Summary
Gistgroei fenotypes worden nauwkeurig gemeten door middel van zeer parallelle time-lapse beeldvorming van geïmmobiliseerde cellen die uitgroeien tot microkolonnies. Tegelijkertijd kunnen stresstolerantie, eiwitexpressie en eiwitlokalisatie worden gemonitord, waardoor geïntegreerde datasets worden gegenereerd om te bestuderen hoe omgevings- en genetische verschillen, evenals genexpressie heterogeniteit tussen isogene cellen, de groei moduleren.
Abstract
Nauwkeurige metingen van heterogeniteit tussen en binnen de stam in microbiële groeisnelheden zijn essentieel voor het begrijpen van genetische en omgevingsinputs in stresstolerantie, pathogeniteit en andere belangrijke componenten van fitness. Dit manuscript beschrijft een microscoop-gebaseerde test die ongeveer 105 Saccharomyces cerevisiae microkolonnies per experiment volgt. Na geautomatiseerde time-lapse beeldvorming van gist geïmmobiliseerd in een multiwell plaat, microkolonisatie groeisnelheden kunnen eenvoudig worden geanalyseerd met aangepaste beeldanalyse software. Voor elke microkolonie kunnen ook expressie en lokalisatie van fluorescerende eiwitten en overleving van acute stress worden gecontroleerd. Deze test maakt een nauwkeurige schatting van de gemiddelde groeipercentages van stammen mogelijk, evenals een uitgebreide meting van heterogeniteit in groei, genexpressie en stresstolerantie binnen klonale populaties.
Introduction
Groeifenotypes dragen kritisch bij aan de gistconditie. Natuurlijke selectie kan efficiënt onderscheid maken tussen afstammingen met groeipercentages die verschillen door de inverse van de effectieve populatiegrootte, die meer dan 108 individuen kan overschrijden1. Bovendien is variabiliteit van groeipercentages tussen individuen binnen een populatie een evolutionair relevante parameter , aangezien deze kan dienen als basis voor overlevingsstrategieën zoals bet hedging2,3,4,5,6. Daarom zijn assays die zeer nauwkeurige metingen van groeifenotypes en hun distributies mogelijk maken, cruciaal voor de studie van micro-organismen. De hier beschreven microkoloniale groeitest kan individuele groeisnelheidsmetingen genereren voor ~ 105 microkolonnies per experiment. Deze test biedt daarom een krachtig protocol om gist evolutionaire genetica en genomica te bestuderen. Het leent zich bijzonder goed om te testen hoe variabiliteit binnen populaties van genetisch identieke enkelvoudige cellen wordt gegenereerd, gehandhaafd en bijdraagt tot populatiegeschiktheid7,8,9,10.
De hier beschreven methode (figuur 1) maakt gebruik van periodiek vastgelegde, low-vergroting brightfield beelden van cellen die groeien in vloeibare media op een 96- of 384-put glasbodemplaat om de groei tot microkolonnies te volgen. De cellen hechten zich aan de lectineconcanavalin A, die de bodem van de microscoopplaat bedekt en tweedimensionale kolonies vormt. Omdat de microkolonnies in een monolaag groeien, is het microkoloniale gebied sterk gecorreleerd met celnummer7. Daarom kunnen nauwkeurige schattingen van de groeisnelheid en vertragingstijd van microkolonen worden gegenereerd met aangepaste beeldanalysesoftware die de veranderingssnelheid van het gebied van elke microkolonisatie bijhoudt. Bovendien kan de experimentele opstelling de overvloed en zelfs de subcellulaire lokalisaties van fluorescerend gelabelde eiwitten, uitgedrukt in deze microkolonnies, monitoren. Downstream verwerking van gegevens van deze microkoloniale groeitest kan worden bereikt door aangepaste analyse of door bestaande beeldanalysesoftware, zoals Processing Images Easily (PIE)11, een algoritme voor robuuste koloniegebiedherkenning en groeianalyse met hoge doorvoer van low-magnification, brightfield-afbeeldingen, die beschikbaar is via GitHub12.
Omdat groeisnelheidsschattingen afgeleid van de microkoloniale-groeitest worden gegenereerd uit een groot aantal metingen met één kolonie, zijn ze uiterst nauwkeurig, met standaardfouten die enkele ordes van grootte kleiner zijn dan de schattingen zelf voor een experiment van redelijke omvang. Daarom is de kracht van de test om groeisnelheidsverschillen tussen verschillende genotypen, behandelingen of omgevingsomstandigheden te detecteren hoog. Het multiwell-plaatformaat maakt het mogelijk om tal van verschillende omgevings- en genotypecombinaties in één experiment te vergelijken. Als stammen constitutief verschillende fluorescerende markers uitdrukken, kunnen ze in dezelfde put worden gemengd en worden onderscheiden door daaropvolgende beeldanalyse, wat het vermogen verder zou kunnen vergroten door een goede gegevensnormalisatie mogelijk te maken.
Figuur 1: Schematische weergave van het protocol. Dit protocol volgt twee belangrijke stappen, namelijk de voorbereiding van de experimentele plaat en de voorbereiding van de cellen op beeld. Randomisatie van platen en groei van cellen moeten worden uitgevoerd vóór en voorafgaand aan de experimentdag. Herhaalde menging van cellen bij elke stap tijdens verdunning is noodzakelijk in de stappen tot het plateren, en daarom wordt het voorbereiden van de experimentele plaat eerst aanbevolen, zodat deze onmiddellijk na voltooiing van de celverdunning klaar is voor plating. Klik hier om een grotere versie van deze afbeelding te bekijken.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. Voorbereiding van gerandomiseerde platen (voorafgaand aan experimentdag)
- Plan de stammen en omstandigheden die moeten worden getest met de groeitest. Op dit punt, willekeurig toewijzen stammen en voorwaarden aan elke put.
