Summary
Gjærvekst fenotyper måles nøyaktig gjennom svært parallell tidsforløpavbildning av immobiliserte celler som vokser til mikrokolonier. Samtidig kan stresstoleranse, proteinuttrykk og proteinlokalisering overvåkes, og genererer integrerte datasett for å studere hvordan miljømessige og genetiske forskjeller, samt genuttrykks heterogenitet blant isogene celler, modulerer vekst.
Abstract
Presise målinger av mellom- og understamme heterogenitet i mikrobielle vekstrater er avgjørende for å forstå genetiske og miljømessige tilførsler til stresstoleranse, patogenisitet og andre viktige komponenter i kondisjon. Dette manuskriptet beskriver en mikroskopbasert analyse som sporer omtrent 105 Saccharomyces cerevisiae mikrokolonier per eksperiment. Etter automatisert tidsforløpsavbildning av gjær immobilisert i en multiwell plate, analyseres mikrokoloni vekstrater enkelt med tilpasset bildeanalyseprogramvare. For hver mikrokoloni kan uttrykk og lokalisering av fluorescerende proteiner og overlevelse av akutt stress også overvåkes. Denne analysen muliggjør presis estimering av stammenes gjennomsnittlige vekstrater, samt omfattende måling av heterogenitet i vekst, genuttrykk og stresstoleranse i kloniske populasjoner.
Introduction
Vekst fenotyper bidrar kritisk til gjær fitness. Naturlig utvalg kan effektivt skille mellom avstamninger med vekstrater forskjellig fra det motsatte av den effektive befolkningsstørrelsen, som kan overstige 108 personer1. Videre er variasjon av vekstrater blant individer i en befolkning en evolusjonært relevant parameter, da den kan tjene som grunnlag for overlevelsesstrategier sominnsatssikring 2,3,4,5,6. Derfor er analyser som tillater svært nøyaktige målinger av vekstfenotyper og deres fordelinger avgjørende for studiet av mikroorganismer. Mikrokolonivekstanalysen som er beskrevet her, kan generere individuelle vekstratemålinger for ~ 105 mikrokolonier per eksperiment. Denne analysen gir derfor en kraftig protokoll for å studere gjær evolusjonær genetikk og genomikk. Det egner seg spesielt godt til å teste hvordan variasjon i populasjoner av genetisk identiske enkeltceller genereres, vedlikeholdes og bidrar til befolkningsform7,8,9,10.
Metoden som er beskrevet her (Figur 1), bruker periodisk fangede, lavforstørrelsesbilder av celler som vokser i flytende medier på en 96- eller 384-brønns glassbunnplate for å spore vekst i mikrokolonier. Cellene holder seg til lectin concanavalin A, som dekker bunnen av mikroskopplaten, og danner todimensjonale kolonier. Fordi mikrokoloniene vokser i en monolayer, er mikrokoloniområdet svært korrelert med celle nummer7. Derfor kan nøyaktige estimater av mikrokoloni vekstrate og oppholdstid genereres med tilpasset bildeanalyseprogramvare som sporer endringshastigheten for området for hvert mikrokoloni. Videre kan det eksperimentelle oppsettet overvåke overflod og til og med subcellulære lokaliseringer av fluorescerende merkede proteiner uttrykt i disse mikrokoloniene. Nedstrøms behandling av data fra denne mikrokoloni vekstanalysen kan oppnås ved tilpasset analyse eller av eksisterende bildeanalyseprogramvare, for eksempel Processing Images Easily (PIE)11, en algoritme for robust koloniområdegjenkjenning og vekstanalyse med høy gjennomstrømning fra lavforstørrelse, brightfield-bilder, som er tilgjengelig via GitHub12.
Fordi vekstrateestimater avledet fra mikrokoloni-vekstanalysen genereres fra et stort antall enkeltkolonimålinger, er de ekstremt nøyaktige, med standardfeil flere størrelsesordener mindre enn estimatene selv for et rimelig stort eksperiment. Derfor er analysens kraft til å oppdage vekstratforskjeller mellom forskjellige genotyper, behandlinger eller miljøforhold høy. Multiwell-plateformatet gjør at mange forskjellige miljø- og genotypekombinasjoner kan sammenlignes i et enkelt eksperiment. Hvis stammer uttrykker forskjellige fluorescerende markører, kan de blandes i samme brønn og preges av påfølgende bildeanalyse, noe som kan øke kraften ytterligere ved å tillate brønn-for-brønn data normalisering.
Figur 1: Skjematisk representasjon av protokollen. Denne protokollen følger to hovedtrinn, som er utarbeidelsen av eksperimentell plate og forberedelsen av cellene til bilde. Randomisering av plater og vekst av celler bør utføres før og før eksperimentdagen. Gjentatt blanding av celler på hvert trinn under fortynning er viktig i trinnene til plating, og derfor anbefales det å forberede den eksperimentelle platen først, slik at den er klar til plating umiddelbart etter ferdigstillelse av cellefortynning. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. Tilberedning av randomiserte plater (før eksperimentdagen)
- Planlegg belastningene og betingelsene som skal testes med vekstanalysen. På dette tidspunktet tilordner tilfeldig stammer og forhold til enhver brønn.
