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Biology

Imagerie en direct à haut débit des microcolonies pour mesurer l’hétérogénéité de la croissance et de l’expression des gènes

Published: April 18, 2021 doi: 10.3791/62038
Automatic Translation
1, 1, 1, 1
1Center for Genomics and Systems Biology, Department of Biology, New York University

Summary

Les phénotypes de croissance de levure sont précisément mesurés par l’imagerie time-lapse très parallèle des cellules immobilisées se développent dans les microcolonies. Simultanément, la tolérance au stress, l’expression des protéines et la localisation des protéines peuvent être surveillées, générant des ensembles de données intégrés pour étudier comment les différences environnementales et génétiques, ainsi que l’hétérogénéité de l’expression génique entre les cellules isogéniques, modulent la croissance.

Abstract

Des mesures précises de l’hétérogénéité entre les souches et à l’intérieur de la souche dans les taux de croissance microbienne sont essentielles pour comprendre les apports génétiques et environnementaux dans la tolérance au stress, la pathogénie et d’autres composantes clés de la condition physique. Ce manuscrit décrit un test au microscope qui suit environ 105microcoloniesSaccharomyces cerevisiae par expérience. Après l’imagerie automatisée en accéléré de levure immobilisée dans une plaque multiwell, les taux de croissance de la microcolonie sont facilement analysés à l’aide d’un logiciel d’analyse d’image personnalisé. Pour chaque microcolonie, l’expression et la localisation des protéines fluorescentes et la survie du stress aigu peuvent également être surveillées. Cet essai permet une estimation précise des taux de croissance moyens des souches, ainsi qu’une mesure complète de l’hétérogénéité de la croissance, de l’expression des gènes et de la tolérance au stress au sein des populations clonales. 

Introduction

Les phénotypes de croissance contribuent de façon critique à la condition physique de levure. La sélection naturelle peut faire une distinction efficace entre les lignées dont les taux de croissance diffèrent par l’inverse de la taille effective de la population, qui peut dépasser 108 individus1. En outre, la variabilité des taux de croissance entre les individus au sein d’une population est un paramètre d’évolution pertinent, car il peut servir de base à des stratégies de survie telles que lacouverture des paris 2,3,4,5,6. Par conséquent, les analyses qui permettent des mesures très précises des phénotypes de croissance et de leurs distributions sont essentielles pour l’étude des micro-organismes. L’analyse de croissance de la microcolonie décrite ici peut générer des mesures individuelles du taux de croissance pour ~105 microcolonies par expérience. Cet essai fournit donc un protocole puissant pour étudier la génétique évolutive de levure et la génomique. Il se prête particulièrement bien à tester comment la variabilité au sein des populations de cellules individuelles génétiquement identiques est générée, maintenue et contribue à la condition physique de la population7,8,9,10.

La méthode décrite ici (figure 1) utilise périodiquement capturées, images de faible grossissement brightfield des cellules qui poussent dans les médias liquides sur une plaque de fond de verre de 96 ou 384 puits pour suivre la croissance en microcolonies. Les cellules adhèrent à la concanavalin A de lectine, qui recouvre le fond de la plaque de microscope, et forment des colonies bidimensionnelles. Puisque les microcolonies se développent dans un monocouche, la zone de microcolonie est fortement corrélée avec le numéro de cellule7. Par conséquent, des estimations précises du taux de croissance de la microcolonie et du temps de décalage peuvent être générées avec un logiciel personnalisé d’analyse d’image qui suit le taux de changement de la zone de chaque microcolonie. En outre, la configuration expérimentale peut surveiller les abondances et même les localisations subcellulaires des protéines étiquetées fluorescentes exprimées dans ces microcolonies. Le traitement en aval des données de cet essai de croissance de microcolonie peut être réalisé par analyse personnalisée ou par des logiciels existants d’analyse d’image, tels que Processing Images Easily (PIE)11, un algorithme pour la reconnaissance robuste de la zone de colonie et l’analyse de croissance à haut débit à partir de faible grossissement, images brightfield, qui est disponible via GitHub12.

Étant donné que les estimations du taux de croissance dérivées de l’analyse de microcolonie-croissance sont générées à partir d’un grand nombre de mesures d’une seule colonie, elles sont extrêmement précises, avec des erreurs standard plusieurs ordres de grandeur plus petits que les estimations elles-mêmes pour une expérience de taille raisonnable. Par conséquent, la puissance de l’analyse pour détecter les différences de taux de croissance entre les différents génotypes, traitements ou conditions environnementales est élevée. Le format multiwell-plaque permet de comparer de nombreuses combinaisons d’environnement et de génotypes différentes en une seule expérience. Si les souches expriment constitutivement différents marqueurs fluorescents, elles peuvent être mélangées dans le même puits et distinguées par une analyse d’image ultérieure, ce qui pourrait augmenter encore la puissance en permettant une normalisation des données bien par puits.

