Summary
Jäst tillväxt fenotyper mäts exakt genom mycket parallell tidsfördröjning imaging av immobiliserade celler växer till mikrokolon. Samtidigt kan stresstolerans, proteinuttryck och proteinlokalisering övervakas, vilket genererar integrerade datamängder för att studera hur miljömässiga och genetiska skillnader, liksom genuttrycks heterogenitet bland isogena celler, modulerar tillväxt.
Abstract
Exakta mätningar av mellan- och inomstams heterogenitet i mikrobiell tillväxthastighet är avgörande för att förstå genetiska och miljömässiga indata i stresstolerans, patogenicitet och andra viktiga komponenter i fitness. Detta manuskript beskriver en mikroskopbaserad analys som spårar cirka 105 Saccharomyces cerevisiae mikrokolonier per experiment. Efter automatiserad timelapse-avbildning av jäst immobiliserad i en multiwellplatta analyseras mikrokolonis tillväxthastigheter enkelt med anpassad bildanalysprogramvara. För varje mikrokoloni kan uttryck och lokalisering av fluorescerande proteiner och överlevnad av akut stress också övervakas. Denna analys möjliggör exakt uppskattning av stammars genomsnittliga tillväxttakt, liksom omfattande mätning av heterogenitet i tillväxt, genuttryck och stresstolerans inom klonurpopulationer.
Introduction
Tillväxt fenotyper bidrar kritiskt till jäst fitness. Naturligt urval kan effektivt skilja mellan härstamningar med tillväxthastigheter som skiljer sig åt genom inversen av den effektiva befolkningsstorleken, som kan överstiga 108 individer1. Dessutom är variabilitet av tillväxttakten bland individer inom en population en evolutionärt relevant parameter, eftersom den kan tjäna som grund för överlevnadsstrategier som betsäkring2,3,4,5,6. Därför är analyser som möjliggör mycket exakta mätningar av tillväxt fenotyper och deras fördelningar avgörande för studier av mikroorganismer. Den mikrokoloniska tillväxtanalysen som beskrivs här kan generera individuella tillväxthastighetsmätningar för ~10 5 mikrokolonier per experiment. Denna analys ger därför ett kraftfullt protokoll för att studera jäst evolutionär genetik och genomik. Det lämpar sig särskilt bra för att testa hur variationer inom populationer av genetiskt identiska enstaka celler genereras, underhålls och bidrar till befolkningens kondition7,8,9,10.
Metoden som beskrivs här (Figur 1) använder periodiskt fångade, lågförstoring brightfield bilder av celler som växer i flytande media på en 96- eller 384-brunn glasbottenplatta för att spåra tillväxt till mikrokolonier. Cellerna klibbar sig vid inktinkonanavalin A, som täcker botten av mikroskopplattan och bildar tvådimensionella kolonier. Eftersom mikrokolonerna växer i ett monoskikt är mikrokoloniområdet mycket korrelerat med cellnummer7. Därför kan exakta uppskattningar av mikrokolonisk tillväxthastighet och fördröjningstid genereras med anpassad bildanalysprogramvara som spårar förändringshastigheten för området för varje mikrokoloni. Dessutom kan den experimentella inställningen övervaka överflöd och till och med subcellulära lokaliseringar av fluorescerande märkta proteiner uttryckta i dessa mikrokolonier. Nedströms bearbetning av data från denna mikrofärgade tillväxtanalys kan uppnås genom anpassad analys eller genom befintlig bildanalysprogramvara, till exempel Processing Images Easily (PIE)11, en algoritm för robust igenkänning av koloniområdet och tillväxtanalys med hög genomströmning från lågförstoring, brightfield-bilder, som är tillgänglig via GitHub12.
Eftersom tillväxthastighetsuppskattningar som härrör från mikrokolonitillväxtanalysen genereras från ett stort antal enkolonimätningar är de extremt exakta, med standardfel som är flera storleksordningar mindre än själva uppskattningarna för ett experiment av rimlig storlek. Därför är kraften i analysen för att upptäcka tillväxthastighetsskillnader mellan olika genotyper, behandlingar eller miljöförhållanden hög. Multiwell-plate-formatet gör att många olika miljö- och genotypkombinationer kan jämföras i ett enda experiment. Om stammar utgör olika fluorescerande markörer kan de blandas i samma brunn och särskiljas genom efterföljande bildanalys, vilket kan öka kraften ytterligare genom att tillåta väl-för-brunn-datanormalisering.
Figur 1: Schematisk representation av protokollet. Detta protokoll följer två huvudsteg, som är förberedelsen av den experimentella plattan och beredningen av cellerna till bild. Randomisering av plattor och tillväxt av celler bör utföras före och fram till experimentdagen. Upprepad blandning av celler i varje steg under utspädning är absolut nödvändigt i stegen fram till plätering, och därför rekommenderas förberedelse av experimentplattan först så att den är klar för plätering omedelbart efter avslutad cellutspädning. Klicka här om du vill visa en större version av den här figuren.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. Förberedelse av randomiserade plattor (före experimentdagen)
- Planera de stammar och förhållanden som ska testas med tillväxtanalysen. Vid denna tidpunkt, slumpmässigt tilldela stammar och villkor till någon brunn.
