High-Throughput Live Imaging af mikrokolonier til måling af heterogenitet i vækst og genekspression

Summary

Gær vækst fænotyper er præcist målt gennem meget parallelle time-lapse billeddannelse af immobiliserede celler vokser til mikrokolonier. Samtidig kan stresstolerance, proteinudtryk og proteinlokalisering overvåges og generere integrerede datasæt for at undersøge, hvordan miljømæssige og genetiske forskelle samt genekspressions heterogenitet blandt isogene celler modulerer vækst.

Abstract

Præcise målinger af heterogenitet mellem og inden for belastningen i mikrobielle vækstrater er afgørende for at forstå genetiske og miljømæssige input i stresstolerance, sygdomsfremkaldende evne og andre nøglekomponenter i fitness. Dette manuskript beskriver en mikroskopbaseret analyse, der sporer ca. 10⁵ Saccharomyces cerevisiae mikrokolonier pr. eksperiment. Efter automatiseret time-lapse billeddannelse af gær immobiliseret i en multiwell plade, mikrokoloni vækstrater er let analyseres med brugerdefinerede billedanalyse software. For hver mikrokoloni kan ekspression og lokalisering af fluorescerende proteiner og overlevelse af akut stress også overvåges. Denne analyse giver mulighed for præcis vurdering af stammernes gennemsnitlige vækstrater samt omfattende måling af heterogenitet i vækst, genekspression og stresstolerance i klonpopulationer.

Introduction

Vækst fænotyper bidrager kritisk til gær fitness. Naturlig udvælgelse kan effektivt skelne mellem afstamninger med vækstrater, der varierer i det modsatte af den effektive befolkningsstørrelse, som kan overstige 10⁸ personer¹. Desuden er variation i vækstrater blandt individer i en population en evolutionært relevant parameter, da den kan tjene som grundlag for overlevelsesstrategier som bet hedging^2,3^,4,5,6. Derfor er assays, der giver mulighed for meget nøjagtige målinger af vækstphoenotyper og deres fordelinger, afgørende for undersøgelsen af mikroorganismer. Den mikrokoloniske vækstanalyse, der er beskrevet her, kan generere individuelle vækstratemålinger for ~ 10⁵ mikrokolonier pr. Eksperiment. Denne analyse giver derfor en stærk protokol til at studere gær evolutionære genetik og genomik. Det egner sig særligt godt til at teste, hvordan variation i populationer af genetisk identiske enkeltceller genereres, vedligeholdes og bidrager til befolkningens egnethed^7,8,9,10.

Den metode, der er beskrevet her (Figur 1) bruger periodisk optagne, lav-forstørrelse brightfield billeder af celler vokser i flydende medier på en 96- eller 384-godt glas-bund plade til at spore vækst i mikrokolonier. Cellerne klæber til lectin concanavalin A, som dækker bunden af mikroskoppladen og danner todimensionelle kolonier. Fordi mikrokolonier vokser i et monolayer, mikrokoloni område er stærkt korreleret med celle nummer⁷. Derfor kan nøjagtige skøn over mikrokolonivækst og forsinkelsestid genereres med brugerdefineret billedanalysesoftware, der sporer ændringshastigheden for arealet af hver mikrokoloni. Desuden kan den eksperimentelle opsætning overvåge overflod og endda de subcellulære lokaliseringer af fluorescerende mærkede proteiner udtrykt i disse mikrokolonier. Downstream-behandling af data fra denne mikrokoloniske vækstanalyse kan opnås ved brugerdefineret analyse eller ved eksisterende billedanalysesoftware, såsom Processing Images Easily (PIE)¹¹, en algoritme til robust koloniområdegenkendelse og vækstanalyse med høj overførselshastighed fra lavforstørrelse, brightfield-billeder, som er tilgængelig via GitHub¹².

Da vækstestimater, der stammer fra mikrokoloniens vækstanalyse, genereres af et stort antal enkeltkolonimålinger, er de ekstremt nøjagtige, idet standardfejl er flere størrelsesordener mindre end selve estimaterne for et eksperiment af rimelig størrelse. Derfor er analysens kraft til at opdage vækstrateforskelle mellem forskellige genotyper, behandlinger eller miljøforhold høj. Multiwell-pladeformatet gør det muligt at sammenligne mange forskellige miljø- og genotypekombinationer i et enkelt eksperiment. Hvis stammer udgør udtryk for forskellige fluorescerende markører, kan de blandes i samme brønd og skelnes af efterfølgende billedanalyse, hvilket kan øge magten yderligere ved at tillade godt-by-well data normalisering.