Figure 1
Figure 1: Représentation schématique du protocole. Ce protocole suit deux étapes principales, qui sont la préparation de la plaque expérimentale et la préparation des cellules à l’image. La randomisation des plaques et la croissance des cellules doivent être effectuées avant et jusqu’au jour de l’expérience. Le mélange répété des cellules à chaque étape pendant la dilution est impératif dans les étapes jusqu’au placage, et donc la préparation de la plaque expérimentale d’abord est recommandée afin qu’elle soit prête pour le placage immédiatement après l’achèvement de la dilution cellulaire. S’il vous plaît cliquez ici pour voir une version plus grande de ce chiffre.

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Protocol

1. Préparation de plaques randomisées (avant le jour de l’expérience)

  1. Planifiez les souches et les conditions à tester avec l’analyse de croissance. À ce stade, assigner au hasard des souches et des conditions à n’importe quel puits.
    REMARQUE : Lors de l’examen de la configuration de la plaque, il est conseillé d’inclure plus d’une réplique par souche et état de croissance sur une seule plaque pour tenir compte du bruit bien apparenté dans les mesures. Voir Discussion pour plus de détails.
  2. Calculez aléatoirement l’emplacement de chaque souche et l’état de l’environnement pour les répliques de plaques qui seront exécutés à des jours différents.
  3. Cultiver toutes les cellules qui seront utilisées dans l’expérience à saturation dans la levure extrait-peptone-dextrose (YEPD; 2% de glucose) milieu dans un shaker à 30 °C (ou toute autre température appropriée).
  4. Créez les plaques de stock randomisées manuellement ou avec un robot de manipulation liquide. Ajouter 10 μL des cellules saturées désignées à chaque puits d’une plaque stérile de culture tissulaire à fond U. Si plusieurs souches seront testées dans un seul puits, ne les combinez pas à ce stade; cette combinaison se fera juste avant les dilutions cellulaires le jour de l’expérience pour s’assurer que toutes les souches sont aux concentrations correctes lorsqu’elles sont plaquées cellules fondatrices de microcolonie.
  5. Ajouter 10 μL de 30% de glycérol à chaque puits de chaque assiette. Pipet de haut en bas de sorte que les cellules et le glycérol deviennent bien mélangés.
  6. Sceller chaque plaque avec un couvercle de papier d’aluminium et congeler immédiatement à -70 °C jusqu’à ce qu’elle soit prête à l’emploi.
    REMARQUE : Il est important de créer toutes les plaques randomisées le même jour et de les congeler, de sorte que les conditions de pré-croissance des cellules de chaque plaque auront été identiques et ne généreront pas de variation technique dans l’analyse du taux de croissance.

2. Pré-croissance de la levure

REMARQUE : En règle générale, cela commence avant le jour de l’expérience et dépend fortement de la question expérimentale. Voir Discussion pour plus de détails.

  1. Retirer une plaque de bouillon (levure de 10 μL, 10 μL de glycérol par puits) du congélateur de -70 °C et ajouter 180 μL du média à utiliser pour l’expérience. Si l’expérience sera menée à l’aide de supports limitant les nutriments, ne pas pré-cultiver la levure à saturation dans le média limitant les nutriments que la sporulation de la levure peut se produire. Au lieu de cela, pré-croissance dans les médias non limitatifs.
  2. Faire pousser la levure en secouant à 30 °C. Examinez s’il faut faire fonctionner l’essai en commençant par les cellules en phase de journal ou en phase stationnaire pour déterminer si la dilution des cellules plusieurs fois avant l’expérience sera nécessaire. Si l’on s’attend à ce que les souches ou les conditions de levure dans l’essai aient des taux de croissance sensiblement différents, alors une période de pré-croissance de deux jours sera nécessaire pour que toutes les différentes conditions atteignent la phase stationnaire.

3. Configuration du microscope

  1. Préparation de plaque de microscope
    1. Assurez-vous que l’incubateur de microscope est en place et chauffez la chambre de microscope à la température de croissance désirée pour les conditions expérimentales. Pour les expériences standard utilisant les cellules de Saccharomyces cerevisiae, l’incubateur doit chauffer la chambre de microscope à 30 °C pour s’assurer que les conditions de croissance des cellules seront correctes pendant l’analyse du taux de croissance.
    2. Assainir l’établi, les pipettes et autres outils avec 70 % d’éthanol. Récupérez une plaque de microscope et placez-la sur le banc au-dessus d’un lingette sans peluche et statique.
      REMARQUE : Ne touchez jamais le fond de la plaque de microscope, même avec des gants, et placez toujours la plaque de microscope sur le dessus d’un lingette sans peluche et statique chaque fois qu’elle touche n’importe quelle surface. Cela empêche les bavures ou les rayures d’empêcher les mesures du taux de croissance une fois que l’expérience est imitée.
    3. Décongeler 5 mL de solution 5x concanavalin A, diluer à 1x avec de l’eau, et filtrer stériliser à travers une seringue équipée d’un filtre de 0,2-μm.
    4. Filtre stériliser tous les autres liquides qui seront utilisés dans l’analyse avec un filtre de 0,2 μm, y compris les médias expérimentaux, pour enlever les cristaux ou les débris qui peuvent avoir matérialisé dans les solutions. La présence de cristaux réduirait la qualité des images de microscopie.
    5. Pipet 200 μL de concanavalin Une solution dans chaque puits de la plaque de microscope.
    6. Centrifugeuse de la plaque pendant 2 min à 411 x gravité (g) avec un lingette sans peluche et statique sous la plaque, pour s’assurer que la solution concanavalin A couvre uniformément le fond de chaque puits et qu’il n’y a pas de bulles d’air.
    7. Couvrir la plaque avec son couvercle et laisser reposer pendant 1-2 h. L’heure précise à l’emplacement de la plaque est flexible, mais il est important d’être cohérent entre les différentes séries de l’expérience.
    8. Retirez toutes les concanavalin Une solution de la plaque soit par aspiration, soit en la déchargeant de force dans l’évier ou dans un réceptacle. Veillez à ne pas toucher la partie vitrée de la plaque. Il est acceptable que certaines gouttes de concanavalin une solution restent dans les puits.
    9. Lavez les puits de plaque de microscope en ajoutant 400 μL d’eau stérile. Retirez l’eau comme cela a été fait avec la concanavalin A dans l’étape précédente. Ne laissez pas la plaque reposer au sec.
    10. Ajouter immédiatement 185 μL de supports de croissance expérimentale dans la plaque. 15 μL de cellules correctement diluées seront ajoutés à cette plaque.
  2. Dilution des cellules de levure
    REMARQUE : Les étapes ci-dessous décrivent une dilution de levure provenant d’une culture saturée(environ 10 8 cellules/mL) 400 fois pour atteindre une concentration de 250 000 cellules/mL, dont 15 μL seront diluées en 400 μL dans la plaque de fond de verre, donnant un nombre final d’environ 4 000 cellules par puits dans une plaque de 96 puits. Si vous utilisez une plaque de 384 puits, le nombre final de cellules par puits devrait être d’environ 700 et les dilutions devraient être ajustées en conséquence. Ce ratio doit être ajusté pour les cellules collectées en phase de notation, en croissance dans des supports de pré-croissance plus riches ou plus pauvres, ou à partir de différentes souches. La densité finale des cellules par puits doit être réduite lors de l’exécution du taux de croissance d’essai pour les périodes de temps de plus de 10 h.
    1. Mettre en place deux plaques de culture de 96 puits pour les dilutions en série : étiqueter comme plaque 1 et 2, et ajouter 90 μL de supports de croissance expérimentaux (c.-à-d. les supports dans qui la levure poussera au microscope) à chaque plaque de dilution en série.
      REMARQUE : Quelle que soit la dilution finale utilisée, au moins deux dilutions périodiques des cellules sont recommandées, dans chacune d’elles un petit volume de levure est canalisé dans un plus grand volume de médias expérimentaux, puis un grand volume de médias expérimentaux est mélangé vigoureusement avec un pipet (comme dans les étapes 3.2.5 et 3.2.6 ci-dessous).
    2. Récupérer la plaque des cellules de la pré-croissance et centrifugeuse de la plaque pendant 2 min à 411 x g.
      REMARQUE : Il est très important de ne pas contaminer différents puits dans la plaque. Le but de cette étape de centrifugation avant d’enlever le revêtement de papier d’aluminium des plaques est de s’assurer que les gouttelettes remplies de levure d’un puits ne s’envolent pas du papier d’aluminium et finissent dans d’autres puits. Veillez à ne jamais incliner ou agiter les plaques pour éviter que la levure entre en contact avec le revêtement de papier d’aluminium après centrifugation.
    3. Peler délicatement le papier d’aluminium et resuspendre les cellules en pipetant vigoureusement les cellules à l’aide d’une pipette réglée à environ la moitié du volume total de la plaque tout en déplaçant le pipet autour du puits pour mélanger. Vérifiez que toutes les cellules ont été réutilisées à partir du fond des puits.
    4. Si plusieurs souches dans les puits individuels seront utilisées, les souches devraient être mélangées à ce moment-là au rapport nécessaire à l’expérience. Si une souche de référence sera utilisée pour générer des mesures du taux de croissance, le rapport de référence à la souche d’essai doit être de 1:1.
    5. Pipet 10 μL de levure du média de croissance dans la plaque de dilution 1. Ajouter 100 μL de supports de croissance expérimentaux à chaque puits à un volume final de 200 μL par puits. Pipet de haut en bas vigoureusement.
    6. Pipet 10 μL de levure de la plaque 1 dans la plaque 2. Ajouter 100 μL de supports de croissance expérimentaux à chaque puits, et pipet de haut en bas vigoureusement à mélanger.
      REMARQUE : Ces étapes de dilution sont essentielles pour aider à séparer les grappes de levure qui sont collées ensemble à la fin du stade de pré-croissance et pour s’assurer qu’un nombre à peu près égal de cellules de levure se retrouvent dans chaque puits. Le fait d’avoir un nombre constant de levures dans chaque puits aide à éliminer le bruit expérimental et les biais dans les mesures du taux de croissance (voir Résultats représentatifs).
  3. Sonication
    REMARQUE : La sonication est facultativeet ne doit être effectuée que pour les souches de levure qui ont une forte propension à adhérer les unes aux autres (p. ex., certaines souches sauvages). Pour les souches de laboratoire, la sonication n’est généralement pas nécessaire et peut être ignorée en procédant à l’étape 3.4.
    1. Assainir une tête de sonicateur de 96 broches avec 70% d’éthanol en le plaçant dans une plaque de 96 puits remplie à 70% d’éthanol et sèche avec un lingette sans peluche et statique.
    2. Définissez un programme de sonication suffisamment solide pour briser les cellules de levure flocculated, mais ne tue pas les cellules ou ne provoque pas de réponses élevées au stress. Certains tests peuvent être nécessaires pour identifier le meilleur programme de sonication pour une expérience donnée. Le programme de sonication utilisé dans cette expérience est: amplitude = 10, temps de traitement = 10 s, pulse-on = 1 s, pulse-off = 1 s. Ce programme exact n’est probablement pas applicable à tous les sonicateurs, de sorte que les tests sont suggérés avant le jour de l’expérience.
    3. Mélanger la levure dans la plaque de dilution en série 2 une fois de plus en pipetting de haut en bas vigoureusement cinq fois.
    4. Placez la plaque de dilution 2 sur la plate-forme et fixez-la avec les broches du sonicateur dans la suspension cellulaire, mais ne touchez pas le fond de la plaque. Exécutez le programme de sonication à l’aide d’une protection adéquate de l’oreille.
    5. Après le programme fonctionne, nettoyer la tête du sonicateur avec 70% d’éthanol, puis avec de l’eau, puis procéder immédiatement à la préparation des plaques de microscope afin que les cellules ne flocculate à nouveau.
  4. Préparer la plaque pour microscope:
    1. Pipet 15 μL de levure de la plaque de dilution en série 2 dans la plaque de microscope à un volume de 200 μL. Ajouter 200 μL de supports de croissance expérimentale à chaque puits à un volume final de 400 μL par puits, et pipet de haut en bas vigoureusement pour mélanger.
    2. Couvrir la plaque d’une membrane respirante. Il est important de bien sceller la plaque avec cette membrane, par exemple à l’aide d’un rouleau de caoutchouc.
    3. Pour adhérer les cellules de levure à la concanavalin A sur la surface de verre, centrifugez la plaque avec un lint- et statique-libre essuyer en dessous pendant 2 min à 411 x g.
    4. Au microscope, essuyez le haut et le bas de la plaque à l’aide d’un lingette sans peluche et statique, et soufflez l’air comprimé sur la plaque pour vous débarrasser des débris.
    5. Placez la plaque sur le microscope, en vous assurant qu’elle est de niveau et que le puits A1 se trouve dans le coin supérieur gauche.