OBS: När du överväger plåtinställning är det lämpligt att inkludera mer än en replikat per stam och tillväxttillstånd på en enda platta för att ta hänsyn till väl relaterat brus i mätningar. Se Diskussion för mer information. - Randomisera beräkningsmässigt platsen för varje stam och miljötillstånd för plåtrepliker som kommer att köras på olika dagar.
- Odla alla celler som kommer att användas i experimentet till mättnad i jästextrakt-pepton-dextros (YEPD; 2% glukos) medium i en shaker vid 30 °C (eller någon annan lämplig temperatur).
- Skapa de randomiserade lagerplattorna antingen manuellt eller med en vätskehanteringsrobot. Tillsätt 10 μL av de avsedda mättade cellerna till varje brunn på en steril U-botten vävnadskulturplatta. Om flera stammar kommer att testas i en enda brunn, kombinera dem inte vid denna tidpunkt; Denna kombination kommer att göras strax före cellutspädningar på experimentdagen för att säkerställa att alla stammar är i rätt koncentrationer när de pläterades som mikrokolonigrundarceller.
- Tillsätt 10 μL 30% glycerol till varje brunn på varje platta. Rör upp och ner så att cellerna och glycerolet blir väl blandade.
- Täta varje platta med ett folieskydd och frys omedelbart vid -70 °C tills den är klar att användas.
OBS: Det är viktigt att skapa alla randomiserade plattor samma dag och frysa dem, så att cellernas förtillväxtförhållanden i varje platta har varit identiska och inte kommer att generera teknisk variation i tillväxthastighetsanalysen.
2. Förtillväxt av jäst
Obs: Vanligtvis börjar detta före experimentdagen och är mycket beroende av den experimentella frågan. Se Diskussion för mer information.
- Ta bort en lagerplatta (10 μL jäst, 10 μL glycerol per brunn) från frysen -70 °C och tillsätt 180 μL av det medium som ska användas för försöket. Om experimentet kommer att utföras med näringsbegränsande media, förodla inte jäst till mättnad i näringsbegränsande medier eftersom sporulering av jäst kan uppstå. I stället växer de i icke-begränsande medier.
- Odla jäst medan du skakar vid 30 °C. Fundera på om analysen ska köras från celler i loggfas eller i stillastående fas för att avgöra om det kommer att behövas att späda ut cellerna flera gånger före experimentet. Om jäststammarna eller förhållandena i analysen förväntas ha betydligt olika tillväxthastigheter, kommer en tvådagarsperiod före tillväxt att vara nödvändig för att alla olika förhållanden ska nå stillastående fas.
3. Inställningar för mikroskop
- Förberedelse av mikroskopplatta
- Se till att mikroskopinkubatorn är på och värm mikroskopkammaren till önskad tillväxttemperatur för försöksförhållandena. För standardexperiment med Saccharomyces cerevisiaeceller bör inkubatorn värma mikroskopkammaren till 30 °C för att säkerställa att cellernas tillväxtförhållanden kommer att vara korrekta under tillväxthastighetsanalysen.
- Sanera arbetsbänken, pipetterna och andra verktyg med 70% etanol. Hämta en mikroskopplatta och placera den på bänken ovanpå en ludd- och statiskfri våtservett.
OBS: Rör aldrig vid botten av mikroskopplattan, även med handskar på, och ställ alltid ner mikroskopplattan ovanpå en ludd- och statiskfri våtservett när den rör vid någon yta. Detta förhindrar fläckar eller repor från att hindra tillväxthastighetsmätningar när experimentet har avbildats. - Tina 5 ml 5x konanavalin En lösning, späd till 1x med vatten och filtrera sterilisera genom en spruta utrustad med ett 0,2-μm filter.
- Filtrera sterilisera alla andra vätskor som kommer att användas i analysen med ett filter på 0,2 μm, inklusive experimentella medier, för att avlägsna kristaller eller skräp som kan ha materialiserats i lösningarna. Närvaron av kristaller skulle minska kvaliteten på mikroskopibilderna.
- Rör 200 μL konanavalin En lösning i varje brunn på mikroskopplattan.
- Centrifugera plattan i 2 min vid 411 x gravitation (g) med en ludd- och statiskfri våtservett under plattan, för att säkerställa att konkaanavalin en lösning jämnt täcker botten av varje brunn och att det inte finns några luftbubblor.
- Täck plattan med locket och låt den sitta i 1-2 timmar. Den exakta tiden som plattan sitter är flexibel, men det är viktigt att vara konsekvent mellan olika körningar av experimentet.
- Ta bort all konkaanavalin En lösning från plattan antingen genom att suga eller genom att kraftfullt släppa ut den i diskbänken eller ett uttag. Var försiktig så att du inte rör glasdelen av plattan. Det är acceptabelt om vissa droppar konanavalin En lösning finns kvar i brunnarna.
