High-Throughput Live Imaging von Mikrokolonien zur Messung der Heterogenität in Wachstum und Genexpression

Summary

Hefewachstumsphänotypen werden präzise durch hochparallele Zeitraffer-Bildgebung von immobilisierten Zellen gemessen, die zu Mikrokolonien heranwachsen. Gleichzeitig können Stresstoleranz, Proteinexpression und Proteinlokalisierung überwacht werden, wodurch integrierte Datensätze generiert werden, um zu untersuchen, wie ökologische und genetische Unterschiede sowie die Genexpressionsheterogenität unter isogenen Zellen das Wachstum modulieren.

Abstract

Präzise Messungen der Heterogenität zwischen und innerhalb der Dehnung in mikrobiellen Wachstumsraten sind entscheidend für das Verständnis genetischer und ökologischer Inputs in Stresstoleranz, Pathogenität und anderen Schlüsselkomponenten der Fitness. Dieses Manuskript beschreibt einen mikroskopischen Assay, der pro Experiment etwa 10⁵ Saccharomyces cerevisiae mikrocolonies nachverfolgt. Nach der automatisierten Zeitraffer-Bildgebung von Hefe, die in einer Multiwell-Platte immobilisiert ist, lassen sich die Wachstumsraten von Mikrokolonien mit einer benutzerdefinierten Bildanalysesoftware einfach analysieren. Für jede Mikrokolonie können auch die Expression und Lokalisation fluoreszierender Proteine und das Überleben akuter Belastungen überwacht werden. Dieser Test ermöglicht eine genaue Schätzung der durchschnittlichen Wachstumsraten der Stämme sowie eine umfassende Messung der Heterogenität in Wachstum, Genexpression und Stresstoleranz innerhalb klonaler Populationen.

Introduction

Wachstumsphänotypen tragen entscheidend zur Hefefitness bei. Die natürliche Selektion kann effizient zwischen Linien unterscheiden, wobei die Wachstumsraten durch die Umkehrung der effektiven Bevölkerungsgröße abweichen, die 10^{8 Individuen}1 überschreiten kann. Darüber hinaus ist die Variabilität der Wachstumsraten bei Individuen innerhalb einer Bevölkerung ein evolutionär relevanter Parameter, da er als Grundlage für Überlebensstrategien wie Wetten hedging^2,3,4,5,6dienen kann. Daher sind Assays, die hochgenaue Messungen von Wachstumsphänotypen und deren Verteilungen ermöglichen, für die Untersuchung von Mikroorganismen von entscheidender Bedeutung. Der hier beschriebene Mikrokolonie-Wachstumstest kann individuelle Wachstumsratenmessungen für 10⁵ Mikrokolonien pro Experiment generieren. Dieser Test bietet daher ein leistungsfähiges Protokoll, um Hefe evolutionäre Genetik und Genomik zu studieren. Es eignet sich besonders gut, um zu testen, wie Variabilität innerhalb von Populationen von genetisch identischen Einzelzellen erzeugt, gepflegt wird und zur Eignung der Bevölkerung beiträgt^7,8,9,10.

Die hier beschriebene Methode (Abbildung 1) verwendet periodisch erfasste Hellfeldbilder von Zellen mit geringer Vergrößerung, die in flüssigen Medien auf einer 96- oder 384-Well-Glasbodenplatte wachsen, um das Wachstum in Mikrokolonien zu verfolgen. Die Zellen haften an dem Lektin Concanavalin A, das den Boden der Mikroskopplatte überzieht, und bilden zweidimensionale Kolonien. Da die Mikrokolonien in einer Monoschicht wachsen, ist das Mikrokoloniegebiet stark mit der Zellnummer⁷korreliert. Daher können genaue Schätzungen der Wachstumsrate und Verzögerungszeit von Mikrokolonien mit einer benutzerdefinierten Bildanalysesoftware generiert werden, die die Änderungsrate der Fläche jeder Mikrokolonie nachverfolgt. Darüber hinaus kann der Versuchsaufbau die Häufigkeiten und sogar die subzellulären Lokalisationen fluoreszierend markierter Proteine überwachen, die in diesen Mikrokolonien exprimiert werden. Die nachgeschaltete Verarbeitung von Daten aus diesem Mikrokolonie-Wachstumstest kann durch benutzerdefinierte Analyse oder durch vorhandene Bildanalysesoftware erreicht werden, wie z. B. Processing Images Easily (PIE)¹¹, ein Algorithmus für robuste Kolonieflächenerkennung und Wachstumsanalyse mit hohem Durchsatz aus Hellfeldbildern mit geringer Vergrößerung, die über GitHub¹²verfügbar sind.

Da wachstumsfördernde Schätzungen, die aus dem Mikrokolonie-Wachstumstest abgeleitet werden, aus einer großen Anzahl von Einzelkolonienmessungen generiert werden, sind sie extrem genau, mit Standardfehlern, die um mehrere Größenordnungen kleiner sind als die Schätzungen selbst für ein angemessen großes Experiment. Daher ist die Kraft des Assays, Wachstumsratenunterschiede zwischen verschiedenen Genotypen, Behandlungen oder Umgebungsbedingungen zu erkennen, hoch. Das Multiwell-Plattenformat ermöglicht den Vergleich zahlreicher unterschiedlicher Umgebungs- und Genotypkombinationen in einem einzigen Experiment. Wenn Stämme konstitutiv unterschiedliche fluoreszierende Marker exprimieren, können sie in der gleichen Bohrung gemischt und durch nachfolgende Bildanalyse unterschieden werden, was die Leistung weiter erhöhen könnte, indem sie eine gut-durch-gut-datennormalisierung ermöglichen.