4. Mesures du taux de croissance de la microscopie en accéléré

REMARQUE : Pendant la microscopie en accéléré, les caractéristiques suivantes sont contrôlées par ordinateur : position x, y et z, volets et filtres de fluorescence. Un système de mise au point automatique basé sur le matériel est optimal pour prévenir la dérive des avions focaux pendant l’imagerie en accéléré. Alternativement, une boucle de mise au point automatique basée sur un logiciel peut être utilisée. Pour maintenir l’humidité dans la chambre de microscope, il est conseillé de garder un bécher avec de l’eau purifiée dans la chambre pendant toute la durée de l’expérience.

  1. Créez une liste de positions (x,y) à l’image, de sorte que chaque puits microscope-plaque est entièrement image. Évitez les images qui se chevauchent afin qu’aucune cellule ne soit analysée plusieurs fois.
  2. Image dans le champ lumineux avec l’illumination diascopique (DIA) à un grossissement de 15x. Réglez l’exposition à ~5 ms.
  3. Zoomez sur l’image numériquement afin que les cellules soient clairement visibles. Utilisez les boutons de mise au point pour identifier la mise au point idéale pour l’expérience dans les quatre puits sur le coin de la plaque et dans un puits au centre de la plaque. Concentrez-vous de manière à obtenir un contraste maximal des cellules.
  4. Définissez la position z (ou position d’autofocus) pour que l’expérience soit une moyenne des positions z/autofocus identifiées pour chacun de ces puits. Si la plaque de microscope est bien faite et que le fond en verre n’a pas de défauts, les positions de mise au point idéales devraient être similaires pour chaque puits.
    REMARQUE: Lors de l’analyse des images avec le traitement des images facilement (PIE) pipeline d’analyse d’image11,12, il est utile pour les cellules d’être légèrement hors de discussion sur le microscope de sorte qu’il ya une jante sombre à l’extérieur de la cellule et un intérieur de couleur claire, ce qui aide à la reconnaissance précise des colonies et des estimations de taille.
  5. Si vous utilisez des souches fluorescentes, identifiez les canaux et les expositions à l’image, en vous assurant qu’aucun pixel n’est surexposé. Lors de la fixation du temps d’exposition pour les canaux fluorescents, éteignez le mode « capture en direct » sur le microscope pour éviter d’exposer les cellules à l’excitation de fluorescence pendant de longues périodes de temps, car cela peut à la fois photobleach les cellules et causer du stress.
  6. Configurer l’acquisition de la séquence de temps pour capturer des images à l’intervalle de temps désiré pour la durée désirée.
  7. Exécutez l’expérience.