OPMERKING: Bij het overwegen van het instellen van de plaat is het raadzaam om meer dan één replica per stam en groeiconditie op een enkele plaat op te nemen om rekening te houden met goed gerelateerd geluid in metingen. Zie Discussie voor meer informatie. - Randomiseer de locatie van elke stam en omgevingsconditie voor plaatreplicaties die op verschillende dagen worden uitgevoerd.
- Kweek alle cellen die in het experiment zullen worden gebruikt tot verzadiging in gistextract-pepton-dextrose (YEPD; 2% glucose) medium in een shaker bij 30 °C (of een andere geschikte temperatuur).
- Maak de gerandomiseerde voorraadplaten handmatig of met een vloeistofbehandelingsrobot. Voeg 10 μL van de aangewezen verzadigde cellen toe aan elke put van een steriele U-bodem weefselkweekplaat. Als meerdere stammen in één put worden getest, combineer ze dan op dit moment niet; deze combinatie zal vlak voor celverdunningen op de dag van het experiment worden uitgevoerd om ervoor te zorgen dat alle stammen in de juiste concentraties zijn wanneer ze worden geplateerd als microkoloniale grondcellen.
- Voeg 10 μL 30% glycerol toe aan elke put van elke plaat. Pipet op en neer zodat de cellen en de glycerol goed gemengd worden.
- Sluit elke plaat af met een folieafdekking en vries onmiddellijk in bij -70 °C tot het klaar is voor gebruik.
OPMERKING: Het is belangrijk om alle gerandomiseerde platen op dezelfde dag te maken en ze in te vriezen, zodat de pre-groeiomstandigheden van de cellen in elke plaat identiek zijn geweest en geen technische variatie in de groeisnelheidstest genereren.
2. Pre-groei van gist
OPMERKING: Meestal begint dit voorafgaand aan de experimenteerdag en is het sterk afhankelijk van de experimentele vraag. Zie Discussie voor meer informatie.
- Verwijder een bouillonplaat (10 μL gist, 10 μL glycerol per put) uit de vriezer van -70 °C en voeg 180 μL van de media toe die voor het experiment moeten worden gebruikt. Als het experiment zal worden uitgevoerd met behulp van nutriëntenbeperkende media, kweek dan geen gist tot verzadiging in de nutriëntenbeperkende media, omdat sporulatie van gist kan optreden. In plaats daarvan, pre-grow in niet-beperkende media.
- Kweek gist tijdens het schudden bij 30 °C. Overweeg of de test moet worden uitgevoerd, te beginnen met cellen in de logfase of in de stationaire fase om te bepalen of het nodig is om de cellen meerdere keren voorafgaand aan het experiment te verdunnen. Als de giststammen of -omstandigheden in de test naar verwachting aanzienlijk verschillende groeisnelheden zullen hebben, dan zal een pregroeiperiode van twee dagen nodig zijn om alle verschillende omstandigheden in de stationaire fase te laten komen.
3. Microscoop setup
- De plaatvoorbereiding van de microscoop
- Zorg ervoor dat de microscoopincubator aan staat en verwarm de microscoopkamer tot de gewenste groeitemperatuur voor de experimentele omstandigheden. Voor standaardexperimenten met Saccharomyces cerevisiae-cellen moet de incubator de microscoopkamer verwarmen tot 30 °C om ervoor te zorgen dat de groeiomstandigheden voor de cellen correct zijn tijdens de groeisnelheidstest.
- Reinig de werkbank, pipetten en ander gereedschap met 70% ethanol. Haal een microscoopplaat op en leg deze op de bank bovenop een pluis- en statisch vrij doekje.
OPMERKING: Raak nooit de onderkant van de microscoopplaat aan, zelfs niet met handschoenen aan, en leg de microscoopplaat altijd op een pluis- en statisch vrij doekje wanneer deze een oppervlak raakt. Dit voorkomt dat vlekken of krassen de groeisnelheidsmetingen belemmeren zodra het experiment in beeld wordt gebracht. - Ontdooi 5 ml 5x concanavaline A-oplossing, verdun tot 1x met water en steriliseer door een spuit met een filter van 0,2-μm.
- Filter steriliseer alle andere vloeistoffen die in de test zullen worden gebruikt met een filter van 0,2 μm, inclusief experimentele media, om kristallen of vuil te verwijderen dat in de oplossingen kan zijn gematerialiseerd. De aanwezigheid van kristallen zou de kwaliteit van de microscopiebeelden verminderen.
- Pipet 200 μL concanavaline Een oplossing in elke put van de microscoopplaat.
- Centrifugeer de plaat gedurende 2 minuten bij 411 x zwaartekracht (g) met een pluis- en statisch vrij doekje onder de plaat, om ervoor te zorgen dat de concanavalin A-oplossing de bodem van elke put gelijkmatig bedekt en dat er geen luchtbellen zijn.
- Bedek de plaat met het deksel en laat het 1-2 uur zitten. De precieze tijd dat de plaat zit is flexibel, maar het is belangrijk om consistent te zijn tussen verschillende uitvoeringen van het experiment.
