوب للطول الزمني المطلوب.
  7. تشغيل التجربة.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

إن حداثة هذا البروتوكول هي أنه يمكن حساب معدل النمو للخلايا الفردية داخل السكان من خلال تتبع نموها إلى المستعمرات الدقيقة من خلال التصوير الفاصل الزمني(الشكل 2A). لأن المستعمرات الدقيقة تنمو لعدة ساعات بطريقة مستو بسبب وجود concanavalin A ، يمكن تتبع مناطقها طوال التجربة ، ويمكن استخدام تناسب خطي للتغيير في السجل الطبيعي للمنطقة بمرور الوقت لحساب معدل النمو لكل مستعمرة فردية لوحظت 7و9و10و13. يتم تسجيل الاختلافات في معدل نمو الألوان الدقيقة للخلايا متساوية المنشأ الفردية في نفس البيئة بوضوح(الأرقام 2A، 2B). وينبغي استخدام برامج تحليل الصور لتتبع التغيرات تلقائيا في حجم الألوان الدقيقة والفلورسينس(الشكل 2C)؛ تم تتبع المستعمرة المبينة في الشكل 2A باستخدام PIE11،12.

Figure 2
الشكل 2:تحديد كمي لمعدل النمو والفلورسينس في المستعمرات الدقيقة الخميرة. (أ) جزء من حقل تصوير واحد يظهر المستعمرات الدقيقة تنمو في بداية التجربة، بعد 3 ساعة، وبعد 6 ساعة، تظهر تتبع المستعمرة باستخدام برنامج تتبع مستعمرة PIE. تنمو المستعمرات بشكل واضح في طبقة أحادية طوال مدة التجربة. (ب) تغيير في ln(area) بمرور الوقت للمستعمرات المتعقبة في اللوحة A. إذا كانت هناك بيانات كافية نقطة زمنية للمستعمرة، يمكن حساب معدل النمو ووقت تأخر ما قبل النمو. (ج) صورة تظهر كثافة مضان GFP للمستعمرات في اللوحة A ، التي اتخذت بعد اكتمال جزء النمو من التجربة ، مع الخطوط العريضة للمستعمرة من نقطة زمنية 6-h مضافة. هنا، Scw11P::GFP علامات سلالة مرجعية المدرجة في كل بئر التجريبية. حساب مستوى الفلورية GFP من كل مستعمرة يسمح بتحديد المستعمرات التي تنشأ من سلالة مرجعية، والتي من السلالات غير المرجعية في كل بئر. كل شريط مقياس هو 50 ميكرومتر. الرجاء الضغط هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

عادة، يمكن جمع ~10 5 معدلات نمو الألوان الدقيقة لكل تجربة باستخدام هذا المقايسة. ويمكن استخدام هذه البيانات لمراقبة كل من الاختلافات بين السلالات / ظروف النمو، والاختلاف عبر المستعمرات الدقيقة متطابقة وراثيا نمت في حالة مشتركة. فعلى سبيل المثال، يبين الشكل 3 ألف توزيعات معدلات النمو ل ~000 12 مستعمرة من خط تراكم الطفرات (MAH.44)14 وسلالة مرجعية تحمل علامة GFP تزرع في نفس الآبار، مع رؤية كل من الاختلافات بين السلالات والتباين العالي داخل السلالة. في الشكل 3B، تظهر معدلات النمو الفردية والإحصاءات الموجزة ل 10 سلالات تراكم الطفرات ، مقترنة بضوابط GFP التي تحمل علامة جيدة ؛ تسمح البيانات التي تم جمعها بحساب دقيق لفروق معدل النمو المتوسط الصغيرة.

Figure 3
الشكل 3. تسمح أحجام العينات الكبيرة لمعدلات نمو الألوان الدقيقة الفردية بالتحديد الكمي الدقيق للتباين في النمو داخل السلالة وبين السلالة. (أ) توزيع معدلات النمو التي تبلغ حوالي 000 12 مستعمرة من سلالتين. لاحظ الاختلافات بين أوضاع التوزيعات ، وكذلك الذيل الطويل للمستعمرات البطيئة النمو الموجودة في كل واحدة ؛ هذا الأخير يمكن اكتشافه فقط بسبب قياسات الألوان الدقيقة الفردية. (ب) توزيع معدلات نمو الألوان الدقيقة الفردية (النقاط السوداء) والإحصاءات الموجزة (الفواصل المربعة التي تبين المتوسط، وكذلك الكميات المنخفضة والعليا 25٪) ل ~ 120،000 مستعمرة من 11 سلالة. كما هو الحال في (A) ، نمت كل سلالة في بئر فردية مع سلالة مرجعية ذات علامة GFP ؛ تمثل البيانات المعروضة هنا 14 بئرا تجريبيا لكل زوج سلالة مرجعية من MAH. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

