Summary
Maya büyüme fenotipleri, mikrokolonlara dönüşen hareketsiz hücrelerin son derece paralel zaman atlamalı görüntülemesi ile tam olarak ölçülür. Aynı zamanda, stres toleransı, protein ekspresyasyonu ve protein lokalizasyonu izlenebilir, çevresel ve genetik farklılıkların yanı sıra izojenik hücreler arasındaki gen ekspresyon heterojenliğinin büyümeyi nasıl modüle ettiğini incelemek için entegre veri kümeleri üretilebilir.
Abstract
Mikrobiyal büyüme oranlarındaki suş içi heterojenitenin hassas ölçümleri, stres toleransı, patojenite ve zindeliğin diğer temel bileşenlerine genetik ve çevresel girdileri anlamak için gereklidir. Bu makale, deney başına yaklaşık 105 Saccharomyces cerevisiae mikrokolonyasını izleyen mikroskop tabanlı bir tahlil tanımlamaktadır. Mayanın çok katlı bir plakada hareketsiz olarak otomatik olarak zaman atlamalı görüntülenmesi sonrasında, mikrokolony büyüme oranları özel görüntü analiz yazılımı ile kolayca analiz edilir. Her mikrokolony için floresan proteinlerin ekspresyonu ve lokalizasyonu ve akut stresin sağkalımları da izlenebilir. Bu tahlil, suşların ortalama büyüme oranlarının kesin olarak tahmin edilmesine ve klonal popülasyonlarda büyüme, gen ekspresyasyonu ve stres toleransında heterojenliğin kapsamlı bir şekilde ölçülmesine izin verir.
Introduction
Büyüme fenotipleri maya zindeliği için kritik katkıda bulunur. Doğal seleksiyon, 108 kişiyi aşabilen etkili nüfus büyüklüğünün tersi ile farklılık gösteren büyüme oranları ile soyları verimli bir şekilde ayırt edebilir1. Ayrıca, bir popülasyondaki bireyler arasında büyüme oranlarının değişkenliği evrimsel olarak ilgili bir parametredir, çünkü bahis koruma 2 , 3,4,5,6gibi hayatta kalma stratejilerinin temelini oluşturabilir. Bu nedenle, büyüme fenotiplerinin ve dağılımlarının son derece doğru ölçümlerine izin veren tahliller mikroorganizmaların incelenmesi için çok önemlidir. Burada açıklanan mikrokolony büyüme tahlili, deney başına ~105 mikrokolon için bireysel büyüme hızı ölçümleri oluşturabilir. Bu nedenle bu test, maya evrimsel genetiği ve genomikleri incelemek için güçlü bir protokol sağlar. Genetik olarak özdeş tek hücre popülasyonları içindeki değişkenliğin nasıl üretildiğini, sürdürüldüğünü ve popülasyon kondisyonu 7 ,8,9,10'anasıl katkıda bulunduğunu test etmek için özellikle iyi bir şekilde kendini ödünç verir.
Burada açıklanan yöntem (Şekil 1), mikrokolonlara büyümeyi izlemek için 96 veya 384 kuyulu bir cam tabanlı plaka üzerinde sıvı ortamda yetişen hücrelerin periyodik olarak yakalanan, düşük büyütmeli parlak alan görüntülerini kullanır. Hücreler, mikroskop plakasının altını kaplayan ve iki boyutlu koloniler oluşturan A lektin kontanvalinine yapışır. Mikrokolonlar monolayerde büyüdüğünden, mikrokolony alanı7numaralı hücre ile oldukça ilişkilidir. Bu nedenle, her bir mikrokolony alanının değişim hızını izleyen özel görüntü analizi yazılımı ile mikrokolony büyüme hızı ve gecikme süresi hakkında doğru tahminler oluşturulabilir. Ayrıca, deneysel kurulum, bu mikrokolonlarda ifade edilen floresan etiketli proteinlerin bolluklarını ve hatta hücre altı lokalizasyonlarını izleyebilir. Bu mikrokolonyum büyüme testinden elde edilen verilerin aşağı akış işlemesi, özel analiz veya Görüntüleri Kolayca İşleme (PIE)11, sağlam koloni alanı tanıma ve gitHub12aracılığıyla kullanılabilen düşük büyütmeli, parlak alan görüntülerinden yüksek verimli büyüme analizi için bir algoritma gibi mevcut görüntü analizi yazılımı ile elde edilebilir.
Mikrokolony-büyüme testinden elde edilen büyüme hızı tahminleri çok sayıda tek koloni ölçümünden oluşturulduğundan, makul büyüklükte bir deney için tahminlerden birkaç büyüklük sırasıyla standart hatalarla son derece doğrudur. Bu nedenle, tahlillerin farklı genotipler, tedaviler veya çevresel koşullar arasındaki büyüme hızı farklarını tespit etme gücü yüksektir. Multiwell-plate formatı, çok sayıda farklı ortam ve genotip kombinasyonunun tek bir deneyde karşılaştırılmasını sağlar. Suşlar farklı floresan belirteçleri tam olarak ifade ederse, aynı kuyuda karıştırılabilir ve sonraki görüntü analizi ile ayırt edilebilir, bu da iyi veri normalleştirmesine izin vererek gücü daha da artırabilir.
Şekil 1: Protokolün şematik gösterimi. Bu protokol, deneysel plakanın hazırlanması ve hücrelerin görüntüye hazırlanması olan iki ana adımı izler. Plakaların randomizasyonu ve hücrelerin büyümesi deney gününden önce ve bu güne kadar yapılmalıdır. Seyreltme sırasında her adımda hücrelerin tekrar tekrar karıştırılması, kaplamaya kadar olan adımlarda zorunludur ve bu nedenle deneysel plakanın ilk olarak hazırlanması önerilir, böylece hücre seyreltmenin tamamlanmasından hemen sonra kaplamaya hazırdır. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. Randomize Plakaların Hazırlanması (Deney Gününden Önce)
- Büyüme testi ile test edilecek suşları ve koşulları planlayın. Bu noktada, herhangi bir kuyuya rastgele suşlar ve koşullar atayın.