- Tvätta mikroskopplattans brunnar genom att tillsätta 400 μL sterilt vatten. Ta bort vattnet som gjort med concanavalin A i föregående steg. Låt inte plattan sitta torr.
- Tillsätt omedelbart 185 μL experimentella tillväxtmedier i plattan. 15 μL korrekt utspädda celler läggs till denna platta.
- Utspädning av jästceller
OBS: Stegen nedan beskriver en utspädning av jäst från en mättad kultur (cirka 108 celler/ml) 400 gånger för att uppnå en koncentration på 250 000 celler/ml, varav 15 μL späds ut till 400 μL i glasbottenplattan, vilket ger ett slutligt antal cirka 4000 celler per brunn i en 96-brunnsplatta. Om du använder en 384-brunnsplatta bör det slutliga antalet celler per brunn vara cirka 700 och utspädningarna bör justeras i enlighet därmed. Detta förhållande bör justeras för celler som samlas in i loggfas, växer i rikare eller fattigare pre-growth media, eller från olika stammar. Den slutliga densiteten hos celler per brunn bör minskas när tillväxthastighetsanalysen körs under tidsperioder längre än 10 timmar.- Sätt upp två 96-brunns odlingsplattor för seriella utspädningar: etikett som platta 1 och 2 och tillsätt 90 μL experimentella tillväxtmedier (dvs. media som jästen kommer att växa in i mikroskopet) till varje seriell utspädningsplatta.
OBS: Oavsett vilken slutlig utspädning som används rekommenderas minst två seriella utspädningar av celler, där var och en av dem en liten volym jäst pipetteds till en större volym experimentella medier och sedan blandas en stor volym experimentella medier kraftigt med en rör (som i steg 3.2.5 och 3.2.6 nedan). - Hämta cellplattan från förtillväxt och centrifugera plattan i 2 min vid 411 x g.
OBS: Det är mycket viktigt att inte korskontaminera olika brunnar i plattan. Syftet med detta centrifugationssteg innan foliebeläggningen tas bort från plattorna är att se till att jästfyllda droppar från en brunn inte flyger av folien och hamnar i andra brunnar. Var noga med att aldrig luta eller omröra plattorna för att undvika att jäst kommer i kontakt med foliebeläggningen efter centrifugation. - Skala försiktigt tillbaka folien och återanvänd cellerna genom att kraftigt pipetting celler med en pipet inställd på ungefär hälften av den totala volymen i plattan samtidigt som röret runt brunnen för att blanda. Kontrollera att alla celler har återsuspenderats från brunnarna.
- Om flera stammar i enskilda brunnar kommer att användas, bör stammar blandas vid denna tidpunkt vid det förhållande som krävs för experimentet. Om en referensstam kommer att användas för att generera tillväxthastighetsmätningar bör referensförhållandet till teststammen vara 1:1.
- Rör 10 μL jäst från tillväxtmedier till utspädningsplatta 1. Tillsätt 100 μL experimentella tillväxtmedier till varje brunn till en slutlig volym på 200 μL per brunn. Rör upp och ner kraftigt.
- Rör 10 μL jäst från platta 1 till platta 2. Tillsätt 100 μL experimentella tillväxtmedier till varje brunn och rör upp och ner kraftigt för att blanda.
OBS: Dessa utspädningssteg är avgörande för att hjälpa till att separera kluster av jäst som sitter ihop i slutet av förtillväxtstadiet och säkerställer att ungefär lika många jästceller hamnar i varje brunn. Att ha ett konsekvent antal jäst i varje brunn hjälper till att avlägsna experimentellt brus och fördomar i tillväxthastighetsmätningar (se representativa resultat).
- Sätt upp två 96-brunns odlingsplattor för seriella utspädningar: etikett som platta 1 och 2 och tillsätt 90 μL experimentella tillväxtmedier (dvs. media som jästen kommer att växa in i mikroskopet) till varje seriell utspädningsplatta.
- Ultraljudsbehandling
OBS: Ultraljudsbehandling är valfritt, och behöver endast utföras för jäststammar som har en hög benägenhet att hålla fast vid varandra (t.ex. vissa vilda stammar). För labbstammar är ultraljudsbehandling i allmänhet inte nödvändigt och kan hoppas över genom att fortsätta till steg 3.4.- Sanera ett 96-stifts ljuddatorns huvud med 70% etanol genom att placera det i en 96-brunnsplatta fylld med 70% etanol och torka med en ludd- och statiskfri våtservett.
- Ställ in ett ultraljudsprogram som är tillräckligt starkt för att bryta isär flocculated jästceller, men dödar inte celler eller orsakar förhöjda stressresponser. Vissa tester kan krävas för att identifiera det bästa ultraljudsbehandling programmet för ett visst experiment. Ultraljudsbehandling programmet som används i detta experiment är: amplitud = 10, processtid = 10 s, puls-on = 1 s, puls-off = 1 s. Detta exakta program är sannolikt inte tillämpligt på alla ljuddämpare så testning föreslås före experimentdagen.
