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Biology

विकास और जीन अभिव्यक्ति में विषमता को मापने के लिए माइक्रोकॉलोनियों की उच्च-थ्रूपुट लाइव इमेजिंग

Published: April 18, 2021 doi: 10.3791/62038
Automatic Translation
1, 1, 1, 1
1Center for Genomics and Systems Biology, Department of Biology, New York University

Summary

खमीर विकास फेनोटाइप को माइक्रोकॉलनी में बढ़ने वाली स्थिर कोशिकाओं के अत्यधिक समानांतर समय-चूक इमेजिंग के माध्यम से ठीक मापा जाता है। इसके साथ ही, तनाव सहिष्णुता, प्रोटीन अभिव्यक्ति, और प्रोटीन स्थानीयकरण की निगरानी की जा सकती है, एकीकृत डेटासेट पैदा करने के लिए कैसे पर्यावरण और आनुवंशिक मतभेदों का अध्ययन करने के लिए, साथ ही जीन अभिव्यक्ति विषमता आइसोजेनिक कोशिकाओं के बीच, विकास मिलाना ।

Abstract

माइक्रोबियल विकास दर में बीच और भीतर तनाव विषमता के सटीक माप तनाव सहिष्णुता, रोगजनकता, और फिटनेस के अन्य प्रमुख घटकों में आनुवंशिक और पर्यावरणीय आदानों को समझने के लिए आवश्यक हैं। यह पांडुलिपि एक माइक्रोस्कोप-आधारित परख का वर्णन करती है जो प्रति प्रयोग लगभग 105 सैकरोमाइसेस सेरेविसिया माइक्रोकॉलनी को ट्रैक करती है। एक मल्टीवेल प्लेट में स्थिर खमीर के स्वचालित समय-चूक इमेजिंग के बाद, माइक्रोकॉलोनी विकास दर आसानी से कस्टम छवि विश्लेषण सॉफ्टवेयर के साथ विश्लेषण कर रहे हैं । प्रत्येक माइक्रोकॉलोनी के लिए, फ्लोरोसेंट प्रोटीन की अभिव्यक्ति और स्थानीयकरण और तीव्र तनाव के अस्तित्व पर भी नजर रखी जा सकती है। यह परख उपभेदों की औसत वृद्धि दर के सटीक अनुमान की अनुमति देता है, साथ ही क्लोनल आबादी के भीतर विकास, जीन अभिव्यक्ति और तनाव सहिष्णुता में विषमता का व्यापक मापन करता है।

Introduction

विकास फेनोटाइप खमीर फिटनेस के लिए गंभीर योगदान करते हैं। प्राकृतिक चयन प्रभावी जनसंख्या आकार के विपरीत से भिन्न विकास दर के साथ वंश के बीच कुशलता से अंतर कर सकता है, जो 108 व्यक्तियों से अधिक हो सकता है1। इसके अलावा, जनसंख्या के भीतर व्यक्तियों के बीच विकास दर की परिवर्तनशीलता एक विकासवादी रूप से प्रासंगिक पैरामीटर है, क्योंकि यह शर्त हेजिंग2,3,4,5,6 जैसी अस्तित्व रणनीतियों के लिए आधार के रूप में काम करसकताहै। इसलिए, परख है कि विकास फेनोटाइप के अत्यधिक सटीक माप के लिए अनुमति देते हैं और उनके वितरण सूक्ष्मजीवों के अध्ययन के लिए निर्णायक हैं। यहां वर्णित माइक्रोकॉलोनी विकास परख प्रति प्रयोग ~ 105 माइक्रोकॉलन के लिए व्यक्तिगत विकास दर माप उत्पन्न कर सकती है। इस परख इसलिए खमीर विकासवादी आनुवंशिकी और जीनोमिक्स का अध्ययन करने के लिए एक शक्तिशाली प्रोटोकॉल प्रदान करता है। यह अपने आप को विशेष रूप से अच्छी तरह से परीक्षण करने के लिए उधार देता है कि आनुवंशिक रूप से समान एकल कोशिकाओं की आबादी के भीतर परिवर्तनशीलता कैसे उत्पन्न होती है, बनाए रखा जाता है, और जनसंख्याफिटनेस7, 8,9,10में योगदान देता है।

यहां वर्णित विधि(चित्रा 1)माइक्रोकॉलन में विकास को ट्रैक करने के लिए तरल मीडिया में 96-या 384-अच्छी तरह से ग्लास-बॉटम प्लेट पर बढ़ने वाली कोशिकाओं की समय-समय पर कैप्चर की गई, कम आवर्धन ब्राइटफील्ड छवियों का उपयोग करती है। कोशिकाएं लेक्टिन कॉनकानवेलियन ए का पालन करती हैं, जो माइक्रोस्कोप प्लेट के नीचे कोट करती हैं, और दो आयामी उपनिवेश बनाती हैं। क्योंकि माइक्रोकॉलोनी मोनोलेयर में बढ़ती है, माइक्रोकॉलोनी क्षेत्र सेल संख्या7के साथ अत्यधिक सहसंबद्ध है। इसलिए, माइक्रोकॉलोनी विकास दर और अंतराल समय के सटीक अनुमान कस्टम छवि-विश्लेषण सॉफ्टवेयर के साथ उत्पन्न किए जा सकते हैं जो प्रत्येक माइक्रोकॉलोनी के क्षेत्र के परिवर्तन की दर को ट्रैक करता है। इसके अलावा, प्रायोगिक सेटअप इन माइक्रोकॉलनियों में व्यक्त फ्लोरोसेंटली लेबल प्रोटीन के बहुतायत और यहां तक कि उपकोशिकीय स्थानीयकरण की निगरानी कर सकता है। इस माइक्रोकॉलोनी विकास परख से डेटा के डाउनस्ट्रीम प्रसंस्करण कस्टम विश्लेषण द्वारा या मौजूदा छवि विश्लेषण सॉफ्टवेयर द्वारा प्राप्त किया जा सकता है, जैसे कि प्रोसेसिंग इमेजेज आसानी से (पाई)11,मजबूत कॉलोनी क्षेत्र मान्यता के लिए एक एल्गोरिदम और कम आवर्धन, ब्राइटफील्ड छवियों से उच्च-थ्रूपुट विकास विश्लेषण, जो गिटहब12के माध्यम से उपलब्ध है।

क्योंकि माइक्रोकॉलोनी-विकास परख से प्राप्त विकास दर अनुमान बड़ी संख्या में एकल-कॉलोनी मापों से उत्पन्न होते हैं, वे बेहद सटीक होते हैं, मानक त्रुटियों के साथ एक यथोचित आकार के प्रयोग के लिए अनुमानों की तुलना में परिमाण के कई आदेश छोटे होते हैं। इसलिए, विभिन्न जीनोटाइप, उपचार या पर्यावरणीय स्थितियों के बीच विकास दर के अंतर का पता लगाने के लिए परख की शक्ति अधिक है। मल्टीवेल-प्लेट प्रारूप कई अलग-अलग वातावरण और जीनोटाइप संयोजनों को एक ही प्रयोग में तुलना करने की अनुमति देता है। यदि उपभेदों का गठन विभिन्न फ्लोरोसेंट मार्कर व्यक्त करते हैं, तो उन्हें एक ही कुएं में मिलाया जा सकता है और बाद में छवि विश्लेषण द्वारा प्रतिष्ठित किया जा सकता है, जो अच्छी तरह से डेटा सामान्यीकरण की अनुमति देकर बिजली को और बढ़ा सकता है।