Abbildung 1:Schematische Darstellung des Protokolls. Dieses Protokoll folgt zwei Hauptschritten, die die Vorbereitung der Versuchsplatte und die Vorbereitung der Zellen auf das Bild sind. Die Randomisierung der Platten und das Wachstum der Zellen sollten vor und vor dem Experimenttag durchgeführt werden. Das wiederholte Mischen von Zellen bei jedem Schritt während der Verdünnung ist in den Schritten bis zur Beschichtung zwingend erforderlich, und daher wird die Vorbereitung der Versuchsplatte zuerst empfohlen, so dass sie sofort nach Abschluss der Zellverdünnung zur Beschichtung bereit ist. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.

Protocol

1. Vorbereitung randomisierter Platten (vor dem Experimenttag)

1. Planen Sie die Belastungen und Bedingungen, die mit dem Wachstumstest getestet werden sollen. An diesem Punkt, zufällig zuweisen Stämme und Bedingungen zu jedem Brunnen.
   HINWEIS: Bei der Prüfung der Platteneinrichtung ist es ratsam, mehr als eine Replikation pro Dehnung und Wachstumszustand auf einer einzigen Platte einzuschließen, um gut verwandte Geräusche in Messungen zu berücksichtigen. Weitere Informationen finden Sie unter Diskussion.
2. Berechnen sie die Position jeder Dehnung und Umgebungsbedingung für Plattenreplikationen, die an verschiedenen Tagen ausgeführt werden.
3. Wachsen Sie alle Zellen, die im Experiment zur Sättigung in Hefeextrakt-Pepton-Dextrose (YEPD; 2% Glukose) Medium in einem Shaker bei 30 °C (oder einer anderen geeigneten Temperatur) verwendet werden.
4. Erstellen Sie die randomisierten Lagerplatten entweder manuell oder mit einem Flüssigkeitshandling-Roboter. Fügen Sie jedem Brunnen einer sterilen U-Boden-Gewebekulturplatte 10 l der bezeichneten gesättigten Zellen hinzu. Wenn mehrere Stämme in einem einzigen Brunnen getestet werden, kombinieren Sie sie an dieser Stelle nicht; Diese Kombination wird kurz vor den Zellverdünnungen am Tag des Experiments durchgeführt, um sicherzustellen, dass alle Stämme in den richtigen Konzentrationen sind, wenn sie als Mikrokolonie-Gründerzellen plattiert werden.
5. Fügen Sie jedem Bohrgut jeder Platte 10 l 30 % Glycerin hinzu. Pipetten Sie nach oben und unten, so dass die Zellen und das Glycerin gut gemischt werden.
6. Versiegeln Sie jede Platte mit einer Folienabdeckung und frieren Sie sofort bei -70 °C ein, bis sie einsatzbereit ist.
   HINWEIS: Es ist wichtig, alle randomisierten Platten am selben Tag zu erstellen und einzufrieren, so dass die Vorwachstumsbedingungen der Zellen in jeder Platte identisch waren und keine technischen Unterschiede im Wachstumsratentest erzeugen.

2. Vorwachstum der Hefe

HINWEIS: In der Regel beginnt dies vor dem Experimenttag und ist in hohem Maße von der experimentellen Frage abhängig. Weitere Informationen finden Sie unter Diskussion.

1. Entfernen Sie eine Stammplatte (10 l Hefe, 10 l Glycerin pro Bohrgut) aus dem Gefrierschrank -70 °C und fügen Sie 180 L des für das Experiment zu verwendenden Mediums hinzu. Wenn das Experiment mit nährstoffbegrenzenden Medien durchgeführt wird, nicht vorwachsen Hefe zu Sättigung in den nährstoffbegrenzenden Medien als Sporulation von Hefe auftreten kann. Stattdessen wachsen Sie in nicht-begrenzenden Medien.
2. Hefe wachsen, während sie bei 30 °C schüttelt. Überlegen Sie, ob der Test mit Zellen in der Protokollphase oder in der stationären Phase ausgeführt werden soll, um zu bestimmen, ob eine verdünnung der Zellen vor dem Experiment erforderlich ist. Wenn erwartet wird, dass die Hefestämme oder Bedingungen im Test deutlich unterschiedliche Wachstumsraten aufweisen, dann wird eine zweitägige Vorwachstumsphase notwendig sein, damit alle unterschiedlichen Bedingungen die stationäre Phase erreichen.