ويمكن أيضا أن تستخدم المقايسة نمو الألوان الدقيقة لقياس النمو والتعبير الجيني في وقت واحد عن طريق تصوير كل من قنوات برايتفيلد والفلورسينس. في التجربة الموضحة في الشكل 2، سمح التصوير الفلوري لتعبير GFP بعد الانتهاء من مرحلة نمو التجربة بتحديد المستعمرات التي تنتمي إلى سلالة مرجعية ذات علامة GFP بشكل جيد مع تعبير GFP ضعيف (الشكل 2C)؛ ومع ذلك، من الممكن أيضا قياس الاختلافات بين الألوان في مستويات التعبير الجيني عبر النقاط الزمنية (راجع المناقشة).

ويمكن لعدد من المزالق الشائعة أن تمنع جمع بيانات دقيقة لمعدل النمو أو التحليل الصحيح لهذه البيانات. نقطة رئيسية واحدة هي أن قياسات معدل النمو تعتمد على تشكيل المستعمرات الدقيقة غير المتحركة ثنائية الأبعاد من خلايا الخميرة مؤسس واحد. كونكانافالين A يتفاعل بشكل غير مكافئ مع السكريات على أسطح خلايا الخميرة لشل الألوان الدقيقة. الرابطة بين concanavalin A وخلايا الخميرة يمكن عكسها عن طريق المنافسة مع السكريات أو عن طريق انخفاض pH15. ولذلك، لا يمكن استخدام الوسائط الحمضية بقوة أو الوسائط التي تحتوي على مكونات ربط الليكتين مثل مستخلص الخميرة (YEPD) أو الفثالات (ادنبره الحد الأدنى من وسائل الإعلام)، لهذا المقايسة دون تعديلات على تقنية شل الحركة(الشكل 4A).

إذا كان يتم إجراء فحص النمو مع سلالات الخميرة التي تتراكم ، يجب استخدام خطوة سونيكيشن الاختيارية لتفكيك الخلايا المجمعة بحيث يتم شل حركة الخلايا المفردة على لوحة المجهر في بداية التجربة (انظر الشكل 4B للحصول على مثال على الخلايا التعويم بعد الطلاء إذا تم حذف خطوة سونيكيشن). وينبغي استبعاد أية مستعمرات صغيرة تقوم عليها مجموعة من الخلايا المتعددة في التحليل النهائي، لأن قياسات معدل النمو لم تعد مشتقة من خلية مؤسسة واحدة، وقد لا تنمو الخلايا في بعدين. المستعمرات الدقيقة التي تقوم عليها خلية في مهدها مقبولة. يتم إعاقة تشكيل المستعمرات الدقيقة ثنائية الأبعاد من قبل الخميرة التي تتخثر بقوة ، حتى لو تأسست المستعمرات من قبل خلية واحدة ، وبالتالي يجب اختبار قدرة سلالة الخميرة على النمو في طبقة واحدة على concanavalin A قبل إجراء فحص النمو.

وثمة مجموعة هامة أخرى من الاعتبارات تأتي خلال مرحلتي التخطيط والتحليل في التجربة، عند تحديد عدد النقاط الزمنية التي ينبغي إدراجها في التحليل. أولا ، من المهم تضمين البيانات للحصول على نقاط زمنية كافية عبر فترة كافية من الزمن لتتبع النمو بدقة: يوصى بتشغيل المقايسات بطريقة يكون فيها الخميرة لديها الوقت للذهاب من خلال ~ 5 مضاعفات ، مع ما لا يقل عن 10 نقاط زمنية تم جمعها خلال تلك الفترة. ومع ذلك، فإن مجرد تضمين كل نقطة زمنية تم جمعها في حساب معدل النمو سيؤدي إلى تحيز يخفض معدل النمو بشكل مصطنع للعديد من المستعمرات. يمكن أن يحدث هذا التحيز عندما تمر الخلايا بمرحلة تأخر قبل بداية النمو (الشكل 4C). تأخر ما قبل النمو من المستعمرات الدقيقة أمر شائع ويختلف بين الشروط التجريبية وسلالات9،13. ويجب أن تكون أساليب التحليل التجريبية قادرة على التمييز بين النقاط الزمنية في فترة "النمو النشط" وبين تأخر ما قبل النمو؛ نهج واحد هو استخدام عدد محدد مسبقا من النقاط الزمنية في نافذة والعثور على النافذة التي تتوافق مع أعلى معدل نمو(الشكل 4C، خط صلب)11،13.