NOT: Plaka kurulumu göz önüne alındığında, ölçümlerde iyi ilişkili gürültüyü hesaba katmak için tek bir plakada gerinim ve büyüme durumu başına birden fazla çoğaltmanın dahil edilmesi önerilir. Daha fazla ayrıntı için Tartışma'ya bakın. - Farklı günlerde çalıştırılacak plaka çoğaltmaları için her bir gerinim ve çevresel durumun konumunu hesaplamalı olarak rastgele hale koyun.
- 30 °C'de (veya başka bir uygun sıcaklıkta) bir çalkalayıcıda maya özü-pepton-dekstroz (YEPD; % 2 glikoz) ortamında doygunluk için deneyde kullanılacak tüm hücreleri yetiştirin.
- Randomize stok plakalarını manuel olarak veya sıvı taşıma robotu ile oluşturun. Steril bir U-bottom doku kültür plakasının her kuyusuna belirlenen doymuş hücrelerin 10 μL'sini ekleyin. Birden fazla suş tek bir kuyuda test edilecekse, bunları bu noktada birleştirmeyin; bu birleştirme, mikrokolony kurucu hücreler olarak kaplandığında tüm suşların doğru konsantrasyonlarda olduğundan emin olmak için deney gününde hücre seyreltmelerinden hemen önce yapılacaktır.
- Her plakanın her kuyusuna 10 μL% 30 gliserol ekleyin. Hücrelerin ve gliserollerin iyi karışması için yukarı ve aşağı boru.
- Her plakayı bir folyo kapakla kapatın ve kullanıma hazır olana kadar hemen -70 °C'de dondurun.
NOT: Tüm randomize plakaların aynı gün içinde oluşturulması ve dondurulması önemlidir, böylece her plakadaki hücrelerin büyüme öncesi koşulları aynı olacaktır ve büyüme hızı testinde teknik varyasyon oluşturmayacaktır.
2. Mayanın Ön Büyümesi
NOT: Genellikle, bu deneme gününden önce başlar ve deneysel soruya oldukça bağlıdır. Ayrıntılar için Tartışma'ya bakın.
- -70 °C dondurucudan bir stok plakasını (kuyu başına 10 μL gliserol) çıkarın ve deney için kullanılacak 180 μL ortam ekleyin. Deney besin sınırlayıcı ortam kullanılarak yapılacaksa, mayanın sporülasyonu meydana gelebileceğinden, mayayı besin sınırlayıcı ortamda doygunluğa önceden yetiştirmeyin. Bunun yerine, sınırlayıcı olmayan medyada önceden büyüyün.
- 30 °C'de titrerken maya yetiştirin. Denemeden önce hücrelerin birden çok kez seyreltilmesinin gerekli olup olmayacağını belirlemek için tahlilin günlük aşamasındaki hücrelerle mi yoksa sabit fazda mı çalıştırılacağını düşünün. Testteki maya suşlarının veya koşullarının önemli ölçüde farklı büyüme oranlarına sahip olması bekleniyorsa, tüm farklı koşulların sabit faza ulaşması için iki günlük bir büyüme öncesi dönem gerekecektir.
3. Mikroskop Kurulumu
- Mikroskop plaka hazırlama
- Mikroskop inkübatörünün açık olduğundan ve mikroskop odasını deneysel koşullar için istenen büyüme sıcaklığına ısıttığından emin olun. Saccharomyces cerevisiae hücrelerini kullanan standart deneyler için inkübatör, büyüme hızı tahlil sırasında hücrelerin büyüme koşullarının doğru olmasını sağlamak için mikroskop odasını 30 °C'ye ısıtmalıdır.
- Tezgahı, pipetleri ve diğer aletleri% 70 etanol ile sterilize edin. Bir mikroskop plakası alın ve tiftiksiz ve statik içermeyen bir mendilin üstündeki tezgaha yerleştirin.
NOT: Eldivenler açık olsa bile mikroskop plakasının altına asla dokunmayın ve mikroskop plakasını herhangi bir yüzeye dokunduğunda her zaman tiftiksiz ve statik içermeyen bir mendilin üzerine yerleştirin. Bu, deney görüntülendikten sonra lekelerin veya çiziklerin büyüme hızı ölçümlerini engellemesini önler. - 5 mL 5x concanavalin A çözeltisini çözün, su ile 1 kata seyreltin ve filtre 0,2-μm filtre ile donatılmış bir şırınna ile sterilize edin.
- Filtre, çözeltilerde gerçekleşmiş olabilecek kristalleri veya kalıntıları gidermek için testte kullanılacak diğer tüm sıvıları deneysel ortam da dahil olmak üzere 0,2 μm filtre ile sterilize eder. Kristallerin varlığı mikroskopi görüntülerinin kalitesini düşürecektir.
- Pipet 200 μL concanavalin Mikroskop plakasının her kuyusuna bir çözelti.
- Concanavalin A çözeltisinin her kuyunun altını eşit şekilde kapladığından ve hava kabarcıkları olmadığından emin olmak için plakanın altında tiftiksiz ve statik içermeyen bir silme ile plakayı 411 x yerçekiminde (g) 2 dakika santrifüj edin.
- Plakayı kapağıyla örtün ve 1-2 saat bekletin. Plakanın tam oturma süresi esnektir, ancak deneyin farklı çalıştırmaları arasında tutarlı olmak önemlidir.