MERK: Når du vurderer plateoppsett, anbefales det å inkludere mer enn én replikering per belastning og veksttilstand på en enkelt plate for å ta hensyn til godt relatert støy i målinger. Se Diskusjon hvis du vil ha mer informasjon. - Beregningsmessig randomisere plasseringen av hver belastning og miljøtilstand for plate replikerer som vil bli kjørt på forskjellige dager.
- Vokse alle celler som vil bli brukt i forsøket til metning i gjær ekstrakt-peptone-dextrose (YEPD; 2% glukose) medium i en shaker ved 30 °C (eller annen passende temperatur).
- Lag de randomiserte lagerplatene enten manuelt eller med en væskehåndteringsrobot. Tilsett 10 μL av de utpekte mettede cellene til hver brønn av en steril U-bunnvevskulturplate. Hvis flere stammer vil bli testet i en enkelt brønn, ikke kombiner dem på dette tidspunktet; denne kombinasjonen vil bli gjort like før cellefortynning på eksperimentets dag for å sikre at alle stammer er i riktig konsentrasjon når de er belagt som mikrokoloniale grunnleggerceller.
- Tilsett 10 μL 30% glyserol til hver brønn av hver plate. Pipet opp og ned slik at cellene og glyserol blir godt blandet.
- Forsegle hver plate med et foliedeksel og frys ned umiddelbart ved -70 °C til den er klar til bruk.
MERK: Det er viktig å lage alle randomiserte plater på samme dag, og fryse dem, slik at cellenes pre-vekstforhold i hver plate har vært identiske og ikke vil generere teknisk variasjon i vekstrateanalysen.
2. Pre-vekst av gjær
MERK: Vanligvis starter dette før eksperimentdagen og er svært avhengig av det eksperimentelle spørsmålet. Se Diskusjon hvis du vil ha mer informasjon.
- Fjern en lagerplate (10 μL gjær, 10 μL glyserol per brønn) fra -70 °C fryseren og tilsett 180 μL av mediet som skal brukes til eksperimentet. Hvis eksperimentet vil bli utført ved hjelp av næringsbegrensende medier, må du ikke pre-dyrke gjær til metning i næringsbegrensende medier, da sporulering av gjær kan forekomme. I stedet kan du forhåndskon vokse i ikke-begrensende medier.
- Dyrg gjær mens du rister ved 30 °C. Vurder om du vil kjøre analysen fra og med celler i loggfasen eller i stasjonær fase for å avgjøre om det vil være nødvendig å fortynne cellene flere ganger før eksperimentet. Hvis gjærstammene eller forholdene i analysen forventes å ha betydelig forskjellige vekstrater, vil en to-dagers førvekstperiode være nødvendig for at alle de forskjellige forholdene skal nå stasjonær fase.
3. Oppsett av mikroskop
- Forberedelse av mikroskopplate
- Forsikre deg om at mikroskopinkubatoren er på og varmer mikroskopkammeret til ønsket veksttemperatur for de eksperimentelle forholdene. For standardforsøk ved hjelp av Saccharomyces cerevisiae-celler, bør inkubatoren varme mikroskopkammeret til 30 °C for å sikre at vekstforholdene for cellene vil være riktige under veksthastighetsanalysen.
- Desinfiser arbeidsbenken, pipettene og andre verktøy med 70% etanol. Hent en mikroskopplate og legg den på benken på toppen av en lo- og statisk fri klut.
MERK: Berør aldri bunnen av mikroskopplaten, selv med hansker på, og sett alltid mikroskopplaten ned på toppen av en lo- og statisk fri klut hver gang den berører en overflate. Dette forhindrer flekker eller riper i å hindre vekstratemålinger når eksperimentet er avbildet. - Tine 5 ml 5x concanavalin En oppløsning, fortynn til 1x med vann, og filtrer steriliser gjennom en sprøyte utstyrt med et 0,2-μm filter.
- Filtrer steriliser alle andre væsker som skal brukes i analysen med et filter på 0,2 μm, inkludert eksperimentelle medier, for å fjerne eventuelle krystaller eller rusk som kan ha materialisert seg i løsningene. Tilstedeværelsen av krystaller vil redusere kvaliteten på mikroskopibildene.
- Pipet 200 μL concanavalin En løsning i hver brønn på mikroskopplaten.
- Sentrifuger platen i 2 min ved 411 x tyngdekraften (g) med en lo- og statisk fri klut under platen, for å sikre at concanavalin A-løsningen jevnt dekker bunnen av hver brønn og at det ikke er luftbobler.
- Dekk platen med lokket og la den sitte i 1-2 timer. Den nøyaktige tiden platen sitter er fleksibel, men det er viktig å være konsekvent mellom forskjellige serier av eksperimentet.
- Fjern alle konkavalein A-oppløsningen fra platen enten ved sug eller ved å kraftig utlade den ut i vasken eller en beholder. Pass på at du ikke berører glassdelen av platen. Det er akseptabelt hvis noen dråper concanavalin A-løsning forblir i brønnene.