Figur 1: Skematisk repræsentation af protokollen. Denne protokol følger to hovedtrin, som er forberedelsen af forsøgspladen og forberedelsen af cellerne til billedet. Randomisering af plader og vækst af celler bør udføres før og op til eksperimentdagen. Gentagen blanding af celler på hvert trin under fortynding er afgørende i trinene, indtil plating, og derfor anbefales det først at forberede forsøgspladen, så den er klar til plating umiddelbart efter afslutningen af cellefortynding. Klik her for at se en større version af dette tal.

Protocol

1. Forberedelse af randomiserede plader (før eksperimentdagen)

1. Planlæg de stammer og betingelser, der skal testes med vækstanalysen. På dette tidspunkt tildeler tilfældigt stammer og betingelser til enhver brønd.
   BEMÆRK: Når man overvejer pladeopsætning, anbefales det at inkludere mere end én replikat pr. stamme og væksttilstand på en enkelt plade for at tage højde for velrelateret støj i målingerne. Se Diskussion for at få flere oplysninger.
2. Randomiser beregningsmæssigt placeringen af hver stamme og miljøtilstand for pladereplikater, der køres på forskellige dage.
3. Vokse alle celler, der vil blive brugt i forsøget til mætning i gær ekstrakt-peptone-dextrose (YEPD; 2% glukose) medium i en shaker ved 30 °C (eller enhver anden passende temperatur).
4. Opret de randomiserede lagerplader enten manuelt eller med en væskehåndteringsrobot. Der tilsættes 10 μL af de udpegede mættede celler til hver brønd af en steril U-bundvævskulturplade. Hvis flere stammer vil blive testet i en enkelt brønd, skal du ikke kombinere dem på dette tidspunkt; denne kombination vil ske lige før cellefortyndinger på forsøgsdagen for at sikre, at alle stammer er i de korrekte koncentrationer, når de er belagt som mikrokoloni grundlæggerceller.
5. Der tilsættes 10 μL på 30% glycerol til hver brønd på hver plade. Pipet op og ned, så cellerne og glycerol bliver godt blandet.
6. Hver plade forsegles med et foliedæksel og fryses straks ned ved -70 °C, indtil den er klar til brug.
   BEMÆRK: Det er vigtigt at skabe alle randomiserede plader på samme dag, og fryse dem, således at præ-vækst betingelser for cellerne i hver plade vil have været identiske og vil ikke generere teknisk variation i vækstraten assay.

2. Pre-vækst af gær

BEMÆRK: Typisk starter dette før eksperimentdagen og er meget afhængig af det eksperimentelle spørgsmål. Yderligere oplysninger finder du i Discussion.

1. Der udtages en stamplade (10 μL gær, 10 μL glycerol pr. brønd) fra fryseren -70 °C, og der tilsættes 180 μL af de medier, der skal anvendes til forsøget. Hvis eksperimentet vil blive udført ved hjælp af næringsstof-begrænsende medier, ikke pre-vokse gær til mætning i næringsstof-begrænsende medier som sporulation af gær kan forekomme. I stedet, pre-vokse i ikke-begrænsende medier.
2. Der dyrkes gær, mens gæren rystes ved 30 °C. Overvej, om analysen skal køres begyndende med celler i logfasen eller i stationær fase for at afgøre, om fortynding af cellerne flere gange før forsøget vil være nødvendig. Hvis gærstammerne eller -betingelserne i analysen forventes at have betydeligt forskellige vækstrater, vil en to-dages prævækstperiode være nødvendig for, at alle de forskellige forhold kan nå stationær fase.