- Tüm concanavalin A çözeltisini emişle veya lavaboya veya bir kap içine zorla boşaltarak plakadan çıkarın. Plakanın cam kısmına dokunmamaya dikkat edin. Bazı concanavalin A çözeltisi damlalarının kuyularda kalması kabul edilebilir.
- Mikroskop plaka kuyularını 400 μL steril su ekleyerek yıkayın. Önceki adımda concanavalin A ile yapılan suyu çıkarın. Tabağın kuru oturmasına izin vermeyin.
- Plakaya hemen 185 μL deneysel büyüme ortamı ekleyin. Bu plakaya 15 μL doğru seyreltilmiş hücre eklenecektir.
- Maya Hücre Seyreltme
NOT: Aşağıdaki adımlarda, 250.000 hücre/mL konsantrasyon elde etmek için doymuş bir kültürden (yaklaşık 108 hücre/mL) 400 kat maya seyreltilmesi açıklanmaktadır, bunun 15 μL'si cam-alt plakada 400 μL'ye seyreltilecek ve 96 kuyulu bir plakada kuyu başına yaklaşık 4000 hücrenin son sayısı verilecektir. 384 kuyu plakası kullanıyorsanız kuyu başına son hücre sayısı yaklaşık 700 olmalı ve seyreltmeler buna göre ayarlanmalıdır. Bu oran, günlük aşamasında toplanan, daha zengin veya daha zayıf büyüme öncesi ortamda büyüyen veya farklı suşlardan toplanan hücreler için ayarlanmalıdır. Büyüme hızı 10 saatten uzun süreler için test edildiğinde kuyu başına hücrelerin son yoğunluğu azaltılmalıdır.- Seri seyreltmeler için iki adet 96 kuyu kültür plakası kurun: plaka 1 ve 2 olarak etiketleyin ve her seri seyreltme plakasına 90 μL deneysel büyüme ortamı (yani mayanın mikroskopta büyüyeceği ortam) ekleyin.
NOT: Hangi son seyreltmenin kullanıldığına bakılmaksızın, her birinde küçük bir maya hacminin daha büyük bir deneysel ortam hacmine pipetle karıştırıldığı ve daha sonra büyük miktarda deneysel ortamın bir pipetle kuvvetli bir şekilde karıştırıldığı en az iki seri hücre seyreltilmesi önerilir (aşağıdaki adım 3.2.5 ve 3.2.6'da olduğu gibi). - Hücre plakasını büyüme öncesi elde edin ve plakayı 411 x g'da 2 dakika santrifüj edin.
NOT: Plakadaki farklı kuyuları çapraz kirletmemek çok önemlidir. Folyo kaplamayı plakalardan çıkarmadan önce bu santrifüjleme adımının amacı, bir kuyudan maya dolu damlacıkların folyodan uçmamasını ve diğer kuyularda sona ermesini sağlamaktır. Santrifüjlemeden sonra folyo kaplama ile temas eden mayayı önlemek için plakaları asla eğmemeye veya karıştırmamaya dikkat edin. - Folyoyu dikkatlice soyun ve pipet karıştırmak için kuyunun etrafında hareket ettirirken, bir pipetle hücreleri plakadaki toplam hacmin yaklaşık yarısına ayarlanmış bir pipetle kuvvetlice pipetle geri koyun. Tüm hücrelerin kuyuların dibinden yeniden biriktirildiğini kontrol edin.
- Bireysel kuyularda birden fazla suş kullanılacaksa, suşlar şu anda deney için gerekli oranda karıştırılmalıdır. Büyüme hızı ölçümleri oluşturmak için bir referans suşu kullanılacaksa, referansın test suşuna oranı 1:1 olmalıdır.
- Pipet 10 μL maya büyüme medyasından seyreltme plakası 1'e. Kuyu başına 200 μL'lik son hacme her kuyuya 100 μL deneysel büyüme ortamı ekleyin. Kuvvetlice yukarı ve aşağı boru.
- Pipet 10 μL maya plaka 1'den plaka 2'ye. Her kuyuya 100 μL deneysel büyüme ortamı ekleyin ve karıştırmak için kuvvetlice yukarı ve aşağı borulayın.
NOT: Bu seyreltme adımları, büyüme öncesi aşamanın sonunda birbirine yapışan maya kümelerinin ayrılmasına yardımcı olmak ve her kuyuda yaklaşık eşit sayıda maya hücresinin sona ermesini sağlamak için kritik öneme sahiptir. Her kuyuda tutarlı sayıda maya olması, büyüme hızı ölçümlerinde deneysel gürültü ve önyargıların giderilmesine yardımcı olur (bkz. Temsili Sonuçlar).
- Seri seyreltmeler için iki adet 96 kuyu kültür plakası kurun: plaka 1 ve 2 olarak etiketleyin ve her seri seyreltme plakasına 90 μL deneysel büyüme ortamı (yani mayanın mikroskopta büyüyeceği ortam) ekleyin.
- Sonication
NOT: Sonication isteğe bağlıdırve sadece birbirine yapışma eğilimi yüksek olan maya suşları için yapılması gerekir (örneğin, bazı vahşi suşlar). Laboratuvar suşları için sonication genellikle gerekli değildir ve adım 3.4'e geçilerek atlanabilir.- %70 etanol ile dolu 96 kuyulu bir tabağa yerleştirerek % 70 etanol ile 96 pimli bir sonicator kafasını sterilize edin ve tiftik ve statik içermeyen bir mendille kurulayın.
- Floküle maya hücrelerini parçalamak için yeterince güçlü olan, ancak hücreleri öldürmeyen veya yüksek stres tepkilerine neden olmayan bir sonication programı ayarlayın. Belirli bir deney için en iyi sonication programını tanımlamak için bazı testler gerekebilir. Bu deneyde kullanılan sonication programı şudur: genlik = 10, işlem süresi = 10 s, pulse-on = 1 s, pulse-off = 1 s. Bu tam program muhtemelen tüm sonicators için geçerli değildir, bu nedenle deney gününden önce test önerilir.