Figure 1
चित्रा 1:प्रोटोकॉल का योजनाबद्ध प्रतिनिधित्व। यह प्रोटोकॉल दो मुख्य चरणों का पालन करता है, जो प्रयोगात्मक प्लेट की तैयारी और कोशिकाओं को छवि के लिए तैयार कर रहे हैं। प्लेटों का यादृच्छिकीकरण और कोशिकाओं का विकास प्रयोग दिवस तक पहले और अग्रणी होना चाहिए। कमजोर पड़ने के दौरान प्रत्येक चरण में कोशिकाओं का बार-बार मिश्रण चढ़ाना तक चरणों में जरूरी है, और इसलिए प्रयोगात्मक प्लेट को पहले तैयार करने की सिफारिश की जाती है ताकि यह कोशिका कमजोर पड़ने के पूरा होने पर तुरंत चढ़ाना के लिए तैयार हो। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें ।

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Protocol

1. रैंडमाइज्ड प्लेट्स की तैयारी (प्रयोग दिवस से पहले)

  1. विकास परख के साथ परीक्षण किए जाने वाले उपभेदों और शर्तों की योजना बनाएं। इस बिंदु पर, बेतरतीब ढंग से किसी भी अच्छी तरह से उपभेदों और शर्तों को आवंटित करें।
    नोट: प्लेट सेटअप पर विचार करते समय, माप में अच्छी तरह से संबंधित शोर के लिए खाते में एक ही प्लेट पर तनाव और विकास की स्थिति के अनुसार एक से अधिक दोहराने को शामिल करने की सलाह दी जाती है। अधिक जानकारी के लिए चर्चा देखें।
  2. गणनाकरने से प्लेट प्रतिकृति के लिए प्रत्येक तनाव और पर्यावरणीय स्थिति के स्थान को यादृच्छिक रूप से अलग-अलग दिनों में चलाया जाएगा।
  3. 30 डिग्री सेल्सियस (या किसी अन्य उपयुक्त तापमान) पर एक शेखर में खमीर निकालने-पेप्टोन-डेक्सट्रोस (YEPD; 2% ग्लूकोज) माध्यम में संतृप्ति के लिए प्रयोग में उपयोग की जाने वाली सभी कोशिकाओं को बढ़ाएं।
  4. यादृच्छिक स्टॉक प्लेटें या तो मैन्युअल रूप से या तरल हैंडलिंग रोबोट के साथ बनाएं। एक बाँझ यू-बॉटम ऊतक संस्कृति प्लेट के प्रत्येक कुएं में नामित संतृप्त कोशिकाओं के 10 माइक्रोन जोड़ें। यदि एक ही कुएं में कई उपभेदों का परीक्षण किया जाएगा, तो उन्हें इस बिंदु पर गठबंधन न करें; यह संयोजन प्रयोग के दिन सेल कमजोर पड़ने से ठीक पहले किया जाएगा ताकि यह सुनिश्चित किया जा सके कि माइक्रोकॉलोनी संस्थापक कोशिकाओं के रूप में चढ़ाया जाने पर सभी उपभेद सही सांद्रता पर हों।
  5. प्रत्येक प्लेट के प्रत्येक कुएं में 30% ग्लाइसरोल का 10 माइक्रोल जोड़ें। ऊपर और नीचे पिपेट करें ताकि कोशिकाएं और ग्लिसरोल अच्छी तरह से मिश्रित हो जाएं।
  6. एक पन्नी कवर के साथ प्रत्येक प्लेट सील और उपयोग करने के लिए तैयार होने तक -70 डिग्री सेल्सियस पर तुरंत नीचे फ्रीज।
    नोट: एक ही दिन सभी यादृच्छिक प्लेटें बनाना महत्वपूर्ण है, और उन्हें फ्रीज करना महत्वपूर्ण है, ताकि प्रत्येक प्लेट में कोशिकाओं की पूर्व-वृद्धि स्थितियां समान रही हों और विकास दर परख में तकनीकी भिन्नता उत्पन्न न हों।

2. खमीर के पूर्व विकास

नोट: आमतौर पर, यह प्रयोग दिवस से पहले शुरू होता है और प्रयोगात्मक प्रश्न पर अत्यधिक निर्भर है। विवरण के लिए चर्चा देखें।

  1. -70 डिग्री सेल्सियस फ्रीजर से एक स्टॉक प्लेट (10 माइक्रोन यीस्ट, 10 माइक्रोन ग्लाइस्रोल प्रति अच्छी तरह से) निकालें और प्रयोग के लिए उपयोग किए जाने वाले मीडिया के 180 माइक्रोन जोड़ें। यदि प्रयोग पोषक तत्वों को सीमित मीडिया का उपयोग कर आयोजित किया जाएगा, पूर्व नहीं बढ़ने खमीर के रूप में खमीर के sporulation हो सकता है पोषक तत्व सीमित मीडिया में संतृप्ति के लिए खमीर । इसके बजाय, गैर सीमित मीडिया में पूर्व बढ़ने ।
  2. 30 डिग्री सेल्सियस पर मिलाते हुए खमीर बढ़ें। विचार करें कि क्या लॉग चरण में कोशिकाओं के साथ शुरू करने के लिए या स्थिर चरण में निर्धारित करने के लिए अगर प्रयोग से पहले कई बार कोशिकाओं को कमजोर करने के लिए आवश्यक हो जाएगा । यदि परख में खमीर उपभेदों या स्थितियों में काफी अलग विकास दर होने की उम्मीद है, तो स्थिर चरण तक पहुंचने के लिए सभी विभिन्न स्थितियों के लिए दो दिन की पूर्व-विकास अवधि आवश्यक होगी।