3. Opsætning af mikroskop

1. Forberedelse af mikroskopplader
   1. Sørg for, at mikroskopinkubatoren er tændt, og opvarmning af mikroskopkammeret til den ønskede væksttemperatur for forsøgsbetingelserne. Til standardforsøg med Saccharomyces cerevisiae-celler skal inkubatoren opvarme mikroskopkammeret til 30 °C for at sikre, at vækstbetingelserne for cellerne vil være korrekte under væksthastighedsanalysen.
   2. Desinficere arbejdsbænken, pipetter og andre værktøjer med 70% ethanol. Hent en mikroskopplade og læg den på bænken oven på en fnug- og statiskfri aftørring.
      BEMÆRK: Rør aldrig ved bunden af mikroskoppladen, selv med handsker på, og sæt altid mikroskoppladen ned oven på en fnug- og statiskfri aftørring, hver gang den rører ved en overflade. Dette forhindrer pletter eller ridser i at hindre vækstmålinger, når eksperimentet afbildes.
   3. Tø 5 ml 5x concanavalin A-opløsning, fortyndes til 1x med vand, og filtreres steriliseres gennem en sprøjte udstyret med et 0,2-μm filter.
   4. Filter steriliserer alle andre væsker, der vil blive brugt i analysen med et 0,2 μm filter, herunder eksperimentelle medier, for at fjerne eventuelle krystaller eller snavs, der måtte være materialiseret i opløsningerne. Tilstedeværelsen af krystaller ville reducere kvaliteten af mikroskopibillederne.
   5. Rør 200 μL concanavalin En opløsning ind i hver brønd af mikroskoppladen.
   6. Centrifuge pladen i 2 min ved 411 x tyngdekraft (g) med en fnug- og statiskfri aftørring under pladen for at sikre, at concanavalin A-opløsningen jævnt dækker bunden af hver brønd, og at der ikke er luftbobler.
   7. Dæk pladen med låget og lad den sidde i 1-2 timer. Den præcise tid pladen sidder er fleksibel, men det er vigtigt at være konsekvent mellem forskellige kørsler af eksperimentet.
   8. Fjern hele concanavalin En opløsning fra pladen enten ved sugning eller ved kraftigt at aflade den ud i vasken eller en beholder. Pas på ikke at røre ved glasdelen af pladen. Det er acceptabelt, hvis nogle dråber concanavalin En opløsning forbliver i brøndene.
   9. Mikroskoppladebrøndene vaskes ved at tilsætte 400 μL sterilt vand. Fjern vandet som gjort med concanavalin A i det foregående trin. Lad ikke pladen sidde tør.
   10. Tilsæt straks 185 μL eksperimentelle vækstmedier i pladen. Der tilsættes 15 μL korrekt fortyndede celler til denne plade.
2. Gær celle fortynding
   BEMÆRK: Nedenstående trin beskriver en fortynding af gær fra en mættet kultur (ca. 10⁸ celler/mL) 400 gange for at opnå en koncentration på 250.000 celler/mL, hvoraf 15 μL fortyndes til 400 μL i glasbundspladen, hvilket giver et endeligt antal på ca. 4000 celler pr. brønd i en 96-brønds plade. Hvis du bruger en 384-brønds plade, skal det endelige antal celler pr. brønd være ca. 700, og fortyndingerne skal justeres i overensstemmelse hermed. Dette forhold bør justeres for celler indsamlet i log fase, vokser i rigere eller dårligere præ-vækst medier, eller fra forskellige stammer. Den endelige tæthed af celler pr. brønd bør reduceres, når vækstrateanalysen køres i perioder på over 10 timer.
   1. Opsæt to 96-brønds kulturplader til serielle fortyndinger: etiket som plade 1 og 2, og tilsæt 90 μL eksperimentelle vækstmedier (dvs. de medier, som gæren vil vokse ind på mikroskopet) til hver seriel fortyndingsplade.
      BEMÆRK: Uanset hvilken endelig fortynding der anvendes, anbefales mindst to serielle fortyndinger af celler, hvor hver især en lille mængde gær pipetteres til et større volumen af eksperimentelle medier, og derefter blandes en stor mængde eksperimentelle medier kraftigt med en pipet (som i trin 3.2.5 og 3.2.6 nedenfor).
   2. Pladen af celler fra forvækst og centrifuge pladen i 2 min ved 411 x g.
      BEMÆRK: Det er meget vigtigt ikke at krydskontaminere forskellige brønde i pladen. Formålet med dette centrifugeringstrin, før foliebelægningen fjernes fra pladerne, er at sikre, at gærfyldte dråber fra en brønd ikke flyver af folien og ender i andre brønde. Pas på aldrig at vippe eller omrøre pladerne for at undgå, at gær kommer i kontakt med foliebeklædningen efter centrifugering.
   3. Skræl forsigtigt folien tilbage og genbrug celler ved kraftigt pipetter celler med en pipet indstillet til ca halvdelen af det samlede volumen i pladen, mens du flytter pipetten rundt i brønden til at blande. Kontroller, at alle celler er blevet genbrugt fra bunden af brøndene.
   4. Hvis der vil blive anvendt flere stammer i de enkelte brønde, bør stammerne blandes på dette tidspunkt i det forhold, der er nødvendigt for forsøget. Hvis der skal anvendes en referencestamme til at generere vækstratemålinger, skal forholdet mellem reference og testbelastning være 1:1.
   5. Rør 10 μL gær fra vækstmedier til fortyndingsplade 1. Der tilsættes 100 μL eksperimentelle vækstmedier til hver brønd til et endeligt volumen på 200 μL pr. brønd. Pipet op og ned kraftigt.
   6. Rør 10 μL gær fra plade 1 til plade 2. Tilsæt 100 μL eksperimentelle vækstmedier til hver brønd, og rør op og ned kraftigt for at blande.
      BEMÆRK: Disse fortyndingstrin er afgørende for at hjælpe med at adskille klynger af gær, der sidder fast sammen i slutningen af førvækstfasen og sikrer, at omtrent lige mange gærceller ender i hver brønd. At have et konstant antal gær i hver brønd hjælper med at fjerne eksperimentel støj og bias i vækstratemålinger (se Repræsentative resultater).
3. Sonikering
   BEMÆRK: Sonikering er valgfriog skal kun udføres for gærstammer, der har en høj tilbøjelighed til at klæbe til hinanden (f.eks. nogle vilde stammer). For laboratoriestammer er sonikering generelt ikke nødvendig og kan springes over ved at gå videre til trin 3.4.
   1. Desinficere en 96-pin sonicator hoved med 70% ethanol ved at placere det i en 96-godt plade fyldt med 70% ethanol og tør med en fnug-og statisk-fri tørre.
   2. Sæt en sonikering program, der er tilstrækkelig stærk til at bryde ud flocculated gærceller, men ikke dræbe celler eller forårsage forhøjede stress reaktioner. Nogle test kan være nødvendige for at identificere det bedste sonikeringsprogram for et givet eksperiment. Det sonikeringsprogram, der bruges i dette eksperiment, er: amplitude = 10, procestid = 10 s, puls-on = 1 s, puls-off = 1 s. Dette nøjagtige program gælder sandsynligvis ikke for alle sonikatorer, så test foreslås før eksperimentdagen.
   3. Bland gæren i seriel fortynding plade 2 igen ved pipetter op og ned kraftigt fem gange.
   4. Placer fortyndingspladen 2 på platformen og fastgør den med sonikatorstifterne i celleaffjedringen, men berører ikke bunden af pladen. Kør sonikeringsprogrammet ved hjælp af passende ørebeskyttelse.
   5. Når programmet kører, rengør sonicatorhovedet med 70% ethanol og derefter med vand, og fortsæt derefter straks til mikroskoppladeforberedelse, så cellerne ikke flocculate igen.
4. Forbered plade til mikroskop:
   1. 15 μL gær fra seriel fortyndingsplade 2 hældes i mikroskoppladen til et volumen på 200 μL. Der tilsættes 200 μL eksperimentelle vækstmedier til hver brønd til et slutvolumen på 400 μL pr. brønd og pipes op og ned kraftigt for at blande.
   2. Dæk pladen med en åndbar membran. Det er vigtigt at forsegle pladen godt med denne membran, for eksempel ved hjælp af en gummirulle.
   3. For at klæbe gærcellerne til concanavalin A på glasoverfladen centrifuges pladen med en fnug- og statiskfri tør under den i 2 minutter ved 411 x g.
   4. Ved mikroskopet skal du tørre toppen og bunden af pladen med en fnug- og statiskfri aftørring og blæse trykluft på pladen for at slippe af med snavs.
   5. Placer pladen på mikroskopet, og sørg for, at den er i niveau, og at A1-brønden er i øverste venstre hjørne.