- Mayayı seri seyreltme plakasında 2 kez daha beş kez kuvvetlice yukarı ve aşağı borulayarak karıştırın.
- Seyreltme plakası 2'yi platforma yerleştirin ve hücre süspansiyonundaki sonicator pimleriyle sabitleyin, ancak plakanın altına dokunmayın. Uygun kulak korumasını kullanarak sonication programını çalıştırın.
- Program çalıştırdıktan sonra, sonicator kafasını% 70 etanol ve ardından su ile temizleyin ve ardından hücrelerin tekrar flocculate olmaması için hemen mikroskop plaka hazırlığına geçin.
- Plakayı Mikroskop için Hazırlayın:
- Pipet 15 μL maya seri seyreltme plakası 2 mikroskop plakasından 200 μL hacme kadar.
- Plakayı nefes alabilen bir zarla örtün. Plakayı bu zarla, örneğin bir lastik silindir kullanarak iyice kapatmak önemlidir.
- Maya hücrelerini cam yüzeyindeki concanavalin A'ya yapıştırmak için, plakayı 411 x g'da2 dakika boyunca altında tiftiksiz ve statik içermeyen bir mendille santrifüj edin.
- Mikroskopta, plakanın üst ve alt kısmını tiftiksiz ve statik içermeyen bir mendille silin ve döküntülerden kurtulmak için sıkıştırılmış havayı tabağa üfleyin.
- Plakayı mikroskopa yerleştirin, düz olduğundan ve A1 kuyusunun sol üst köşede olduğundan emin olun.
4. Zaman Atlamalı Mikroskopi Büyüme Hızı Ölçümleri
NOT: Hızlandırılmış mikroskopi sırasında aşağıdaki özellikler bilgisayar kontrollü olarak kontrol edilir: x, y ve z konumu, panjurlar ve floresan filtreleri. Donanım tabanlı otomatik odaklama sistemi, hızlandırılmış görüntüleme sırasında odak düzlemlerinin sürüklenmesini önlemek için en uygun sistemdir. Alternatif olarak, yazılım tabanlı otomatik odaklama döngüsü kullanılabilir. Mikroskop odasındaki nemi korumak için, deney süresi boyunca odada arıtılmış su ile bir beher tutulması önerilir.
- Her mikroskop plakası kuyusunun tam olarak görüntülenebilmesi için görüntüye bir konum listesi (x,y) oluşturun. Hiçbir hücrenin birden çok kez analiz olmaması için çakışan görüntülerden kaçının.
- 15x büyütmede diyoskopik aydınlatma (DIA) ile brightfield görüntü. Pozlamayı ~5 ms olarak ayarlayın.
- Hücrelerin açıkça görülebilmesi için görüntüyü dijital olarak yakınlaştırın. Plakanın köşesindeki dört kuyuda ve plakanın ortasındaki bir kuyuda deney için ideal odağı tanımlamak için odak düğmelerini kullanın. Hücrelerin maksimum kontrastını alacak şekilde odaklanın.
- Deneme için z konumunu (veya otomatik odaklama konumunu) bu kuyuların her biri için tanımlanan z/otomatik odaklama konumlarının ortalaması olacak şekilde ayarlayın. Mikroskop plakası iyi yapılmışsa ve cam tabanın kusurları yoksa, ideal odak pozisyonları her kuyu için benzer olmalıdır.
NOT: Görüntüleri kolayca işleme (PIE) görüntü analizi ardışık düzeni11,12ile analizederken,hücrelerin mikroskop üzerinde biraz odaklanmaması yararlıdır, böylece hücrenin dışında koyu bir kenar ve doğru koloni tanıma ve boyut tahminlerine yardımcı olan açık renkli bir iç mekan vardır. - Floresan suşları kullanıyorsanız, hiçbir pikselin aşırı pozlanmamasını sağlamak için görüntülerin kanallarını ve pozlamalarını tanımlayın. Floresan kanallar için pozlama süresini ayarlarken, hücreleri uzun süre floresan heyecana maruz bırakmamak için mikroskopta "canlı yakalama" modunu kapatın, çünkü bu hem hücreleri fotobleach edebilir hem de strese neden olabilir.
- İstenilen süre boyunca istenen zaman aralığında görüntü yakalamak için zaman sırası alımını ayarlayın.
- Deneyi çalıştırın.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Bu protokolün yeniliği, büyüme hızının bir popülasyondaki bireysel hücreler için zaman atlamalı görüntüleme yoluyla mikrokolonlara büyümelerini izleyerek hesaplanabilmesidir (Şekil 2A). Mikro sömürgeler concanavalin A varlığı nedeniyle düzlemsel bir şekilde saatlerce büyüdüğünden, alanları deney boyunca izlenebilir ve zaman içinde alanın doğal günlüğündeki değişime doğrusal bir uyum, 7,9, 10,13gözlenen her bir koloni için büyüme hızını hesaplamak için kullanılabilir. Aynı ortamdaki bireysel izojenik hücreler için mikrokolony büyüme hızındaki farklılıklar açıkça kaydedilmiştir (Şekil 2A, 2B). Mikrokolony boyutu ve floresandaki değişiklikleri otomatik olarak izlemek için görüntü analizi yazılımı kullanılmalıdır (Şekil 2C); Şekil 2A'da gösterilen koloni izleme PIE11,12kullanılarak yapılmıştır.