وأخيرا، واحدة من أهم الخطوات من المقايسة نمو الكولونية الدقيقة هي خطوة تخفيف الخميرة الخلية. يجب التحكم بعناية في تركيز الخلايا ونسبة الأنماط الجينية المختلفة داخل آبار لوحة المجهر. للتحليل الإحصائي من المهم أن تكون التجارب متوازنة بحيث يتم اختبار أعداد متساوية تقريبا من الخلايا لكل نمط وراثي وحالة ومقارنتها16. وبالإضافة إلى ذلك، لا يمكن قياس معدلات النمو المفيدة عادة بعد دمج المستعمرات المجاورة لأنه لم يعد من الممكن تمييز معدلات نمو المستعمرات الفردية؛ ولذلك، فإن الخلايا المطلية بكثافة أكثر تسفر عن بيانات النمو من نقاط زمنية أقل(الشكل 4D). والأهم من ذلك، إذا كانت كثافة الخلايا مرتفعة أو غير متساوية في بداية التجربة، فإن تصفية المستعمرات الدقيقة المدمجة ستستبعد بشكل غير متناسب المستعمرات الدقيقة الأسرع نموا من تحليلات المصب لأن المزارعين السريعين سوف يندمجون بشكل أكثر تواترا من المزارعين البطيءين. ولذلك، فإن قياسات النمو النهائية ستكون متحيزة نحو المجموعات السكانية الفرعية التي تشهد نموا أبطأ. بالإضافة إلى ذلك، قد يتم تصفية أعداد مختلفة من المستعمرات لعلاجات مختلفة، مما يمنع تجربة متوازنة. من المستحسن أن لوحة حوالي 4000 خلية لكل بئر في لوحة 96 جيدا (أو 700 خلية لكل بئر في لوحة 384 جيدا). خلط ماصة شاملة في جميع أنحاء الجزء تخفيف الخميرة من البروتوكول أمر حتمي لضمان أن العدد الصحيح من الخلايا موجودة في كل بئر، وأن يتم تفريق الخلايا بالتساوي في جميع أنحاء البئر. من المستحسن أيضا إزالة أي مستعمرات صغيرة من التحليل تكون مراكزها ضمن أقطار خلايا 25 تقريبا من بعضها البعض.

Figure 4
الشكل 4. المزالق التجريبية. (أ) المستعمرات المتنامية في وسائل الإعلام YEPD، مما يمنع ربط كفاءة الخلايا إلى concanavalin A. ظهور خلايا جديدة بعيدة عن أي مستعمرة (رؤوس الأسهم)، فضلا عن ظهور العديد من الخلايا خارج التركيز على حافة المستعمرة، هي نتيجة للخلايا فشل في الالتزام السطح الزجاجي والانجراف بعيدا عن المستعمرة أثناء النمو. (ب) خلايا من سلالة التعويم مباشرة بعد الطلاء دون sonication؛ لاحظ وجود أعداد كبيرة من مجموعات من خلايا متعددة (رؤوس الأسهم) ، والخلايا داخل مجموعات في مستويات بؤرية مختلفة. (ج) التغير في ln(area) مع مرور الوقت للمستعمرة ذات مرحلة التأخر الطويل. لاحظ أنه إذا تم استخدام جميع النقاط الزمنية لتقدير معدل النمو، فإن معدل النمو المقدر منخفض بشكل كبير؛ يتم إنتاج قياس دقيق فقط عند استخدام المجموعة الفرعية من النقاط الزمنية n (هنا n= 6) التي تؤدي إلى أعلى تقدير لمعدل النمو. (د) الخلايا التي كانت مطلية بكثافة كبيرة جدا تظهر في بداية التجربة وبعد 7 ساعة من النمو. تتبع الألوان المستعمرات الفردية حتى تندمج مع الجيران؛ هنا ، من خلال علامة 7 ساعة ، اندمجت غالبية المستعمرات ، مع عدد قليل فقط من المستعمرات الفردية بطيئة النمو المتبقية. (يتم فقدان تتبع مجموعة فرعية صغيرة من المستعمرات المعروضة هنا لأسباب لا علاقة لها بدمج المستعمرة.) كل شريط مقياس هو 50 ميكرومتر. الرجاء الضغط هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