4. Time-lapse Mikroskopi Vækstmålinger

BEMÆRK: Under time-lapse mikroskopi er følgende funktioner computerstyrede: x, y og z position, skodder og fluorescensfiltre. Et hardwarebaseret autofokussystem er optimalt til at forhindre, at brændplanet glider under time-lapse-billedbehandling. Alternativt kan en softwarebaseret automatisk fokuseringssløjfe bruges. For at opretholde fugtigheden i mikroskopkammeret anbefales det at holde et bægerglas med renset vand i kammeret under hele forsøgets varighed.

1. Opret en liste over positioner (x,y) til billede, så hver mikroskop-plade godt er fuldt afbildet. Undgå overlappende billeder, så ingen celle analyseres flere gange.
2. Billede i lysfelt med diaskopisk belysning (DIA) ved en forstørrelse på 15x. Indstil eksponeringen til ~5 ms.
3. Zoom ind på billedet digitalt, så cellerne er tydeligt synlige. Brug fokusknapperne til at identificere det ideelle fokus for eksperimentet i de fire brønde på hjørnet af pladen og i en brønd i midten af pladen. Fokus på en sådan måde, at der opnås maksimal kontrast mellem cellerne.
4. Angiv z-positionen (eller autofokuspositionen) for eksperimentet til at være et gennemsnit af de z/autofokuspositioner, der er identificeret for hver af disse brønde. Hvis mikroskoppladen er godt lavet, og glasbunden ikke har defekter, skal de ideelle fokuspositioner være ens for hver brønd.
   BEMÆRK: Når du analyserer billeder med Processing Images Let (PIE) billedanalyse pipeline^11,12, er det nyttigt for cellerne at være lidt ude af fokus på mikroskopet, så der er en mørk kant uden for cellen og en lys-farvet interiør, som hjælpemidler i nøjagtig koloni anerkendelse og størrelse skøn.
5. Hvis du bruger fluorescerende stammer, identificere de kanaler og de eksponeringer, som billedet, sikre, at ingen pixels er overeksponeret. Når du indstiller eksponeringstid for fluorescerende kanaler, skal du slå tilstanden "live capture" på mikroskopet for at undgå at udsætte celler for fluorescens excitation i lange perioder, da dette både kan fotobleach cellerne og forårsage stress.
6. Konfigurer tidssekvensanskaffelsen til at tage billeder med det ønskede tidsinterval i det ønskede tidsrum.
7. Kør eksperimentet.