- Verwijder alle concanavalin A-oplossing van de plaat door afzuiging of door deze krachtig in de gootsteen of een recipiënt te lozen. Zorg ervoor dat u het glazen deel van de plaat niet aanraakt. Het is acceptabel als er enkele druppels concanavaline A-oplossing in de putten achterblijven.
- Was de platenputten van de microscoop door 400 μL steriel water toe te voegen. Verwijder het water zoals gedaan met de concanavalin A in de vorige stap. Laat de plaat niet droog zitten.
- Voeg onmiddellijk 185 μL experimentele groeimedia toe aan de plaat. Aan deze plaat wordt 15 μL correct verdunde cellen toegevoegd.
- Gistcelverdunning
OPMERKING: De onderstaande stappen beschrijven een verdunning van gist uit een verzadigde cultuur (ongeveer 108 cellen/ml) 400 keer om een concentratie van 250.000 cellen/ml te bereiken, waarvan 15 μL wordt verdund tot 400 μL in de glasbodemplaat, wat een eindaantal van ongeveer 4000 cellen per put in een plaat met 96 putjes oplevert. Bij gebruik van een 384-putplaat moet het uiteindelijke aantal cellen per put ongeveer 700 zijn en moeten de verdunningen dienovereenkomstig worden aangepast. Deze verhouding moet worden aangepast voor cellen die in de logfase worden verzameld en groeien in rijkere of armere pre-groeimedia of uit verschillende stammen. De uiteindelijke dichtheid van cellen per put moet worden verminderd bij het uitvoeren van de groeisnelheidstest voor perioden langer dan 10 uur.- Stel twee 96-putkweekplaten op voor seriële verdunningen: label als plaat 1 en 2 en voeg 90 μL experimentele groeimedia (d.w.z. de media waarin de gist op de microscoop zal groeien) toe aan elke seriële verdunningsplaat.
OPMERKING: Ongeacht welke uiteindelijke verdunning wordt gebruikt, worden ten minste twee seriële verdunningen van cellen aanbevolen, waarbij elk een klein gistvolume in een groter volume experimentele media wordt gepijpt en vervolgens een groot volume experimentele media krachtig wordt gemengd met een pipet (zoals in stap 3.2.5 en 3.2.6 hieronder). - Haal de plaat cellen uit de voorgroei en centrifugeer de plaat gedurende 2 minuten bij 411 x g.
OPMERKING: Het is erg belangrijk om verschillende putten in de plaat niet te kruisvervuilen. Het doel van deze centrifugeerstap voordat de foliebekleding van platen wordt verwijderd, is ervoor te zorgen dat met gist gevulde druppels uit de ene put niet van de folie vliegen en in andere putten terechtkomen. Zorg ervoor dat u de platen nooit kantelt of roert om te voorkomen dat gist na centrifugeren in contact komt met de foliebekleding. - Verwijder voorzichtig de folie en resuspend cellen door krachtig pipet cellen met een pipet ingesteld op ongeveer de helft van het totale volume in de plaat, terwijl het verplaatsen van de pipet rond de put te mengen. Controleer of alle cellen zijn geresuspendeerd vanaf de bodem van de putten.
- Als meerdere stammen in individuele putten zullen worden gebruikt, moeten stammen op dit moment worden gemengd in de verhouding die nodig is voor het experiment. Als een referentiestam wordt gebruikt om groeisnelheidsmetingen te genereren, moet de verhouding tussen referentie en testspanning 1:1 zijn.
- Pipet 10 μL gist uit groeimedia in verdunningsplaat 1. Voeg 100 μL experimentele groeimedia toe aan elke put tot een eindvolume van 200 μL per put. Pipet krachtig op en neer.
- Pipet 10 μL gist van plaat 1 in plaat 2. Voeg 100 μL experimentele groeimedia toe aan elke put en pipet krachtig op en neer om te mengen.
OPMERKING: Deze verdunningsstappen zijn van cruciaal belang om clusters van gist te helpen scheiden die aan het einde van de pregroeifase aan elkaar vastzitten en ervoor te zorgen dat ongeveer gelijke aantallen gistcellen in elke put terechtkomen. Het hebben van consistente aantallen gist in elke put helpt experimentele ruis en biases in groeisnelheidsmetingen te verwijderen (zie Representatieve resultaten).
- Stel twee 96-putkweekplaten op voor seriële verdunningen: label als plaat 1 en 2 en voeg 90 μL experimentele groeimedia (d.w.z. de media waarin de gist op de microscoop zal groeien) toe aan elke seriële verdunningsplaat.
- Sonicatie
OPMERKING: Sonicatie is optioneelen hoeft alleen te worden uitgevoerd voor giststammen met een hoge neiging om zich aan elkaar te hechten (bijv. sommige wilde stammen). Voor laboratoriumstammen is sonicatie over het algemeen niet nodig en kan worden overgeslagen door door te gaan naar stap 3.4.- Reinig een 96-pins sonicatorkop met 70% ethanol door deze in een 96-put plaat gevuld met 70% ethanol te plaatsen en droog met een pluis- en statisch vrij doekje.
- Stel een sonicatieprogramma in dat voldoende sterk is om gevloculeerde gistcellen uit elkaar te breken, maar geen cellen doodt of verhoogde stressreacties veroorzaakt. Sommige tests kunnen nodig zijn om het beste sonicatieprogramma voor een bepaald experiment te identificeren. Het sonicatieprogramma dat in dit experiment wordt gebruikt is: amplitude = 10, procestijd = 10 s, pulse-on = 1 s, pulse-off = 1 s. Dit exacte programma is waarschijnlijk niet van toepassing op alle sonicators, dus testen wordt voorgesteld voorafgaand aan de experimentdag.