3. माइक्रोस्कोप सेटअप

  1. माइक्रोस्कोप प्लेट तैयार
    1. सुनिश्चित करें कि माइक्रोस्कोप इनक्यूबेटर चालू है और प्रायोगिक स्थितियों के लिए वांछित विकास तापमान के लिए माइक्रोस्कोप कक्ष को गर्म कर रहा है। सैकरोमाइसेस सेरेविसी कोशिकाओं का उपयोग करके मानक प्रयोगों के लिए, इनक्यूबेटर को माइक्रोस्कोप चैंबर को 30 डिग्री सेल्सियस तक गर्म करना चाहिए ताकि यह सुनिश्चित किया जा सके कि विकास दर परख के दौरान कोशिकाओं के लिए विकास की स्थिति सही होगी।
    2. 70% इथेनॉल के साथ कार्यक्षेत्र, पिपेट और अन्य उपकरणों को साफ करें। एक माइक्रोस्कोप प्लेट को पुनः प्राप्त करें और इसे एक लिंट-और स्थिर-मुक्त पोंछ के शीर्ष पर बेंच पर रखें।
      नोट: माइक्रोस्कोप प्लेट के नीचे कभी न स्पर्श करें, यहां तक कि दस्ताने के साथ, और हमेशा माइक्रोस्कोप प्लेट को एक लिंट के शीर्ष पर सेट करें- और स्थिर-मुक्त पोंछ किसी भी समय यह किसी भी सतह को छूता है। यह प्रयोग इमेज डे होने के बाद विकास दर माप में बाधा बनने से धब्बा या खरोंच को रोकता है।
    3. गल 5x concanavalin एक समाधान के 5 एमएल, पानी के साथ 1x करने के लिए पतला, और एक 0.2-μm फिल्टर के साथ लगे एक सिरिंज के माध्यम से बंध्याकरण फिल्टर ।
    4. फिल्टर अन्य सभी तरल पदार्थ है कि एक 0.2 माइक्रोन फिल्टर के साथ परख में इस्तेमाल किया जाएगा, प्रयोगात्मक मीडिया सहित, किसी भी क्रिस्टल या मलबे है कि समाधान में मूर्त रूप दिया हो सकता है हटाने के लिए बंध्याकरण। क्रिस्टल की उपस्थिति माइक्रोस्कोपी छवियों की गुणवत्ता को कम करेगी।
    5. पिपेट 200 माइक्रोन का एक समाधान माइक्रोस्कोप प्लेट के प्रत्येक कुएं में।
    6. प्लेट के नीचे एक लिंट और स्थिर-मुक्त पोंछ के साथ 411 x गुरुत्वाकर्षण(जी)पर 2 मिनट के लिए प्लेट को अपकेंद्रित्र करें, यह सुनिश्चित करने के लिए कि कॉन्सनवेलियन एक समाधान समान रूप से प्रत्येक कुएं के नीचे को कवर करता है और कोई हवा के बुलबुले नहीं हैं।
    7. प्लेट को उसके ढक्कन से ढक कर रख दें और इसे 1-2 घंटे के लिए बैठने दें। सटीक समय प्लेट बैठता है लचीला है, लेकिन यह प्रयोग के विभिन्न रन के बीच संगत होना महत्वपूर्ण है।
    8. या तो सक्शन द्वारा या जबरदस्ती इसे सिंक या एक गोदाम में निर्वहन करके थाली से एक समाधान के सभी concanavalin निकालें । ध्यान रहे कि थाली के कांच के हिस्से को न छुएं। यह स्वीकार्य है अगर concanavalin एक समाधान की कुछ बूंदें कुओं में रहते हैं ।
    9. 400 माइक्रोन बाँझ पानी डालकर माइक्रोस्कोप प्लेट कुओं को धोएं। पिछले चरण में कॉनकावलियन ए के साथ किए गए पानी को हटा दें। थाली को सूखने न दें.
    10. तुरंत प्लेट में 185 माइक्रोन प्रायोगिक विकास मीडिया जोड़ें। इस प्लेट में सही ढंग से पतला कोशिकाओं के 15 माइक्रोन जोड़े जाएंगे।
  2. खमीर सेल कमजोर पड़ने
    नोट: नीचे दिए गए कदम एक संतृप्त संस्कृति (लगभग 108 कोशिकाओं/एमएल) 400 गुना से खमीर के एक कमजोर पड़ने का वर्णन 250,000 कोशिकाओं की एकाग्रता को प्राप्त करने के लिए/ 15 माइक्रोन जिनमें से ग्लास-बॉटम प्लेट में 400 माइक्रोन में पतला किया जाएगा, जो 96-अच्छी प्लेट में लगभग 4000 कोशिकाओं की अंतिम संख्या देता है। यदि एक 384-अच्छी तरह से थाली का उपयोग कर प्रति अच्छी तरह से कोशिकाओं की अंतिम संख्या लगभग 700 होना चाहिए और कमजोर पड़ने तदनुसार समायोजित किया जाना चाहिए। इस अनुपात को लॉग चरण में एकत्र कोशिकाओं के लिए समायोजित किया जाना चाहिए, जो अमीर या गरीब पूर्व-विकास मीडिया में बढ़ रहा है, या विभिन्न उपभेदों से। 10 घंटे से अधिक समय अवधि के लिए विकास दर परख चलाते समय प्रति अच्छी तरह से कोशिकाओं के अंतिम घनत्व को कम किया जाना चाहिए।
    1. धारावाहिक कमजोर पड़ने के लिए दो 96-अच्छी तरह से संस्कृति प्लेटें सेट करें: प्लेट 1 और 2 के रूप में लेबल, और प्रत्येक धारावाहिक कमजोर पड़ने की प्लेट में 90 माइक्रोन प्रायोगिक विकास मीडिया (यानी, मीडिया कि खमीर माइक्रोस्कोप पर बढ़ेगा) जोड़ें।
      नोट: अंतिम कमजोर पड़ने का उपयोग किए जाने की परवाह किए बिना, कोशिकाओं के कम से कम दो धारावाहिक कमजोर पड़ने की सिफारिश की जाती है, जिनमें से प्रत्येक में खमीर की एक छोटी मात्रा को प्रयोगात्मक मीडिया की एक बड़ी मात्रा में पिपेट किया जाता है और फिर प्रयोगात्मक मीडिया की एक बड़ी मात्रा को एक पिपेट के साथ सख्ती से मिलाया जाता है (जैसा कि कदम 3.2.5 और नीचे 3.2.6 में)।
    2. पूर्व वृद्धि से कोशिकाओं की थाली पुनः प्राप्त करने और 411 x gपर 2 मिनट के लिए थाली अपकेंद्रित्र ।
