הדמיה חיה בעלת תפוקה גבוהה של מיקרוקולוניות למדידת הטרוגניות בצמיחה ובביטוי גנים

סיכום

פנוטיפים של צמיחת שמרים נמדדים במדויק באמצעות הדמיה מקבילה מאוד של תאים משותקים הגדלים למיקרוקולוניות. במקביל, ניתן לעקוב אחר עמידות ללחץ, ביטוי חלבון ולוקליזציה של חלבונים, וליצור ערכות נתונים משולבות כדי לחקור כיצד הבדלים סביבתיים וגנטיים, כמו גם הטרוגניות של ביטוי גנים בקרב תאים איסוגניים, מווסתים את הצמיחה.

תקציר

מדידות מדויקות של הטרוגניות בין ומתח בתוך זן בשיעורי צמיחה מיקרוביאלית חיוניות להבנת תשומות גנטיות וסביבתיות לסובלנות מתח, פתוגניות ורכיבי מפתח אחרים של כושר. כתב יד זה מתאר בדיקה המבוססת על מיקרוסקופ העוקבת אחר^{כ-10 5}מיקרוקולוניותסכרומיאציות של Saccharomyces בכל ניסוי. לאחר הדמיה אוטומטית של שמרים משותקים בצלחת מרובת גלים, שיעורי הצמיחה של מיקרו-מושבה מנותחים בקלות באמצעות תוכנה מותאמת אישית לניתוח תמונות. עבור כל מיקרו-מושבה, ניתן גם לעקוב אחר ביטוי ולוקליזציה של חלבונים פלואורסצנטיים והישרדות של מתח חריף. בדיקה זו מאפשרת הערכה מדויקת של שיעורי הצמיחה הממוצעים של הזנים, כמו גם מדידה מקיפה של הטרוגניות בצמיחה, ביטוי גנים וסובלנות מתח בתוך אוכלוסיות שיבוטים. 

מבוא

פנוטיפים לצמיחה תורמים באופן קריטי לכושר שמרים. הברירה הטבעית יכולה להבחין ביעילות בין שושלת עם שיעורי צמיחה שונים על ידי ההופכי של גודל האוכלוסייה האפקטיבי, אשר יכול לחרוג 10⁸ אנשים¹. יתר על כן, שונות בשיעורי הצמיחה בקרב אנשים בתוך אוכלוסייה היא פרמטר רלוונטי מבחינה אבולוציונית, שכן הוא יכול לשמש כבסיס לאסטרטגיות הישרדות כגון גידור הימור^2,3,4,5,6. לכן, מבחנים המאפשרים מדידות מדויקות מאוד של פנוטיפים צמיחה והתפלגותם הם מרכזיים לחקר מיקרואורגניזמים. מבחני הצמיחה של המיקרו-מ....

פרוטוקול

1. הכנת צלחות אקראיות (לפני יום הניסוי)

1. תכנן את הזנים והתנאים להיבדק עם מבחני הצמיחה. בשלב זה, באופן אקראי להקצות זנים ותנאים לכל באר.
   הערה: כאשר שוקלים הגדרת צלחת, מומלץ לכלול יותר משכפול אחד לכל זן ומצב צמיחה על צלחת אחת כדי להסביר רעש הקשורים היטב במדידות. ראה דיון לקבלת פרטים נוספים.
2. אקראיות חישובית את המיקום של כל זן ומצב סביבתי עבור משכפלים צלחת שיופעלו בימים שונים.
3. לגדל את כל התאים שישמשו בניסוי לרוויה תמצית שמרים-פפטון-דקסטרוז (YEPD; 2% גלוקוז) בינוני בשייקר ב 30 מעלות צלזיוס (או כל טמפרטורה מתאימה אחרת).
4. צור את לוחות המלאי האקראיים באופן ידני או באמצעות רובוט לטיפול בנוזלים. הוסף 10 μL של התאים הרוויים המיועדים לכל ב....

תוצאות

החידוש בפרוטוקול זה הוא שניתן לחשב את קצב הגדילה עבור תאים בודדים בתוך אוכלוסייה על ידי מעקב אחר צמיחתם למיקרוקולוניות באמצעות הדמיה של זמן לשגות (איור 2A). בגלל מיקרוקולוניות לגדול במשך שעות רבות באופן מישורי בשל נוכחותו של concanavalin A, האזורים שלהם ניתן לעקוב לאורך כל הניסוי, ואת ההתאמה הליניארית לשינוי ביומן הטבעי של האזור לאורך זמן ניתן להשתמש כדי לחשב את קצב הצמיחה עבור כל מושבה בודדת נצפתה ^{7,9,10.......}