3. Mikroskop-Setup

1. Mikroskopplattenvorbereitung
   1. Stellen Sie sicher, dass der Mikroskop-Inkubator eingeschaltet ist und erwärmen Sie die Mikroskopkammer auf die gewünschte Wachstumstemperatur für die experimentellen Bedingungen. Bei Standardexperimenten mit Saccharomyces cerevisiae-Zellen sollte der Inkubator die Mikroskopkammer auf 30 °C erwärmen, um sicherzustellen, dass die Wachstumsbedingungen für die Zellen während des Wachstumsraten-Assays korrekt sind.
   2. Sanitisieren Sie die Werkbank, Pipetten und andere Werkzeuge mit 70% Ethanol. Holen Sie sich eine Mikroskopplatte und legen Sie sie auf die Bank auf einem fussel- und statisch-freien Wisch.
      HINWEIS: Berühren Sie niemals den Boden der Mikroskopplatte, auch nicht mit Handschuhen, und stellen Sie die Mikroskopplatte immer auf ein fussel- und statisch-freies Wischen, wenn es eine Oberfläche berührt. Dadurch wird verhindert, dass Flecken oder Kratzer Wachstumsmessungen behindern, sobald das Experiment abgebildet wird.
   3. 5 ml 5x Concanavalin Eine Lösung auftauen, mit Wasser auf 1x verdünnen und durch eine Spritze mit einem 0,2-mm-Filter sterilisieren.
   4. Filter sterilisieren alle anderen Flüssigkeiten, die im Test mit einem 0,2 m-Filter verwendet werden, einschließlich experimenteller Medien, um Kristalle oder Schmutz zu entfernen, die in den Lösungen materialisiert wurden. Das Vorhandensein von Kristallen würde die Qualität der Mikroskopiebilder verringern.
   5. Pipetten Sie 200 l Concanavalin Eine Lösung in jeden Brunnen der Mikroskopplatte.
   6. Zentrifugieren Sie die Platte für 2 min bei 411 x Schwerkraft (g) mit einem fussel- und statisch-freien Wisch unter der Platte, um sicherzustellen, dass die Concanavalin-A-Lösung den Boden jedes Brunnens gleichmäßig abdeckt und keine Luftblasen vorhanden sind.
   7. Bedecken Sie die Platte mit ihrem Deckel und lassen Sie sie für 1-2 h sitzen. Die genaue Zeit, in der die Platte sitzt, ist flexibel, aber es ist wichtig, zwischen verschiedenen Durchläufen des Experiments konsistent zu sein.
   8. Entfernen Sie die gesamte Concanavalin-A-Lösung entweder durch Absaugen oder durch gewaltsames Abladen in die Spüle oder eine Aufnahme. Achten Sie darauf, den Glasteil der Platte nicht zu berühren. Es ist akzeptabel, wenn einige Tropfen Concanavalin Eine Lösung in den Brunnen bleiben.
   9. Waschen Sie die Mikroskopplattenbrunnen, indem Sie 400 l steriles Wasser hinzufügen. Entfernen Sie das Wasser wie mit dem Concanavalin A im vorherigen Schritt getan. Lassen Sie die Platte nicht trocken sitzen.
   10. Fügen Sie sofort 185 l experimentelle Wachstumsmedien in die Platte ein. 15 l richtig verdünnte Zellen werden dieser Platte zugesetzt.
2. Hefezellverdünnung
   ANMERKUNG: Die folgenden Schritte beschreiben eine Verdünnung der Hefe aus einer gesättigten Kultur (ca. 10⁸ Zellen/ml) 400-fach, um eine Konzentration von 250.000 Zellen/ml zu erreichen, von denen 15 l in der Glasbodenplatte in 400 l verdünnt werden, was eine endgültige Anzahl von etwa 4000 Zellen pro Brunnen in einer 96-Well-Platte ergibt. Bei Verwendung einer 384-Well-Platte sollte die endgültige Anzahl der Zellen pro Bohrgut etwa 700 betragen und die Verdünnungen sollten entsprechend angepasst werden. Dieses Verhältnis sollte für Zellen angepasst werden, die in der Protokollphase gesammelt werden und in reicheren oder ärmeren Medien vor dem Wachstum oder aus verschiedenen Stämmen wachsen. Die enddichte Dichte der Zellen pro Bohrkörper sollte reduziert werden, wenn der Wachstumsratentest für Zeiträume von mehr als 10 h ausgeführt wird.
   1. Richten Sie zwei 96-Well-Kulturplatten für serielle Verdünnungen ein: Etikettieren Sie als Platte 1 und 2, und fügen Sie jeder seriellen Verdünnungsplatte 90 L experimentelle Wachstumsmedien (d. h. die Medien, in denen die Hefe auf dem Mikroskop wächst) hinzu.
      HINWEIS: Unabhängig davon, welche endgültige Verdünnung verwendet wird, werden mindestens zwei serielle Verdünnungen von Zellen empfohlen, in denen jeweils ein kleines Hefevolumen in ein größeres Volumen experimenteller Medien pipettiert wird und dann eine große Menge experimenteller Medien kräftig mit einer Pipette vermischt wird (wie in den Schritten 3.2.5 und 3.2.6 unten).
   2. Holen Sie die Platte der Zellen aus dem Vorwachstum und zentrifugieren Sie die Platte für 2 min bei 411 x g.