Representative Results

Det nye ved denne protokol er, at vækstraten kan beregnes for de enkelte celler i en population ved at spore deres vækst til mikrokolonier gennem time-lapse imaging (Figur 2A). Da mikrokolonier vokser i mange timer på en planar måde på grund af tilstedeværelsen af concanavalin A, kan deres områder spores gennem hele eksperimentet, og en lineær pasform til ændringen i områdets naturlige log over tid kan bruges til at beregne vækstraten for hver enkelt koloni observeret ^7,9,10,13. Forskelle i mikrokolonivæksten for individuelle isogene celler i samme miljø registreres tydeligt (Figur 2A, 2B). Billedanalysesoftware bør anvendes til automatisk at spore ændringer i mikrokolonistørrelse og fluorescens (figur 2C); kolonisporingen i figur 2A blev udført ved hjælp af PIE^11,12.

Figur 2:Kvantificering af vækstrate og fluorescens i gærmikrokolonier. (A) En del af et enkelt billedfelt, der viser mikrokolonier, der vokser ved forsøgets begyndelse efter 3 timer og efter 6 timer, og som viser kolonisporing ved hjælp af PIE-kolonisporingssoftwaren. Kolonier vokser synligt i et monolayer i eksperimentets varighed. (B) Ændring i (område) over tid for de sporede kolonier i panel A. Hvis der findes tilstrækkelige tidspointdata for en koloni, kan dens vækstrate og forsinkelsestid før vækst beregnes. (C) Billede, der viser GFP-fluorescensintensiteten for kolonierne i panel A, taget efter at vækstdelen af eksperimentet er afsluttet, med koloniens konturer fra 6-timers tidspunktet overlejret. Her markerer Scw11P::GFP en referencestamme, der indgår i enhver eksperimentel brønd. Beregning af GFP-fluorescensniveauet for hver koloni gør det muligt at bestemme, hvilke kolonier der stammer fra referencestammen, og hvilken fra ikke-referencestammerne i hver brønd. Hver skalalinje er 50 μm. Klik her for at se en større version af dette tal.

Typisk, ~ 10⁵ mikrokoloni vækstrater pr eksperiment kan indsamles ved hjælp af denne analyse. Disse data kan bruges til at observere både forskelle mellem stammer/vækstbetingelser og variation på tværs af genetisk identiske mikrokolonier, der dyrkes i en fælles tilstand. Figur 3A viser f.eks. fordelingen af vækstrater for ~12.000 kolonier fra en mutationsakkumuleringslinje (MAH.44)¹⁴ og GFP-mærket referencestamme dyrket i de samme brønde, med både forskelle mellem stammerne og høj variabilitet inden for belastningen synlig. I figur 3Bvises individuelle vækstrater og sammenfattende statistikker for 10 mutationsakkumuleringsstammer, parret med deres ind-godt GFP-mærkede kontroller; de indsamlede data gør det muligt at foretage en præcis beregning af små gennemsnitlige vækstrateforskelle.

Figur 3. Store stikprøvestørrelser af individuelle mikrokoloniske vækstrater giver mulighed for præcis kvantificering af vækstvariationer inden for belastning og mellem belastning. (A) Fordelingen af vækstrater på ~ 12.000 kolonier fra to stammer. Bemærk forskelle mellem fordelingernes tilstande såvel som den lange hale af langsomt voksende kolonier, der er til stede i hver enkelt; sidstnævnte kan kun påvises på grund af individuelle mikrokoloniske målinger. (B) Fordeling af individuelle mikrokoloniske vækstrater (sorte prikker) og sammenfattende statistikker (boxplots viser median, samt lavere og øvre 25% kvantiteter) for ~ 120.000 kolonier fra 11 stammer. Som i (A) blev hver stamme dyrket i en individuel brønd med en indsat GFP-mærket referencestamme; data, der vises her, repræsenterer 14 eksperimentelle brønde pr. MAH-referencestammepar. Klik her for at se en større version af dette tal.