- Blanda jästen i seriell utspädningsplatta 2 en gång till genom att pipetting upp och ner kraftigt fem gånger.
- Placera utspädningsplattan 2 på plattformen och fäst den med ljudstiften i cellupphängningen men rör inte vid botten av plattan. Kör ultraljudsbehandlingsprogrammet med lämpligt hörselskydd.
- När programmet har gått, rengör ljudhuvudet med 70% etanol och sedan med vatten, och fortsätt sedan omedelbart till mikroskopplattaberedning så att cellerna inte flockas igen.
- Förbered platta för mikroskop:
- Pipet 15 μL jäst från seriell utspädningsplatta 2 i mikroskopplattan till en volym av 200 μL. Tillsätt 200 μL experimentellt tillväxtmedier till varje brunn till en slutlig volym på 400 μL per brunn och rör upp och ner kraftigt för att blanda.
- Täck plattan med ett membran som andas. Det är viktigt att försegla plattan väl med detta membran, till exempel med hjälp av en gummirulle.
- För att fästa jästcellerna på konkaanavalin A på glasytan, centrifugera plattan med en ludd- och statiskfri våtservett under den i 2 min vid 411 x g.
- Vid mikroskopet torkar du av toppen och botten av plattan med en ludd- och statiskfri våtservett och blåser tryckluft på plattan för att bli av med skräp.
- Placera plattan på mikroskopet och se till att den är jämn och att A1-brunnen är i det övre vänstra hörnet.
4. Mätningar av tidsfördröjning av mikroskopitillväxt
OBS: Under tidsfördröjningsmikroskopi är följande funktioner datorstyrda: x-, y- och z-position, fönsterluckor och fluorescensfilter. Ett hårdvarubaserat autofokussystem är optimalt för att förhindra att fokalplan driver under timelapse-avbildning. Alternativt kan en mjukvarubaserad autofokuseringsslinga användas. För att bibehålla luftfuktigheten i mikroskopkammaren rekommenderas att hålla en bägare med renat vatten i kammaren under hela experimentets varaktighet.
- Skapa en lista över positioner (x,y) till bilden, så att varje mikroskopplattas brunn är helt avbildad. Undvik överlappande bilder så att ingen cell analyseras flera gånger.
- Bild i brightfield med diascopic belysning (DIA) vid en förstoring av 15x. Ställ in exponeringen på ~5 ms.
- Zooma in bilden digitalt så att cellerna syns tydligt. Använd fokuseringsknapparna för att identifiera det idealiska fokuset för experimentet i de fyra brunnarna i hörnet av plattan och i en brunn i mitten av plattan. Fokusera på ett sådant sätt att cellernas maximala kontrast får maximal kontrast.
- Ställ in z-positionen (eller autofokuspositionen) för att experimentet ska vara ett genomsnitt av de z/autofokuspositioner som identifierats för var och en av dessa brunnar. Om mikroskopplattan är välgjord och glasbotten inte har defekter, bör de idealiska fokuspositionerna vara lika för varje brunn.
OBS: När du analyserar bilder med bearbetningsbilder lätt (PIE) bildanalyspipeline11,12, är det bra att cellerna är något ur fokus på mikroskopet så att det finns en mörk kant utanför cellen och en ljus inredning, vilket hjälper till med korrekt koloniigenkänning och storleksuppskattningar. - Om du använder fluorescerande stammar, identifiera kanalerna och exponeringarna för att avbilda, vilket säkerställer att inga pixlar är överexponerade. När du ställer in exponeringstid för fluorescerande kanaler stänger du av "live capture"-läget på mikroskopet för att undvika att utsätta celler för fluorescensexcitation under långa tidsperioder, eftersom detta både kan fotoblechera cellerna och orsaka stress.
- Ställ in anskaffningen av tidssekvensen för att ta bilder med önskat tidsintervall under önskad tid.
- Kör experimentet.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Nyheten med detta protokoll är att tillväxttakten kan beräknas för enskilda celler inom en population genom att spåra deras tillväxt till mikrokolonier genom timelapse imaging (Figur 2A). Eftersom mikrokolonier växer i många timmar på ett planartat sätt på grund av närvaron av concanavalin A, kan deras områden spåras under hela experimentet, och en linjär passform till förändringen i områdets naturliga logg över tiden kan användas för att beräkna tillväxttakten för varje enskild koloni observerad 7,9,10,13. Skillnader i mikrokolonitillväxt för enskilda isogena celler i samma miljö registreras tydligt (figurerna 2A, 2B). Programvara för bildanalys bör användas för att automatiskt spåra förändringar i mikrokolonistorlek och fluorescens (figur 2C). kolonispårningen som visas i figur 2A gjordes med PIE11,12.