Şekil 2: Maya mikrokolonlarında büyüme hızının ve floresan miktarının ölçülmesi. (A) Tek bir görüntüleme alanının, deney başlangıcında, 3 saat sonra ve 6 saat sonra büyüyen mikrokolonları gösteren, PIE koloni izleme yazılımını kullanarak koloni takibini gösteren bir kısmı. Koloniler deney süresince tek katmanlı olarak gözle görülür şekilde büyüyorlar. (B) A panelinde izlenen koloniler için zaman içinde ln(alan) değişikliği. Bir koloni için yeterli zaman noktası verisi varsa, büyüme hızı ve büyüme öncesi gecikme süresi hesaplanabilir. (C) Deneyin büyüme kısmı tamamlandıktan sonra çekilen A panelinde koloniler için GFP floresan yoğunluğunu gösteren görüntü, koloninin 6-h zaman noktasından ana hatlarıyla kaplanmıştır. Burada, Scw11P::GFP her deneysel kuyuda bulunan bir referans suşu işaretler. Her koloninin GFP floresan seviyesinin hesaplanması, hangi kolonilerin referans suşundan kaynaklandığının ve her kuyudaki referans olmayan suşlardan hangisinin kaynaklandığının belirlenmesini sağlar. Her ölçek çubuğu 50 μm'dir. Bu şeklin daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.
Tipik olarak, deney başına~10 5 mikrokolony büyüme oranları bu test kullanılarak toplanabilir. Bu veriler, hem suşlar/büyüme koşulları arasındaki farklılıkları hem de paylaşılan bir durumda yetişen genetik olarak özdeş mikrokolonlar arasındaki varyasyonu gözlemlemek için kullanılabilir. Örneğin, Şekil 3A, aynı kuyularda yetişen mutasyon-birikim çizgisi (MAH.44) 14 ve GFP işaretli referans suşundan~12.000 koloni için büyüme oranlarının dağılımlarını gösterir ve hem suşlar arasındaki farklar hem de yüksek gerinim değişkenliği görülebilir. Şekil 3B'de, kuyu içi GFP işaretli kontrolleriyle eşleştirilmiş 10 mutasyon-birikim suşu için bireysel büyüme oranları ve özet istatistikleri gösterilmiştir; toplanan veriler, küçük ortalama büyüme oranı farklılıklarının hassas bir şekilde hesaplanmasına izin verir.
Şekil 3. Bireysel mikrokolony büyüme oranlarının büyük örnek boyutları, gerinim içinde ve gerinim arasında büyüme varyasyonunun hassas bir şekilde ölçülmesini sağlar. (A) İki suştan ~12.000 koloninin büyüme oranlarının dağılımları. Dağılım modlarının yanı sıra her birinde bulunan yavaş büyüyen kolonilerin uzun kuyruğu arasındaki farklara dikkat edin; ikincisi sadece bireysel mikrokolony ölçümleri nedeniyle tespit edilebilir. (B) 11 suştan ~120.000 koloni için bireysel mikrokolony büyüme oranlarının (siyah noktalar) ve özet istatistiklerinin (ortanca gösteren boxplots ve daha düşük ve üst% 25 nicelik) dağılımları. (A)'da olduğu gibi, her suş, çivili GFP işaretli referans suşu ile tek bir kuyuda yetiştirildi; burada gösterilen veriler MAH referanslı gerinim çifti başına 14 deneysel kuyuyı temsil eder. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.
Mikrokolony büyüme tahlili, hem brightfield hem de floresan kanallarını görüntüleyerek büyüme ve gen ekspresyonunu aynı anda ölçmek için de kullanılabilir. Şekil 2'degösterilen deneyde, deneyin büyüme aşamasının tamamlanmasından sonra GFP ekspresyonunun floresan görüntülenmesi, GFP işaretli kuyu içi referans suşuna ait kolonilerin zayıf GFP ekspresy hızı ile tanımlanmasına izin verdi (Şekil 2C); bununla birlikte, zaman noktalarında gen ekspresyon düzeylerindeki interkolony farklılıklarının ölçümü de mümkündür (bkz. Tartışma).
Bir dizi yaygın tuzak, doğru büyüme hızı verilerinin toplanmasını veya bu verilerin doğru analizini engelleyebilir. Önemli bir nokta, büyüme hızı ölçümlerinin tek kurucu maya hücrelerinden hareketsiz, iki boyutlu mikrokolonların oluşumuna dayandırdığıdır. Concanavalin A, mikrokolonları hareketsiz hale getirmek için maya hücrelerinin yüzeylerindeki polisakkaritlerle yaygın olmayan bir şekilde etkileşime girer. Concanavalin A ve maya hücreleri arasındaki bağ şekerlerle rekabet veya düşük pH15ile tersine çevrilebilir. Bu nedenle, maya özü (YEPD) veya fitalat (Edinburgh Minimal Media) gibi lectin bağlayıcı bileşenler içeren güçlü asidik ortam veya ortam, hareketsizleştirme tekniğinde değişiklik yapılmadan bu test için kullanılamaz (Şekil 4A).
Büyüme tahlili, flocculate maya suşları ile yapılıyorsa, isteğe bağlı sonication adımı, tek hücrelerin deneyin başındaki mikroskop plakasında hareketsiz hale getirilmesi için agrega hücrelerini parçalamak için kullanılmalıdır (sonikasyon adımı atlanırsa, kaplama sonrası hücrelerin flokülasyonu örneği için Şekil 4B'ye bakın). Büyüme hızı ölçümleri artık tek bir kurucu hücreden türemediğinden ve hücreler iki boyutta büyümeyebileceğinden, birden çok hücre kümesi tarafından kurulan mikrokolonlar aşağı akış analizinde hariç tutulmalıdır. Tomurcuklanan bir hücre tarafından kurulan mikrokolonlar kabul edilebilir. İki boyutlu mikro sömürgelerin oluşumu, koloniler tek bir hücre tarafından kurulmuş olsa bile, çok güçlü bir şekilde flocculate olan maya tarafından engellenir ve bu nedenle bir maya suşunun concanavalin A üzerinde tek bir katmanda büyüme yeteneği, büyüme testi yapmadan önce test edilmelidir.