Den mikrokoloni vækst assay kan også bruges til samtidig at måle vækst og genekspression ved billeddannelse både brightfield og fluorescens kanaler. I det eksperiment , der er vist i figur 2, gjorde fluorescerende billeddannelse af GFP-ekspression efter forsøgets vækstfase det muligt at identificere kolonier, der tilhører en GFP-mærket in-well-referencestamme med svagt GFP-udtryk (Figur 2C); Det er dog også muligt at måle interkoloniske forskelle i genudtryksniveauer på tværs af tidspunkter (se diskussion).

En række almindelige faldgruber kan forhindre indsamling af nøjagtige vækstratedata eller korrekt analyse af disse data. Et centralt punkt er, at vækstratemålinger er afhængige af dannelsen af immobile, todimensionelle mikrokolonier fra enkeltstiftede gærceller. Concanavalin A interagerer noncovalently med polysaccharider på overfladerne af gærceller til at immobilisere mikrokolonier. Båndet mellem concanavalin A og gærceller kan vendes ved konkurrence med sukkerarter eller ved lav pH¹⁵. Derfor kan stærkt sure medier eller medier, der indeholder lectin-bindende komponenter såsom gærekstrakt (YEPD) eller phthalat (Edinburgh Minimal Media), ikke anvendes til denne analyse uden ændringer af immobiliseringsteknikken (Figur 4A).

Hvis vækstanalysen udføres med gærstammer, der flocculate, bør det valgfrie sonikeringstrin bruges til at adskille aggregerede celler, så enkelte celler immobiliseres på mikroskoppladen i begyndelsen af forsøget (se figur 4B for et eksempel på flocculating celler efter plating, hvis sonikeringstrinnet udelades). Mikrokolonier, der er grundlagt af en klynge af flere celler, bør udelukkes i downstream-analyse, da vækstratemålinger ikke længere er afledt af en enkelt grundlæggercelle, og cellerne muligvis ikke vokser i to dimensioner. Mikrokolonier, der er grundlagt af en spirende celle, kan accepteres. Dannelsen af to-dimensionelle mikrokolonier er hæmmet af gær, der flocculate meget stærkt, selv om kolonier er grundlagt af en enkelt celle, og derfor evne til en gær stamme til at vokse i et enkelt lag på concanavalin A bør testes, før der foretages en vækst assay.

Et andet vigtigt sæt overvejelser kommer i både planlægnings- og analysefaserne af eksperimentet, når det bestemmes, hvor mange tidspunkter der skal medtages i analysen. For det første er det vigtigt at medtage data for nok tidspunkter over en tilstrækkelig periode til præcist at spore vækst: det anbefales, at assays køres på en sådan måde, at gær har tid til at gå gennem ~ 5 fordoblinger, med mindst 10 tidspunkter indsamlet i løbet af denne periode. Men blot at inkludere hvert indsamlet tidspunkt i vækstrateberegningen vil resultere i en bias, der kunstigt sænker vækstraten for mange kolonier. Denne skævhed kan forekomme, når celler gennemgår en forsinkelsesfase, før væksten påbegyndes (Figur 4C). Forvækstforsinkelse af mikrokolonier er almindelig og varierer mellem forsøgsbetingelser og stammer^9,13. Eksperimentelle analysemetoder skal være i stand til at skelne tidspunkter i den "aktive vækst" periode fra pre-vækst forsinkelse; En metode er at bruge et forudindstillet antal tidspunkter i et vindue og finde det vindue , der svarer til den højeste vækstrate (Figur 4C, fast linje)^11,13.

Endelig er et af de mest kritiske trin i mikrokoloni vækstanalysen gær-celle fortyndingstrinnet. Koncentrationen af celler og forholdet mellem forskellige genotyper i mikroskoppladebrønde skal kontrolleres omhyggeligt. Til statistisk analyse er det vigtigt, at forsøgene afbalanceres på en sådan måde , at omtrent lige mange celler for hver genotype og tilstand testes og sammenlignes¹⁶. Desuden kan nyttige vækstrater typisk ikke måles efter nabokolonier fusionere, fordi vækstraterne i de enkelte kolonier ikke længere kan skelnes; Derfor vil mere tætbelagte celler give vækstdata fra færre tidspunkter (Figur 4D). Det er vigtigt, at hvis celletætheden er høj eller ujævn ved forsøgets begyndelse, vil filtrering af fusionerede mikrokolonier uforholdsmæssigt udelukke hurtigere voksende mikrokolonier fra downstream-analyser, fordi hurtigere avlere vil fusionere oftere end langsomme producenter. Derfor vil de endelige vækstmålinger være forudindtaget mod langsommere voksende delpopulationer. Derudover kan forskellige antal kolonier filtreres ud til forskellige behandlinger, udelukke et afbalanceret eksperiment. Det anbefales at tallerken omkring 4000 celler per brønd i en 96-brønd plade (eller 700 celler per brønd i en 384-godt plade). Grundig pipetblanding i hele gærfortyndingsdelen af protokollen er afgørende for at sikre, at det korrekte antal celler er til stede i hver brønd, og at cellerne er jævnt spredt over brønden. Det er også tilrådeligt at fjerne eventuelle mikrokolonier fra analyse, hvis centre er inden for ~ 25 cellediametre af hinanden.