Figur 2: Kvantifiering av tillväxttakt och fluorescens i jästmikrokolonier. (A) En del av ett enda bildfält som visar mikrokolon som växer i början av experimentet, efter 3 timmar och efter 6 timmar, som visar kolonispårning med hjälp av PIE-kolonispårningsprogramvaran. Kolonier växer synligt i ett monolager under experimentets varaktighet. B) Förändring i Int(område) över tid för de spårade kolonierna i panel A. Om det finns tillräckligt med tidspunktsdata för en koloni kan dess tillväxthastighet och fördröjning före tillväxt beräknas. (C) Bild som visar GFP fluorescensintensitet för kolonierna i panel A, tagen efter att tillväxtdelen av experimentet är klar, med kolonins konturer från 6-h-tidspunkten överlagrad. Här markerar Scw11P::GFP en referensstam som ingår i varje experimentell brunn. Genom att beräkna GFP-fluorescensnivån för varje koloni kan man fastställa vilka kolonier som härrör från referensstammen och vilka från icke-referensstammarna i varje brunn. Varje skalbar är 50 μm. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Vanligtvis kan ~ 105 mikrokolonitillväxthastigheter per experiment samlas in med hjälp av denna analys. Dessa data kan användas för att observera både skillnader mellan stammar/tillväxtförhållanden och variation mellan genetiskt identiska mikrokolonier som odlas i ett gemensamt tillstånd. Figur 3A visar till exempel fördelningen av tillväxthastigheter för ~12 000 kolonier från en mutationsackumuleringslinje (MAH.44)14 och GFP-märkt referensstam som odlas i samma brunnar, med både skillnader mellan stammarna och hög variabilitet inom belastningen synliga. I figur 3Bvisas individuella tillväxthastigheter och sammanfattande statistik för 10 mutationsackumuleringsstammar, i kombination med deras GFP-märkta kontroller i brunnen. De insamlade uppgifterna gör det möjligt att exakt beräkna små genomsnittliga tillväxtskillnader.
Bild 3. Stora urvalsstorlekar av individuell mikrokolonitillväxt möjliggör exakt kvantifiering av tillväxtvariationer inom och mellan stammar. A) Fördelningen av tillväxttakten på ~12 000 kolonier från två stammar. Notera skillnader mellan distributionssätten, liksom den långa svansen av långsamt växande kolonier som finns i var och en; den senare kan endast detekteras på grund av individuella mikrokolonimätningar. (B) Fördelningar av individuella mikrokolonier (svarta prickar) och sammanfattande statistik (boxplots som visar median, liksom lägre och övre 25% kvantiler) för ~ 120 000 kolonier från 11 stammar. Liksom i (A) odlades varje stam i en enskild brunn med en spikad GFP-märkt referensstam; data som visas här representerar 14 experimentella brunnar per mah-referensstampar. Klicka här om du vill visa en större version av den här figuren.
Mikrokolonitillväxtanalysen kan också användas för att samtidigt mäta tillväxt och genuttryck genom att avbilda både brightfield- och fluorescenskanaler. I det experiment som visas i figur 2tillät fluorescerande avbildning av GFP-uttrycket efter avslutad tillväxtfas av försöket identifiering av kolonier som tillhör en GFP-märkt referensstam i brunnen med svagt GFP-uttryck (figur 2C). Mätning av interkolonia skillnader i genuttrycksnivåer över tidspunkter är dock också möjlig (se Diskussion).
Ett antal vanliga fallgropar kan förhindra insamling av exakta tillväxthastighetsdata eller korrekt analys av dessa data. En viktig punkt är att tillväxthastighetsmätningar är beroende av bildandet av orörliga, tvådimensionella mikrokolonier från engrundsjästceller. Concanavalin A interagerar noncovalently med polysackarider på ytorna av jästceller för att immobilisera mikrokolonier. Bindningen mellan konanavalin A och jästceller kan vändas genom konkurrens med sockerarter eller med lågt pH15. Därför kan starkt sura medier eller medier som innehåller tektinbindande komponenter såsom jästextrakt (YEPD) eller ftalat (Edinburgh Minimal Media) inte användas för denna analys utan ändringar av immobiliseringstekniken (figur 4A).
Om tillväxtanalysen utförs med jäststammar som flocculate, bör det valfria ultraljudsbehandlingssteget användas för att bryta isär aggregerade celler så att enstaka celler immobiliseras på mikroskopplattan i början av experimentet (se figur 4B för ett exempel på flocculating celler efter plätering om ultraljudsbehandlingssteget utelämnas). Alla mikrokolonier som grundas av ett kluster av flera celler bör uteslutas i nedströmsanalys, eftersom tillväxthastighetsmätningar inte längre härleds från en enda grundcell och celler kanske inte växer i två dimensioner. Mikrokolonier som grundas av en spirande cell är tillåtna. Bildandet av tvådimensionella mikrokolonier hindras av jäst som flocculate mycket starkt, även om kolonier grundas av en enda cell, och därför bör förmågan hos en jäststam att växa i ett enda lager på concanavalin A testas innan en tillväxtanalys.