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Representative Results

La nouveauté de ce protocole est que le taux de croissance peut être calculé pour les cellules individuelles au sein d’une population en suivant leur croissance en microcolonies par imagerie en accéléré (figure 2A). Étant donné que les microcolonies poussent pendant de nombreuses heures de façon planaire en raison de la présence de concanavalin A, leurs zones peuvent être suivies tout au long de l’expérience, et un ajustement linéaire au changement dans le journal naturel de la région au fil du temps peut être utilisé pour calculer le taux de croissance pour chaque colonie observée 7,9,10,13. Les différences dans le taux de croissance de la microcolonie pour les cellules isogéniques individuelles dans le même environnement sont clairement enregistrées(figures 2A, 2B). Les logiciels d’analyse d’images devraient être utilisés pour suivre automatiquement les changements dans la taille et la fluorescence de la microcolonie (figure 2C); le suivi des colonies indiqué à la figure 2A a été effectué à l’aide de PIE11,12.

Figure 2
Figure 2 :Quantification du taux de croissance et fluorescence des microcolonies de levure. (A) Une partie d’un seul champ d’imagerie montrant des microcolonies en croissance au début de l’expérience, après 3 h, et après 6 h, montrant le suivi des colonies à l’aide du logiciel de suivi de la colonie PIE. Les colonies poussent visiblement dans un monocouche pendant toute la durée de l’expérience. (B) Changement dans ln(zone) au fil du temps pour les colonies suivies dans le panneau A. S’il existe suffisamment de données sur le point de temps pour une colonie, son taux de croissance et son délai de pré-croissance peuvent être calculés. (C) Image montrant l’intensité de fluorescence du GFP pour les colonies du panneau A, prise après la fin de la partie de croissance de l’expérience, avec les contours de la colonie à partir du point de temps de 6 h superposé. Ici, Scw11P::GFP marque une souche de référence incluse dans chaque puits expérimental. Le calcul du niveau de fluorescence GFP de chaque colonie permet de déterminer quelles colonies proviennent de la souche de référence et qui proviennent des souches non référencées de chaque puits. Chaque barre d’échelle est de 50 μm. Veuillez cliquer ici pour voir une version plus grande de ce chiffre.

En règle générale, ~105 taux de croissance de microcolonie par expérience peuvent être collectés à l’aide de cet essai. Ces données peuvent être utilisées pour observer à la fois les différences entre les souches et les conditions de croissance, et la variation entre les microcolonies génétiquement identiques cultivées dans un état commun. Par exemple, la figure 3A montre les distributions des taux de croissance d’environ 12 000 colonies à partir d’une lignée mutation-accumulation (MAH.44)14 et d’une souche de référence marquée GFP cultivées dans les mêmes puits, les deux différences entre les souches et une grande variabilité interne de la souche visible. À la figure 3B, les taux de croissance individuels et les statistiques sommaires de 10 souches d’accumulation de mutation, jumelées à leurs témoins bien marqués GFP, sont affichés; les données recueillies permettent de calcul précis des faibles écarts moyens de taux de croissance.

Figure 3
Figure 3. De grandes tailles d’échantillons de taux de croissance individuels de la microcolonie permettent une quantification précise de la variation de croissance entre les souches et entre les souches. (A) Les distributions des taux de croissance d’environ 12 000 colonies à partir de deux souches. Notez les différences entre les modes de distribution, ainsi que la longue queue des colonies à croissance lente présentes dans chacune d’entre eux; ce dernier n’est détectable qu’en raison de mesures individuelles de microcolonie. (B) Distributions des taux individuels de croissance de la microcolonie (points noirs) et des statistiques sommaires (boxplots montrant médiane, ainsi que des quantiles inférieurs et supérieurs de 25 pour cent) pour ~120.000 colonies de 11 souches. Comme dans (A), chaque souche a été cultivée dans un puits individuel avec une souche de référence marquée par GFP; les données présentées ici représentent 14 puits expérimentaux par paire de souches de référence MAH. S’il vous plaît cliquez ici pour voir une version plus grande de ce chiffre.

L’analyse de croissance de la microcolonie peut également être utilisée pour mesurer simultanément la croissance et l’expression des gènes en imagerie à la fois des canaux de champ lumineux et de fluorescence. Dans l’expérience présentée à la figure 2, l’imagerie fluorescente de l’expression du PF GFP après l’achèvement de la phase de croissance de l’expérience a permis d’identifier des colonies appartenant à une souche de référence in-well marquée par GFP avec une faible expression GFP (figure 2C); toutefois, il est également possible de mesurer les différences d’intercolonie dans les niveaux d’expression génétique entre les points de temps (voir Discussion).

Un certain nombre d’écueils courants peuvent empêcher la collecte de données précises sur le taux de croissance ou l’analyse correcte de ces données. Un point clé est que les mesures du taux de croissance reposent sur la formation de microcolonies immobiles bidimensionnelles à partir de cellules de levure fondatrices individuelles. Concanavalin A interagit noncovalentement avec les polysaccharides sur les surfaces des cellules de levure pour immobiliser les microcolonies. Le lien entre concanavalin A et cellules de levure peut être inversé par la concurrence avec les sucres ou par un faible pH15. Par conséquent, les supports fortement acides ou les supports contenant des composants liant la lectine tels que l’extrait de levure (YEPD) ou le phtalate (Edinburgh Minimal Media), ne peuvent pas être utilisés pour ce test sans modifications à la technique d’immobilisation (Figure 4A).

Si l’essai de croissance est effectué avec des souches de levure qui flocculent, l’étape optionnelle de sonication devrait être employée pour décomposer les cellules agrégées ainsi les cellules simples sont immobilisées sur la plaque de microscope au début de l’expérience (voir figure 4B pour un exemple de cellules flocculating post-placage si l’étape de sonication est omise). Les microcolonies fondées par un groupe de cellules multiples devraient être exclues dans l’analyse en aval, car les mesures du taux de croissance ne sont plus dérivées d’une seule cellule fondatrice, et les cellules peuvent ne pas croître en deux dimensions. Les microcolonies fondées par une cellule en herbe sont admissibles. La formation de microcolonies bidimensionnelles est entravée par la levure qui floccule très fortement, même si les colonies sont fondées par une seule cellule, et donc la capacité d’une souche de levure à croître en une seule couche sur concanavalin A doit être testé avant d’effectuer un essai de croissance.

Un autre ensemble important de considérations se produit pendant les étapes de planification et d’analyse de l’expérience, lorsqu’il s’agit de déterminer combien de points de temps inclure dans l’analyse. Tout d’abord, il est important d’inclure des données pour suffisamment de points de temps sur une période de temps suffisante pour suivre avec précision la croissance: il est recommandé que les analyses sont exécutés de telle sorte que la levure ont le temps de passer par ~ 5 doublements, avec au moins 10 points de temps collectés au cours de cette période. Toutefois, le simple fait d’inclure chaque point de temps recueilli dans le calcul du taux de croissance entraînera un biais qui abaisse artificiellement le taux de croissance de nombreuses colonies. Ce biais peut se produire lorsque les cellules passent par une phase de décalage avant de commencer la croissance( Figure 4C). Le décalage pré-croissance des microcolonies est commun et varie entre les conditions expérimentales et les souches9,13. Les méthodes d’analyse expérimentale doivent être en mesure de différencier les points de temps de la période de « croissance active » du décalage pré-croissance; une approche consiste à utiliser un nombre prédéfiguré de points de temps dans une fenêtre et à trouver la fenêtre qui correspond au taux de croissance le plus élevé(figure 4C, ligne solide)11,13.

Enfin, l’une des étapes les plus critiques de l’analyse de croissance de la microcolonie est l’étape de dilution des cellules de levure. La concentration des cellules et le rapport des différents génotypes dans les puits de plaque de microscope doivent être soigneusement contrôlés. Pour l’analyse statistique, il est important que les expériences soient équilibrées de telle sorte qu’un nombre à peu près égal de cellules pour chaque génotype et condition sont testéset comparés 16. En outre, les taux de croissance utiles ne peuvent généralement pas être mesurés après la fusion des colonies voisines parce que les taux de croissance des colonies individuelles ne peuvent plus être discernés; par conséquent, des cellules plus densément plaquées donneront des données de croissance à partir de moins de points de temps( figure 4D). Fait important, si la densité cellulaire est élevée ou inégale au début d’une expérience, le filtrage des microcolonies fusionnées exclura de façon disproportionnée les microcolonies à croissance plus rapide des analyses en aval parce que les producteurs rapides fusionneront plus fréquemment que les producteurs lents. Par conséquent, les mesures finales de la croissance seront biaisées vers des sous-populations à croissance plus lente. En outre, différents nombres de colonies peuvent être filtrés pour différents traitements, excluant une expérience équilibrée. Il est recommandé de plaquer environ 4000 cellules par puits dans une plaque de 96 puits (ou 700 cellules par puits dans une plaque de 384 puits). Le mélange complet de pipet tout au long de la partie levure-dilution du protocole est impératif pour s’assurer que le nombre correct de cellules est présent dans chaque puits, et que les cellules sont uniformément dispersées dans tout le puits. Il est également conseillé d’éliminer les microcolonies de l’analyse dont les centres se trouvent à environ 25 diamètres cellulaires les uns des autres.

Figure 4
Figure 4. Pièges expérimentaux. (A) Colonies de plus en plus dans les médias YEPD, ce qui empêche la liaison efficace des cellules à concanavalin A. L’apparition de nouvelles cellules loin de toute colonie (pointes de flèches), ainsi que l’apparition de nombreuses cellules hors foyer à la lisière de la colonie, sont le résultat de cellules qui ne adhèrent pas à la surface du verre et s’éloignent de la colonie pendant la croissance. (B) Cellules d’une souche flocculante juste après le placage sans sonication; remarquez la présence d’un grand nombre d’amas de cellules multiples (pointes de flèches) et de cellules à l’intérieur des grappes dans différents plans focaux. (C) Changement dans ln(zone) au fil du temps pour une colonie avec une phase de long décalage. Notez que si tous les points de temps sont utilisés pour l’estimation du taux de croissance, le taux de croissance estimé est considérablement déprimé; une mesure précise n’est produite que lorsque le sous-ensemble de points de temps n (ici n=6) qui se traduit par l’estimation du taux de croissance le plus élevé est utilisé. (D) Cellules qui ont été plaquées trop densément montrées au début de l’expérience et après 7 h de croissance. Les couleurs suivent les colonies individuelles jusqu’à ce qu’elles fusionnent avec les voisins; ici, par la marque de 7 h, la majorité des colonies ont fusionné, avec seulement un petit nombre de colonies individuelles à croissance lente restantes. (Le suivi d’un petit sous-ensemble des colonies indiquées ici est perdu pour des raisons qui n’ont rien à voir avec la fusion des colonies.) Chaque barre d’échelle est de 50 μm. Veuillez cliquer ici pour voir une version plus grande de ce chiffre.

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Discussion

Le protocole décrit ici est un test polyvalent qui permet de surveiller simultanément la croissance cellulaire et l’expression des gènes au niveau des microcolonies individuelles. La combinaison de ces deux modalités donne des idées biologiques uniques. Par exemple, des travaux antérieurs ont utilisé cet essai pour montrer une corrélation négative entre l’expression du gène TSL1 et le taux de croissance de la microcolonie dans les cellules isogéniques de type sauvage en mesurant lesdeux simultanément 7,10. Il est également possible de surveiller la relation entre le taux de croissance et la dynamique de localisation subcellulaire des protéines étiquetées fluorescentes avec l’analyse décrite. Par exemple, une relation négative entre le taux de croissance et l’occupation nucléaire du facteur de transcription msn2 marqué par DP a été identifiée par fluorescence d’imagerie dans les cellules chaque minute pendant 30 min avant d’initialiser l’essai decroissance 10. Enfin, ce protocole permet de surveiller les réponses cellulaires aux contraintes et perturbations environnementales. Des traitements tels que le choc thermique peuvent être administrés à mi-chemin à travers l’analyse de croissance. De telles études ont révélé, par exemple, que les cellules à croissance lente exprimant des niveaux élevés de Tsl1 sont plus tolérantes au choc thermique 7,10.

En plus des écueils courants décrits dans la section Résultats représentatifs (fig. 4), plusieurs facteurs clés doivent être pris en considération lors de la conception d’une expérience d’analyse de croissance. La variation phénotypique mesurée à l’essai est affectée par de multiples facteurs, dont certains sont reproductibles et d’intérêt inhérent, comme le génotype ou l’environnement, tandis que d’autres sont le résultat de la variationtechnique 13. Par conséquent, la première considération importante lors de la conception d’un essai de microcolonie est de mener l’expérience d’une manière qui facilite la séparation des effets d’intérêt des effets résultant de la variation technique; la clé de cette séparation sont le randomisation des traitements ou des souches sur les plaques expérimentales, et y compris les contrôles dans chaque expérience. Les méthodes statistiques appropriées, telles que la modélisation mixte linéaire (LMM), doivent être appliquées aux données après leur collecte, afin de tenir compte des différentes sources de variation dans l’analyseen aval 17,18.

Afin d’employer des méthodes statistiques pour séparer la variation des phénotypes de croissance due à des variables expérimentales d’intérêt de la variation due à des facteurs aléatoires tels que les effets de lots, il est nécessaire d’exécuter plusieurs expériences à différents jours et avec des emplacements de puits randomisés de génotype et de conditions de croissance. En outre, pour augmenter la puissance de l’expérience pour détecter les différences de croissance entre les souches ou les conditions de traitement, il est également important d’inclure plusieurs répliques de chaque génotype testé ou condition de croissance, sur une seule plaque expérimentale dans la mesure du possible.

Un avantage clé de l’analyse de croissance de la microcolonie réside dans la quantité de données qu’il peut recueillir: une seule plaque expérimentale génère généralement des données pour ~ 105 microcolonies individuelles, ce qui est plusieurs ordres de grandeur supérieure aux expériences typiques utilisant des dispositifs microfluidiques au lieu de plaques multiwell. Un logiciel qui suit automatiquement les colonies et calcule les données pertinentes (p. ex. temps de décalage, taux de croissance et intensités fluorescentes moyens) est essentiel pour tirer pleinement parti de cet essai. Ce logiciel devrait non seulement identifier solidement les limites des colonies et suivre les colonies à travers le temps, mais aussi mesurer correctement la croissance des colonies avec une phase de décalage13. Une option développée à cette fin est PIE, un logiciel open source qui suit les colonies au fil du temps (y compris la comptabilisation des changements dans la position des colonies), calcule les taux de croissance et permet l’intégration des données d’imagerie fluorescente dans lesmesures expérimentales 11,12.

L’essai de croissance de microcolony peut être employé pour obtenir l’aperçu des questions fondamentales relatives à la forme physique et à l’évolution de levure, y compris la variabilité de phénotype de croissance, les changements dans différents environnements ou en réponse au stress, et la relation entre la croissance et l’expression de protéine ou la localisation subcellulaire. L’essai a été employé intensivement dans des études des souches de laboratoire et sauvages de S. cerevisiae7,9,10,13.

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Disclosures

Les auteurs n’ont rien à divulguer.

Acknowledgments

Nous remercions Naomi Ziv, Sasha Levy et Shuang Li pour leur contribution au développement de ce protocole, David Gresham pour l’équipement partagé, et Marissa Knoll pour leur aide à la production vidéo. Ces travaux ont été soutenus par la subvention R35GM118170 des National Institutes of Health.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
General Materials
500 mL Bottletop Filter .22 µm PES Sterilizing, Low Protein Binding, w/45mm Neck Fisher CLS431154 used to filter the media
BD Falcon*Tissue Culture Plates, microtest u-bottom Fisher 08-772-54 96-well culture tubes used to freeze cells, pre-grow cells, and dilutions
BD Syringes without Needle, 50 mL Fisher 13-689-8 Used to filter the Concanavalin A
Costar Sterile Disposable Reagent Reservoirs Fisher 07-200-127 reagent reservoirs used to pipette solutions with multichannel pipette
Costar Thermowell Aluminum Sealing Tape Fisher 07-200-684 96-well plate seal for pre-growth and freezing
lint and static free Kimwipes Fisher 06-666A lint and static free wipes to keep microscope plate bottom free of debris and scratches
Nalgene Syringe Filters ThermoFisher Scientific 199-2020 0.2 μm pore size, 25 mm diameter; used to filter concanavalin A solution
Media Components
Minimal chemically defined media (MD; 2% glucose) alternative microscopy media used for yeast pre-growth and growth during microscopy
Synthetic Complete Media (SC; 2% glucose) microscopy media used for yeast pre-growth and growth during microscopy
Yeast extract-peptone-dextrose (YEPD; 2% glucose) medium cell growth prior to freezing down randomized plates
Microscopy Materials
Breathe-Easy sealing membrane Millipore Sigma Z380059-1PAK breathable membranes used to seal plate during microscopy experiment. At this stage breathable membranes are recommended because they prevent condensation in the wells and allow for better microscopy images
Brooks 96-well flat clear glass bottom microscope plate Dot Scientific MGB096-1-2-LG-L microscope plate
Concanavalin A from canavalia ensiformis (Jack Bean), lyophilized powder Millipore Sigma 45-C2010-1G Make 5x concanavalin A solution and freeze 5ml of 5x concanavalin A in 50 mL conical tubes at -80 °C
Strains Used
MAH.5, MAH.96, MAH.52, MAH.66, MAH.11, MAH.58, MAH.135, MAH.15, MAH.44, MAH.132 Haploid mutation accumulation strains in a laboratory background, described in Hall and Joseph 2010
EP026.2A-2C Progeny of the ancestral Hall and Joseph 2010 mutation accumulation strain, transformed with YFR054cΔ::Scw11P::GFP
Equipment
Misonix Sonicator S-4000 with 96-pin attachment Sonicator https://www.labx.com/item/misonix-inc-s-4000-sonicator/4771281
Nikon Eclipse Ti-E with Perfect Focus System Inverted microscope with automated stage and autofocus system

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References

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Biologie Numéro 170 taux de croissance Saccharomyces cerevisiae,hétérogénéité non génétique microscopie à haut débit variation naturelle
Imagerie en direct à haut débit des microcolonies pour mesurer l’hétérogénéité de la croissance et de l’expression des gènes
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Sartori, F. M. O., Buzby, C.,… More

Sartori, F. M. O., Buzby, C., Plavskin, Y., Siegal, M. L. High-Throughput Live Imaging of Microcolonies to Measure Heterogeneity in Growth and Gene Expression. J. Vis. Exp. (170), e62038, doi:10.3791/62038 (2021).

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