Figur 4. Eksperimentelle faldgruber. (A) Kolonier vokser i YEPD medier, som forhindrer effektiv binding af celler til concanavalin A. Udseendet af nye celler langt fra enhver koloni (pilespidser) samt udseendet af mange celler uden for fokus ved koloniens kant er resultatet af celler, der ikke klæber til glasoverfladen og glider væk fra kolonien under vækst. (B) Celler fra en flocculating stamme lige efter plating uden sonikering; bemærk tilstedeværelsen af et stort antal klynger af flere celler (pilespidser) og celler i klyngerne i forskellige brændplaner. (C) Ændring i (område) over tid for en koloni med en lang forsinkelse fase. Bemærk, at hvis alle tidspunkter bruges til vækstrateestimater, er den anslåede vækstrate betydeligt trykket; Der foretages kun en nøjagtig måling, når den delmængde af n tidspunkter (her n=6), der resulterer i det højeste vækstestimat, anvendes. (D) Celler, der var for tæt belagt ved forsøgets begyndelse og efter 7 timers vækst. Farver sporer individuelle kolonier, indtil de fusionerer med naboer; her, ved 7-timers mærket, har de fleste kolonier fusioneret, med kun et lille antal individuelle langsomt voksende kolonier tilbage. (Sporing for en lille delmængde af de kolonier, der vises her, går tabt af årsager, der ikke er relateret til kolonifletning). Hver skalalinje er 50 μm. Klik her for at se en større version af dette tal.

Discussion

Den protokol, der er beskrevet her, er en alsidig analyse, der gør det muligt at overvåge cellevækst og genekspression samtidigt på niveau med individuelle mikrokolonier. Ved at kombinere disse to modaliteter giver unikke biologiske indsigter. For eksempel har tidligere arbejde brugt denne analyse til at vise en negativ korrelation mellem udtryk for TSL1-genet og mikrokolonivæksten i isogene wildtypeceller ved at måle både samtidigt^7,10. Det er også muligt at overvåge forholdet mellem vækstrate og subcellulær lokaliseringsdynamik af fluorescerende mærkede proteiner med den beskrevne analyse. For eksempel blev en negativ sammenhæng mellem vækstrate og den nukleare belægning af RFP-mærkede transskription faktor Msn2 identificeret ved billeddannelse fluorescens i celler hvert minut i 30 min før initialisere væksten assay¹⁰. Endelig gør denne protokol det muligt at overvåge celleresponser på miljøbelastninger og -belastninger. Behandlinger såsom varmechok kan administreres halvvejs gennem vækstanalysen. Sådanne undersøgelser har for eksempel afsløret, at langsomt voksende celler, der udtrykker høje niveauer af TSL1, er mere tolerante over for varmechok ^7,10.

Ud over de almindelige faldgruber, der er beskrevet i afsnittet Repræsentative resultater (fig. 4), skal der tages hensyn til flere nøglefaktorer ved udformningen af et vækstanalyseeksperiment. Den fænotypiske variation, der måles med analysen, påvirkes af flere faktorer, hvoraf nogle er repeterbare og af iboende interesse, såsom genotype eller miljø, mens andre er resultatet af teknisk variation¹³. Derfor er den første vigtige overvejelse ved udformningen af en mikrokolonianalyse at udføre eksperimentet på en måde, der letter adskillelsen af virkningerne af interesse fra virkningerne som følge af tekniske variationer; nøglen til denne adskillelse er randomiserende behandlinger eller belastninger på eksperimentelle plader, og herunder kontrol i hvert eksperiment. Relevante statistiske metoder, såsom lineær blandet modellering (LMM), skal anvendes på data, efter at de er indsamlet, for at tage højde for forskellige kilder til variation i downstream-analyse^17,18.