البروتوكول الموصوف هنا هو اختبار متعدد الاستخدامات يسمح بمراقبة نمو الخلايا والتعبير الجيني في وقت واحد على مستوى الألوان الدقيقة الفردية. والجمع بين هذين الشكلين يسفر عن رؤى بيولوجية فريدة من نوعها. على سبيل المثال، استخدم العمل السابق هذا المقايسة لإظهار ارتباط سلبي بين التعبير عن جين TSL1 ومعدل نمو الألوان الدقيقة في خلايا النمط البري متساوية المنشأ عن طريق قياس كليهما في وقت واحد7،10. من الممكن أيضا مراقبة العلاقة بين معدل النمو وديناميكيات التعريب دون الخلوي للبروتينات الموسومة بالفلورسنت مع المقايسة الموصوفة. على سبيل المثال ، تم تحديد علاقة سلبية بين معدل النمو والإشغال النووي لعامل النسخ الموسومة ب RFP Msn2 عن طريق التصوير الفلوري في الخلايا كل دقيقة لمدة 30 دقيقة قبل تهيئة فحص النمو10. وأخيرا، يسمح هذا البروتوكول برصد استجابات الخلايا للضغوط والاضطرابات البيئية. يمكن إعطاء علاجات مثل الصدمة الحرارية في جزء من الطريق من خلال فحص النمو. وقد كشفت مثل هذه الدراسات، على سبيل المثال، أن الخلايا بطيئة النمو التي تعبر عن مستويات عالية من Tsl1 هي أكثر تسامحا من صدمة الحرارة 7،10.

وبالإضافة إلى المزالق الشائعة الموصوفة في قسم النتائج التمثيلية (الشكل 4)، يجب النظر في عدة عوامل رئيسية عند تصميم تجربة فحص النمو. يتأثر الاختلاف الظاهري الذي يقاس بالمقايسة بعوامل متعددة ، بعضها قابل للتكرار وصالح بطبيعته ، مثل النمط الجيني أو البيئة ، في حين أن البعض الآخر ناتج عن الاختلاف التقني13. ولذلك، فإن الاعتبار الهام الأول عند تصميم مقايسة الكولونات الدقيقة هو إجراء التجربة بطريقة تسهل فصل آثار الاهتمام عن الآثار الناجمة عن الاختلاف التقني؛ مفتاح هذا الفصل هي العلاجات العشوائية أو سلالات على لوحات تجريبية، بما في ذلك الضوابط في كل تجربة. يجب تطبيق الأساليب الإحصائية المناسبة، مثل النمذجة الخطية المختلطة (LMM)، على البيانات بعد جمعها، لمراعاة مصادر الاختلاف المختلفة في تحليل المصب17،18.

من أجل استخدام الأساليب الإحصائية لفصل الاختلاف في الأنماط الظاهرية للنمو بسبب المتغيرات التجريبية ذات الاهتمام من الاختلاف بسبب عوامل عشوائية مثل الآثار الدفعية ، من الضروري إجراء تجارب متعددة في أيام مختلفة ومع مواقع آبار عشوائية من النمط الجيني وظروف النمو. بالإضافة إلى ذلك ، لزيادة قوة التجربة للكشف عن اختلافات النمو بين السلالات أو ظروف العلاج ، من المهم أيضا تضمين تكرارات متعددة لكل نمط جيني أو حالة نمو تم اختبارها ، على لوحة تجريبية واحدة حيثما أمكن ذلك.