En annan viktig uppsättning överväganden kommer under både planerings- och analysstadierna i experimentet, när man bestämmer hur många tidsramar som ska inkluderas i analysen. För det första är det viktigt att inkludera data för tillräckligt med tidspunkter under en tillräckligt lång tid för att noggrant spåra tillväxt: det rekommenderas att analyser körs på ett sådant sätt att jäst har tid att gå igenom ~ 5 fördubblingar, med minst 10 tidspunkter insamlade under den perioden. Men att helt enkelt inkludera varje insamlad tidspunkt i tillväxthastighetsberäkningen kommer att resultera i en partiskhet som artificiellt sänker tillväxttakten för många kolonier. Denna bias kan uppstå när celler går igenom en fördröjningsfas innan tillväxten påbörjas (figur 4C). Pre-growth lag av mikrokolonier är vanligt och varierar mellan experimentella tillstånd ochstammar 9,13. Experimentella analysmetoder måste kunna skilja tidspunkter under perioden "aktiv tillväxt" från eftersläpning före tillväxt. En metod är att använda ett förinställt antal tidspunkter i ett fönster och hitta det fönster som motsvarar den högsta tillväxttakten(figur 4C,heldragen linje)11,13.
Slutligen är ett av de mest kritiska stegen i mikrokolonitillväxtanalysen jästcellsutspädningssteget. Koncentrationen av celler och förhållandet mellan olika genotyper i mikroskopplåtsbrunnar måste kontrolleras noggrant. För statistisk analys är det viktigt att experimenten balanseras så att ungefär lika många celler för varje genotyp och tillstånd testas och jämförs16. Dessutom kan användbara tillväxthastigheter vanligtvis inte mätas efter att angränsande kolonier har sammanfogats eftersom tillväxthastigheterna för de enskilda kolonierna inte längre kan urskiljas. Därför kommer mer tätt pläterade celler att ge tillväxtdata från färre tidspunkter (figur 4D). Viktigt, om celltätheten är hög eller ojämn i början av ett experiment, kommer filtrering av sammanslagna mikrokolonier oproportionerligt att utesluta snabbare växande mikrokolonier från nedströmsanalyser eftersom snabbodlarna kommer att slås samman oftare än långsamma odlare. Därför kommer slutliga tillväxtmätningar att vara partiska mot långsammare växande subpopulationer. Dessutom kan olika antal kolonier filtreras bort för olika behandlingar, vilket utesluter ett balanserat experiment. Det rekommenderas att plätera cirka 4000 celler per brunn i en 96-brunnsplatta (eller 700 celler per brunn i en 384-brunnsplatta). Noggrann rörblandning i hela jästspädningsdelen av protokollet är absolut nödvändigt för att säkerställa att rätt antal celler finns i varje brunn och att cellerna är jämnt spridda över hela brunnen. Det är också lämpligt att ta bort alla mikrokolonier från analys vars centra ligger inom ~ 25 celldiametrar från varandra.
Figur 4. Experimentella fallgropar. A) Kolonier som växer i YEPD-medier, vilket förhindrar effektiv bindning av celler till konanavalin A. Utseendet på nya celler långt ifrån någon koloni (pilspetsar), liksom utseendet på många out-of-focus celler vid kolonins kant, är resultatet av celler som inte håller fast vid glasytan och driver bort från kolonin under tillväxt. B) Celler från en flocculating stam direkt efter plätering utan ultraljudsbehandling; observera förekomsten av ett stort antal kluster av flera celler (pilspetsar) och celler i klustren i olika fokala plan. C) Förändring i Int(område) över tid för en koloni med lång fördröjningsfas. Observera att om alla tidspunkter används för tillväxthastighetsuppskattning är den uppskattade tillväxttakten betydligt deprimerad. En noggrann mätning produceras endast när den delmängd av n tidspunkter (här n=6) som resulterar i den högsta tillväxthastighetsuppskattningen används. D) Celler som pläterades för tätt visades i början av försöket och efter 7 h tillväxt. Färger spårar enskilda kolonier tills de sammanfogas med grannar; Här, vid 7-h-märket, har majoriteten av kolonierna slagits samman, med endast ett litet antal enskilda långsamt växande kolonier kvar. (Spårning för en liten delmängd av kolonierna som visas här går förlorad av orsaker som inte har något samband med sammanslagning av kolonier.) Varje skalbar är 50 μm. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Protokollet som beskrivs här är en mångsidig analys som gör det möjligt att övervaka celltillväxt och genuttryck samtidigt på nivån för enskilda mikrokolonier. Att kombinera dessa två metoder ger unika biologiska insikter. Till exempel har tidigare arbete använt denna analys för att visa en negativ korrelation mellan uttryck av TSL1-genen och mikrokolonitillväxthastighet i isogena vilda typceller genom att mätabåda samtidigt 7,10. Det är också möjligt att övervaka förhållandet mellan tillväxthastighet och subcellulär lokaliseringsdynamik av fluorescerande märkta proteiner med den beskrivna analysen. Till exempel identifierades ett negativt samband mellan tillväxttakt och kärnbeläggning av RFP-märkt transkriptionsfaktor Msn2 genom avbildning fluorescens i celler varje minut i 30 minuter innan du initierar tillväxtanalys10. Slutligen tillåter detta protokoll övervakning av cellsvar på miljöbelastningar och miljöbelastningar. Behandlingar som värmechock kan administreras halvvägs genom tillväxtanalysen. Sådana studier har till exempel visat att långsamt växande celler som uttrycker höga nivåer av Tsl1 är mer toleranta mot värmechock 7,10.