דיון

הפרוטוקול המתואר כאן הוא מבחנים רב-תכליתיים המאפשרים מעקב אחר צמיחת תאים וביטוי גנים בו זמנית ברמה של מיקרוקולוניות בודדות. שילוב שתי שיטות אלה מניב תובנות ביולוגיות ייחודיות. לדוגמה, עבודה קודמת השתמשה ב- assay זה כדי להראות מתאם שלילי בין ביטוי של הגן TSL1 לבין קצב הצמיחה של מיקרו-מושבה בתאי בר איסוגניים על ידי מדידת שניהם בו זמנית^7,10. ניתן גם לעקוב אחר הקשר בין קצב הגדילה לבין דינמיקת לוקליזציה תת-תאית של חלבונים מתויגים בפלורסנט עם ההסתייגות המתוארת.......

חומרים

רשימת החומרים שנעשה בהם שימוש במאמר זה

שם	חברה	מספר קטלוג	הערות
<חזק>חומרים כלליים
500 מ"ל מסנן בקבוק .22 ומיקרו; m PES סטריליזציה, כריכה דלת חלבון, עם CLS431154 פישר צוואר 45 מ"מ			המשמשת לסינון המדיה
BD Falcon*Tissue Culture Plates, microtest u-bottom	Fisher	08-772-54	צינורות תרבית 96 בארות המשמשים להקפאת תאים, תאים לפני גידול ודילול
מזרקי BD ללא מחט, 50 מ"ל	פישר	13-689-8	משמש לסינון מאגרי Concanavalin A
Costar חד פעמיים סטריליים	פישר	07-200-127	מאגרי ריאגנטים המשמשים לתמיסות פיפטה עם פיפטה רב-ערוצית
סרט איטום אלומיניום Costar Thermowell	Fisher	07-200-684	אטם צלחת 96 בארות לקדם גידול והקפאה
מוך וללא חשמל סטטי Kimwipes	Fisher	06-666A	מוך ומגבונים חופשיים סטטיים כדי לשמור על תחתית צלחת המיקרוסקופ נקייה מפסולת ושריטות
מסנני	מזרק NalgeneThermoFisher Scientific	199-2020	0.2 μ גודל נקבוביות מ ', קוטר 25 מ"מ; משמש לסינון קונקנבלין תמיסה
<חזקה>רכיבי מדיה
מדיה מינימלית מוגדרת כימית (MD; 2% גלוקוז)			מדיית מיקרוסקופיה חלופית המשמשת לשמרים לפני צמיחה וצמיחה במהלך מיקרוסקופיה
מדיה סינתטית שלמה (SC; 2% גלוקוז)			מדיה מיקרוסקופית המשמשת לשמרים לפני צמיחה וצמיחה במהלך מיקרוסקופיה
תמצית שמרים-פפטון-דקסטרוז (YEPD; 2% גלוקוז)			של תאים לפני הקפאת צלחות אקראיות
<חזק>מיקרוסקופיה חומרים
ממברנת איטום קלה לנשימה	Millipore Sigma	Z380059-1PAK	ממברנות נושמות המשמשות לאיטום צלחת במהלך ניסוי מיקרוסקופיה. בשלב זה מומלץ להשתמש בממברנות נושמות מכיוון שהן מונעות עיבוי בבארות ומאפשרות תמונות מיקרוסקופ טובות יותר
צלחת מיקרוסקופ תחתונה מזכוכית שקופה שטוחה 96 באר	Dot Scientific	MGB096-1-2-LG-L	צלחת מיקרוסקופ
Concanavalin A מ-canavalia ensiformis (Jack Bean), אבקה ליופילית	Millipore Sigma	45-C2010-1G	הכינו תמיסה של 5x concanavalin A והקפיאו 5 מ"ל של 5x concanavalin A בצינורות חרוטיים של 50 מ"ל ב-80 מעלות; C
זנים בשימוש
MAH.5, MAH.96, MAH.52, MAH.66, MAH.11, MAH.58, MAH.135, MAH.15, MAH.44, MAH.132			זני הצטברות מוטציות הפלואידים ברקע מעבדתי, המתוארים בהול וג'וזף 2010
EP026.2A-2C			צאצאים של הול הקדמון וזן הצטברות מוטציות ג'וזף 2010, שעבר טרנספורמציה עם YFR054cΔ::Scw11P: GFP
חזק>ציוד
Misonix Sonicator S-4000 עם חיבור			Sonicator https://www.labx.com/item/misonix-inc-s-4000-sonicator/4771281
Nikon Eclipse Ti-E עם מערכת			מיקרוסקופ הפוך עם מערכת מיקוד אוטומטית ומערכת פוקוס אוטומטי

צמיחה בינונית < 96 פינים מיקוד מושלמת