      नोट: यह बहुत महत्वपूर्ण है कि थाली में विभिन्न कुओं को पार न करें। प्लेटों से कवर पन्नी को हटाने से पहले इस अपकेंद्रित्र कदम का उद्देश्य यह सुनिश्चित करना है कि एक कुएं से खमीर से भरी बूंदें पन्नी से उड़न न करें और अन्य कुओं में खत्म न करें। अपकेंद्रित्र के बाद पन्नी को कवर करने के संपर्क में आने से बचने के लिए प्लेटों को झुकाने या उत्तेजित करने के लिए कभी भी सावधान न रहें।
    3. ध्यान से वापस पन्नी छील और तेजी से एक पिपेट सेट के साथ कोशिकाओं को पुन: खर्च करने के लिए लगभग एक-आधा थाली में कुल मात्रा जबकि अच्छी तरह से चारों ओर पाइप ले मिश्रण करने के लिए सेट । जांच करें कि सभी कोशिकाओं को कुओं के नीचे से फिर से निलंबित कर दिया गया है ।
    4. यदि व्यक्तिगत कुओं के भीतर कई उपभेदों का उपयोग किया जाएगा, तो प्रयोग के लिए आवश्यक अनुपात में इस समय उपभेदों को मिलाया जाना चाहिए। यदि विकास दर मापन उत्पन्न करने के लिए संदर्भ तनाव का उपयोग किया जाएगा, तो परीक्षण तनाव के संदर्भ का अनुपात 1:1 होना चाहिए।
    5. विकास मीडिया से खमीर के पिपेट 10 माइक्रोन कमजोर पड़ने की थाली 1 में। प्रत्येक अच्छी तरह से प्रयोगात्मक विकास मीडिया के 100 माइक्रोन जोड़ें। ऊपर और नीचे तेजी से पिपेट ।
    6. प्लेट 1 से प्लेट 2 में खमीर के 10 माइक्रोल पिपेट। प्रत्येक अच्छी तरह से प्रयोगात्मक विकास मीडिया के 100 μL जोड़ें, और मिश्रण करने के लिए तेजी से ऊपर और नीचे पिपेट करें।
      नोट: ये कमजोर पड़ने के कदम खमीर के अलग समूहों की मदद करने के लिए महत्वपूर्ण हैं जो पूर्व-विकास चरण के अंत में एक साथ अटके हुए हैं और यह सुनिश्चित करते हैं कि खमीर कोशिकाओं की लगभग बराबर संख्या प्रत्येक अच्छी तरह से समाप्त हो। प्रत्येक कुएं में खमीर की लगातार संख्या होने से विकास दर मापन में प्रयोगात्मक शोर और पूर्वाग्रहों को दूर करने में मदद मिलती है (प्रतिनिधि परिणाम देखें)।
  3. सोनीशन
    नोट: सोनीशन वैकल्पिक है,और केवल खमीर उपभेदों के लिए प्रदर्शन करने की आवश्यकता है जिसमें एक दूसरे का पालन करने की उच्च प्रवृत्ति है (उदाहरण के लिए, कुछ जंगली उपभेद)। प्रयोगशाला उपभेदों के लिए, सोनीशन आम तौर पर आवश्यक नहीं है और 3.4 चरण के लिए आगे बढ़ने से छोड़ दिया जा सकता है।
    1. 70% इथेनॉल के साथ 96-पिन सोनिकेटर हेड को 70% इथेनॉल के साथ साफ करें, इसे 70% इथेनॉल से भरी 96-अच्छी तरह से प्लेट में रखकर और एक लिंट और स्थिर मुक्त पोंछ के साथ सूखा।
    2. एक सोनिकेशन प्रोग्राम सेट करें जो फ्लॉस्कुलेटेड यीस्ट कोशिकाओं को तोड़ने के लिए पर्याप्त रूप से मजबूत है, लेकिन कोशिकाओं को नहीं मारता है या ऊंचा तनाव प्रतिक्रियाओं का कारण नहीं बनता है। दिए गए प्रयोग के लिए सर्वश्रेष्ठ सोनीशन कार्यक्रम की पहचान करने के लिए कुछ परीक्षण की आवश्यकता हो सकती है। इस प्रयोग में उपयोग किया जाने वाला सोनीशन कार्यक्रम है: आयाम = 10, प्रक्रिया समय = 10 एस, पल्स-ऑन = 1 एस, पल्स-ऑफ = 1 एस। यह सटीक कार्यक्रम सभी सोनिकेटरों पर लागू नहीं होने की संभावना है, इसलिए प्रयोग दिवस से पहले परीक्षण का सुझाव दिया जाता है।
    3. धारावाहिक कमजोर पड़ने की थाली में खमीर मिश्रण 2 एक बार फिर से ऊपर और नीचे तेजी से पांच बार पाइपिंग द्वारा ।
    4. मंच पर कमजोर पड़ने की प्लेट 2 रखें और इसे सेल निलंबन में सोनिकेटर पिन के साथ सुरक्षित करें लेकिन प्लेट के नीचे को न छूएं। उचित कान संरक्षण का उपयोग कर सोनीशन कार्यक्रम चलाएं।
    5. कार्यक्रम चलने के बाद, सोनिकेटर हेड को 70% इथेनॉल और फिर पानी से साफ करें, और फिर तुरंत माइक्रोस्कोप प्लेट तैयार करने के लिए आगे बढ़ें ताकि कोशिकाएं फिर से फ्लॉस्केट न करें।
  4. माइक्रोस्कोप के लिए प्लेट तैयार करें:
    1. धारावाहिक कमजोर पड़ने की थाली 2 से खमीर के 15 माइक्रोन 2 200 माइक्रोन की मात्रा में। प्रत्येक अच्छी तरह से प्रयोगात्मक विकास मीडिया के 200 माइक्रोन जोड़ें, प्रति अच्छी तरह से 400 माइक्रोन की अंतिम मात्रा में, और मिश्रण करने के लिए तेजी से ऊपर और नीचे पिप्ट करें।
    2. एक सांस झिल्ली के साथ थाली को कवर करें। इस झिल्ली के साथ प्लेट को अच्छी तरह से सील करना महत्वपूर्ण है, उदाहरण के लिए रबर रोलर का उपयोग करना।
    3. कांच की सतह पर कॉनकावलियन ए के लिए खमीर कोशिकाओं का पालन करने के लिए, 411 x ग्रामपर 2 मिनट के लिए एक लिंट और स्थिर मुक्त पोंछ के साथ प्लेट को अपकेंद्रित्र करें।
    4. माइक्रोस्कोप में, प्लेट के ऊपर और नीचे एक लिंट और स्थिर मुक्त पोंछ के साथ पोंछें, और मलबे से छुटकारा पाने के लिए प्लेट पर संकुचित हवा उड़ा दें।
    5. माइक्रोस्कोप पर थाली प्लेस, यकीन है कि यह स्तर है और यह कि A1 अच्छी तरह से शीर्ष बाएं कोने में है ।

4. समय-चूक माइक्रोस्कोपी विकास दर माप

नोट: समय-चूक माइक्रोस्कोपी के दौरान निम्नलिखित विशेषताएं कंप्यूटर नियंत्रित होती हैं: एक्स, वाई, और जेड स्थिति, शटर और फ्लोरेसेंस फिल्टर। एक हार्डवेयर आधारित ऑटो फोकस प्रणाली समय चूक इमेजिंग के दौरान फोकल विमान बहाव को रोकने के लिए इष्टतम है । वैकल्पिक रूप से, एक सॉफ्टवेयर आधारित ऑटो-फोकसिंग लूप का उपयोग किया जा सकता है। माइक्रोस्कोप कक्ष में आर्द्रता बनाए रखने के लिए, प्रयोग की अवधि के दौरान कक्ष में शुद्ध पानी के साथ एक बीकर रखने की सलाह दी जाती है।

  1. छवि के लिए पदों (x, y) की एक सूची बनाएं, ताकि प्रत्येक माइक्रोस्कोप-प्लेट अच्छी तरह से पूरी तरह से इमेज्ड हो। ओवरलैपिंग छवियों से बचें ताकि किसी भी सेल का कई बार विश्लेषण न किया जा सके।
  2. 15x के आवर्धन पर डायस्कोपिक रोशनी (व्यास) के साथ ब्राइटफील्ड में छवि। ~5 एमएस के लिए एक्सपोजर सेट करें।
  3. डिजिटल रूप से छवि पर ज़ूम इन करें ताकि कोशिकाएं स्पष्ट रूप से दिखाई दे सकें। प्लेट के कोने पर चार कुओं में प्रयोग के लिए आदर्श ध्यान की पहचान करने के लिए ध्यान केंद्रित घुंडी का उपयोग करें और थाली के केंद्र में एक अच्छी तरह से। कोशिकाओं के अधिकतम विपरीत प्राप्त करने के लिए इस तरह से ध्यान केंद्रित करें।
  4. प्रयोग के लिए जेड स्थिति (या ऑटोफोकस स्थिति) सेट करें जो इन कुओं में से प्रत्येक के लिए पहचाने गए जेड/ऑटोफोकस पदों का औसत हो । यदि माइक्रोस्कोप प्लेट अच्छी तरह से बनाई गई है और ग्लास बॉटम में दोष नहीं हैं, तो आदर्श फोकस स्थितियां प्रत्येक अच्छी तरह से समान होनी चाहिए।
    नोट: प्रसंस्करण छवियों के साथ छवियों का विश्लेषण करते समय आसानी से (पाई) छवि विश्लेषण पाइपलाइन11,12,यह कोशिकाओं के लिए उपयोगी है माइक्रोस्कोप पर ध्यान केंद्रित करने से थोड़ा बाहर है ताकि कोशिका के बाहर एक अंधेरा रिम और एक हल्के रंग का इंटीरियर हो, जो सटीक कॉलोनी मान्यता और आकार अनुमानों में एड्स हो।
  5. फ्लोरोसेंट उपभेदों का उपयोग कर रहे हैं, तो चैनलों और एक्सपोजर की पहचान करें जिनके साथ छवि है, यह सुनिश्चित करना कि कोई पिक्सेल अधिक उजागर न हो। फ्लोरोसेंट चैनलों के लिए एक्सपोजर समय सेट करते समय, माइक्रोस्कोप पर "लाइव कैप्चर" मोड को बंद कर दें ताकि कोशिकाओं को लंबे समय तक फ्लोरेसेंस उत्तेजन के संपर्क में आने से बचा जा सके, क्योंकि यह दोनों कोशिकाओं को फोटोब्लैक कर सकते हैं और तनाव पैदा कर सकते हैं।
  6. समय की वांछित लंबाई के लिए वांछित समय अंतराल पर छवियों को कैप्चर करने के लिए समय-अनुक्रम अधिग्रहण सेट करें।
  7. प्रयोग चलाएं।

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Representative Results

इस प्रोटोकॉल की नवीनता यह है कि विकास दर की गणना जनसंख्या के भीतर व्यक्तिगत कोशिकाओं के लिए समय-चूक इमेजिंग(चित्रा 2 ए)के माध्यम से माइक्रोकॉलोनियों में उनके विकास को ट्रैक करके की जा सकती है। चूंकि कॉनकानवेलियन ए की उपस्थिति के कारण माइक्रोकॉलन कई घंटों तक एक प्लैनायर तरीके से बढ़ते हैं, इसलिए उनके क्षेत्रों को पूरे प्रयोग में ट्रैक किया जा सकता है, और समय के साथ क्षेत्र के प्राकृतिक लॉग में परिवर्तन के लिए एक रैखिक फिट का उपयोग प्रत्येक कॉलोनी के लिए विकास दर की गणना करने के लिए किया जा सकता है 7,9,10,13। एक ही वातावरण में व्यक्तिगत आइसोजेनिक कोशिकाओं के लिए माइक्रोकॉलोनी विकास दर में अंतर स्पष्ट रूप से दर्ज किया जाता है(आंकड़े 2A, 2B)। इमेज-एनालिसिस सॉफ्टवेयर का उपयोग माइक्रोकॉलोनी आकार और फ्लोरेसेंस(चित्रा 2सी)में परिवर्तनों को स्वचालित रूप से ट्रैक करने के लिए किया जाना चाहिए; फिगर 2ए में दिखाया गया कॉलोनी ट्रैकिंग पाई11,12का उपयोग कर किया गया था .

Figure 2
चित्र 2:खमीर माइक्रोकॉलनी में विकास दर और फ्लोरेसेंस का मात्राकरण। (क) एक एकल इमेजिंग फ़ील्ड का एक हिस्सा प्रयोग की शुरुआत में, 3 घंटे के बाद, और 6 घंटे के बाद, पाई कॉलोनी ट्रैकिंग सॉफ्टवेयर का उपयोग करके कॉलोनी ट्रैकिंग दिखाता है। कालोनियों प्रयोग की अवधि के लिए एक मोनोलेयर में बढ़ रही दिख रही है । (ख) पैनल ए में ट्रैक की गई कॉलोनियों के लिए समय के साथ एलएन (क्षेत्र) में परिवर्तन । यदि कॉलोनी के लिए पर्याप्त टाइमपॉइंट डेटा मौजूद है, तो इसकी विकास दर और पूर्व-विकास अंतराल समय की गणना की जा सकती है। (ग) प्रयोग के विकास भाग के पूरा होने के बाद लिए गए पैनल ए में कालोनियों के लिए जीएफपी फ्लोरेसेंस तीव्रता दिखाने वाली छवि, 6-एच टाइमपॉइंट मढ़ा से कॉलोनी की रूपरेखा के साथ । यहां, Scw11P:: GFP हर प्रयोगात्मक अच्छी तरह से शामिल एक संदर्भ तनाव को चिह्नित करता है। प्रत्येक कॉलोनी के जीएफपी फ्लोरेसेंस स्तर की गणना करने से यह निर्धारण होता है कि कौन सी उपनिवेश संदर्भ तनाव से उत्पन्न होते हैं, और प्रत्येक कुएं में गैर-संदर्भ उपभेदों से कौन सा। प्रत्येक स्केल बार 50 माइक्रोन है। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

आमतौर पर, प्रति प्रयोग ~ 105 माइक्रोकॉलोनी विकास दर इस परख का उपयोग करके एकत्र की जा सकती है। इन आंकड़ों का उपयोग उपभेदों/विकास की स्थिति के बीच दोनों मतभेदों और साझा स्थिति में उगाए गए आनुवंशिक रूप से समान माइक्रोकॉलनियों में भिन्नता का निरीक्षण करने के लिए किया जा सकता है । उदाहरण के लिए, चित्रा 3 ए एक उत्परिवर्तन-संचय लाइन (MAH.44) 14 और GFP-चिह्नित संदर्भ तनाव से ~ 12,000 कालोनियों के लिए विकास दर के वितरण को दर्शाता है, जिसमें तनाव और उच्च भीतर-तनाव परिवर्तनशीलता दिखाई देता है। चित्रा 3 Bमें, व्यक्तिगत विकास दर और 10 उत्परिवर्तन-संचय उपभेदों के लिए सारांश आंकड़े, उनके इन-वेल जीएफपी-चिह्नित नियंत्रणों के साथ जोड़े गए हैं; एकत्र किए गए डेटा छोटे औसत वृद्धि दर मतभेदों की सटीक गणना की अनुमति देते हैं।

Figure 3
चित्रा 3। व्यक्तिगत माइक्रोकॉलोनी विकास दर के बड़े नमूना आकार भीतर-तनाव और बीच-तनाव विकास भिन्नता के सटीक मात्राकरण के लिए अनुमति देते हैं। (क) दो उपभेदों से ~ 12,000 कॉलोनियों की विकास दर का वितरण। वितरण के तरीकों के बीच मतभेदों पर ध्यान दें, साथ ही हर एक में मौजूद धीमी गति से बढ़ती उपनिवेशों की लंबी पूंछ; उत्तरार्द्ध केवल व्यक्तिगत माइक्रोकॉलोनी माप के कारण पता लगाने योग्य है। (ख) 11 उपभेदों से ~ 120,000 कॉलोनियों के लिए व्यक्तिगत माइक्रोकॉलोनी विकास दर (ब्लैक डॉट्स) और सारांश सांख्यिकी (औसत दिखाने वाले बॉक्सप्लॉट्स, साथ ही निम्न और ऊपरी 25% क्वांटिकल्स) का वितरण । (ए) के रूप में, प्रत्येक तनाव एक व्यक्ति में अच्छी तरह से एक नुकीला-GFP-चिह्नित संदर्भ तनाव के साथ उगाया गया था; यहां दिखाए गए डेटा एमएएच-संदर्भ तनाव जोड़ी प्रति 14 प्रायोगिक कुओं का प्रतिनिधित्व करते हैं । कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें ।

माइक्रोकॉलोनी विकास परख भी एक साथ दोनों ब्राइटफील्ड और फ्लोरेसेंस चैनलों इमेजिंग द्वारा विकास और जीन अभिव्यक्ति को मापने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है । चित्रा 2में दिखाए गए प्रयोग में, प्रयोग के विकास चरण के पूरा होने के बाद जीएफपी अभिव्यक्ति की फ्लोरोसेंट इमेजिंग ने कमजोर जीएफपी अभिव्यक्ति(चित्रा 2सी)के साथ जीएफपी-चिह्नित इन-वेल संदर्भ तनाव से संबंधित कालोनियों की पहचान की अनुमति दी; हालांकि, टाइमपॉइंट्स में जीन अभिव्यक्ति के स्तर में इंटरकॉलोनी मतभेदों का मापन भी संभव है (चर्चा देखें)।

कई सामान्य नुकसान सटीक विकास दर डेटा या इन आंकड़ों के सही विश्लेषण के संग्रह को रोक सकते हैं । एक महत्वपूर्ण बात यह है कि विकास दर माप स्थिर, एकल संस्थापक खमीर कोशिकाओं से दो आयामी माइक्रोकॉलनी के गठन पर भरोसा करते हैं । कॉनकानवेलियन ए माइक्रोकॉलनी को स्थिर करने के लिए खमीर कोशिकाओं की सतहों पर पॉलीसैकराइड्स के साथ गैर-सहोता से बातचीत करता है। कॉन्नवेलियन ए और खमीर कोशिकाओं के बीच के बंधन को शर्करा के साथ प्रतिस्पर्धा या कम पीएच15द्वारा उलट दिया जा सकता है। इसलिए, दृढ़ता से अम्लीय मीडिया या मीडिया जिसमें लेक्टिन-बाध्यकारी घटक जैसे खमीर निकालने (YEPD) या थैलेट (एडिनबर्ग मिनिमल मीडिया) शामिल हैं, का उपयोग इस परख के लिए स्थिरीकरण तकनीक(चित्रा 4 ए)में संशोधनों के बिना नहीं किया जा सकता है।

यदि विकास परख खमीर उपभेदों के साथ आयोजित किया जा रहा है कि flocculate, वैकल्पिक sonication कदम के अलावा एकत्रित कोशिकाओं को तोड़ने के लिए इस्तेमाल किया जाना चाहिए तो एकल कोशिकाओं प्रयोग की शुरुआत में माइक्रोस्कोप प्लेट पर स्थिर कर रहे है (फ्लोकुलेटिंग कोशिकाओं के एक उदाहरण के लिए चित्रा 4B देखें पोस्ट चढ़ाना अगर sonication कदम छोड़ दिया है) । कई कोशिकाओं के एक समूह द्वारा स्थापित किसी भी माइक्रोकॉलनी को डाउनस्ट्रीम विश्लेषण में बाहर रखा जाना चाहिए, क्योंकि विकास दर माप अब एक संस्थापक कोशिका से प्राप्त नहीं होते हैं, और कोशिकाएं दो आयामों में नहीं बढ़ सकती हैं। एक नवोदित कोशिका द्वारा स्थापित माइक्रोकॉलन स्वीकार्य हैं। दो आयामी माइक्रोकॉलनी के गठन खमीर से बाधित है कि बहुत दृढ़ता से flocculate, भले ही कालोनियों एक ही कोशिका द्वारा स्थापित कर रहे हैं, और इसलिए एक खमीर तनाव की क्षमता concanavalin एक पर एक परत में बढ़ने के लिए एक विकास परख का आयोजन करने से पहले परीक्षण किया जाना चाहिए ।

विचारों का एक और महत्वपूर्ण सेट प्रयोग की योजना और विश्लेषण चरणों दोनों के दौरान आता है, जब यह निर्धारित करते हैं कि विश्लेषण में कितने टाइमपॉइंट शामिल हैं। सबसे पहले, विकास को सही ढंग से ट्रैक करने के लिए पर्याप्त समय बिंदुओं के लिए डेटा शामिल करना महत्वपूर्ण है: यह सिफारिश की जाती है कि परख इस तरह से चलाई जाती है कि खमीर के पास ~ 5 दोहरीकरण के माध्यम से जाने का समय हो, उस अवधि में कम से कम 10 टाइमपॉइंट एकत्र किए जाएं। हालांकि, बस विकास दर गणना में हर एकत्र समय बिंदु सहित एक पूर्वाग्रह है कि कृत्रिम रूप से कई कालोनियों के लिए विकास दर कम करती है में परिणाम होगा । यह पूर्वाग्रह तब हो सकता है जब कोशिकाएं विकास(चित्रा 4C)शुरू करने से पहले अंतराल चरण से गुजरती हैं। माइक्रोकॉलोनियों का पूर्व विकास अंतराल आम बात है और9,13प्रायोगिक स्थितियों और उपभेदों के बीच भिन्न होता है। प्रायोगिक विश्लेषण विधियों को पूर्व-विकास अंतराल से "सक्रिय विकास" अवधि में टाइमपॉइंट्स में अंतर करने में सक्षम होना चाहिए; एक दृष्टिकोण एक विंडो में टाइमपॉइंट्स की एक पूर्व निर्धारित संख्या का उपयोग करें और खिड़की है कि उच्चतम विकास दर(चित्रा 4C,ठोस लाइन)11,13से मेल खाती है लगता है .

अंत में, माइक्रोकॉलोनी विकास परख के सबसे महत्वपूर्ण चरणों में से एक खमीर-सेल कमजोर पड़ने कदम है। कोशिकाओं की एकाग्रता और माइक्रोस्कोप-प्लेट कुओं के भीतर विभिन्न जीनोटाइप के अनुपात को सावधानीपूर्वक नियंत्रित किया जाना चाहिए। सांख्यिकीय विश्लेषण के लिए यह महत्वपूर्ण है कि प्रयोगों को संतुलित किया जाए ताकि प्रत्येक जीनोटाइप और स्थिति के लिए लगभग समान संख्या में कोशिकाओं का परीक्षण किया जाए और16की तुलना की जाए । इसके अलावा, पड़ोसी उपनिवेशों के विलय के बाद आम तौर पर उपयोगी विकास दर को मापा नहीं जा सकता क्योंकि व्यक्तिगत उपनिवेशों की विकास दर को अब नहीं समझा जा सकता है; इसलिए, अधिक घनी प्लेटेड कोशिकाओं कम टाइमपॉइंट(चित्रा 4D)से विकास डेटा निकलेगा। महत्वपूर्ण बात, यदि किसी प्रयोग की शुरुआत में सेल घनत्व अधिक या असमान है, तो विलय किए गए माइक्रोकॉलन को कम करने से डाउनस्ट्रीम विश्लेषणों से तेजी से बढ़ते माइक्रोकॉलन को अलग किया जाएगा क्योंकि तेजी से उत्पादक धीमे उत्पादकों की तुलना में अधिक बार विलय करेंगे। इसलिए, अंतिम विकास मापन धीमी बढ़ती उप-आबादी की ओर पक्षपातपूर्ण होगा । इसके अतिरिक्त, विभिन्न प्रकार के प्रकारों कालोनियों को विभिन्न उपचारों के लिए फ़िल्टर किया जा सकता है, जो एक संतुलित प्रयोग को पहले से शामिल करते हैं। यह एक 96-अच्छी तरह से प्लेट में अच्छी तरह से प्रति अच्छी तरह से लगभग 4000 कोशिकाओं को प्लेट करने की सिफारिश की जाती है (या 384-अच्छी प्लेट में 700 कोशिकाएं प्रति अच्छी तरह से)। प्रोटोकॉल के खमीर-कमजोर पड़ने वाले हिस्से में पूरी तरह से पाइप मिश्रण यह सुनिश्चित करने के लिए जरूरी है कि कोशिकाओं की सही संख्या प्रत्येक कुएं में मौजूद है, और कोशिकाओं को पूरे कुएं में समान रूप से फैलाया जाता है। विश्लेषण से किसी भी माइक्रोकॉलोनियों को हटाने की सलाह दी जाती है जिनके केंद्र एक दूसरे के ~ 25 कोशिका व्यास के भीतर हैं।

Figure 4
चित्रा 4। प्रायोगिक नुकसान। (क) YEPD मीडिया में बढ़ रही कॉलोनियां, जो कोशिकाओं के कुशल बाध्यकारी को concanavalin ए को रोकती हैं । किसी भी कॉलोनी (एरोहेड) से दूर नई कोशिकाओं की उपस्थिति, साथ ही कॉलोनी के किनारे पर कई आउट-ऑफ-फोकस कोशिकाओं की उपस्थिति, कोशिकाओं का परिणाम है जो कांच की सतह का पालन करने में विफल रहती हैं और विकास के दौरान कॉलोनी से दूर बहती हैं। (ख) बिना सोनीशन के चढ़ाना के ठीक बाद एक फ्लोक्यूलिंग स्ट्रेन से कोशिकाएं; विभिन्न फोकल विमानों में समूहों के भीतर कई कोशिकाओं (एरोहेड) और कोशिकाओं के समूहों की बड़ी संख्या की उपस्थिति पर ध्यान दें। (ग) लंबे अंतराल चरण वाली कॉलोनी के लिए समय के साथ एलएन (क्षेत्र) में परिवर्तन । ध्यान दें कि यदि सभी समय बिंदुओं का उपयोग विकास दर अनुमान के लिए किया जाता है, तो अनुमानित विकास दर काफी उदास है; एक सटीक माप का उत्पादन तभी किया जाता है जब एन टाइमपॉइंट (यहां एन= 6) का सबसेट जो उच्चतम वृद्धि दर अनुमान के परिणामस्वरूप उपयोग किया जाता है। (घ) जिन कोशिकाओं को प्रयोग की शुरुआत में और 7 घंटे के विकास के बाद बहुत घनी रूप से दिखाया गया था । रंग व्यक्तिगत उपनिवेशों को ट्रैक करते हैं जब तक कि वे पड़ोसियों के साथ विलय न कर दें; यहां, 7-एच निशान से, अधिकांश उपनिवेशों का विलय हो गया है, जिसमें केवल कम संख्या में व्यक्तिगत धीमी गति से बढ़ती कॉलोनियां शेष हैं। (यहां दिखाए गए कॉलोनियों के एक छोटे सबसेट के लिए ट्रैकिंग कॉलोनी विलय से असंबंधित कारणों के लिए खो दिया है.) प्रत्येक स्केल बार 50 माइक्रोन है। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

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Discussion

यहां वर्णित प्रोटोकॉल एक बहुमुखी परख है जो सेल विकास और जीन अभिव्यक्ति को व्यक्तिगत माइक्रोकॉलनी के स्तर पर एक साथ निगरानी करने की अनुमति देता है। इन दोनों तौर-तरीकों के संयोजन से अद्वितीय जैविक अंतर्दृष्टि प्राप्त होती है । उदाहरण के लिए, पिछले कार्य ने इस परख का उपयोग आइसोजेनिक वाइल्डटाइप कोशिकाओं में टीएसएल1 जीन और माइक्रोकॉलोनी की वृद्धि दर की अभिव्यक्ति के बीच नकारात्मक संबंध दिखाने के लिए किया है, दोनों को एक साथ7,10मापकर । वर्णित परख के साथ फ्लोरोसेंटली टैग किए गए प्रोटीन की विकास दर और उपकोशिकीय स्थानीयकरण गतिशीलता के बीच संबंधों की निगरानी करना भी संभव है। उदाहरण के लिए, विकास दर और आरएफपी-टैग किए गए ट्रांसक्रिप्शन फैक्टर एमएसएन2 के परमाणु अधिभोग के बीच एक नकारात्मक संबंध की पहचान विकास परख10को शुरू करने से पहले 30 मिनट के लिए हर मिनट कोशिकाओं में फ्लोरेसेंस इमेजिंग द्वारा की गई थी । अंत में, यह प्रोटोकॉल पर्यावरणीय तनावों और क्षोभ के लिए सेल प्रतिक्रियाओं की निगरानी की अनुमति देता है। इस तरह के गर्मी सदमे के रूप में उपचार विकास परख के माध्यम से भाग-रास्ता प्रशासित किया जा सकता है । उदाहरण के लिए, इस तरह के अध्ययनों से पता चला है कि Tsl1 के उच्च स्तर को व्यक्त करने वाली धीमी गति से बढ़ती कोशिकाएं हीट शॉक 7,10के अधिक सहिष्णु हैं।

प्रतिनिधि परिणाम अनुभाग (चित्र 4) में वर्णित आम नुकसान के अलावा, विकास-परख प्रयोग को डिजाइन करते समय कई प्रमुख कारकों पर विचार किया जाना चाहिए। परख के साथ मापा जाता है कि फेनोटाइपिक भिन्नता कई कारकों से प्रभावित है, जिनमें से कुछ दोहराने योग्य और अंतर्निहित ब्याज, जैसे जीनोटाइप या पर्यावरण के हैं, जबकि अन्य तकनीकी भिन्नता13का परिणाम हैं। इसलिए, माइक्रोकॉलोनी परख डिजाइन करते समय पहला महत्वपूर्ण विचार प्रयोग को इस तरह से पूरा करना है जो तकनीकी भिन्नता के परिणामस्वरूप प्रभावों से ब्याज के प्रभावों को अलग करने की सुविधा प्रदान करता है; इस अलगाव की कुंजी प्रयोगात्मक प्लेटों पर यादृच्छिक उपचार या उपभेद हैं, और हर प्रयोग में नियंत्रण शामिल हैं। 17,18में भिन्नता के विभिन्न स्रोतों के लिए खाते में, रैखिक मिश्रित मॉडलिंग(एलएमएम)जैसे उचित सांख्यिकीय तरीकों को एकत्र करने के बाद डेटा पर लागू किया जाना चाहिए।