- Vask mikroskopplatens brønner ved å tilsette 400 μL sterilt vann. Fjern vannet som gjort med concanavalin A i forrige trinn. Ikke la platen sitte tørr.
- Tilsett umiddelbart 185 μL eksperimentelle vekstmedier i platen. 15 μL korrekt fortynnede celler vil bli lagt til denne platen.
- Gjærcellefortynning
MERK: Trinnene nedenfor beskriver en fortynning av gjær fra en mettet kultur (ca. 108 celler/ml) 400 ganger for å oppnå en konsentrasjon på 250 000 celler/ml, hvorav 15 μL vil bli fortynnet til 400 μL i glassbunnplaten, noe som gir et endelig antall på ca. 4000 celler per brønn i en 96-brønns plate. Ved bruk av en 384-brønnsplate skal det endelige antallet celler per brønn være ca. 700 og fortynningene bør justeres tilsvarende. Dette forholdet bør justeres for celler som samles inn i loggfasen, vokser i rikere eller dårligere pre-vekstmedier, eller fra forskjellige stammer. Den endelige tettheten av celler per brønn bør reduseres ved kjøring av vekstrateanalysen for tidsperioder som er lengre enn 10 timer.- Sett opp to 96-brønns kulturplater for serielle fortynninger: etikett som plate 1 og 2, og tilsett 90 μL eksperimentelle vekstmedier (dvs. mediet som gjæren vil vokse inn på mikroskopet) til hver seriell fortynningsplate.
MERK: Uansett hvilken endelig fortynning som brukes, anbefales minst to serielle fortynninger av celler, hvorav et lite volum gjær pipetteres inn i et større volum eksperimentelle medier, og deretter blandes et stort volum eksperimentelle medier kraftig med en pipet (som i trinn 3.2.5 og 3.2.6 nedenfor). - Hent platen av celler fra pre-vekst og sentrifuger platen i 2 min ved 411 x g.
MERK: Det er svært viktig å ikke krysskontaminere forskjellige brønner i platen. Formålet med dette sentrifugeringstrinnet før du fjerner foliebelegget fra plater, er å sikre at gjærfylte dråper fra en brønn ikke flyr av folien og havner i andre brønner. Vær forsiktig så du aldri vipper eller agiterer platene for å unngå at gjær kommer i kontakt med foliebelegget etter sentrifugering. - Skrell forsiktig tilbake folien og resuspendcellene ved å røre celler kraftig med en pipet satt til omtrent halvparten av det totale volumet i platen mens du flytter pipetten rundt brønnen for å blande. Kontroller at alle celler er resuspendert fra bunnen av brønnene.
- Hvis flere stammer i individuelle brønner skal brukes, bør stammer blandes på dette tidspunktet med forholdet som er nødvendig for forsøket. Hvis en referansestamme skal brukes til å generere vekstratemålinger, bør forholdet mellom referanse og teststamme være 1:1.
- Pipet 10 μL gjær fra vekstmedier til fortynningsplate 1. Tilsett 100 μL eksperimentelle vekstmedier til hver brønn til et endelig volum på 200 μL per brønn. Pipet opp og ned kraftig.
- Pipet 10 μL gjær fra plate 1 til plate 2. Tilsett 100 μL eksperimentelle vekstmedier til hver brønn, og pipet kraftig opp og ned for å blande.
MERK: Disse fortynningstrinnene er avgjørende for å skille klynger av gjær som sitter fast sammen på slutten av førvekststadiet og sikre at omtrent like mange gjærceller havner i hver brønn. Å ha konsistent antall gjær i hver brønn bidrar til å fjerne eksperimentell støy og skjevheter i vekstratemålinger (se Representative resultater).
- Sett opp to 96-brønns kulturplater for serielle fortynninger: etikett som plate 1 og 2, og tilsett 90 μL eksperimentelle vekstmedier (dvs. mediet som gjæren vil vokse inn på mikroskopet) til hver seriell fortynningsplate.
- Sonikering
MERK: Sonikering er valgfritt, og trenger bare å utføres for gjærstammer som har høy tilbøyelighet til å holde seg til hverandre (f.eks. noen ville stammer). For laboratoriestammer er sonikering generelt ikke nødvendig og kan hoppes over ved å gå videre til trinn 3.4.- Desinfiser et 96-pinners sonikerhode med 70 % etanol ved å plassere det i en 96-brønnsplate fylt med 70 % etanol og tørk med en lo- og statisk fri klut.
- Sett et sonikeringsprogram som er tilstrekkelig sterkt til å bryte fra hverandre flocculated gjærceller, men dreper ikke celler eller forårsaker forhøyede stressresponser. Noen tester kan være nødvendig for å identifisere det beste sonikeringsprogrammet for et gitt eksperiment. Sonikeringsprogrammet som brukes i dette eksperimentet er: amplitude = 10, prosesstid = 10 s, puls-on = 1 s, pulse-off = 1 s. Dette eksakte programmet gjelder sannsynligvis ikke for alle sonikere, så testing foreslås før eksperimentdagen.