Förutom de vanliga fallgroparna i avsnittet Representativa resultat (fig. 4) måste flera nyckelfaktorer beaktas vid utformningen av ett tillväxtanalysexperiment. Den fenotypiska variationen som mäts med analysen påverkas av flera faktorer, av vilka vissa är repeterbara och av inneboende intresse, såsom genotyp eller miljö, medan andra är resultatet av teknisk variation13. Den första viktiga faktorn vid utformningen av en mikrokolonianalys är därför att utföra försöket på ett sätt som underlättar separationen av effekter av intresse från effekterna till följd av tekniska variationer. nyckeln till denna separation är randomiserande behandlingar eller stammar på experimentella plattor, och inklusive kontroller i varje experiment. Lämpliga statistiska metoder, såsom linjär blandad modellering (LMM), måste tillämpas på uppgifter efter det att de har samlats in, för att ta hänsyn till olika variationskällor i analyseni senare led i 17,18.
För att använda statistiska metoder för att separera variationen i tillväxt fenotyper på grund av experimentella variabler av intresse från variation på grund av slumpmässiga faktorer såsom batcheffekter, är det nödvändigt att köra flera experiment på olika dagar och med randomiserade brunnsplatser för genotyp och tillväxtförhållanden. För att öka experimentet för att upptäcka tillväxtskillnader mellan stammar eller behandlingsförhållanden är det också viktigt att inkludera flera replikat av varje testad genotyp eller tillväxttillstånd, på en enda experimentell platta där det är möjligt.
En viktig fördel med mikrokolonitillväxtanalysen ligger i mängden data som den kan samla in: en enda experimentell platta genererar vanligtvis data för ~ 105 enskilda mikrokolonier, vilket är flera storleksordningar större än typiska experiment med mikrofluidiska enheter istället för multiwellplattor. Programvara som automatiskt spårar kolonier och beräknar relevanta data (t.ex. fördröjningstider, tillväxthastigheter och genomsnittliga fluorescerande intensiteter) är nyckeln till att dra full nytta av denna analys. Denna programvara bör inte bara robust identifiera kolonigränser och spåra kolonier genom tiden, men också korrekt mäta tillväxten i kolonier med en fördröjning fas13. Ett alternativ som utvecklats för detta ändamål är PIE, programvara med öppen källkod som spårar kolonier över tid (inklusive redovisning av förändringar i koloniposition), beräknar tillväxthastigheter och möjliggör integrering av fluorescerande bilddata i experimentellamätningar 11,12.
Microcolony tillväxt analys kan användas för att få insikt i grundläggande frågor som rör jäst fitness och evolution, inklusive tillväxt fenotyp variabilitet, förändringar i olika miljöer eller som svar på stress, och förhållandet mellan tillväxt och protein uttryck eller subcellulära lokalisering. Analysen har använts i stor utsträckning i studier av både laboratoriestammar och vilda stammar av S. cerevisiae7,9,10,13.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Författarna har inget att avslöja.
Acknowledgments
Vi tackar Naomi Ziv, Sasha Levy och Shuang Li för deras bidrag till att utveckla detta protokoll, David Gresham för delad utrustning och Marissa Knoll för hjälp med videoproduktion. Detta arbete stöddes av National Institutes of Health grant R35GM118170.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| General Materials | |||
| 500 mL Bottletop Filter .22 µm PES Sterilizing, Low Protein Binding, w/45mm Neck | Fisher | CLS431154 | used to filter the media |
| BD Falcon*Tissue Culture Plates, microtest u-bottom | Fisher | 08-772-54 | 96-well culture tubes used to freeze cells, pre-grow cells, and dilutions |
| BD Syringes without Needle, 50 mL | Fisher | 13-689-8 | Used to filter the Concanavalin A |
| Costar Sterile Disposable Reagent Reservoirs | Fisher | 07-200-127 | reagent reservoirs used to pipette solutions with multichannel pipette |
| Costar Thermowell Aluminum Sealing Tape | Fisher | 07-200-684 | 96-well plate seal for pre-growth and freezing |
| lint and static free Kimwipes | Fisher | 06-666A | lint and static free wipes to keep microscope plate bottom free of debris and scratches |
| Nalgene Syringe Filters | ThermoFisher Scientific | 199-2020 | 0.2 μm pore size, 25 mm diameter; used to filter concanavalin A solution |
| Media Components | |||
| Minimal chemically defined media (MD; 2% glucose) | alternative microscopy media used for yeast pre-growth and growth during microscopy | ||