- Meng de gist opnieuw in seriële verdunningsplaat 2 door vijf keer krachtig op en neer te pipetten.
- Plaats verdunningsplaat 2 op het platform en zet deze vast met de sonicatorpennen in de celsuspensie, maar raak de onderkant van de plaat niet aan. Voer het sonicatieprogramma uit met de juiste gehoorbescherming.
- Nadat het programma is uitgevoerd, reinigt u de sonicatorkop met 70% ethanol en vervolgens met water en gaat u onmiddellijk verder met de bereiding van de microscoopplaat, zodat de cellen niet opnieuw flocculeren.
- Bereid plaat voor microscoop:
- Pipet 15 μL gist van seriële verdunningsplaat 2 in de microscoopplaat tot een volume van 200 μL. Voeg 200 μL experimentele groeimedia toe aan elke put tot een eindvolume van 400 μL per put, en pipet krachtig op en neer om te mengen.
- Bedek de plaat met een ademend membraan. Het is belangrijk om de plaat goed af te dichten met dit membraan, bijvoorbeeld met behulp van een rubberen roller.
- Om de gistcellen aan de concanavaline A op het glasoppervlak te hechten, centrifugeert u de plaat met een pluis- en statisch vrij doekje eronder gedurende 2 minuten bij 411 x g.
- Veeg bij de microscoop de boven- en onderkant van de plaat af met een pluis- en statisch vrij doekje en blaas perslucht op de plaat om van vuil af te komen.
- Plaats de plaat op de microscoop en zorg ervoor dat deze waterpas staat en dat de A1-put zich in de linkerbovenhoek bevindt.
4. Time-lapse Microscopie Groeisnelheid Metingen
OPMERKING: Tijdens time-lapse microscopie worden de volgende functies computergestuurd: x-, y- en z-positie, rolluiken en fluorescentiefilters. Een hardwaregebaseerd autofocussysteem is optimaal om focal plane drift tijdens time-lapse imaging te voorkomen. Als alternatief kan een softwaregebaseerde automatische scherpstellus worden gebruikt. Om de vochtigheid in de microscoopkamer te behouden, wordt geadviseerd om een bekerglas met gezuiverd water in de kamer te houden gedurende de duur van het experiment.
- Maak een lijst met posities (x,y) om in beeld te komen, zodat elke microscoopplaat goed in beeld is. Vermijd overlappende afbeeldingen, zodat geen enkele cel meerdere keren wordt geanalyseerd.
- Afbeelding in brightfield met diascopische verlichting (DIA) bij een vergroting van 15x. Stel de belichting in op ~5 ms.
- Zoom digitaal in op de afbeelding zodat cellen goed zichtbaar zijn. Gebruik de scherpstelknoppen om de ideale scherpstelling voor het experiment te identificeren in de vier putten op de hoek van de plaat en in één put in het midden van de plaat. Focus zodanig dat het maximale contrast van de cellen wordt verkregen.
- Stel de z-positie (of autofocuspositie) voor het experiment in op een gemiddelde van de z/autofocusposities die voor elk van deze putten zijn geïdentificeerd. Als de microscoopplaat goed is gemaakt en de glazen bodem geen defecten heeft, moeten de ideale scherpstelposities voor elke put vergelijkbaar zijn.
OPMERKING: Bij het analyseren van afbeeldingen met de Processing Images Easily (PIE) beeldanalysepijplijn11,12, is het handig dat de cellen enigszins onopgeraakt zijn op de microscoop, zodat er een donkere rand buiten de cel is en een lichtgekleurd interieur, wat helpt bij nauwkeurige kolonieherkenning en grootteschattingen. - Als u fluorescerende stammen gebruikt, identificeert u de kanalen en de belichtingen waarmee u kunt beeld maken, zodat er geen pixels overbelicht zijn. Schakel bij het instellen van de belichtingstijd voor fluorescerende kanalen de modus "live capture" op de microscoop uit om te voorkomen dat cellen gedurende lange tijd worden blootgesteld aan fluorescentieprikkeling, omdat dit zowel de cellen kan fotobleachen als stress kan veroorzaken.
- Stel de tijdsvolgorde-acquisitie in om afbeeldingen vast te leggen met het gewenste tijdsinterval voor de gewenste tijdsduur.
- Voer het experiment uit.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
De nieuwigheid van dit protocol is dat de groeisnelheid kan worden berekend voor individuele cellen binnen een populatie door hun groei in microkolonies te volgen door middel van time-lapse imaging (Figuur 2A). Omdat microkolonies vele uren op een planaire manier groeien als gevolg van de aanwezigheid van concanavalin A, kunnen hun gebieden gedurende het hele experiment worden gevolgd en kan een lineaire pasvorm voor de verandering in het natuurlijke logboek van het gebied in de loop van de tijd worden gebruikt om de groeisnelheid te berekenen voor elke individuele kolonie waargenomen 7,9,10,13. Verschillen in microkoloniale groeisnelheid voor individuele isogene cellen in dezelfde omgeving worden duidelijk geregistreerd (Figuren 2A, 2B). Beeldanalysesoftware moet worden gebruikt om veranderingen in microkoloniale grootte en fluorescentie automatisch bij te houden(figuur 2C); de kolonietracering in figuur 2A werd uitgevoerd met behulp van PIE11,12.