وتكمن إحدى المزايا الرئيسية لمقايسة نمو الكولونات الدقيقة في كمية البيانات التي يمكن جمعها: فطبقة تجريبية واحدة تولد عادة بيانات ل ~105 ميكروكولونات فردية، وهي عدة أوامر أكبر من التجارب النموذجية باستخدام أجهزة ميكروفلويديك بدلا من لوحات متعددة الأدوات. البرامج التي تتعقب المستعمرات تلقائيا وتحسب البيانات ذات الصلة (على سبيل المثال، أوقات التأخر، ومعدلات النمو، ومتوسط كثافة الفلورسنت) هي المفتاح للاستفادة الكاملة من هذا الفحص. هذا البرنامج يجب أن لا تحدد بقوة حدود مستعمرة وتتبع المستعمرات عبر الزمن، ولكن أيضا قياس صحيح النمو في المستعمرات مع مرحلة تأخر13. أحد الخيارات التي تم تطويرها لهذا الغرض هو PIE ، وهو برنامج مفتوح المصدر يتتبع المستعمرات بمرور الوقت (بما في ذلك المحاسبة عن التحولات في موقف المستعمرة) ، ويحسب معدلات النمو ، ويسمح بدمج بيانات التصوير الفلوري في القياسات التجريبية11،12.

يمكن استخدام اختبار نمو الألوان الدقيقة للحصول على نظرة ثاقبة على الأسئلة الأساسية المتعلقة بلياقة الخميرة وتطورها ، بما في ذلك تقلب النمط الظاهري للنمو ، والتغيرات في بيئات مختلفة أو استجابة للإجهاد ، والعلاقة بين النمو والتعبير عن البروتين أو التعريب دون الخلوي. وقد استخدم المقايسة على نطاق واسع في دراسات كل من السلالات المختبرية والبرية من S. cerevisiae7,9,10,13.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

وليس لدى صاحبي البلاغ ما يكشفان عنه.

Acknowledgments

نشكر نعومي زيف وساشا ليفي وشوانغ لي على مساهماتهم في تطوير هذا البروتوكول، وديفيد غريشام على المعدات المشتركة، وماريسا نول للمساعدة في إنتاج الفيديو. وقد تم دعم هذا العمل من قبل المعاهد الوطنية للصحة منحة R35GM118170.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
General Materials
500 mL Bottletop Filter .22 µm PES Sterilizing, Low Protein Binding, w/45mm Neck Fisher CLS431154 used to filter the media
BD Falcon*Tissue Culture Plates, microtest u-bottom Fisher 08-772-54 96-well culture tubes used to freeze cells, pre-grow cells, and dilutions
BD Syringes without Needle, 50 mL Fisher 13-689-8 Used to filter the Concanavalin A
Costar Sterile Disposable Reagent Reservoirs Fisher 07-200-127 reagent reservoirs used to pipette solutions with multichannel pipette
Costar Thermowell Aluminum Sealing Tape Fisher 07-200-684 96-well plate seal for pre-growth and freezing
lint and static free Kimwipes Fisher 06-666A lint and static free wipes to keep microscope plate bottom free of debris and scratches
Nalgene Syringe Filters ThermoFisher Scientific 199-2020 0.2 μm pore size, 25 mm diameter; used to filter concanavalin A solution
Media Components
Minimal chemically defined media (MD; 2% glucose) alternative microscopy media used for yeast pre-growth and growth during microscopy
Synthetic Complete Media (SC; 2% glucose) microscopy media used for yeast pre-growth and growth during microscopy
Yeast extract-peptone-dextrose (YEPD; 2% glucose) medium cell growth prior to freezing down randomized plates
Microscopy Materials
Breathe-Easy sealing membrane Millipore Sigma Z380059-1PAK breathable membranes used to seal plate during microscopy experiment. At this stage breathable membranes are recommended because they prevent condensation in the wells and allow for better microscopy images
Brooks 96-well flat clear glass bottom microscope plate Dot Scientific MGB096-1-2-LG-L microscope plate
Concanavalin A from canavalia ensiformis (Jack Bean), lyophilized powder Millipore Sigma 45-C2010-1G Make 5x concanavalin A solution and freeze 5ml of 5x concanavalin A in 50 mL conical tubes at -80 °C
Strains Used
MAH.5, MAH.96, MAH.52, MAH.66, MAH.11, MAH.58, MAH.135, MAH.15, MAH.44, MAH.132 Haploid mutation accumulation strains in a laboratory background, described in Hall and Joseph 2010
EP026.2A-2C Progeny of the ancestral Hall and Joseph 2010 mutation accumulation strain, transformed with YFR054cΔ::Scw11P::GFP
Equipment
Misonix Sonicator S-4000 with 96-pin attachment Sonicator https://www.labx.com/item/misonix-inc-s-4000-sonicator/4771281
Nikon Eclipse Ti-E with Perfect Focus System Inverted microscope with automated stage and autofocus system