      HINWEIS: Es ist sehr wichtig, verschiedene Brunnen in der Platte nicht zu verunreinigen. Der Zweck dieses Zentrifugationsschritts vor dem Entfernen der Folienabdeckung von Platten besteht darin, sicherzustellen, dass hefegefüllte Tröpfchen aus einem Brunnen nicht von der Folie abfliegen und in anderen Brunnen landen. Achten Sie darauf, die Platten niemals zu kippen oder zu erregen, um zu vermeiden, dass Hefe nach der Zentrifugation mit der Folienabdeckung in Berührung kommt.
   3. Die Folie vorsichtig zurückziehen und Zellen durch kräftiges Pipetieren von Zellen mit einer Pipetten, die auf etwa die Hälfte des Gesamtvolumens in der Platte eingestellt ist, zurückblättern, während die Pipette um den Brunnen bewegt wird, um sie zu mischen. Überprüfen Sie, ob alle Zellen von der Unterseite der Brunnen resuspendiert wurden.
   4. Wenn mehrere Stämme in einzelnen Brunnen verwendet werden, sollten Stämme zu diesem Zeitpunkt in dem für das Experiment erforderlichen Verhältnis gemischt werden. Wenn ein Referenzstamm verwendet wird, um Wachstumsratenmessungen zu generieren, sollte das Verhältnis der Referenz zu Teststamm 1:1 betragen.
   5. Pipetten Sie 10 l Hefe aus Wachstumsmedien in Verdünnungsplatte 1. Fügen Sie jedem Bohrwert 100 L experimentelle Wachstumsmedien zu einem Endvolumen von 200 l pro Bohrgut hinzu. Pipetten Sie kräftig auf und ab.
   6. Pipetten Sie 10 l Hefe von Platte 1 in Platte 2. Fügen Sie jedem Brunnen 100 l experimentelle Wachstumsmedien hinzu und pfeifen Sie kräftig nach oben und unten, um sie zu mischen.
      HINWEIS: Diese Verdünnungsschritte sind entscheidend, um Hefecluster zu trennen, die am Ende der Vorwachstumsphase zusammengeklebt sind, und sicherzustellen, dass ungefähr die gleiche Anzahl von Hefezellen in jedem Brunnen landet. Eine konsistente Anzahl von Hefen in jedem Brunnen hilft, experimentelles Rauschen und Verzerrungen bei Wachstumsratenmessungen zu entfernen (siehe repräsentative Ergebnisse).
3. Sonorisierung
   HINWEIS: Beschallung ist optionalund muss nur für Hefestämme durchgeführt werden, die eine hohe Neigung haben, sich aneinander zu halten (z. B. einige wilde Stämme). Bei Laborstämmen ist eine Beschallung in der Regel nicht erforderlich und kann durch fortfahren sie mit Schritt 3.4 übersprungen werden.
   1. Sanitisieren Sie einen 96-poligen Beschallungskopf mit 70% Ethanol, indem Sie ihn in eine 96-Well-Platte legen, die mit 70% Ethanol gefüllt ist und mit einem fussel- und statisch-freien Wisch trocknen.
   2. Legen Sie ein Beschallungsprogramm fest, das stark genug ist, um flockige Hefezellen zu trennen, aber keine Zellen abtötet oder erhöhte Stressreaktionen verursacht. Einige Tests sind möglicherweise erforderlich, um das beste Beschallungsprogramm für ein bestimmtes Experiment zu identifizieren. Das in diesem Experiment verwendete Beschallungsprogramm ist: Amplitude = 10, Prozesszeit = 10 s, Puls-on = 1 s, Puls-off = 1 s. Dieses genaue Programm ist wahrscheinlich nicht für alle Beschallungsgeräte anwendbar, so dass Tests vor dem Experimenttag vorgeschlagen werden.
   3. Mischen Sie die Hefe in der seriellen Verdünnungsplatte 2 noch einmal, indem Sie fünfmal kräftig nach oben und unten pfeifen.
   4. Legen Sie verdünnungsplatte 2 auf die Plattform und befestige Sie sie mit den Beschallungsstiften in der Zellsuspension, berühren Sie jedoch nicht den Boden der Platte. Führen Sie das Beschallungsprogramm mit entsprechendem Gehörschutz aus.
   5. Nach dem Programmläuft, reinigen Sie den Beschallungskopf mit 70% Ethanol und dann mit Wasser, und gehen Sie dann sofort zur Mikroskopplattenvorbereitung, damit die Zellen nicht wieder flumeln.
4. Platte für Mikroskop vorbereiten:
   1. Pipetten Sie 15 l Hefe von der seriellen Verdünnungsplatte 2 in die Mikroskopplatte bis zu einem Volumen von 200 l. Fügen Sie jedem Bohrgut 200 l experimentelle Wachstumsmedien zu einem Endvolumen von 400 l pro Bohrgut hinzu und geben Sie die Spipet nach oben und unten kräftig an, um sie zu mischen.
   2. Bedecken Sie die Platte mit einer atmungsaktiven Membran. Es ist wichtig, die Platte mit dieser Membran gut zu versiegeln, zum Beispiel mit einer Gummiwalze.
   3. Um die Hefezellen an das Concanavalin A auf der Glasoberfläche zu kleben, zentrieren Sie die Platte mit einem fussel- und statisch-freien Abwischen darunter für 2 min bei 411 x g.
   4. Wischen Sie am Mikroskop die Ober- und Unterseite der Platte mit einem fussel- und statisch-freien Wisch ab und blasen Sie Druckluft auf die Platte, um Schmutz zu beseitigen.
   5. Legen Sie die Platte auf das Mikroskop, um sicherzustellen, dass sie eben ist und dass sich der A1-Brunnen in der linken oberen Ecke befindet.

4. Zeitraffermikroskopische Wachstumsrate Messungen

HINWEIS: Während der Zeitraffermikroskopie werden die folgenden Funktionen computergesteuert: x-, y- und z-Position, Rollläden und Fluoreszenzfilter. Ein hardwarebasiertes Autofokussystem ist optimal, um eine Drift der Brennebene während der Zeitraffer-Bildgebung zu verhindern. Alternativ kann eine softwarebasierte Autofokus-Schleife verwendet werden. Um die Luftfeuchtigkeit in der Mikroskopkammer aufrechtzuerhalten, wird empfohlen, während der gesamten Dauer des Experiments einen Becher mit gereinigtem Wasser in der Kammer zu halten.

1. Erstellen Sie eine Liste der Positionen (x,y) zum Abbild, sodass jeder Mikroskop-Plattenbrunnen vollständig abgebildet ist. Vermeiden Sie überlappende Bilder, sodass keine Zelle mehrmals analysiert wird.
2. Bild im hellen Feld mit diaskopischer Beleuchtung (DIA) bei einer Vergrößerung von 15x. Stellen Sie die Belichtungsposition auf 5 ms fest.
3. Zoomen Sie das Bild digital ein, sodass Zellen deutlich sichtbar sind. Verwenden Sie die Fokussierknöpfe, um den idealen Fokus für das Experiment in den vier Brunnen an der Ecke der Platte und in einem Brunnen in der Mitte der Platte zu identifizieren. Konzentrieren Sie sich so, dass ein maximaler Kontrast der Zellen zu erhalten ist.
4. Legen Sie die z-Position (oder Autofokusposition) für das Experiment als Durchschnitt der für jeden dieser Brunnen identifizierten Z/Autofokus-Positionen fest. Wenn die Mikroskopplatte gut gemacht ist und der Glasboden keine Defekte aufweist, sollten die idealen Fokuspositionen für jeden Brunnen ähnlich sein.
   HINWEIS: Bei der Analyse von Bildern mit der Bildanalyse-Pipeline^11,12ist es hilfreich, dass die Zellen etwas außerhalb des Fokus auf das Mikroskop liegen, so dass sich ein dunkler Rand außerhalb der Zelle und ein helles Inneres befinden, was zu einer genauen Kolonieerkennung und Größenschätzungen beihilft.
5. Wenn Sie fluoreszierende Stämme verwenden, identifizieren Sie die Kanäle und belichtungswerten Belichtungen, mit denen sie abbilden, und stellen Sie sicher, dass keine Pixel überbelichtet sind. Wenn Sie die Belichtungszeit für fluoreszierende Kanäle einstellen, deaktivieren Sie den Modus "Live Capture" am Mikroskop, um zu vermeiden, dass Zellen über einen längeren Zeitraum der Fluoreszenzerregung ausgesetzt werden, da dies sowohl die Zellen photobleichen als auch Stress verursachen kann.
6. Richten Sie die Zeitsequenzerfassung ein, um Bilder im gewünschten Zeitintervall für die gewünschte Zeitzunahme zu erfassen.
7. Führen Sie das Experiment aus.

Representative Results

Die Neuheit dieses Protokolls ist, dass die Wachstumsrate für einzelne Zellen innerhalb einer Population berechnet werden kann, indem ihr Wachstum in Mikrokolonien durch Zeitraffer-Bildgebung verfolgt wird (Abbildung 2A). Da Mikrokolonien aufgrund des Vorhandenseins von Concanavalin A viele Stunden planarer wachsen, können ihre Gebiete während des gesamten Experiments verfolgt werden, und eine lineare Anpassung an die Veränderung des natürlichen Protokolls des Gebiets im Laufe der Zeit kann verwendet werden, um die Wachstumsrate für jede beobachtete einzelne Kolonie zu berechnen ^7,9,10,13. Unterschiede in der Mikrokolonie-Wachstumsrate für einzelne isogene Zellen in der gleichen Umgebung sind deutlich zu verzeichnen (Abbildungen 2A, 2B). Bildanalysesoftware sollte verwendet werden, um Änderungen der Mikrokoloniegröße und Fluoreszenz automatisch nachzuverfolgen (Abbildung 2C); die in Abbildung 2A dargestellte Kolonieverfolgung wurde mit PIE^11,12durchgeführt.

Abbildung 2: Quantifizierung der Wachstumsrate und Fluoreszenz in Hefemikrokolonien. (A) Ein Teil eines einzelnen Bildfelds, das Mikrokolonien zeigt, die zu Beginn des Experiments nach 3 h und nach 6 h wachsen, zeigt die Kolonieverfolgung mit der Pie-Kolonie-Tracking-Software. Kolonien wachsen für die Dauer des Experiments sichtbar in einer Monoschicht. (B) Änderung der ln(Fläche) im Laufe der Zeit für die verfolgten Kolonien in Panel A. Wenn ausreichende Zeitpunktdaten für eine Kolonie vorhanden sind, können ihre Wachstumsrate und die Verzögerungszeit vor dem Wachstum berechnet werden. (C) Bild, das die GFP-Fluoreszenzintensität für die Kolonien in Panel A zeigt, aufgenommen, nachdem der Wachstumsteil des Experiments abgeschlossen ist, wobei die Kolonieumrisse aus dem 6-h-Zeitpunkt überlagert sind. Hier markiert Scw11P::GFP einen Referenzstamm, der in jedem Versuchsbrunnen enthalten ist. Die Berechnung des GFP-Fluoreszenzniveaus jeder Kolonie ermöglicht die Bestimmung, welche Kolonien aus dem Referenzstamm stammen und welche aus den nicht referenzierten Stämmen in jedem Brunnen. Jede Maßstabsleiste ist 50 m. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.

In der Regel können mit diesem Test 10⁵ Mikrokolonie-Wachstumsraten pro Experiment gesammelt werden. Diese Daten können verwendet werden, um sowohl Unterschiede zwischen Stämmen/Wachstumsbedingungen als auch Unterschiede zwischen genetisch identischen Mikrokolonien zu beobachten, die in einem gemeinsamen Zustand angebaut werden. Beispiel 3A zeigt die Verteilung der Wachstumsraten für 12.000 Kolonien aus einer Mutations-Akkumulationslinie (MAH.44)¹⁴ und GFP-markierte Referenzstämme, die in denselben Brunnen wachsen, wobei sowohl Unterschiede zwischen den Stämmen als auch eine hohe Variabilität innerhalb der Dehnung sichtbar sind. In Abbildung 3Bwerden individuelle Wachstumsraten und zusammenfassende Statistiken für 10 Mutations-Akkumulationsstämme, gepaart mit ihren gut GFP-gekennzeichneten Kontrollen, dargestellt; die gesammelten Daten ermöglichen eine genaue Berechnung kleiner durchschnittlicher Wachstumsratenunterschiede.

Abbildung 3. Große Stichprobengrößen einzelner Mikrokolonien-Wachstumsraten ermöglichen eine präzise Quantifizierung der Wachstumsschwankungen innerhalb und zwischen den Stämmen. (A) Die Verteilung der Wachstumsraten von 12.000 US-Amerikanischen Kolonien aus zwei Stämmen. Beachten Sie Unterschiede zwischen den Modi der Verteilungen, sowie der lange Schwanz der langsam wachsenden Kolonien in jedem vorhanden; Letzteres ist nur durch individuelle Mikrokoloniemessungen nachweisbar. (B) Verteilung endes Individuums (schwarze Punkte) und zusammenfassende Statistiken (Boxplots mit medianen sowie unteren und oberen 25% Quantilen) für 120.000 Kolonien aus 11 Stämmen. Wie in (A) wurde jede Sorte in einem einzelnen Brunnen mit einem mit GFP gekennzeichneten Referenzstamm angebaut; Die hier gezeigten Daten stellen 14 experimentelle Brunnen pro MAH-Referenzstammpaar dar. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.

Der Mikrokolonie-Wachstumstest kann auch verwendet werden, um gleichzeitig Wachstum und Genexpression zu messen, indem sowohl Hellfeld- als auch Fluoreszenzkanäle geographiert werden. In dem in Abbildung 2gezeigten Experiment ermöglichte die fluoreszierende Bildgebung der GFP-Expression nach Abschluss der Wachstumsphase des Experiments die Identifizierung von Kolonien, die zu einem GFP-markierten In-Well-Referenzstamm mit schwacher GFP-Expression gehören ( Abbildung2C); Es ist jedoch auch möglich, interkoloniale Unterschiede in den Genexpressionswerten über Zeitpunkte hinweg zu messen (siehe Diskussion).

Eine Reihe von häufigen Fallstricken kann die Erfassung genauer Wachstumsdaten oder die korrekte Analyse dieser Daten verhindern. Ein wichtiger Punkt ist, dass Wachstumsratenmessungen auf der Bildung von unbeweglichen, zweidimensionalen Mikrokolonien aus einzelnen Gründerhefezellen beruhen. Concanavalin A interagiert nichtkovalent mit Polysacchariden auf den Oberflächen von Hefezellen, um Mikrokolonien zu immobilisieren. Die Bindung zwischen Concanavalin A und Hefezellen kann durch Konkurrenz mit Zuckern oder durch niedrigen^{pH-Wert 15}umgekehrt werden. Daher können stark saure Medien oder Medien, die Lektin-bindende Komponenten wie Hefeextrakt (YEPD) oder Phthalat (Edinburgh Minimal Media) enthalten, für diesen Test nicht ohne Änderungen an der Immobilisierungstechnik verwendet werden (Abbildung 4A).

Wenn der Wachstumstest mit Hefestämmen durchgeführt wird, die flockulieren, sollte der optionale Beschallungsschritt verwendet werden, um aggregierte Zellen aufzubrechen, so dass einzelne Zellen zu Beginn des Experiments auf der Mikroskopplatte immobilisiert werden (siehe Abbildung 4B für ein Beispiel für flockende Zellen, die nach der Beschichtung sind, wenn der Beschallungsschritt weggelassen wird). Mikrokolonien, die durch einen Cluster mehrerer Zellen gegründet werden, sollten in der nachgelagerten Analyse ausgeschlossen werden, da Wachstumsratenmessungen nicht mehr aus einer einzelnen Gründerzelle abgeleitet werden und Zellen möglicherweise nicht in zwei Dimensionen wachsen. Mikrokolonien, die durch eine angehende Zelle gegründet werden, sind zulässig. Die Bildung von zweidimensionalen Mikrokolonien wird durch Hefe behindert, die sehr stark flocculat, auch wenn Kolonien durch eine einzelne Zelle gegründet sind, und daher sollte die Fähigkeit eines Hefestamms, in einer einzigen Schicht auf Concanavalin A zu wachsen, getestet werden, bevor ein Wachstumstest durchgeführt wird.

Ein weiterer wichtiger Satz von Überlegungen kommt sowohl während der Planungs- als auch der Analysephase des Experiments, wenn bestimmt wird, wie viele Zeitpunkte in die Analyse einzugebunden werden sollen. Erstens ist es wichtig, Daten für genügend Zeitpunkte über einen ausreichenden Zeitraum einzuschließen, um das Wachstum genau zu verfolgen: Es wird empfohlen, dass Assays so ausgeführt werden, dass Hefe Zeit hat, um 5 Verdoppelungen zu durchlaufen, wobei in diesem Zeitraum mindestens 10 Zeitpunkte gesammelt werden. Allerdings führt die einfache Einbeziehung jedes gesammelten Zeitpunkts in die Berechnung der Wachstumsrate zu einer Verzerrung, die die Wachstumsrate für viele Kolonien künstlich senkt. Diese Verzerrung kann auftreten, wenn Zellen eine Verzögerungsphase durchlaufen, bevor sie mit dem Wachstum beginnen (Abbildung 4C). Vordem-Wachstum Lag von Mikrokolonien ist häufig und variiert zwischen experimentellen Bedingungen und Stämme^9,13. Experimentelle Analysemethoden müssen in der Lage sein, Zeitpunkte im "aktiven Wachstum" von der Verzögerung vor dem Wachstum zu unterscheiden; Ein Ansatz besteht darin, eine voreingestellte Anzahl von Zeitpunkten in einem Fenster zu verwenden und das Fenster zu finden, das der höchsten Wachstumsrate entspricht (Abbildung 4C, durchgezogene Linie)^11,13.

Schließlich ist einer der kritischsten Schritte des Mikrokolonie-Wachstums-Assays der Hefe-Zell-Verdünnungsschritt. Die Konzentration der Zellen und das Verhältnis verschiedener Genotypen in Mikroskopplattenbrunnen müssen sorgfältig kontrolliert werden. Für die statistische Analyse ist es wichtig, dass die Experimente so ausbalanciert werden, dass für jeden Genotyp und Zustand ungefähr die gleiche Anzahl von Zellen getestet und¹⁶verglichen werden. Darüber hinaus können nützliche Wachstumsraten in der Regel nicht nach der Fusion benachbarter Kolonien gemessen werden, da die Wachstumsraten der einzelnen Kolonien nicht mehr erkennbar sind; Daher liefern dichter beschichtete Zellen Wachstumsdaten aus weniger Zeitpunkten (Abbildung 4D). Wichtig ist, dass, wenn die Zelldichte zu Beginn eines Experiments hoch oder ungleichmäßig ist, das Herausfiltern zusammengeführter Mikrokolonien schneller wachsende Mikrokolonien überproportional von nachgelagerten Analysen ausschließt, da schnelle Züchter häufiger fusionieren als langsame Züchter. Daher werden die endgültigen Wachstumsmessungen auf langsamer wachsende Teilpopulationen ausgerichtet sein. Darüber hinaus können verschiedene Kolonien für verschiedene Behandlungen herausgefiltert werden, was ein ausgewogenes Experiment ausschließt. Es wird empfohlen, etwa 4000 Zellen pro Brunnen in einer 96-Well-Platte (oder 700 Zellen pro Brunnen in einer 384-Well-Platte) zu versieben. Eine gründliche Pipetmischung im Hefe-Verdünnungsteil des Protokolls ist unerlässlich, um sicherzustellen, dass die richtige Anzahl von Zellen in jedem Brunnen vorhanden ist und dass die Zellen gleichmäßig im Brunnen verteilt sind. Es ist auch ratsam, alle Mikrokolonien aus der Analyse zu entfernen, deren Zentren innerhalb von 25 Zelldurchmessern voneinander liegen.

Abbildung 4. Experimentelle Fallstricke. (A) Kolonien, die in YEPD-Medien wachsen, was eine effiziente Bindung von Zellen an Concanavalin A verhindert. Das Auftreten neuer Zellen weit entfernt von jeder Kolonie (Pfeilspitzen), sowie das Auftreten vieler nicht fokussierter Zellen am Rand der Kolonie, sind das Ergebnis von Zellen, die nicht an der Glasoberfläche haften und während des Wachstums von der Kolonie wegdriften. (B) Zellen einer flockigen Dehnung direkt nach der Beschichtung ohne Beschallung; beachten Sie das Vorhandensein einer großen Anzahl von Clustern mehrerer Zellen (Pfeilspitzen) und Zellen innerhalb der Cluster in verschiedenen Fokusebenen. (C) Veränderung der ln(Fläche) im Laufe der Zeit für eine Kolonie mit einer langen Verzögerungsphase. Beachten Sie, dass, wenn alle Zeitpunkte für die Schätzung der Wachstumsrate verwendet werden, die geschätzte Wachstumsrate erheblich gedrückt wird; Eine genaue Messung wird nur erstellt, wenn die Teilmenge von n Zeitpunkten (hier n=6) verwendet wird, die zu der höchsten Wachstumsrate n führt. (D) Zellen, die zu Beginn des Experiments und nach 7 h Wachstum zu dicht plattiert waren. Farben verfolgen einzelne Kolonien, bis sie mit Nachbarn verschmelzen; hier, durch die 7-h-Marke, haben sich die meisten Kolonien verschmolzen, wobei nur noch eine kleine Anzahl von einzelnen langsam wachsenden Kolonien übrig geblieben ist. (Tracking für eine kleine Teilmenge der hier gezeigten Kolonien geht aus Gründen verloren, die nichts mit der Zusammenlegung von Kolonien zu tun haben.) Jede Maßstabsleiste ist 50 m. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.

Discussion

Das hier beschriebene Protokoll ist ein vielseitiger Test, der es ermöglicht, Zellwachstum und Genexpression gleichzeitig auf der Ebene einzelner Mikrokolonien zu überwachen. Die Kombination dieser beiden Modalitäten ergibt einzigartige biologische Erkenntnisse. Zum Beispiel haben frühere Arbeiten diesen Test verwendet, um eine negative Korrelation zwischen der Expression des TSL1-Gens und der Mikrokolonie-Wachstumsrate in isogenen Wildtypzellen zu zeigen, indem beide gleichzeitig^7,10gemessen wurden. Es ist auch möglich, die Beziehung zwischen Wachstumsrate und subzellulärer Lokalisierungsdynamik von fluoreszierend markierten Proteinen mit dem beschriebenen Test zu überwachen. Beispielsweise wurde ein negativer Zusammenhang zwischen der Wachstumsrate und der nuklearen Belegung des Mit dem RFP-markierten Transkriptionsfaktors Msn2 durch Bildgebung der Fluoreszenz in Zellen jede Minute für 30 min identifiziert, bevor der Wachstumstest¹⁰initialisiert wurde. Schließlich ermöglicht dieses Protokoll die Überwachung von Zellreaktionen auf Umweltbelastungen und Störungen. Behandlungen wie Hitzeschock können teilweise durch den Wachstumstest verabreicht werden. Solche Studien haben zum Beispiel gezeigt, dass langsam wachsende Zellen, die hohe Tsl1-Werte exdrücken, toleranter gegenüber Hitzeschock ^7,10sind.

Zusätzlich zu den im Abschnitt Repräsentativen Ergebnissen (Abb. 4) beschriebenen häufigen Fallstricken sind bei der Konzeption eines Wachstumstestexperiments mehrere Schlüsselfaktoren zu berücksichtigen. Die phänotypische Variation, die mit dem Test gemessen wird, wird von mehreren Faktoren beeinflusst, von denen einige wiederholbar sind und von inhärentem Interesse sind, wie Genotyp oder Umgebung, während andere das Ergebnis der technischen Variation¹³sind. Daher ist die erste wichtige Überlegung bei der Gestaltung eines Mikrokolonie-Assays, das Experiment so durchzuführen, dass die Auswirkungen von Interesse von den Auswirkungen der technischen Variation getrennt werden können; Der Schlüssel zu dieser Trennung sind randomisierende Behandlungen oder Belastungen auf experimentellen Platten und die Einbeziehung von Kontrollen in jedes Experiment. Geeignete statistische Methoden, wie z. B. lineare gemischte Modellierung (LMM), müssen auf Daten angewendet werden, nachdem sie erhoben wurden, um verschiedene Variationsquellen in der nachgelagerten Analyse^17,18zu berücksichtigen.

Um statistische Methoden zu verwenden, um Variationen von Wachstumsphänotypen aufgrund experimenteller Variablen von Interesse aufgrund von Zufallsfaktoren wie Batch-Effekten zu trennen, ist es notwendig, mehrere Experimente an verschiedenen Tagen und mit randomisierten Brunnenpositionen des Genotyps und der Wachstumsbedingungen durchzuführen. Um die Kraft des Experiments zu erhöhen, Um Wachstumsunterschiede zwischen Stämmen oder Behandlungsbedingungen zu erkennen, ist es auch wichtig, mehrere Repliken jedes getesteten Genotyps oder Wachstumszustandes auf einer einzigen Versuchsplatte aufzunehmen, wo dies möglich ist.

Ein wesentlicher Vorteil des Mikrokolonie-Wachstums-Assays liegt in der Menge an Daten, die er sammeln kann: Eine einzelne Versuchsplatte erzeugt in der Regel Daten für 10⁵ einzelne Mikrokolonien, was mehrere Größenordnungen größer ist als typische Experimente mit mikrofluidischen Geräten anstelle von Multiwell-Platten. Software, die Kolonien automatisch verfolgt und relevante Daten berechnet (z. B. Verzögerungszeiten, Wachstumsraten und mittlere fluoreszierende Intensitäten), ist der Schlüssel, um diesen Test voll auszuschöpfen. Diese Software sollte nicht nur koloniegrenzen und Kolonien im Laufe der Zeit robust identifizieren, sondern auch das Wachstum in Kolonien mit einer Verzögerungsphase¹³richtig messen. Eine für diesen Zweck entwickelte Option ist PIE, Open-Source-Software, die Kolonien im Laufe der Zeit verfolgt (einschließlich der Berücksichtigung von Verschiebungen in der Kolonieposition), Wachstumsraten berechnet und die Integration fluoreszierender Bildgebungsdaten in experimentelle Messungen^11,12ermöglicht.

Der Mikrokolonie-Wachstumstest kann verwendet werden, um Einblicke in grundlegende Fragen im Zusammenhang mit Hefe-Fitness und Evolution zu gewinnen, einschließlich der Variabilität des Wachstumsphäpustyps, Veränderungen in verschiedenen Umgebungen oder als Reaktion auf Stress und die Beziehung zwischen Wachstum und Proteinexpression oder subzellulärer Lokalisierung. Der Assay wurde ausgiebig in Studien von Labor- und Wildstämmen von S. cerevisiae^7,9,10,13verwendet.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
General Materials
500 mL Bottletop Filter .22 µm PES Sterilizing, Low Protein Binding, w/45mm Neck	Fisher	CLS431154	used to filter the media
BD Falcon*Tissue Culture Plates, microtest u-bottom	Fisher	08-772-54	96-well culture tubes used to freeze cells, pre-grow cells, and dilutions
BD Syringes without Needle, 50 mL	Fisher	13-689-8	Used to filter the Concanavalin A
Costar Sterile Disposable Reagent Reservoirs	Fisher	07-200-127	reagent reservoirs used to pipette solutions with multichannel pipette
Costar Thermowell Aluminum Sealing Tape	Fisher	07-200-684	96-well plate seal for pre-growth and freezing
lint and static free Kimwipes	Fisher	06-666A	lint and static free wipes to keep microscope plate bottom free of debris and scratches
Nalgene Syringe Filters	ThermoFisher Scientific	199-2020	0.2 μm pore size, 25 mm diameter; used to filter concanavalin A solution
Media Components
Minimal chemically defined media (MD; 2% glucose)			alternative microscopy media used for yeast pre-growth and growth during microscopy
Synthetic Complete Media (SC; 2% glucose)			microscopy media used for yeast pre-growth and growth during microscopy
Yeast extract-peptone-dextrose (YEPD; 2% glucose) medium			cell growth prior to freezing down randomized plates
Microscopy Materials
Breathe-Easy sealing membrane	Millipore Sigma	Z380059-1PAK	breathable membranes used to seal plate during microscopy experiment. At this stage breathable membranes are recommended because they prevent condensation in the wells and allow for better microscopy images
Brooks 96-well flat clear glass bottom microscope plate	Dot Scientific	MGB096-1-2-LG-L	microscope plate
Concanavalin A from canavalia ensiformis (Jack Bean), lyophilized powder	Millipore Sigma	45-C2010-1G	Make 5x concanavalin A solution and freeze 5ml of 5x concanavalin A in 50 mL conical tubes at -80 °C
Strains Used
MAH.5, MAH.96, MAH.52, MAH.66, MAH.11, MAH.58, MAH.135, MAH.15, MAH.44, MAH.132			Haploid mutation accumulation strains in a laboratory background, described in Hall and Joseph 2010
EP026.2A-2C			Progeny of the ancestral Hall and Joseph 2010 mutation accumulation strain, transformed with YFR054cΔ::Scw11P::GFP
Equipment
Misonix Sonicator S-4000 with 96-pin attachment			Sonicator https://www.labx.com/item/misonix-inc-s-4000-sonicator/4771281
Nikon Eclipse Ti-E with Perfect Focus System			Inverted microscope with automated stage and autofocus system