Figuur 2: Kwantificering van groeisnelheid en fluorescentie in gistmicrokolonnies. (A) Een deel van een enkel beeldvormingsveld met microkolonies die aan het begin van het experiment groeien, na 3 uur en na 6 uur, met kolonietracking met behulp van de PIE-kolonievolgsoftware. Kolonies groeien zichtbaar in een monolaag voor de duur van het experiment. (B) Verandering in ln(gebied) in de loop van de tijd voor de getraceerde kolonies in paneel A. Als er voldoende tijdspunten voor een kolonie bestaan, kunnen de groeisnelheid en de vertragingstijd vóór de groei worden berekend. (C) Afbeelding met GFP-fluorescentie-intensiteit voor de kolonies in paneel A, genomen nadat het groeigedeelte van het experiment is voltooid, met de koloniecontouren van het 6-uurstijdpunt bedekt. Hier markeert Scw11P::GFP een referentiestam die in elke experimentele put is opgenomen. Door het GFP-fluorescentieniveau van elke kolonie te berekenen, kan worden vastgesteld welke kolonies afkomstig zijn van de referentiestam en welke van de niet-referentiestammen in elke put. Elke schaalbalk is 50 μm. Klik hier om een grotere versie van deze afbeelding te bekijken.
Meestal kunnen ~ 105 microkoloniale groeisnelheden per experiment worden verzameld met behulp van deze test. Deze gegevens kunnen worden gebruikt om zowel verschillen tussen stammen/groeiomstandigheden als variatie tussen genetisch identieke microkolonies die in een gedeelde toestand worden gekweekt, waar te nemen. Figuur 3A toont bijvoorbeeld de verdelingen van groeisnelheden voor ~12.000 kolonies uit een mutatieaccumulatielijn (MAH.44)14 en GFP-gemarkeerde referentiestam die in dezelfde putten wordt gekweekt, waarbij zowel verschillen tussen de stammen als een hoge variabiliteit binnen de stam zichtbaar zijn. In figuur 3Bworden individuele groeipercentages en samenvattende statistieken voor 10 mutatieaccumulatiestammen, in combinatie met hun in-well GFP-gemarkeerde controles, weergegeven; de verzamelde gegevens maken een nauwkeurige berekening van kleine gemiddelde groeipercentageverschillen mogelijk.
Figuur 3. Grote steekproefgrootten van individuele microkoloniale groeisnelheden maken een nauwkeurige kwantificering van de groeivariatie binnen en tussen de stam mogelijk. (A) De verdeling van groeisnelheden van ~12.000 kolonies uit twee stammen. Merk verschillen op tussen de modi van de distributies, evenals de lange staart van langzaam groeiende kolonies die in elke kolonie aanwezig zijn; dit laatste is alleen detecteerbaar door individuele microkoloniale metingen. (B) Verdelingen van individuele microkoloniale groeisnelheden (zwarte stippen) en samenvattende statistieken (boxplots met mediaan, evenals lagere en bovenste 25% quantiles) voor ~120.000 kolonies uit 11 stammen. Net als in (A) werd elke stam gekweekt in een individuele put met een spiked-in GFP-gemarkeerde referentiestam; de hier getoonde gegevens vertegenwoordigen 14 experimentele putten per MAH-referentiestampaar. Klik hier om een grotere versie van deze afbeelding te bekijken.
De microkoloniale groeitest kan ook worden gebruikt om tegelijkertijd groei en genexpressie te meten door zowel brightfield- als fluorescentiekanalen in beeld te brengen. In het experiment in figuur 2maakte fluorescerende beeldvorming van GFP-expressie na voltooiing van de groeifase van het experiment identificatie mogelijk van kolonies die behoren tot een GFP-gemarkeerde in-well referentiestam met een zwakke GFP-expressie (figuur 2C); meting van interkoloniale verschillen in genexpressieniveaus over tijdspunten is echter ook mogelijk (zie Discussie).
Een aantal veelvoorkomende valkuilen kan het verzamelen van nauwkeurige groeisnelheidsgegevens of de juiste analyse van deze gegevens voorkomen. Een belangrijk punt is dat groeisnelheidsmetingen afhankelijk zijn van de vorming van onbeweeglijke, tweedimensionale microkolonies uit gistcellen met één grondlegger. Concanavaline A interageert noncovalently met polysachariden op de oppervlakken van gistcellen om microkolonnies te immobiliseren. De binding tussen concanavaline A en gistcellen kan worden omgekeerd door concurrentie met suikers of door een lage pH15. Daarom kunnen sterk zure media of media die lectinebindende componenten zoals gistextract (YEPD) of ftalaat (Edinburgh Minimal Media) bevatten, niet voor deze test worden gebruikt zonder wijzigingen in de immobilisatietechniek (figuur 4A).
Als de groeitest wordt uitgevoerd met giststammen die flocculeren, moet de optionele sonicatiestap worden gebruikt om geaggregeerde cellen uit elkaar te halen, zodat afzonderlijke cellen aan het begin van het experiment op de microscoopplaat worden geïmmobiliseerd (zie figuur 4B voor een voorbeeld van flocculerende cellen na het plateren als de sonicatiestap wordt weggelaten). Microkolonen die worden opgericht door een cluster van meerdere cellen moeten worden uitgesloten in downstream-analyse, omdat groeisnelheidsmetingen niet langer worden afgeleid van één grondleggercel en cellen mogelijk niet in twee dimensies groeien. Microkolonnies die zijn opgericht door een ontluikende cel zijn toelaatbaar. De vorming van tweedimensionale microkolonies wordt belemmerd door gist die zeer sterk flocculeren, zelfs als kolonies worden gefundeerd door een enkele cel, en daarom moet het vermogen van een giststam om in een enkele laag op concanavaline A te groeien worden getest voordat een groeitest wordt uitgevoerd.
Een andere belangrijke reeks overwegingen komt tijdens zowel de plannings- als de analysefase van het experiment, bij het bepalen van het aantal tijdspunten dat in de analyse moet worden opgenomen. Ten eerste is het belangrijk om gegevens op te nemen voor voldoende tijdspunten over een voldoende periode om de groei nauwkeurig te volgen: het wordt aanbevolen om assays zo uit te voeren dat gist tijd heeft om ~ 5 verdubbelingen door te maken, met ten minste 10 tijdspunten verzameld over die periode. Het simpelweg opnemen van elk verzameld tijdspunt in de groeisnelheidsberekening zal echter resulteren in een bias die de groeisnelheid voor veel kolonies kunstmatig verlaagt. Deze bias kan optreden wanneer cellen een vertragingsfase doorlopen voordat ze beginnen met groeien (figuur 4C). Pregroeivertraging van microkolonnies komt vaak voor en varieert tussen experimentele omstandigheden en stammen9,13. Experimentele analysemethoden moeten in staat zijn om tijdspunten in de periode van "actieve groei" te onderscheiden van pregroeivertraging; een benadering is om een vooraf ingesteld aantal tijdspunten in een venster te gebruiken en het venster te vinden dat overeenkomt met het hoogste groeipercentage (Figuur 4C, vaste lijn)11,13.
Ten slotte is een van de meest kritieke stappen van de microkoloniale groeitest de gistcelverdunningsstap. De concentratie van cellen en de verhouding van verschillende genotypen in microscoopplaatputten moeten zorgvuldig worden gecontroleerd. Voor statistische analyse is het belangrijk dat experimenten zodanig worden uitgebalanceerd dat ongeveer gelijke aantallen cellen voor elk genotype en elke conditie worden getest en vergeleken16. Bovendien kunnen nuttige groeipercentages meestal niet worden gemeten nadat naburige kolonies samensmelten omdat de groeipercentages van de individuele kolonies niet langer kunnen worden onderscheiden; daarom zullen dichter geplateerde cellen groeigegevens opleveren van minder tijdspunten (figuur 4D). Belangrijk is dat als de celdichtheid aan het begin van een experiment hoog of ongelijk is, het filteren van samengevoegde microkolonen sneller groeiende microkolonnies onevenredig zal uitsluiten van downstreamanalyses, omdat snelle telers vaker zullen fuseren dan langzame telers. Daarom zullen de uiteindelijke groeimetingen worden gericht op langzamer groeiende subpopulaties. Bovendien kunnen verschillende aantallen kolonies worden gefilterd voor verschillende behandelingen, waardoor een uitgebalanceerd experiment wordt uitgesloten. Het wordt aanbevolen om ongeveer 4000 cellen per put in een 96-put plaat (of 700 cellen per put in een 384-well plaat) te borderen. Grondige pipetmenging in het gistverdunningsgedeelte van het protocol is noodzakelijk om ervoor te zorgen dat het juiste aantal cellen in elke put aanwezig is en dat cellen gelijkmatig door de put worden verspreid. Het is ook raadzaam om microkolonnies uit de analyse te verwijderen waarvan de centra zich binnen ~ 25 celdiameters van elkaar bevinden.
Figuur 4. Experimentele valkuilen. (A) Kolonies die groeien in YEPD-media, wat een efficiënte binding van cellen aan concanavaline A voorkomt. Het verschijnen van nieuwe cellen ver van elke kolonie (pijlpunten), evenals het verschijnen van veel out-of-focus cellen aan de rand van de kolonie, zijn het resultaat van cellen die zich niet aan het glasoppervlak hechten en tijdens de groei van de kolonie afdrijven. (B) Cellen van een flocculerende stam direct na het plateren zonder sonicatie; de aanwezigheid van grote aantallen clusters van meerdere cellen (pijlpunten) en cellen binnen de clusters in verschillende brandpuntsvlakken opmerken. (C) Verandering in ln(gebied) in de loop van de tijd voor een kolonie met een lange vertragingsfase. Merk op dat als alle tijdspunten worden gebruikt voor de raming van de groeisnelheid, het geschatte groeipercentage aanzienlijk wordt verlaagd; een nauwkeurige meting wordt alleen geproduceerd wanneer de subset van n tijdspunten (hier n=6) die resulteert in de hoogste groeisnelheidsschatting wordt gebruikt. (D) Cellen die aan het begin van het experiment en na 7 uur groei te dicht waren geplateerd. Kleuren volgen individuele kolonies totdat ze fuseren met buren; hier, door de 7-h mark, zijn de meeste kolonies samengevoegd, met slechts een klein aantal individuele langzaam groeiende kolonies over. (Het volgen van een kleine subset van de hier getoonde kolonies gaat verloren om redenen die niets te maken hebben met het samenvoegen van kolonies.) Elke schaalbalk is 50 μm. Klik hier om een grotere versie van deze afbeelding te bekijken.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Het hier beschreven protocol is een veelzijdige test waarmee celgroei en genexpressie tegelijkertijd kunnen worden gecontroleerd op het niveau van individuele microkolonnies. Het combineren van deze twee modaliteiten levert unieke biologische inzichten op. Eerder werk heeft deze test bijvoorbeeld gebruikt om een negatieve correlatie aan te tonen tussen de expressie van het TSL1-gen en de microkoloniale groeisnelheid in isogene wildtypecellen door beide gelijktijdig7,10te meten . Het is ook mogelijk om de relatie tussen groeisnelheid en subcellulaire lokalisatiedynamiek van fluorescerend gelabelde eiwitten te monitoren met de beschreven assay. Bijvoorbeeld, een negatieve relatie tussen groeisnelheid en de nucleaire bezetting van RFP-gelabelde transcriptiefactor Msn2 werd geïdentificeerd door fluorescentie in cellen elke minuut gedurende 30 minuten in beeld te brengen voordat de groeitest10werd geïnitialiseerd . Ten slotte maakt dit protocol monitoring van celreacties op omgevingsspanningen en verstoringen mogelijk. Behandelingen zoals hitteschok kunnen halverwege de groeitest worden toegediend. Dergelijke studies hebben bijvoorbeeld aangetoond dat langzaam groeiende cellen die hoge niveaus van Tsl1 uitdrukken toleranter zijn voor hitteschok 7,10.