For at anvende statistiske metoder til at adskille variation i vækst fænotyper på grund af eksperimentelle variabler af interesse fra variation på grund af tilfældige faktorer såsom batcheffekter, er det nødvendigt at køre flere eksperimenter på forskellige dage og med randomiserede brøndplaceringer af genotype og vækstbetingelser. For at øge eksperimentets effekt til at opdage vækstforskelle mellem stammer eller behandlingsbetingelser er det også vigtigt at inkludere flere replikater af hver testet genotype eller væksttilstand på en enkelt eksperimentel plade, hvor det er muligt.

En vigtig fordel ved den mikrokoloniske vækstanalyse ligger i mængden af data, den kan indsamle: en enkelt eksperimentel plade genererer typisk data for ~ 10⁵ individuelle mikrokolonier, hvilket er flere størrelsesordener større end typiske eksperimenter ved hjælp af mikrofluidiske enheder i stedet for multiwell plader. Software, der automatisk sporer kolonier og beregner relevante data (f.eks. forsinkelsestider, vækstrater og gennemsnitlige fluorescerende intensiteter) er nøglen til at drage fuld fordel af denne analyse. Denne software bør ikke kun robust identificere kolonigrænser og spore kolonier gennem tiden, men også korrekt måle væksten i kolonier med en forsinkelse fase¹³. En mulighed udviklet til dette formål er PIE, open source-software, der sporer kolonier over tid (herunder tegner sig for skift i koloni position), beregner vækstrater, og giver mulighed for integration af fluorescerende billeddata i eksperimentelle målinger^11,12.

Den mikrokoloni vækst assay kan bruges til at få indsigt i grundlæggende spørgsmål vedrørende gær fitness og evolution, herunder vækst fænotype variation, ændringer i forskellige miljøer eller som reaktion på stress, og forholdet mellem vækst og protein udtryk eller subcellulær lokalisering. Analysen er blevet anvendt i vid udstrækning i undersøgelser af både laboratorie - og vilde stammer af S. cerevisiae^7,9,10,13.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
General Materials
500 mL Bottletop Filter .22 µm PES Sterilizing, Low Protein Binding, w/45mm Neck	Fisher	CLS431154	used to filter the media
BD Falcon*Tissue Culture Plates, microtest u-bottom	Fisher	08-772-54	96-well culture tubes used to freeze cells, pre-grow cells, and dilutions
BD Syringes without Needle, 50 mL	Fisher	13-689-8	Used to filter the Concanavalin A
Costar Sterile Disposable Reagent Reservoirs	Fisher	07-200-127	reagent reservoirs used to pipette solutions with multichannel pipette
Costar Thermowell Aluminum Sealing Tape	Fisher	07-200-684	96-well plate seal for pre-growth and freezing
lint and static free Kimwipes	Fisher	06-666A	lint and static free wipes to keep microscope plate bottom free of debris and scratches
Nalgene Syringe Filters	ThermoFisher Scientific	199-2020	0.2 μm pore size, 25 mm diameter; used to filter concanavalin A solution
Media Components
Minimal chemically defined media (MD; 2% glucose)			alternative microscopy media used for yeast pre-growth and growth during microscopy
Synthetic Complete Media (SC; 2% glucose)			microscopy media used for yeast pre-growth and growth during microscopy
Yeast extract-peptone-dextrose (YEPD; 2% glucose) medium			cell growth prior to freezing down randomized plates
Microscopy Materials
Breathe-Easy sealing membrane	Millipore Sigma	Z380059-1PAK	breathable membranes used to seal plate during microscopy experiment. At this stage breathable membranes are recommended because they prevent condensation in the wells and allow for better microscopy images
Brooks 96-well flat clear glass bottom microscope plate	Dot Scientific	MGB096-1-2-LG-L	microscope plate
Concanavalin A from canavalia ensiformis (Jack Bean), lyophilized powder	Millipore Sigma	45-C2010-1G	Make 5x concanavalin A solution and freeze 5ml of 5x concanavalin A in 50 mL conical tubes at -80 °C
Strains Used
MAH.5, MAH.96, MAH.52, MAH.66, MAH.11, MAH.58, MAH.135, MAH.15, MAH.44, MAH.132			Haploid mutation accumulation strains in a laboratory background, described in Hall and Joseph 2010
EP026.2A-2C			Progeny of the ancestral Hall and Joseph 2010 mutation accumulation strain, transformed with YFR054cΔ::Scw11P::GFP
Equipment
Misonix Sonicator S-4000 with 96-pin attachment			Sonicator https://www.labx.com/item/misonix-inc-s-4000-sonicator/4771281
Nikon Eclipse Ti-E with Perfect Focus System			Inverted microscope with automated stage and autofocus system