Bir diğer önemli husus, denemenin hem planlama hem de analiz aşamalarında, analize kaç zaman noktasının dahil edilerek belirlenirken gelir. İlk olarak, büyümeyi doğru bir şekilde izlemek için yeterli bir süre boyunca yeterli zaman noktaları için veri eklemek önemlidir: testlerin, mayaların ~ 5 iki katına çıkmak için zamana sahip olacak şekilde çalıştırıldır ve bu süre boyunca en az 10 zaman noktası toplanması önerilir. Bununla birlikte, toplanan her zaman noktasını büyüme hızı hesaplamasına dahil ederim, birçok koloni için büyüme oranını yapay olarak düşüren bir önyargıya neden olacaktır. Bu sapma, hücreler büyümeye başlamadan önce bir gecikme aşamasından geçtiğinde ortaya çıkabilir (Şekil 4C). Mikrokolonların büyüme öncesi gecikmesi yaygındır ve deneysel koşullar ile suşlar arasında değişir9,13. Deneysel analiz yöntemleri, "aktif büyüme" dönemindeki zaman noktalarını büyüme öncesi gecikmeden ayırt edebilmelidir; bir yaklaşım, bir pencerede önceden ayarlanmış sayıda zaman noktası kullanmak ve en yüksek büyüme hızına karşılık gelen pencereyi bulmaktır (Şekil 4C, katı çizgi)11,13.
Son olarak, mikrokolony büyüme testinin en kritik adımlarından biri maya hücre seyreltme adımıdır. Hücrelerin konsantrasyonu ve mikroskop plaka kuyuları içindeki farklı genotiplerin oranı dikkatlice kontrol edilmelidir. İstatistiksel analiz için, deneylerin her genotip ve durum için yaklaşık eşit sayıda hücrenin test edilmesi ve karşılaştırılması için dengelenmiş olması önemlidir16. Buna ek olarak, komşu koloniler birleştikten sonra yararlı büyüme oranları tipik olarak ölçülemez, çünkü bireysel kolonilerin büyüme oranları artık ayırt edilemez; bu nedenle, daha yoğun kaplamalı hücreler daha az zaman noktasından büyüme verileri verecektir (Şekil 4D). Daha da önemlisi, bir deneyin başlangıcında hücre yoğunluğu yüksek veya düzensizse, birleştirilmiş mikrokolonları filtrelemek, daha hızlı büyüyen mikrokolonları aşağı akış analizlerinden orantısız bir şekilde dışlayacaktır, çünkü hızlı yetiştiriciler yavaş yetiştiricilerden daha sık birleşecektir. Bu nedenle, nihai büyüme ölçümleri daha yavaş büyüyen alt popülasyonlara karşı önyargılı olacaktır. Ek olarak, farklı sayıda koloni, dengeli bir deneyi önleyen farklı tedaviler için filtrelenebilir. Kuyu başına yaklaşık 4000 hücrenin 96 kuyulu bir plakada (veya 384 kuyu plakasında kuyu başına 700 hücre) tabaklatması önerilir. Protokolün maya seyreltme kısmı boyunca kapsamlı pipet karıştırma, her kuyuda doğru sayıda hücrenin bulunduğundan ve hücrelerin kuyu boyunca eşit olarak dağıldığından emin olmak için zorunludur. Ayrıca, merkezleri birbirine ~25 hücre çapı içinde olan herhangi bir mikrokolonyu analizden çıkarmanız önerilir.
Şekil 4. Deneysel tuzaklar. (A) Hücrelerin concanavalin A'ya verimli bağlanmasını önleyen YEPD medyasında büyüyen koloniler. Herhangi bir koloniden (ok uçları) uzak yeni hücrelerin ortaya çıkması ve koloninin kenarındaki birçok odak dışı hücrenin ortaya çıkması, hücrelerin cam yüzeye yapışamamasının ve büyüme sırasında koloniden uzaklaşmasının sonucudur. (B) Sonication olmadan kaplamadan hemen sonra bir flokülasyon geriniminden hücreler; farklı odak düzlemlerinde çok sayıda birden çok hücre kümesinin (ok ucu) ve kümeler içindeki hücrelerin varlığına dikkat edin. (C) Uzun gecikme evresi olan bir koloni için zaman içinde ln(alan) değişikliği. Büyüme hızı tahmini için tüm zaman noktaları kullanılıyorsa, tahmini büyüme oranının önemli ölçüde depresyonda olduğunu unutmayın; doğru bir ölçüm yalnızca en yüksek büyüme hızı tahminiyle sonuçlanan n zaman noktalarının alt kümesi (burada n=6) kullanıldığında üretilir. (D) Deney başlangıcında ve 7 saat büyümeden sonra çok yoğun bir şekilde kaplanan hücreler. Renkler, komşularla birleşene kadar tek tek kolonileri izler; burada, 7-h işaretiyle, kolonilerin çoğunluğu birleşti ve sadece az sayıda bireysel yavaş büyüyen koloni kaldı. (Burada gösterilen kolonilerin küçük bir alt kümesinin izlenmesi, koloni birleştirme ile ilgisi olmayan nedenlerden dolayı kaybolur.) Her ölçek çubuğu 50 μm'dir. Bu şeklin daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Burada açıklanan protokol, hücre büyümesi ve gen ekspresyonunun aynı anda bireysel mikrokolonlar düzeyinde izlenmesini sağlayan çok yönlü bir testtir. Bu iki modaliteyi birleştirmek benzersiz biyolojik içgörüler sağlar. Örneğin, önceki çalışmalar bu tahlili, aynı anda7,10'unher ikisini de ölçerek Izojenik wildtype hücrelerinde TSL1 geninin ekspresyonu ile mikrokolony büyüme hızı arasında negatif bir korelasyon göstermek için kullanmıştır. Açıklanan tahlil ile floresan etiketli proteinlerin büyüme hızı ile hücre altı lokalizasyon dinamikleri arasındaki ilişkiyi izlemek de mümkündür. Örneğin, büyüme hızı ile RFP etiketli transkripsiyon faktörü Msn2'nin nükleer doluluğu arasında negatif bir ilişki, büyüme testini başlatmadan önce 30 dakika boyunca her dakika hücrelerde floresan görüntüleme ile tanımlanmıştır10. Son olarak, bu protokol çevresel streslere ve pertürbasyonlara karşı hücre yanıtlarının izlenmesine izin verir. Isı şoku gibi tedaviler büyüme test yoluyla yarı yolda uygulanabilir. Bu tür çalışmalar, örneğin, yüksek Tsl1 seviyelerini ifade eden yavaş büyüyen hücrelerin ısı şokuna daha hoşgörülü olduğunu ortaya koydu 7,10.