Naast de gemeenschappelijke valkuilen die worden beschreven in de sectie Representatieve resultaten (fig. 4), moeten verschillende belangrijke factoren in aanmerking worden genomen bij het ontwerpen van een groeitestexperiment. De fenotypische variatie die met de test wordt gemeten, wordt beïnvloed door meerdere factoren, waarvan sommige herhaalbaar en inherent belang zijn, zoals genotype of omgeving, terwijl andere het resultaat zijn van technische variatie13. Daarom is de eerste belangrijke overweging bij het ontwerpen van een microkoloniale test om het experiment uit te voeren op een manier die de scheiding vergemakkelijkt van effecten van belang van de effecten die voortvloeien uit technische variatie; de sleutel tot deze scheiding zijn randomiserende behandelingen of stammen op experimentele platen, en inclusief controles in elk experiment. Passende statistische methoden , zoals lineaire gemengde modellering (LMM), moeten worden toegepast op gegevens nadat zij zijn verzameld , verantwoordelijk voor verschillende bronnen van variatie in downstreamanalyse17,18.
Om statistische methoden te gebruiken om variatie in groeifenotypes te scheiden als gevolg van experimentele variabelen van belang van variatie als gevolg van willekeurige factoren zoals batcheffecten, is het noodzakelijk om meerdere experimenten uit te voeren op verschillende dagen en met gerandomiseerde putlocaties van genotype en groeiomstandigheden. Om de kracht van het experiment te vergroten om groeiverschillen tussen stammen of behandelingsomstandigheden te detecteren, is het bovendien belangrijk om meerdere replica's van elk getest genotype of groeiconditie op één experimentele plaat op te nemen waar mogelijk.
Een belangrijk voordeel van de microkoloniale groeitest ligt in de hoeveelheid gegevens die het kan verzamelen: een enkele experimentele plaat genereert meestal gegevens voor ~ 105 individuele microkolonnies, wat verschillende ordes van grootte groter is dan typische experimenten met microfluïdische apparaten in plaats van multiwell-platen. Software die kolonies automatisch bijhoudt en relevante gegevens berekent (bijv. vertragingstijden, groeipercentages en gemiddelde fluorescerende intensiteiten) is de sleutel om ten volle te profiteren van deze test. Deze software moet niet alleen koloniegrenzen robuust identificeren en kolonies door de tijd volgen, maar ook de groei in kolonies met een vertragingsfase13correct meten . Een optie die voor dit doel is ontwikkeld, is PIE, open-source software die kolonies in de loop van de tijd volgt (inclusief het verantwoorden van verschuivingen in koloniepositie), groeipercentages berekent en integratie van fluorescerende beeldvormingsgegevens in experimentele metingen11,12mogelijk maakt .
De microkoloniale groeitest kan worden gebruikt om inzicht te krijgen in fundamentele vragen met betrekking tot gistgeschiktheid en evolutie, waaronder groeifenotypevariabiliteit, veranderingen in verschillende omgevingen of als reactie op stress, en de relatie tussen groei en eiwitexpressie of subcellulaire lokalisatie. De test is veelvuldig gebruikt in studies van zowel laboratorium - als wilde stammen van S. cerevisiae7,9,10,13.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
De auteurs hebben niets bekend te maken.
Acknowledgments
We danken Naomi Ziv, Sasha Levy en Shuang Li voor hun bijdragen aan de ontwikkeling van dit protocol, David Gresham voor gedeelde apparatuur en Marissa Knoll voor hulp bij videoproductie. Dit werk werd ondersteund door de National Institutes of Health grant R35GM118170.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| General Materials | |||
| 500 mL Bottletop Filter .22 µm PES Sterilizing, Low Protein Binding, w/45mm Neck | Fisher | CLS431154 | used to filter the media |
| BD Falcon*Tissue Culture Plates, microtest u-bottom | Fisher | 08-772-54 | 96-well culture tubes used to freeze cells, pre-grow cells, and dilutions |
| BD Syringes without Needle, 50 mL | Fisher | 13-689-8 | Used to filter the Concanavalin A |
| Costar Sterile Disposable Reagent Reservoirs | Fisher | 07-200-127 | reagent reservoirs used to pipette solutions with multichannel pipette |
| Costar Thermowell Aluminum Sealing Tape | Fisher | 07-200-684 | 96-well plate seal for pre-growth and freezing |
| lint and static free Kimwipes | Fisher | 06-666A | lint and static free wipes to keep microscope plate bottom free of debris and scratches |
| Nalgene Syringe Filters | ThermoFisher Scientific | 199-2020 | 0.2 μm pore size, 25 mm diameter; used to filter concanavalin A solution |
| Media Components | |||
| Minimal chemically defined media (MD; 2% glucose) | alternative microscopy media used for yeast pre-growth and growth during microscopy | ||
| Synthetic Complete Media (SC; 2% glucose) | microscopy media used for yeast pre-growth and growth during microscopy | ||
| Yeast extract-peptone-dextrose (YEPD; 2% glucose) medium | cell growth prior to freezing down randomized plates | ||
| Microscopy Materials | |||
| Breathe-Easy sealing membrane | Millipore Sigma | Z380059-1PAK | breathable membranes used to seal plate during microscopy experiment. At this stage breathable membranes are recommended because they prevent condensation in the wells and allow for better microscopy images |
| Brooks 96-well flat clear glass bottom microscope plate | Dot Scientific | MGB096-1-2-LG-L | microscope plate |
| Concanavalin A from canavalia ensiformis (Jack Bean), lyophilized powder | Millipore Sigma | 45-C2010-1G | Make 5x concanavalin A solution and freeze 5ml of 5x concanavalin A in 50 mL conical tubes at -80 °C |
| Strains Used | |||
| MAH.5, MAH.96, MAH.52, MAH.66, MAH.11, MAH.58, MAH.135, MAH.15, MAH.44, MAH.132 | Haploid mutation accumulation strains in a laboratory background, described in Hall and Joseph 2010 | ||
| EP026.2A-2C | Progeny of the ancestral Hall and Joseph 2010 mutation accumulation strain, transformed with YFR054cΔ::Scw11P::GFP | ||
| Equipment | |||
| Misonix Sonicator S-4000 with 96-pin attachment | Sonicator https://www.labx.com/item/misonix-inc-s-4000-sonicator/4771281 | ||
| Nikon Eclipse Ti-E with Perfect Focus System | Inverted microscope with automated stage and autofocus system |
References
- Geiler-Samerotte, K. A., Hashimoto, T., Dion, M. F., Budnik, B. A., Airoldi, E. M., Drummond, D. A. Quantifying condition-dependent intracellular protein levels enables high-precision fitness estimates. PloS one. 8 (9), 75320 (2013).
- Kussell, E., Leibler, S. Phenotypic diversity, population growth, and information in fluctuating environments. Science. 309 (5743), 2075-2078 (2005).
- Thattai, M., van Oudenaarden, A. Stochastic gene expression in fluctuating environments. Genetics. 167 (1), 523-530 (2004).
- King, O. D., Masel, J. The evolution of bet-hedging adaptations to rare scenarios. Theoretical population biology. 72 (4), 560-575 (2007).
- Acar, M., Mettetal, J. T., van Oudenaarden, A. Stochastic switching as a survival strategy in fluctuating environments. Nature genetics. 40 (4), 471-475 (2008).
- Avery, S. V. Microbial cell individuality and the underlying sources of heterogeneity. Nature reviews. Microbiology. 4 (8), 577-587 (2006).
- Levy, S. F., Ziv, N., Siegal, M. L. Bet hedging in yeast by heterogeneous, age-correlated expression of a stress protectant. PLoS biology. 10 (5), 1001325 (2012).
- van Dijk, D., et al. Slow-growing cells within isogenic populations have increased RNA polymerase error rates and DNA damage. Nature communications. 6, 7972 (2015).
- Ziv, N., Shuster, B. M., Siegal, M. L., Gresham, D. Resolving the Complex Genetic Basis of Phenotypic Variation and Variability of Cellular Growth. Genetics. 206 (3), 1645-1657 (2017).
- Li, S., Giardina, D. M., Siegal, M. L. Control of nongenetic heterogeneity in growth rate and stress tolerance of Saccharomyces cerevisiae by cyclic AMP-regulated transcription factors. PLoS genetics. 14 (11), 1007744 (2018).
- Plavskin, Y., Li, S., Ziv, N., Levy, S. F., Siegal, M. L. Robust colony recognition for high-throughput growth analysis from suboptimal low-magnification brightfield micrographs. bioRxiv. , (2018).
- Siegallab. , Available from: http://github.com/Siegallab/PIE (2020).
- Ziv, N., Siegal, M. L., Gresham, D. Genetic and nongenetic determinants of cell growth variation assessed by high-throughput microscopy. Molecular biology and evolution. 30 (12), 2568-2578 (2013).
- Hall, D. W., Joseph, S. B. A high frequency of beneficial mutations across multiple fitness components in Saccharomyces cerevisiae. Genetics. 185 (4), 1397-1409 (2010).
- Saleemuddin, M., Husain, Q. Concanavalin A: a useful ligand for glycoenzyme immobilization--a review. Enzyme and microbial technology. 13 (4), 290-295 (1991).
- Geiler-Samerotte, K. A., Bauer, C. R., Li, S., Ziv, N., Gresham, D., Siegal, M. L. The details in the distributions: why and how to study phenotypic variability. Current opinion in biotechnology. 24 (4), 752-759 (2013).
- Nakagawa, S., Schielzeth, H. Repeatability for Gaussian and non-Gaussian data: a practical guide for biologists. Biological reviews of the Cambridge Philosophical Society. 85 (4), 935-956 (2010).
- Bolker, J. A. Exemplary and surrogate models: two modes of representation in biology. Perspectives in biology and medicine. 52 (4), 485-499 (2009).