- Bland gjæren i seriell fortynningsplate 2 igjen ved å pipettere kraftig opp og ned fem ganger.
- Plasser fortynningsplaten 2 på plattformen og fest den med sonikerpinnene i celleopphenget, men ikke rør bunnen av platen. Kjør sonikeringsprogrammet med passende ørebeskyttelse.
- Etter at programmet har kjørt, rengjør sonicatorhodet med 70% etanol og deretter med vann, og fortsett deretter umiddelbart til mikroskopplateforberedelse slik at cellene ikke flocculate igjen.
- Forbered plate for mikroskop:
- Pipet 15 μL gjær fra seriell fortynningsplate 2 inn i mikroskopplaten til et volum på 200 μL. Tilsett 200 μL eksperimentelle vekstmedier til hver brønn til et sluttvolum på 400 μL per brønn, og pipet kraftig opp og ned for å blande.
- Dekk platen med en pustende membran. Det er viktig å forsegle platen godt med denne membranen, for eksempel ved hjelp av en gummirulle.
- For å feste gjærcellene til concanavalin A på glassoverflaten, sentrifuger platen med en lo- og statisk fri klut under den i 2 min ved 411 x g.
- I mikroskopet tørker du toppen og bunnen av platen med en lo- og statisk fri klut, og blåser trykkluft på platen for å kvitte seg med rusk.
- Plasser platen på mikroskopet, sørg for at den er i vater og at A1-brønnen er i øverste venstre hjørne.
4. Måling av intervallmikroskopi
MERK: Under intervallmikroskopi er følgende funksjoner datastyrte: x-, y- og z-posisjon, skodder og fluorescensfiltre. Et maskinvarebasert autofokussystem er optimalt for å forhindre drift av fokusplan under tidsforløpavbildning. Alternativt kan en programvarebasert automatisk fokuseringssløyfe brukes. For å opprettholde fuktighet i mikroskopkammeret, anbefales det å holde et beger med renset vann i kammeret gjennom hele eksperimentets varighet.
- Lag en liste over posisjoner (x,y) til bildet, slik at hver mikroskopplatebrønn er fullstendig avbildet. Unngå overlappende bilder slik at ingen celler analyseres flere ganger.
- Bilde i brightfield med diaskopisk belysning (DIA) ved en forstørrelse på 15x. Sett eksponeringen til ~5 ms.
- Zoom inn på bildet digitalt slik at cellene er tydelig synlige. Bruk fokuseringsknappene til å identifisere det ideelle fokuset for eksperimentet i de fire brønnene på hjørnet av platen og i en brønn i midten av platen. Fokuser på en slik måte at du får maksimal kontrast til cellene.
- Angi z-posisjonen (eller autofokusposisjonen) for eksperimentet som et gjennomsnitt av z/autofokusposisjonene som er identifisert for hver av disse brønnene. Hvis mikroskopplaten er godt laget og glassbunnen ikke har feil, bør de ideelle fokusposisjonene være like for hver brønn.
MERK: Når du analyserer bilder med rørledningen Processing Images Easily (PIE) bildeanalyse11,12, er det nyttig for cellene å være litt ute av fokus på mikroskopet slik at det er en mørk kant utenfor cellen og et lyst interiør, noe som hjelper til med nøyaktig kolonigjenkjenning og størrelsesestimater. - Hvis du bruker fluorescerende stammer, må du identifisere kanalene og eksponeringene som bildet skal brukes på, slik at ingen piksler blir overeksponert. Når du angir eksponeringstid for fluorescerende kanaler, slår du av "live capture" -modusen på mikroskopet for å unngå å utsette celler for fluorescenseksitasjon i lange perioder, da dette både kan fotobleach cellene og forårsake stress.
- Definer tidssekvensanskaffelsen for å ta bilder med ønsket tidsintervall i ønsket tidsperiode.
- Kjør eksperimentet.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Nyheten i denne protokollen er at vekstraten kan beregnes for enkeltceller i en populasjon ved å spore veksten i mikrokolonier gjennom tidsforløpavbildning (figur 2A). Fordi mikrokolonier vokser i mange timer på en planar måte på grunn av tilstedeværelsen av concanavalin A, kan deres områder spores gjennom hele eksperimentet, og en lineær passform til endringen i områdets naturlige logg over tid kan brukes til å beregne vekstrate for hver enkelt koloni observert 7,9,10,13. Forskjeller i mikrokolonivekst for enkelte isogene celler i samme miljø registreres tydelig (Figur 2A, 2B). Bildeanalyseprogramvare bør brukes til automatisk å spore endringer i mikrokolonistørrelse og fluorescens (Figur 2C); kolonisporingen vist i figur 2A ble utført ved hjelp av PIE11,12.