Temsili Sonuçlar bölümünde (Şekil 4) açıklanan yaygın tuzaklara ek olarak, bir büyüme tahlil deneyi tasarlarken birkaç temel faktör göz önünde bulundurulmalıdır. Test ile ölçülen fenotip varyasyonu, bazıları tekrarlanabilir ve genotip veya çevre gibi doğal ilgi çekici olan birden fazla faktörden etkilenirken, diğerleri teknik varyasyonun sonucudur13. Bu nedenle, bir mikrokolony tahlili tasarlarken ilk önemli husus, deneyi, ilgi çekici etkilerin teknik varyasyondan kaynaklanan etkilerden ayrılmasını kolaylaştıracak şekilde gerçekleştirmektir; bu ayrımın anahtarı, deneysel plakalardaki tedavileri veya suşları rastgele hale getirmek ve her deneye kontrolleri dahil etmektir. Doğrusal karma modelleme (LMM) gibi uygun istatistiksel yöntemler, aşağı akış analizi17,18'dekifarklı varyasyon kaynaklarını hesaba katmak için toplandıktan sonra verilere uygulanmalıdır.
Deneysel ilgi değişkenleri nedeniyle büyüme fenotiplerindeki varyasyonu, parti etkileri gibi rastgele faktörler nedeniyle varyasyondan ayırmak için istatistiksel yöntemler kullanabilmek için, farklı günlerde ve genotip ve büyüme koşullarının randomize kuyu konumları ile birden fazla deney yapmak gerekir. Ek olarak, suşlar veya tedavi koşulları arasındaki büyüme farklılıklarını tespit etmek için deneyin gücünü artırmak için, test edilen her genotip veya büyüme durumunun mümkün olduğunca tek bir deneysel plakaya birden fazla çoğaltılması da önemlidir.
Mikrokolonik büyüme testinin önemli bir avantajı, toplayabildiği veri miktarında yatmaktadır: tek bir deneysel plaka genellikle ~105 bireysel mikrokolonlar için veri üretir, bu da çok işlevli plakalar yerine mikroakışkan cihazlar kullanan tipik deneylerden birkaç büyüklük siparişidir. Kolonileri otomatik olarak izleyen ve ilgili verileri hesaplayan yazılımlar (örneğin gecikme süreleri, büyüme oranları ve ortalama floresan yoğunlukları) bu testten tam olarak yararlanmanın anahtarıdır. Bu yazılım sadece koloni sınırlarını sağlam bir şekilde tanımlamak ve kolonileri zaman içinde izlemekle kalmamalı, aynı zamanda bir gecikme fazı13olan kolonilerdeki büyümeyi doğru bir şekilde ölçmelidir. Bu amaçla geliştirilen seçeneklerden biri, zaman içinde kolonileri izleyen (koloni pozisyonundaki kaymaları hesaba katan), büyüme oranlarını hesaplayan ve floresan görüntüleme verilerinin deneysel ölçümlere entegrasyonuna izin veren açık kaynaklı yazılım PIE11,12.
Mikrokolony büyüme tahlili, büyüme fenotip değişkenliği, farklı ortamlarda veya strese yanıt olarak değişiklikler ve büyüme ile protein ekspresyonu veya hücre altı lokalizasyonu arasındaki ilişki de dahil olmak üzere maya fitness ve evrimi ile ilgili temel sorular hakkında fikir edinmek için kullanılabilir. Test, S. cerevisiae7,9,10,13'ünhem laboratuvar hem de vahşi suşlarının çalışmalarında yoğun olarak kullanılmıştır.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Yazarların açıklayacak bir şeyi yok.