बैच प्रभाव जैसे यादृच्छिक कारकों के कारण भिन्नता से ब्याज के प्रयोगात्मक चर के कारण विकास फेनोटाइप में भिन्नता को अलग करने के लिए सांख्यिकीय तरीकों को नियोजित करने के लिए, विभिन्न दिनों पर और जीनोटाइप और विकास की स्थिति के यादृच्छिक अच्छी स्थानों के साथ कई प्रयोगों को चलाना आवश्यक है। इसके अलावा, उपभेदों या उपचार की स्थिति के बीच विकास मतभेदों का पता लगाने के लिए प्रयोग की शक्ति को बढ़ाने के लिए, जहां संभव हो, एक ही प्रयोगात्मक प्लेट पर प्रत्येक परीक्षण जीनोटाइप या विकास की स्थिति की कई प्रतिकृति शामिल करना भी महत्वपूर्ण है।

माइक्रोकॉलोनी विकास परख का एक प्रमुख लाभ डेटा की मात्रा में निहित है जो इसे एकत्र कर सकता है: एक प्रयोगात्मक प्लेट आमतौर पर ~ 105 व्यक्तिगत माइक्रोकॉलनी के लिए डेटा उत्पन्न करती है, जो मल्टीवेल प्लेटों के बजाय माइक्रोफ्लुइडिक उपकरणों का उपयोग करके विशिष्ट प्रयोगों से अधिक परिमाण के कई आदेश हैं। सॉफ्टवेयर जो स्वचालित रूप से कालोनियों को ट्रैक करता है और प्रासंगिक डेटा की गणना करता है (उदाहरण के लिए अंतराल समय, विकास दर और मतलब फ्लोरोसेंट तीव्रता) इस परख का पूरा लाभ उठाने के लिए महत्वपूर्ण है। इस सॉफ्टवेयर को न केवल समय के माध्यम से कॉलोनी की सीमा और ट्रैक कॉलोनियों की मजबूती से पहचान करनी चाहिए, बल्कि अंतराल चरण13के साथ कॉलोनियों में विकास को भी सही ढंग से मापना चाहिए। इस उद्देश्य के लिए विकसित एक विकल्प पाई, ओपन-सोर्स सॉफ्टवेयर है जो समय के साथ उपनिवेशों को ट्रैक करता है (कॉलोनी की स्थिति में बदलाव के लिए लेखांकन सहित), विकास दर की गणना करता है, और फ्लोरोसेंट इमेजिंग डेटा के एकीकरण को प्रायोगिक माप11,12में अनुमति देता है।

माइक्रोकॉलोनी विकास परख का उपयोग खमीर फिटनेस और विकास से संबंधित मौलिक प्रश्नों में अंतर्दृष्टि प्राप्त करने के लिए किया जा सकता है, जिसमें विकास फेनोटाइप परिवर्तनशीलता, विभिन्न वातावरणों में परिवर्तन या तनाव के जवाब में, और विकास और प्रोटीन अभिव्यक्ति या उपकोशिकीय स्थानीयकरण के बीच संबंध शामिल हैं। इस परख का उपयोग एस सेरेविसिया7 ,9,10,13की प्रयोगशाला और जंगली उपभेदों दोनों के अध्ययन में बड़े पैमाने पर किया गया है ।

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Disclosures

लेखकों के पास खुलासा करने के लिए कुछ नहीं है ।

Acknowledgments

हम नाओमी जिव, साशा लेवी और शुआंग ली को इस प्रोटोकॉल को विकसित करने में उनके योगदान के लिए धन्यवाद देते हैं, साझा उपकरणों के लिए डेविड ग्रेशम, और वीडियो उत्पादन में मदद के लिए मारिसा टीला। इस काम को राष्ट्रीय स्वास्थ्य अनुदान संस्थानों R35GM118170 द्वारा समर्थित किया गया था।

Materials

Name Company Catalog Number Comments
General Materials
500 mL Bottletop Filter .22 µm PES Sterilizing, Low Protein Binding, w/45mm Neck Fisher CLS431154 used to filter the media
BD Falcon*Tissue Culture Plates, microtest u-bottom Fisher 08-772-54 96-well culture tubes used to freeze cells, pre-grow cells, and dilutions
BD Syringes without Needle, 50 mL Fisher 13-689-8 Used to filter the Concanavalin A
Costar Sterile Disposable Reagent Reservoirs Fisher 07-200-127 reagent reservoirs used to pipette solutions with multichannel pipette
Costar Thermowell Aluminum Sealing Tape Fisher 07-200-684 96-well plate seal for pre-growth and freezing
lint and static free Kimwipes Fisher 06-666A lint and static free wipes to keep microscope plate bottom free of debris and scratches
Nalgene Syringe Filters ThermoFisher Scientific 199-2020 0.2 μm pore size, 25 mm diameter; used to filter concanavalin A solution
Media Components
Minimal chemically defined media (MD; 2% glucose) alternative microscopy media used for yeast pre-growth and growth during microscopy
Synthetic Complete Media (SC; 2% glucose) microscopy media used for yeast pre-growth and growth during microscopy
Yeast extract-peptone-dextrose (YEPD; 2% glucose) medium cell growth prior to freezing down randomized plates
Microscopy Materials
Breathe-Easy sealing membrane Millipore Sigma Z380059-1PAK breathable membranes used to seal plate during microscopy experiment. At this stage breathable membranes are recommended because they prevent condensation in the wells and allow for better microscopy images
Brooks 96-well flat clear glass bottom microscope plate Dot Scientific MGB096-1-2-LG-L microscope plate
Concanavalin A from canavalia ensiformis (Jack Bean), lyophilized powder Millipore Sigma 45-C2010-1G Make 5x concanavalin A solution and freeze 5ml of 5x concanavalin A in 50 mL conical tubes at -80 °C
Strains Used
MAH.5, MAH.96, MAH.52, MAH.66, MAH.11, MAH.58, MAH.135, MAH.15, MAH.44, MAH.132 Haploid mutation accumulation strains in a laboratory background, described in Hall and Joseph 2010
EP026.2A-2C Progeny of the ancestral Hall and Joseph 2010 mutation accumulation strain, transformed with YFR054cΔ::Scw11P::GFP
Equipment
Misonix Sonicator S-4000 with 96-pin attachment Sonicator https://www.labx.com/item/misonix-inc-s-4000-sonicator/4771281
Nikon Eclipse Ti-E with Perfect Focus System Inverted microscope with automated stage and autofocus system

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References

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Sartori, F. M. O., Buzby, C., Plavskin, Y., Siegal, M. L. High-Throughput Live Imaging of Microcolonies to Measure Heterogeneity in Growth and Gene Expression. J. Vis. Exp. (170), e62038, doi:10.3791/62038 (2021).

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