Figur 2: Kvantifisering av vekstrate og fluorescens i gjærmikrokolonier. (A) En del av et enkelt bildefelt som viser mikrokolonier som vokser i begynnelsen av eksperimentet, etter 3 timer og etter 6 timer, viser kolonisporing ved hjelp av PIE-kolonisporingsprogramvaren. Kolonier vokser synlig i en monolayer så lenge eksperimentet varer. (B) Endring i ln(område) over tid for de sporede koloniene i panel A. Hvis det finnes tilstrekkelige tidspunktdata for en koloni, kan vekstraten og oppholdstiden før vekst beregnes. (C) Bilde som viser GFP fluorescensintensitet for koloniene i panel A, tatt etter at vekstdelen av eksperimentet er fullført, med koloniomrissene fra 6-timers tidspunktet lagt over. Her markerer Scw11P::GFP en referansestamme som er inkludert i hver eksperimentelle brønn. Beregning av GFP-fluorescensnivået til hver koloni tillater bestemmelse av hvilke kolonier som stammer fra referansestammen, og hvilke fra ikke-referansestammene i hver brønn. Hver skalalinje er 50 μm. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
Vanligvis kan ~ 105 mikrokoloni vekstrater per eksperiment samles inn ved hjelp av denne analysen. Disse dataene kan brukes til å observere både forskjeller mellom stammer/vekstforhold, og variasjon på tvers av genetisk identiske mikrokolonier dyrket i felles tilstand. Figur 3A viser for eksempel fordelingen av vekstrater for ~12 000 kolonier fra en mutasjonsakkumuleringslinje (MAH.44)14 og GFP-merket referansestamme som vokser i de samme brønnene, med både forskjeller mellom belastningene og høy variasjon i belastningen synlig. I figur 3Bvises individuelle vekstrater og sammendragsstatistikk for 10 mutasjonsakkumuleringsstammer, sammen med deres brønnbaserte GFP-merkede kontroller; De innsamlede dataene tillater presis beregning av små gjennomsnittlige vekstratforskjeller.
Figur 3. Store utvalgsstørrelser av individuelle mikrokolonivekstrater gir presis kvantifisering av vekstvariasjoner innen belastning og mellom belastning. (A) Fordelingen av vekstrater på ~12 000 kolonier fra to stammer. Legg merke til forskjeller mellom distribusjonsmåtene, samt den lange halen av langsomt voksende kolonier som er tilstede i hver enkelt; sistnevnte kan bare påvises på grunn av individuelle mikrokolonimålinger. (B) Fordelinger av individuelle mikrokoloni vekstrater (svarte prikker) og sammendrag statistikk (boxplots viser median, samt lavere og øvre 25% kvantiler) for ~ 120,000 kolonier fra 11 stammer. Som i (A) ble hver stamme dyrket i en individuell brønn med en spiked-in GFP-merket referansestamme; data vist her representerer 14 eksperimentelle brønner per MAH-referansestammepar. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
Mikrokolonivekstanalysen kan også brukes til samtidig å måle vekst og genuttrykk ved å avbilde både brightfield- og fluorescenskanaler. I eksperimentet vist i figur 2, fluorescerende avbildning av GFP-uttrykk etter ferdigstillelse av vekstfasen av eksperimentet tillot identifisering av kolonier som tilhører en GFP-merket referansestamme i brønn med svakt GFP-uttrykk (Figur 2C); Måling av interkoloniale forskjeller i genuttrykksnivåer på tvers av tidspunkter er imidlertid også mulig (se Diskusjon).
En rekke vanlige fallgruver kan forhindre innsamling av nøyaktige vekstratedata eller riktig analyse av disse dataene. Et sentralt poeng er at vekstratemålinger er avhengige av dannelsen av immobile, todimensjonale mikrokolonier fra enkeltgründer gjærceller. Concanavalin A samhandler ikke-kovavalent med polysakkarider på overflatene av gjærceller for å immobilisere mikrokolonier. Båndet mellom concanavalin A og gjærceller kan reverseres ved konkurranse med sukker eller ved lav pH15. Derfor kan sterkt sure medier eller medier som inneholder lectin-bindende komponenter som gjærekstrakt (YEPD) eller ftalat (Edinburgh Minimal Media), ikke brukes til denne analysen uten modifikasjoner på immobiliseringsteknikken (Figur 4A).
Hvis vekstanalysen utføres med gjærstammer som flommer, bør det valgfrie sonikeringstrinnet brukes til å bryte fra hverandre aggregerte celler slik at enkeltceller immobiliseres på mikroskopplaten i begynnelsen av eksperimentet (se figur 4B for et eksempel på flocculating celler post-plating hvis sonikeringstrinnet utelates). Eventuelle mikrokolonier som er grunnlagt av en klynge av flere celler, bør utelukkes i nedstrømsanalyser, da vekstratemålinger ikke lenger er avledet fra en enkelt grunnleggercelle, og celler kan ikke vokse i to dimensjoner. Mikrokolonier som er grunnlagt av en spirende celle er tillatt. Dannelsen av todimensjonale mikrokolonier er hindret av gjær som flocculate veldig sterkt, selv om kolonier er grunnlagt av en enkelt celle, og derfor evnen til en gjærstamme til å vokse i et enkelt lag på concanavalin A bør testes før du utfører en vekstanalyse.