Acknowledgments
Naomi Ziv, Sasha Levy ve Shuang Li'ye bu protokolün geliştirilmesine katkılarından dolayı, David Gresham'a paylaşılan ekipmanlar için ve Marissa Knoll'a video prodüksiyon konusunda yardımları için teşekkür ederiz. Bu çalışma Ulusal Sağlık Enstitüleri hibesi R35GM118170 tarafından desteklendi.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| General Materials | |||
| 500 mL Bottletop Filter .22 µm PES Sterilizing, Low Protein Binding, w/45mm Neck | Fisher | CLS431154 | used to filter the media |
| BD Falcon*Tissue Culture Plates, microtest u-bottom | Fisher | 08-772-54 | 96-well culture tubes used to freeze cells, pre-grow cells, and dilutions |
| BD Syringes without Needle, 50 mL | Fisher | 13-689-8 | Used to filter the Concanavalin A |
| Costar Sterile Disposable Reagent Reservoirs | Fisher | 07-200-127 | reagent reservoirs used to pipette solutions with multichannel pipette |
| Costar Thermowell Aluminum Sealing Tape | Fisher | 07-200-684 | 96-well plate seal for pre-growth and freezing |
| lint and static free Kimwipes | Fisher | 06-666A | lint and static free wipes to keep microscope plate bottom free of debris and scratches |
| Nalgene Syringe Filters | ThermoFisher Scientific | 199-2020 | 0.2 μm pore size, 25 mm diameter; used to filter concanavalin A solution |
| Media Components | |||
| Minimal chemically defined media (MD; 2% glucose) | alternative microscopy media used for yeast pre-growth and growth during microscopy | ||
| Synthetic Complete Media (SC; 2% glucose) | microscopy media used for yeast pre-growth and growth during microscopy | ||
| Yeast extract-peptone-dextrose (YEPD; 2% glucose) medium | cell growth prior to freezing down randomized plates | ||
| Microscopy Materials | |||
| Breathe-Easy sealing membrane | Millipore Sigma | Z380059-1PAK | breathable membranes used to seal plate during microscopy experiment. At this stage breathable membranes are recommended because they prevent condensation in the wells and allow for better microscopy images |
| Brooks 96-well flat clear glass bottom microscope plate | Dot Scientific | MGB096-1-2-LG-L | microscope plate |
| Concanavalin A from canavalia ensiformis (Jack Bean), lyophilized powder | Millipore Sigma | 45-C2010-1G | Make 5x concanavalin A solution and freeze 5ml of 5x concanavalin A in 50 mL conical tubes at -80 °C |
| Strains Used | |||
| MAH.5, MAH.96, MAH.52, MAH.66, MAH.11, MAH.58, MAH.135, MAH.15, MAH.44, MAH.132 | Haploid mutation accumulation strains in a laboratory background, described in Hall and Joseph 2010 | ||
| EP026.2A-2C | Progeny of the ancestral Hall and Joseph 2010 mutation accumulation strain, transformed with YFR054cΔ::Scw11P::GFP | ||
| Equipment | |||
| Misonix Sonicator S-4000 with 96-pin attachment | Sonicator https://www.labx.com/item/misonix-inc-s-4000-sonicator/4771281 | ||
| Nikon Eclipse Ti-E with Perfect Focus System | Inverted microscope with automated stage and autofocus system |
References
- Geiler-Samerotte, K. A., Hashimoto, T., Dion, M. F., Budnik, B. A., Airoldi, E. M., Drummond, D. A. Quantifying condition-dependent intracellular protein levels enables high-precision fitness estimates. PloS one. 8 (9), 75320 (2013).
- Kussell, E., Leibler, S. Phenotypic diversity, population growth, and information in fluctuating environments. Science. 309 (5743), 2075-2078 (2005).
- Thattai, M., van Oudenaarden, A. Stochastic gene expression in fluctuating environments. Genetics. 167 (1), 523-530 (2004).
- King, O. D., Masel, J. The evolution of bet-hedging adaptations to rare scenarios. Theoretical population biology. 72 (4), 560-575 (2007).
- Acar, M., Mettetal, J. T., van Oudenaarden, A. Stochastic switching as a survival strategy in fluctuating environments. Nature genetics. 40 (4), 471-475 (2008).
- Avery, S. V. Microbial cell individuality and the underlying sources of heterogeneity. Nature reviews. Microbiology. 4 (8), 577-587 (2006).
- Levy, S. F., Ziv, N., Siegal, M. L. Bet hedging in yeast by heterogeneous, age-correlated expression of a stress protectant. PLoS biology. 10 (5), 1001325 (2012).
- van Dijk, D., et al. Slow-growing cells within isogenic populations have increased RNA polymerase error rates and DNA damage. Nature communications. 6, 7972 (2015).
- Ziv, N., Shuster, B. M., Siegal, M. L., Gresham, D. Resolving the Complex Genetic Basis of Phenotypic Variation and Variability of Cellular Growth. Genetics. 206 (3), 1645-1657 (2017).
- Li, S., Giardina, D. M., Siegal, M. L. Control of nongenetic heterogeneity in growth rate and stress tolerance of Saccharomyces cerevisiae by cyclic AMP-regulated transcription factors. PLoS genetics. 14 (11), 1007744 (2018).
- Plavskin, Y., Li, S., Ziv, N., Levy, S. F., Siegal, M. L. Robust colony recognition for high-throughput growth analysis from suboptimal low-magnification brightfield micrographs. bioRxiv. , (2018).
- Siegallab. , Available from: http://github.com/Siegallab/PIE (2020).
- Ziv, N., Siegal, M. L., Gresham, D. Genetic and nongenetic determinants of cell growth variation assessed by high-throughput microscopy. Molecular biology and evolution. 30 (12), 2568-2578 (2013).
- Hall, D. W., Joseph, S. B. A high frequency of beneficial mutations across multiple fitness components in Saccharomyces cerevisiae. Genetics. 185 (4), 1397-1409 (2010).
- Saleemuddin, M., Husain, Q. Concanavalin A: a useful ligand for glycoenzyme immobilization--a review. Enzyme and microbial technology. 13 (4), 290-295 (1991).
- Geiler-Samerotte, K. A., Bauer, C. R., Li, S., Ziv, N., Gresham, D., Siegal, M. L. The details in the distributions: why and how to study phenotypic variability. Current opinion in biotechnology. 24 (4), 752-759 (2013).
- Nakagawa, S., Schielzeth, H. Repeatability for Gaussian and non-Gaussian data: a practical guide for biologists. Biological reviews of the Cambridge Philosophical Society. 85 (4), 935-956 (2010).
- Bolker, J. A. Exemplary and surrogate models: two modes of representation in biology. Perspectives in biology and medicine. 52 (4), 485-499 (2009).