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Geiler-Samerotte, K. A., Hashimoto, T., Dion, M. F., Budnik, B. A., Airoldi, E. M., Drummond, D. A. Quantifying condition-dependent intracellular protein levels enables high-precision fitness estimates. PloS one. 8 (9), 75320 (2013).
  2. Kussell, E., Leibler, S. Phenotypic diversity, population growth, and information in fluctuating environments. Science. 309 (5743), 2075-2078 (2005).
  3. Thattai, M., van Oudenaarden, A. Stochastic gene expression in fluctuating environments. Genetics. 167 (1), 523-530 (2004).
  4. King, O. D., Masel, J. The evolution of bet-hedging adaptations to rare scenarios. Theoretical population biology. 72 (4), 560-575 (2007).
  5. Acar, M., Mettetal, J. T., van Oudenaarden, A. Stochastic switching as a survival strategy in fluctuating environments. Nature genetics. 40 (4), 471-475 (2008).
  6. Avery, S. V. Microbial cell individuality and the underlying sources of heterogeneity. Nature reviews. Microbiology. 4 (8), 577-587 (2006).
  7. Levy, S. F., Ziv, N., Siegal, M. L. Bet hedging in yeast by heterogeneous, age-correlated expression of a stress protectant. PLoS biology. 10 (5), 1001325 (2012).
  8. van Dijk, D., et al. Slow-growing cells within isogenic populations have increased RNA polymerase error rates and DNA damage. Nature communications. 6, 7972 (2015).
  9. Ziv, N., Shuster, B. M., Siegal, M. L., Gresham, D. Resolving the Complex Genetic Basis of Phenotypic Variation and Variability of Cellular Growth. Genetics. 206 (3), 1645-1657 (2017).
  10. Li, S., Giardina, D. M., Siegal, M. L. Control of nongenetic heterogeneity in growth rate and stress tolerance of Saccharomyces cerevisiae by cyclic AMP-regulated transcription factors. PLoS genetics. 14 (11), 1007744 (2018).
  11. Plavskin, Y., Li, S., Ziv, N., Levy, S. F., Siegal, M. L. Robust colony recognition for high-throughput growth analysis from suboptimal low-magnification brightfield micrographs. bioRxiv. , (2018).
  12. Siegallab. , Available from: http://github.com/Siegallab/PIE (2020).
  13. Ziv, N., Siegal, M. L., Gresham, D. Genetic and nongenetic determinants of cell growth variation assessed by high-throughput microscopy. Molecular biology and evolution. 30 (12), 2568-2578 (2013).
  14. Hall, D. W., Joseph, S. B. A high frequency of beneficial mutations across multiple fitness components in Saccharomyces cerevisiae. Genetics. 185 (4), 1397-1409 (2010).
  15. Saleemuddin, M., Husain, Q. Concanavalin A: a useful ligand for glycoenzyme immobilization--a review. Enzyme and microbial technology. 13 (4), 290-295 (1991).
  16. Geiler-Samerotte, K. A., Bauer, C. R., Li, S., Ziv, N., Gresham, D., Siegal, M. L. The details in the distributions: why and how to study phenotypic variability. Current opinion in biotechnology. 24 (4), 752-759 (2013).
  17. Nakagawa, S., Schielzeth, H. Repeatability for Gaussian and non-Gaussian data: a practical guide for biologists. Biological reviews of the Cambridge Philosophical Society. 85 (4), 935-956 (2010).
  18. Bolker, J. A. Exemplary and surrogate models: two modes of representation in biology. Perspectives in biology and medicine. 52 (4), 485-499 (2009).

Tags

علم الأحياء، العدد 170، معدل النمو، Saccharomyces cerevisiae،عدم التجانس غير الجيني، المجهر عالي الإنتاجية، الاختلاف الطبيعي
تصوير حي عالي الإنتاجية للمستعمرات الدقيقة لقياس التغايرية في النمو والتعبير الجيني
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Sartori, F. M. O., Buzby, C.,… More

Sartori, F. M. O., Buzby, C., Plavskin, Y., Siegal, M. L. High-Throughput Live Imaging of Microcolonies to Measure Heterogeneity in Growth and Gene Expression. J. Vis. Exp. (170), e62038, doi:10.3791/62038 (2021).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter