Summary
Presenteras här är ett protokoll av Helicoverpa armigera (Hübner) embryo microinjection och knockout mutant identifiering skapad av CRISPR/Cas9 genomredigering. Mutanta insekter möjliggör ytterligare forskning om genfunktion och interaktion mellan olika gener in vivo.
Abstract
Bomullsbollmasken, Helicoverpa armigera, är en av de mest destruktiva skadedjuren i världen. En kombination av molekylär genetik, fysiologi, funktionell genomik och beteendestudier har gjort H. armigera till en modellart i Lepidoptera Noctuidae. För att studera in vivo-funktionerna hos och interaktioner mellan olika gener är grupperade regelbundet interspaced korta palindromiska upprepningar (CRISPR)/ tillhörande protein 9 (Cas9) genomredigeringsteknik en bekväm och effektiv metod som används för att utföra funktionella genomiska studier. I denna studie tillhandahåller vi en steg-för-steg systematisk metod för att slutföra gen knockout i H. armigera med hjälp av CRISPR/Cas9 systemet. Utformningen och syntesen av guide RNA (gRNA) beskrivs i detalj. Sedan sammanfattas de efterföljande stegen som består av genspecifik primerdesign för guide RNA (gRNA) skapande, embryosamling, mikroinjektion, insektsuppfödning och mutantdetektering. Slutligen ges felsökningsråd och anteckningar för att förbättra effektiviteten i genredigering. Vår metod kommer att fungera som referens för tillämpningen av CRISPR/ Cas9 genomredigering i H. armigera samt andra Lepidopteran moths.
Introduction
Tillämpningen av genomredigeringsteknik ger ett effektivt verktyg för att uppnå målgenmutanter i olika arter. Framväxten av det grupperade regelbundet interspaced korta palindromiska repetitioner (CRISPR)/associerade protein 9 (Cas9) systemet ger en ny metod för att manipulera genom1. CRISPR/Cas9-systemet består av en guide RNA (gRNA) och Cas9 endonuclease2,3, medan gRNA kan delas in ytterligare i två delar, ett mål kompletterande CRISPR RNA (crRNA) och en transaktiverande crRNA (tracrRNA). GRNA integreras med Cas9 endonuclease och bildar ett ribonucleoprotein (RNP). Med gRNA kan Cas9 endonuclease dirigeras till en specifik plats för genomet via baskomplementation. RuvC- och HNH-domänerna i Cas9 klyver målplatsen för genomet tre baser före den protospacer-intilliggande motivsekvensen (PAM) och skapar en dubbelsträngsbrytning (DSB). DNA-klyvningen kan sedan repareras genom två mekanismer, icke-homolog end join (NHEJ) eller homology-directed repair (HDR)4. Reparation av DSB introducerar infogningar eller borttagningar som ett sätt att inaktivera den riktade genen, vilket potentiellt orsakar en fullständig förlust av genfunktionen. Därför gör crispr/cas9-systemets härdikerbara och specificitet det till en robust metod för att karakterisera genfunktioner in vivo och analysera geninteraktioner5.
Med många fördelar har CRISPR/Cas9-systemet tillämpats på olika områden, inklusive biomedicin6,7, genterapi8,9 och jordbruk10,11,12, och har använts för olika biologiska system inklusive mikroorganismer13, växter14,15, nematoder16 och däggdjur17 . Hos ryggradslösa djur har många insektsarter utsatts för CRISPR/Cas9-genomredigering, såsom fruktflugan Drosophila melanogaster och bortom 18,19,20,21,22.
Helicoverpa armigera är en av de mest destruktiva skadedjuren i världen23, och skadar många grödor, inklusive bomull, sojabönor och sorghum24,25. Med utvecklingen av sekvenseringsteknik har arvsmassan hos H. armigera, liksom en rad lepidoptera insektsarter, sekvenserats helt26,27,28,29. Ett stort antal resistens- och luktreceptorgener har identifierats och karakteriserats från dessa insekter under de senaste åren19,27,28,29. Vissa resistensrelaterade gener har identifierats i H. armigera, såsom generna som kodar för cadherin30, en ATP-bindande kassetttransportör31,32, samt HaTSPAN133. Knockout av dessa gener med CRISPR/Cas9-teknik resulterar i en hög resistens mot Bacillus thuringiensis (BT) toxin i mottagliga stammar. Dessutom slog Chang et al. (2017) ut en feromonreceptor, som validerade sin signifikanta funktion i parningstidsreglering19. Dessa rapporter tyder på att CRISPR/Cas9 kan fungera som ett effektivt verktyg för att studera genfunktionen in vivo i insektssystem. Ett detaljerat förfarande för CRISPR/Cas9-modifiering i insektssystem är dock fortfarande ofullständigt, vilket begränsar dess tillämpningsområde inom insektsfunktionell genomik.
Här presenterar vi ett protokoll för att slå ut en funktionell gen i H. armigera med CRISPR/ Cas9-systemet. Ett detaljerat steg-för-steg-protokoll tillhandahålls, inklusive design och beredning av genspecifika primers för gRNA-produktion, embryosamling, mikroinjektion, insektsuppfödning och mutantidentifiering. Detta protokoll fungerar som en värdefull referens för att manipulera alla funktionella gener i H. armigera och kan utvidgas till andra Lepidoptera arter.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. Utformning av genspecifika primers och beredning av sgRNA
- Verifiera en bevarad genomisk region i den gen av intresse genom PCR-förstärkning och sekvenseringsanalyser. Förstärka målgenen från arvsmassans DNA och skilja exoner och introner.
OBS: Sekvensens specificitet på guideplatsen är nödvändig för att undvika genredigering utanför målet. Sök möjliga guide platser i exons är nära 5 ' UTR av genen. Då är det viktigt att se till att genen är helt icke-funktionell. En sammanfattning av flödesvägen för beredning av sgRNA illustreras i figur 1. - Välj sgRNA-målen. Använd CRISPR:s onlinewebbplats CRISPOR (version 4.97) (http://crispor.tefor.net/crispor.py) för att söka efter möjliga guidewebbplatser i exonerna nära genens 5' UTR. Mata in exonsekvensen i textrutan och välj målgenomet till Helicoverpa armigera (Harm_1.0). Välj alternativet "20 bp-NGG" (protospacer adjacent motif) och lämna de andra inställningarna på standardparametrarna enligt webbplatsernas användarhandböcker.
- Jämför de förutsagda guidesekvenserna från programvaran och välj guidesekvensen med den högsta förväntade effektiviteten och minst bristande överensstämmelse för att förbättra redigeringseffektiviteten och minska redigering utanför målet. En 20 bp styrsekvens som innehåller ett eller två G på 5' UTR rekommenderas eftersom det kan öka skäreffektiviteten.
OBS: Ett par gRNAs över exon-regioner rekommenderas också för att få ett stort segment borttagning, vilket förenklar mutant identifiering i senare steg. Se till att avståndet mellan de två valda styrsekvenserna är minst 100 bp. I detta protokoll väljer vi det vanliga SpCas9-proteinet, som känner igen NGG-motivet. Enligt tillverkarens instruktion är den styrsekvens som saknar G också acceptabel när du väljer T7-promotorn eftersom promotorn lägger till ett G till 5' UTR i sekvensen. - Designa framåt och omvänd oligonukleotider. Ställ in sekvensordningen på 5'-20 bp guidesekvens-NGG-3' och komplettera styrsekvensen. Lägg till T7-promotorsekvensen i den främre respektive omvända strängguidesekvensen, enligt användarhandboken för gRNA-syntessatsen.
OBS: PAM-sekvensen NGG ska uteslutas från oligonukleotidsekvensen. - Generera sgRNA med hjälp av gRNA-syntessatsen. Denna process omfattar tre steg: DNA-mallmontering, in vitro-transkription och rening av sgRNA (figur 2). Utför varje steg i enlighet med användaranvisningarna.
2. Embryoberedning och embryosamling
- Separera han- och honpuppar enligt Hongtao et al.34 och separera dem i två olika nätburar. Efter eklosion, mata dem ~ 30 ml 10% (w / v) vitsockerlösning i absorberande bomull i en Petri-maträtt.
OBS: 3 g vitsocker löstes upp i 30 ml sterilt vatten för att förbereda vitsockerlösningen på 10 % (w/v). - Välj 50 friska individer från 3-dagars gamla män respektive 2-dagars gamla honor och blanda dem i en ren nätbur. Placera en bomullsbit som innehåller 10 % (w/v) sockerlösning i buret och håll bomullen fuktig. Täck nätburarna med gasväv och fixera gasväven med ett gummiband. Spraya vatten på gasväven för att hålla fukt.
- Låt utvalda manliga och kvinnliga malar i steg 2 kompisera helt och observera äggläggningsmängden.
OBS: Toppen av oviposition av H. armigera visas efter 21:00 p.m. Därför bör parningens tid övervägas för att säkerställa ett tillräckligt antal ägg i de efterföljande stegen. Vid toppen av ovipositionen, byt ut gasväven med en svart trasa och möjliggör fri oviposition i 30 min. Byt ut den svarta trasan var 30:e minut för att samla färska ägg (figur 3A). - Skär den svarta trasan i oregelbundet formade fläckar med en storlek på 3 mm ungefär. Se till att det finns fler ägg på varje plåster.
OBS: Undvik att välja skrynkliga ägg eftersom de vanligtvis är obefruktade. - Klistra in dubbelhäftande tejp på en mikroskopbild (25 mm x 75 mm) (bild 3B). Använd tång, klistra in plåstren med ägg i rad på ytan av den dubbelsidiga tejpen. Tryck på marginalen för varje plåster för att se till att de håller fast vid tejpen. Samla 50-100 ägg per mikroskopbild (bild 3C).
OBS: Plåstren måste täcka hela ytan på den dubbelsidiga tejpen, annars kommer kläckningslarven att ha svårt att krypa ut. - Innan mikroinjektion, håll mikroskopet glida på is för att fördröja utvecklingen av embryon.
3. Mikroinjektion av embryon
- Förbered nålen genom att dra i ett kapillärglas med hjälp av en mikropipettedragare (figur 4A). Ställ in värme på 540, dra till 80, Vel till 75, Tid till 170 och tryck på 450. Jorda nålspetsen med en mikrokvarn. Den idealiska nålen visar en skarp spets (bild 4B).
- Förberedelse av injektionslösningar. Tillsätt 2 μL kommersialiserat Cas9-protein (1 mg/ml) och sgRNA (300-500 ng/μL slutlig koncentration) till RNase-fritt vatten i ett PCR-rör för att erhålla en 10 μL-volymblandning. Volymen av sgRNA beror på dess koncentration. Blanda väl genom pipettering och lägg den på is.
OBS: Alla pipettspetsar och PCR-rör som används i detta steg är RNase-fria. - Ställ in parametrarna för den elektroniska mikroinjektorn. Ställ in injektionstrycket (pi) på 1 500 hPa, injektionstiden (ti) till 0,1 s och kompensationstrycket (pc) till 30 hPa.
- Ladda 2 μL av blandningen i en nål med hjälp av en mikrolastarpipettspets. Restluften i nålens spets bör vara uttömd så mycket som möjligt.
- Anslut injektionsnålen till en mikromanipulator och säkerställ en tät anslutning mellan de två delarna.
- Placera en diabild i en Petriskål (100 mm) och lägg dem på mikroskopets scen (figur 5A).
- Justera nålspetsens position under ett ljusmikroskop tills både nålspetsen och embryona syns under mikroskopet (figur 5B).
- Justera droppens volym. Tryck på pedalen och observera vätskefallet vid nålspetsen. Justera mikroinjektorns injektionstryck tills volymen av en vätskedroppe är ungefär en tiondel av embryots volym.
OBS: Kvaliteten på injektionsnålen är avgörande för embryonas överlevnad. - För försiktigt in nålspetsen på embryots övre halvklot i 45 graders vinkel (figur 5C). Tryck på pedalen för att leverera blandningen i embryot. Injektionen leder till en liten utvidgning av embryot. Dra tillbaka nålen omedelbart från embryot och flytta Petri-skålen med en hand tills nästa embryo är i närheten av nålen och injicera nästa embryo med samma procedur.
OBS: Det cytoplasmiska utflödet vid pinhole är acceptabelt. Om det cytoplasmiska läckaget är för mycket, justera nålens vinkel till en svårare vinkel tills vätskeutflödet är kontrollerat. - Injicera minst 300 embryon för att säkerställa en tillräcklig kläckningsmängd. Täck locket på Petriskålen efter injektionen.
OBS: Tiden från oviposition till injektion av 50-100 embryon är begränsad till 2 h. De flesta embryona befinner sig fortfarande i encellsstadiet inom denna tidsram. I allmänhet är det användbart att upprepa ovipositionsförfarandet under embryoinjektion för att främja effektiviteten.
4. Insektsuppfödning efter injektion
- Förökning av G0-embryon.
- Inkubera embryona vid 60% relativ luftfuktighet och 28°C i en konstgjord klimatlåda med 14 h ljus/10 h mörkt.
- Kontrollera utvecklingen av embryon dagligen efter injektion. När embryonas ytfärg har mörknat, lägg konstgjord kost i Petri-skålen runt mikroskopbilden och kontrollera utvecklingen av embryon var 12: e timme.
OBS: Den konstgjorda kosten framställs enligt wu et al.35 och Jha et al.36. - Förbered 24-brunnskulturplattor och fyll varje brunn till en tredjedel av dess volymetriska kapacitet med konstgjord kost.
- Plocka ut kläckningslarver (figur 5D) med en liten pensel och överför dem till 24-brunnskulturplattan. Sätt in en larva per brunn för att säkerställa att varje larva har tillräckligt med mat för att överleva.
OBS: Larverna av H. armigera uppföddes individuellt i varje brunn eftersom de vanligtvis kannibaliserade varandra.
- G0 larver uppfödning
- Upp larverna under samma förhållanden som embryona.
- Kontrollera de kläckta larverna varje dag. När larver växer till det tredje instar-steget, överför varje larva till ett nytt glas dactylethrae och fyller en femtedel av volymen med konstgjord kost.
- Cirka 12 d efter inkubation bör de mogna larverna börja poppa.
- G0 mogna puppar utmärks baserat på kön och placeras i separata burar före utbrytning. Den samma åldern puppar av vild typ är också beredda.
- G0 vuxna uppfödning
- Kontrollera eklosion av både vild typ och mutant pupae dagligen.
- Överför de nyligen eclosed G0 manliga vuxna och vilda kvinnliga vuxna till en färsk nätbur och gör förhållandet mellan G0 och vild typ vid ungefär 1:1. Förse dem med 10% (w/v) sockerlösning som tappas i bomullstussar.
- Bakre insekter som använder rutinmetoden ovan fram till poppningen av generation ett (G1).
- Överför det nyligen utmätta enskilda G1-paret med hjälp av en plastburk (13 cm x 12 cm x 12 cm) som levereras med 10 % (w/v) sockerlösning. Täck varje burk med gasväv. Ta totalt cirka 50 par G1 vuxna.
OBS: Utgående av kvinnliga malar föregick den hos manliga malar. I allmänhet är en 3-dagars gammal man och en 2-dagars gammal kvinna sexuellt mogna och redo att kompisera. De nyemitterade vuxna kommer inte att para sig i sin första ljusperiod utan utfodring. - Samla G1 vuxna i en plastburk efter att de har lagt ägg. Lägg varje vuxen mal i ett 1,5 ml centrifugrör.
5. Knock-out mutant upptäckt
- Designa ett par primers som sträcker sig över den förutst trunkerade webbplatsen. Primers bör ställas in minst 50 bp avstånd på vardera sidan (uppströms och nedströms) från målplatsen.
OBS: Primersna för identifieringen av målsekvensen täcker ofta stora spännvidder för att förstärka effektivt. - Utför PCR-reaktionen med genotypning primers med genom DNA extraheras i avsnitt 1. Utför PCR-cykling vid 95 °C i 20 s; 35 cykler på 95 °C för 20 s, 55 °C för 20 s, 72 °C i 1 min, 72 °C i 5 minuter och 4 °C i vänteläge. Kontrollera reaktionsprodukten via 1% (w/v) agarosegel. Det valda paret av detektionsprimrar bekräftades av kvaliteten på PCR-produkten. Om banden är uppenbara och specifika, kan primers användas för ytterligare mutant upptäckt baserat på amplicon storlek.
- Skärm för potentiella redigerade personer. Ta försiktigt bort ett bakben med tång och lägg varje ben i ett lysningsmatrisrör. Märk lysingmatrisröret som överensstämmer med numret på glasets dactylethrae.
- Homogenisera bakbenet med hjälp av en vävnadshomogenisator. Ställ in hastigheten på 6,0 m/s och tiden till 60 s. Extrahera det homogeniserade provets genomiska DNA med hjälp av ett kommersiellt gDNA-extraktionskit enligt tillverkarens instruktioner.
- Förstärka gensegmentet med genotypning primers med samma PCR reaktion villkor som beskrivs i steg 2. Bekräfta genotypen genom en gensekvenseringstjänst. När G1 mutant genotyper (mål samma plats) som finns i samma burk upptäcktes, behålla G1 avkomman och byta namn på den som generation två (G2).
- Sätt G1-individer av samma genotyp i en nätbur. Korsa G1-avkomman själv och fortsätt att screena med samma metoder.
- Förstärka gensegmentet och bekräfta genotypen med samma förfarande som beskrivs i steg 2. Skaffa G2 homozygous linjer och upprätthålla knock-out mutant linje.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Detta protokoll ger detaljerade steg för att erhålla gen knock-out linjer av H. armigera med CRISPR / Cas9 teknik. De representativa resultaten som erhålls genom detta protokoll sammanfattas för gDNA urval, embryo insamling och injektion, insekt uppfödning och mutant upptäckt.
I denna studie var målplatsen för vår gen av intresse belägen i sin andra exon (figur 2A). Denna webbplats var mycket bevarade, och målband fragment av syntetiserade sgRNA bekräftades med hjälp av agarose gel elektrofores (figur 2B, C, D).
Han- och honmotarna uppföddes ursprungligen i separata nätburar för att förhindra parning i förtid och för att säkerställa en tillräcklig mängd embryon så mycket som möjligt. I allmänhet samlades totalt 300 befruktade ägg in och injicerades omedelbart med sgRNA/Cas9-proteinblandningen (300-500 ng/μL sgRNA, 200 ng/μL Cas9-protein) i encellsstadiet. Injektionsvolymen var ungefär en tiondel av embryona. Efter microinjection, embryona uppföddes enligt beskrivningen i avsnitt 4, och 40%-60% av injicerade embryon överlevde.
Mutant detektion av ett enda sgRNA-mål utfördes genom sekvensering av PCR-produkterna från G1 föräldra vuxna (figur 6B). Vi testade också effektiviteten av att använda icke-överlappande sgRNA-par över olika exoner. Den stora borttagningen av mutanterna (figur 6C, D) kan lätt särskiljas från vilda typband (figur 6A).
Mutationshastigheten som beräknades i detta protokoll var 87,50% när 16 individer testas slumpmässigt, vilket indikerar att detta protokoll var högeffektivt. Gen knockout resultat visades i flera genotyper, men majoriteten av mutanter identifieras från vår screening var -2 bp typ. Mutationer resulterade i förtida upphörande av proteinöversättning i genomet, vilket därefter ledde till förlust av genfunktionen.
Bild 1: Flödesschemat för beredning av sgRNA. Klicka här för att se en större version av denna figur.
Bild 2: Val och syntes av målsgRNAs från H. armigera. (A) Den gula domänen representerar exon, medan den svarta linjen representerar intronen. De röda sekvenserna anger målsekvensen och de blå sekvenserna anger det intilliggande motivet (PAM). B) PCR-sammansättning av SgRNA DNA-mallen. C) Transkriptionsprodukten in vitro. D) Rening av sgRNA. Klicka här för att se en större version av den här figuren.
Figur 3: Embryosamling(A) En nätbur täckt med svart trasa. H. armigeras manliga och kvinnliga malar parade sig. B) Mikroskopet glider utan embryon. C) Mikroskopbilden som innehåller 50–100 embryon på bitar av svart tyg. Klicka här för att se en större version av den här figuren.