Et annet viktig sett med hensyn kommer både i planleggings- og analysestadiene av eksperimentet, når man bestemmer hvor mange tidspunkter som skal inkluderes i analysen. For det første er det viktig å inkludere data for nok tidspunkter over en tilstrekkelig tidsperiode til å spore veksten nøyaktig: det anbefales at analyser kjøres på en slik måte at gjær har tid til å gå gjennom ~ 5 dobler, med minst 10 tidspunkt samlet inn i løpet av den perioden. Men bare å inkludere hvert innsamlede tidspunkt i vekstrateberegningen vil resultere i en skjevhet som kunstig senker vekstraten for mange kolonier. Denne skjevheten kan oppstå når celler går gjennom en oppholdsfase før vekst startes (Figur 4C). Pre-vekst lag av mikrokolonier er vanlig og varierer mellom eksperimentelle forhold og stammer9,13. Eksperimentelle analysemetoder må kunne skille mellom tidspunkter i den "aktive vekstperioden" fra pre-vekstforsinkelse; Én fremgangsmåte er å bruke et forhåndsinnstilt antall tidspunkter i et vindu og finne vinduet som tilsvarer den høyeste vekstraten (Figur 4C, heltrukket linje)11,13.
Til slutt er et av de mest kritiske trinnene i mikrokolonivekstanalysen gjærcellefortynningstrinnet. Konsentrasjonen av celler og forholdet mellom ulike genotyper i mikroskopplatebrønner må kontrolleres nøye. For statistisk analyse er det viktig at eksperimenter balanseres slik at omtrent like mange celler for hver genotype og tilstand testes og sammenlignesmed 16. I tillegg kan nyttige vekstrater vanligvis ikke måles etter at nærliggende kolonier fusjonerer fordi vekstratene til de enkelte koloniene ikke lenger kan ses; Derfor vil tettere belagte celler gi vekstdata fra færre tidspunkter (Figur 4D). Det er viktig at hvis celletettheten er høy eller ujevn i begynnelsen av et eksperiment, vil filtrering av sammenslåtte mikrokolonier uforholdsmessig utelukke raskere voksende mikrokolonier fra nedstrømsanalyser fordi raske produsenter vil fusjonere oftere enn langsomme produsenter. Derfor vil endelige vekstmålinger være partisk mot langsommere voksende underpopulasjoner. I tillegg kan forskjellige antall kolonier filtreres ut for forskjellige behandlinger, og utelukker et balansert eksperiment. Det anbefales å plate rundt 4000 celler per brønn i en 96-brønnsplate (eller 700 celler per brønn i en 384-brønnsplate). Grundig pipetblanding gjennom gjærfortynningsdelen av protokollen er viktig for å sikre at riktig antall celler er til stede i hver brønn, og at cellene er jevnt spredt gjennom brønnen. Det anbefales også å fjerne eventuelle mikrokolonier fra analyse hvis sentre er innenfor ~ 25 cellediametre av hverandre.
Figur 4. Eksperimentelle fallgruver. (A) Kolonier som vokser i YEPD-medier, som forhindrer effektiv binding av celler til concanavalin A. Utseendet til nye celler langt fra enhver koloni (pilspisser), samt utseendet til mange ute-av-fokus-celler på kanten av kolonien, er resultatet av at celler ikke klarer å holde seg til glassoverflaten og drive bort fra kolonien under vekst. (B) Celler fra en flocculating stamme rett etter plating uten sonikering; Legg merke til at det finnes et stort antall klynger med flere celler (pilspisser) og celler i klyngene i forskjellige fokusplan. (C) Endring i ln(område) over tid for en koloni med lang etterslepfase. Vær oppmerksom på at hvis alle tidspunkter brukes til vekstrateestimering, er den estimerte vekstraten betydelig deprimert; En nøyaktig måling produseres bare når delsettet med n tidspunkter (her n=6) som resulterer i det høyeste vekstrateestimatet, brukes. (D) Celler som ble belagt for tett vist ved starten av eksperimentet og etter 7 timers vekst. Farger sporer individuelle kolonier til de smelter sammen med naboer; her, ved 7-h-merket, har flertallet av koloniene fusjonert, med bare et lite antall individuelle langsomt voksende kolonier igjen. (Sporing for en liten undergruppe av koloniene som vises her, går tapt av grunner som ikke er relatert til kolonisammenslåing.) Hver skalalinje er 50 μm. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Protokollen som er beskrevet her er en allsidig analyse som gjør at cellevekst og genuttrykk kan overvåkes samtidig på nivået av individuelle mikrokolonier. Å kombinere disse to modalitetene gir unik biologisk innsikt. For eksempel har tidligere arbeid brukt denne analysen til å vise en negativ sammenheng mellom uttrykk for TSL1-genet og mikrokolonivekstraten i isogene wildtype-celler ved å måle begge samtidig7,10. Det er også mulig å overvåke forholdet mellom vekstrate og subcellulær lokaliseringsdynamikk av fluorescerende merkede proteiner med den beskrevne analysen. For eksempel ble en negativ sammenheng mellom vekstrate og kjernefysisk belegg av RFP-merket transkripsjonsfaktor Msn2 identifisert ved å avbilde fluorescens i celler hvert minutt i 30 minutter før du initialiserervekstanalysen 10. Til slutt tillater denne protokollen overvåking av celleresponser på miljøbelastninger og perturbasjoner. Behandlinger som varmesjokk kan administreres delvis gjennom vekstanalysen. Slike studier har for eksempel avslørt at langsomt voksende celler som uttrykker høye nivåer av Tsl1, er mer tolerante for varmesjokk 7,10.
I tillegg til de vanlige fallgruvene som er beskrevet i avsnittet Representative resultater (fig. 4), må flere nøkkelfaktorer vurderes ved utforming av et vekstanalyseeksperiment. Den fenotypiske variasjonen som måles med analysen påvirkes av flere faktorer, hvorav noen er repeterbare og av iboende interesse, for eksempel genotype eller miljø, mens andre er et resultat av teknisk variasjon13. Derfor er det første viktige hensynet når du designer en mikrokolonianalyse å utføre eksperimentet på en måte som letter separasjon av effekter av interesse fra effektene som følge av teknisk variasjon; nøkkelen til denne separasjonen er randomisering av behandlinger eller stammer på eksperimentelle plater, og inkluderer kontroller i hvert eksperiment. Egnede statistiske metoder, for eksempel lineær blandet modellering (LMM), må brukes på data etter at de er samlet inn, for å gjøre rede for ulike variasjonskilder i nedstrømsanalyse17,18.
For å kunne anvende statistiske metoder for å skille variasjon i vekstfenotyper på grunn av eksperimentelle interessevariabler fra variasjon på grunn av tilfeldige faktorer som batcheffekter, er det nødvendig å kjøre flere eksperimenter på forskjellige dager og med randomiserte brønnplasseringer av genotype og vekstforhold. I tillegg, for å øke kraften i eksperimentet for å oppdage vekstforskjeller mellom stammer eller behandlingsforhold, er det også viktig å inkludere flere replikeringer av hver testet genotype eller veksttilstand, på en enkelt eksperimentell plate der det er mulig.
En viktig fordel med mikrokolonivekstanalysen ligger i mengden data den kan samle inn: En enkelt eksperimentell plate genererer vanligvis data for ~ 105 individuelle mikrokolonier, som er flere størrelsesordener større enn typiske eksperimenter ved hjelp av mikrofluidiske enheter i stedet for multiwell-plater. Programvare som automatisk sporer kolonier og beregner relevante data (f.eks. oppholdstider, vekstrater og gjennomsnittlige fluorescerende intensiteter) er nøkkelen til å dra full nytte av denne analysen. Denne programvaren bør ikke bare robust identifisere kolonigrenser og spore kolonier gjennom tidene, men også riktig måle vekst i kolonier med en forsinkelsesfase13. Et alternativ utviklet for dette formålet er PIE, åpen kildekode-programvare som sporer kolonier over tid (inkludert regnskap for skift i koloniposisjon), beregner vekstrater og tillater integrering av fluorescerende bildedata i eksperimentellemålinger 11,12.
Mikrokoloni vekstanalysen kan brukes til å få innsikt i grunnleggende spørsmål knyttet til gjær fitness og evolusjon, inkludert vekst fenotype variabilitet, endringer i ulike miljøer eller som svar på stress, og forholdet mellom vekst og proteinuttrykk eller subcellulær lokalisering. Analysen har blitt brukt mye i studier av både laboratorie- og villstammer av S. cerevisiae7,9,10,13.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Forfatterne har ingenting å avsløre.
Acknowledgments
Vi takker Naomi Ziv, Sasha Levy og Shuang Li for deres bidrag til å utvikle denne protokollen, David Gresham for delt utstyr, og Marissa Knoll for hjelp med videoproduksjon. Dette arbeidet ble støttet av National Institutes of Health grant R35GM118170.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| General Materials | |||
| 500 mL Bottletop Filter .22 µm PES Sterilizing, Low Protein Binding, w/45mm Neck | Fisher | CLS431154 | used to filter the media |
| BD Falcon*Tissue Culture Plates, microtest u-bottom | Fisher | 08-772-54 | 96-well culture tubes used to freeze cells, pre-grow cells, and dilutions |
| BD Syringes without Needle, 50 mL | Fisher | 13-689-8 | Used to filter the Concanavalin A |
| Costar Sterile Disposable Reagent Reservoirs | Fisher | 07-200-127 | reagent reservoirs used to pipette solutions with multichannel pipette |
| Costar Thermowell Aluminum Sealing Tape | Fisher | 07-200-684 | 96-well plate seal for pre-growth and freezing |
| lint and static free Kimwipes | Fisher | 06-666A | lint and static free wipes to keep microscope plate bottom free of debris and scratches |
| Nalgene Syringe Filters | ThermoFisher Scientific | 199-2020 | 0.2 μm pore size, 25 mm diameter; used to filter concanavalin A solution |
| Media Components | |||
| Minimal chemically defined media (MD; 2% glucose) | alternative microscopy media used for yeast pre-growth and growth during microscopy | ||
| Synthetic Complete Media (SC; 2% glucose) | microscopy media used for yeast pre-growth and growth during microscopy | ||
| Yeast extract-peptone-dextrose (YEPD; 2% glucose) medium | cell growth prior to freezing down randomized plates | ||
| Microscopy Materials | |||
| Breathe-Easy sealing membrane | Millipore Sigma | Z380059-1PAK | breathable membranes used to seal plate during microscopy experiment. At this stage breathable membranes are recommended because they prevent condensation in the wells and allow for better microscopy images |
| Brooks 96-well flat clear glass bottom microscope plate | Dot Scientific | MGB096-1-2-LG-L | microscope plate |
| Concanavalin A from canavalia ensiformis (Jack Bean), lyophilized powder | Millipore Sigma | 45-C2010-1G | Make 5x concanavalin A solution and freeze 5ml of 5x concanavalin A in 50 mL conical tubes at -80 °C |
| Strains Used | |||
| MAH.5, MAH.96, MAH.52, MAH.66, MAH.11, MAH.58, MAH.135, MAH.15, MAH.44, MAH.132 | Haploid mutation accumulation strains in a laboratory background, described in Hall and Joseph 2010 | ||
| EP026.2A-2C | Progeny of the ancestral Hall and Joseph 2010 mutation accumulation strain, transformed with YFR054cΔ::Scw11P::GFP | ||
| Equipment | |||
| Misonix Sonicator S-4000 with 96-pin attachment | Sonicator https://www.labx.com/item/misonix-inc-s-4000-sonicator/4771281 | ||
| Nikon Eclipse Ti-E with Perfect Focus System | Inverted microscope with automated stage and autofocus system |
References
- Geiler-Samerotte, K. A., Hashimoto, T., Dion, M. F., Budnik, B. A., Airoldi, E. M., Drummond, D. A. Quantifying condition-dependent intracellular protein levels enables high-precision fitness estimates. PloS one. 8 (9), 75320 (2013).
- Kussell, E., Leibler, S. Phenotypic diversity, population growth, and information in fluctuating environments. Science. 309 (5743), 2075-2078 (2005).
- Thattai, M., van Oudenaarden, A. Stochastic gene expression in fluctuating environments. Genetics. 167 (1), 523-530 (2004).
- King, O. D., Masel, J. The evolution of bet-hedging adaptations to rare scenarios. Theoretical population biology. 72 (4), 560-575 (2007).
- Acar, M., Mettetal, J. T., van Oudenaarden, A. Stochastic switching as a survival strategy in fluctuating environments. Nature genetics. 40 (4), 471-475 (2008).
- Avery, S. V. Microbial cell individuality and the underlying sources of heterogeneity. Nature reviews. Microbiology. 4 (8), 577-587 (2006).
- Levy, S. F., Ziv, N., Siegal, M. L. Bet hedging in yeast by heterogeneous, age-correlated expression of a stress protectant. PLoS biology. 10 (5), 1001325 (2012).
- van Dijk, D., et al. Slow-growing cells within isogenic populations have increased RNA polymerase error rates and DNA damage. Nature communications. 6, 7972 (2015).
- Ziv, N., Shuster, B. M., Siegal, M. L., Gresham, D. Resolving the Complex Genetic Basis of Phenotypic Variation and Variability of Cellular Growth. Genetics. 206 (3), 1645-1657 (2017).
- Li, S., Giardina, D. M., Siegal, M. L. Control of nongenetic heterogeneity in growth rate and stress tolerance of Saccharomyces cerevisiae by cyclic AMP-regulated transcription factors. PLoS genetics. 14 (11), 1007744 (2018).
- Plavskin, Y., Li, S., Ziv, N., Levy, S. F., Siegal, M. L. Robust colony recognition for high-throughput growth analysis from suboptimal low-magnification brightfield micrographs. bioRxiv. , (2018).
- Siegallab. , Available from: http://github.com/Siegallab/PIE (2020).
- Ziv, N., Siegal, M. L., Gresham, D. Genetic and nongenetic determinants of cell growth variation assessed by high-throughput microscopy. Molecular biology and evolution. 30 (12), 2568-2578 (2013).
- Hall, D. W., Joseph, S. B. A high frequency of beneficial mutations across multiple fitness components in Saccharomyces cerevisiae. Genetics. 185 (4), 1397-1409 (2010).
- Saleemuddin, M., Husain, Q. Concanavalin A: a useful ligand for glycoenzyme immobilization--a review. Enzyme and microbial technology. 13 (4), 290-295 (1991).
- Geiler-Samerotte, K. A., Bauer, C. R., Li, S., Ziv, N., Gresham, D., Siegal, M. L. The details in the distributions: why and how to study phenotypic variability. Current opinion in biotechnology. 24 (4), 752-759 (2013).
- Nakagawa, S., Schielzeth, H. Repeatability for Gaussian and non-Gaussian data: a practical guide for biologists. Biological reviews of the Cambridge Philosophical Society. 85 (4), 935-956 (2010).
- Bolker, J. A. Exemplary and surrogate models: two modes of representation in biology. Perspectives in biology and medicine. 52 (4), 485-499 (2009).