| Synthetic Complete Media (SC; 2% glucose) | microscopy media used for yeast pre-growth and growth during microscopy | ||
| Yeast extract-peptone-dextrose (YEPD; 2% glucose) medium | cell growth prior to freezing down randomized plates | ||
| Microscopy Materials | |||
| Breathe-Easy sealing membrane | Millipore Sigma | Z380059-1PAK | breathable membranes used to seal plate during microscopy experiment. At this stage breathable membranes are recommended because they prevent condensation in the wells and allow for better microscopy images |
| Brooks 96-well flat clear glass bottom microscope plate | Dot Scientific | MGB096-1-2-LG-L | microscope plate |
| Concanavalin A from canavalia ensiformis (Jack Bean), lyophilized powder | Millipore Sigma | 45-C2010-1G | Make 5x concanavalin A solution and freeze 5ml of 5x concanavalin A in 50 mL conical tubes at -80 °C |
| Strains Used | |||
| MAH.5, MAH.96, MAH.52, MAH.66, MAH.11, MAH.58, MAH.135, MAH.15, MAH.44, MAH.132 | Haploid mutation accumulation strains in a laboratory background, described in Hall and Joseph 2010 | ||
| EP026.2A-2C | Progeny of the ancestral Hall and Joseph 2010 mutation accumulation strain, transformed with YFR054cΔ::Scw11P::GFP | ||
| Equipment | |||
| Misonix Sonicator S-4000 with 96-pin attachment | Sonicator https://www.labx.com/item/misonix-inc-s-4000-sonicator/4771281 | ||
| Nikon Eclipse Ti-E with Perfect Focus System | Inverted microscope with automated stage and autofocus system |
References
- Geiler-Samerotte, K. A., Hashimoto, T., Dion, M. F., Budnik, B. A., Airoldi, E. M., Drummond, D. A. Quantifying condition-dependent intracellular protein levels enables high-precision fitness estimates. PloS one. 8 (9), 75320 (2013).
- Kussell, E., Leibler, S. Phenotypic diversity, population growth, and information in fluctuating environments. Science. 309 (5743), 2075-2078 (2005).
- Thattai, M., van Oudenaarden, A. Stochastic gene expression in fluctuating environments. Genetics. 167 (1), 523-530 (2004).
- King, O. D., Masel, J. The evolution of bet-hedging adaptations to rare scenarios. Theoretical population biology. 72 (4), 560-575 (2007).
- Acar, M., Mettetal, J. T., van Oudenaarden, A. Stochastic switching as a survival strategy in fluctuating environments. Nature genetics. 40 (4), 471-475 (2008).
- Avery, S. V. Microbial cell individuality and the underlying sources of heterogeneity. Nature reviews. Microbiology. 4 (8), 577-587 (2006).
- Levy, S. F., Ziv, N., Siegal, M. L. Bet hedging in yeast by heterogeneous, age-correlated expression of a stress protectant. PLoS biology. 10 (5), 1001325 (2012).
- van Dijk, D., et al. Slow-growing cells within isogenic populations have increased RNA polymerase error rates and DNA damage. Nature communications. 6, 7972 (2015).
- Ziv, N., Shuster, B. M., Siegal, M. L., Gresham, D. Resolving the Complex Genetic Basis of Phenotypic Variation and Variability of Cellular Growth. Genetics. 206 (3), 1645-1657 (2017).
- Li, S., Giardina, D. M., Siegal, M. L. Control of nongenetic heterogeneity in growth rate and stress tolerance of Saccharomyces cerevisiae by cyclic AMP-regulated transcription factors. PLoS genetics. 14 (11), 1007744 (2018).
- Plavskin, Y., Li, S., Ziv, N., Levy, S. F., Siegal, M. L. Robust colony recognition for high-throughput growth analysis from suboptimal low-magnification brightfield micrographs. bioRxiv. , (2018).
- Siegallab. , Available from: http://github.com/Siegallab/PIE (2020).
- Ziv, N., Siegal, M. L., Gresham, D. Genetic and nongenetic determinants of cell growth variation assessed by high-throughput microscopy. Molecular biology and evolution. 30 (12), 2568-2578 (2013).
- Hall, D. W., Joseph, S. B. A high frequency of beneficial mutations across multiple fitness components in Saccharomyces cerevisiae. Genetics. 185 (4), 1397-1409 (2010).
- Saleemuddin, M., Husain, Q. Concanavalin A: a useful ligand for glycoenzyme immobilization--a review. Enzyme and microbial technology. 13 (4), 290-295 (1991).
- Geiler-Samerotte, K. A., Bauer, C. R., Li, S., Ziv, N., Gresham, D., Siegal, M. L. The details in the distributions: why and how to study phenotypic variability. Current opinion in biotechnology. 24 (4), 752-759 (2013).
- Nakagawa, S., Schielzeth, H. Repeatability for Gaussian and non-Gaussian data: a practical guide for biologists. Biological reviews of the Cambridge Philosophical Society. 85 (4), 935-956 (2010).
- Bolker, J. A. Exemplary and surrogate models: two modes of representation in biology. Perspectives in biology and medicine. 52 (4), 485-499 (2009).