Bild 4: Nålberedning (A) Mikropipettedragare. B) Spets på en mikroinjektionsnål efter att ha dragits av en mikropipettedragare. Den prickade rutan anger den förstorade nålspetsen. Skalstrecket representerar 1 mm. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 5: Embryomikroinjektioner. A) Hela uppsättningen av ett mikroinjektionssystem som innehåller ett mikroskop (mitten) och en elektronisk mikroinjektor (vänster) ansluten till en mikromanipulator (höger). B) Embryon och mikroinjektionsnål. C) Embryots injektionsställe är märkt med den röda pilen. Skalstången representerar 200 μm. (D) En kläckt larva under mikroskopet. Skalstrecket representerar 1 mm. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 6: Påvisande av mutanter med PCR och gelelektrofores. De svarta pilarna och röda linjerna anger sgRNA:s målplatser. A) Bandet i bana 1 representerar förstärkningsfragmentet som härrör från vild typ. (B) Banden i bana 2 och 3 representerar förstärkningsfragmentet som härrör från mutant med hjälp av ett enda sgRNA-mål. C) Detektion av en heterozygot med hjälp av ett par icke-överlappande sgRNA. Banden i körfält 4 och 5 representerar förstärkning fragment härrör från mutationen av två sgRNA mål. De nedre banden anger en stor fragmentborttagning. (D) Resultaten härleds från en homozygot. Banden i bana 6 och 7 anger att det stora fragmentet raderas. Klicka här för att se en större version av den här figuren.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Tillämpningen av CRISPR/Cas9-systemet har gett kraftfullt tekniskt stöd för analys av genfunktion och interaktion mellan olika gener. Det detaljerade protokollet vi presenterar här visar genereringen av en homozygote mutant i H. armigera via CRISPR/Cas9 genomredigering. Detta tillförlitliga förfarande ger ett enkelt sätt för riktade gen mutagenes i H. armigera.
Valet av CRISPR-målplatser kan påverka mutageneseffektiviteten37. I detta protokoll jämförde och analyserade vi flera resultat från onlinewebbplatsen CRISPOR för att få en lämplig målwebbplats. I silico, gRNA förutsägelser presenterar vissa fördelar. För det första analyserar de hela arvsmassan hos H. armigera när de utformar sgRNAs för att minimera off-target-effekterna. De onlineresurser som nämns ovan, liksom CHOPCHOP (http://chopchop.cbu.uib.no/), fungerar med ett antal Lepidoptera-genom, vilket kan vara fördelaktigt för genredigering i andra Lepidopteran-malar. För det andra jämför rankningen av kandidatsgRNAs direkt möjligheterna men kan innehålla vissa variationer baserade på de olika algoritmerna. Kandidatsekvensen med höga betyg i båda listorna tenderar att vara mer tillförlitlig. En stor begränsning av detta protokoll är dock att ett stort antal insektsgenom saknas i databaserna på webbplatserna, så det finns potential för off-target effekter. En annan begränsning är att PAM-sekvensen är nödvändig för sgRNA-designen, vilket kan leda till oförmåga att hitta en lämplig målplats.
Vävnaderna som används för mutant screening är också en avgörande faktor. Insekternas överlevnadsgrad, livscykel och fysiologiska funktioner bör inte påverkas. I vår process att utforska den optimala gDNA extraktionsmetoden, mikro-hemolymph extraktion från larver försökte för mutant upptäckt för att spara tid och undvika parning (opublicerade data). Denna metod medförde dock fler utmaningar när det gäller effektiviteten i PCR-förstärkning och överlevnadsgraden för vuxna (data visas inte). Dessutom rapporterade Zheng et al.38 en icke-destruktiv metod för gDNA-extraktion med exuviatet eller puparia. Baserat på dessa resultat, ändrade och utforskade vi ett tillvägagångssätt med bakben för gDNA extraktion, som gör det möjligt för vuxna malar att överleva och kompisera naturligt, avsevärt förbättra detektion noggrannheten hos en viss genotyp. Därför utvecklade vi en ny metod för att öka framgångsgraden för gDNA-extraktion genom att ta bort ett av bakbenen från varje vuxen kandidat. Vi bekräftade vidare att denna operation inte påverkade överlevnadsgraden och parningsfrekvensen hos vuxna malar. Dessutom fann vi att det stora fragment borttagningen lätt kan observeras av gel elektrofores när co-injiceras med ett par gRNAs över exon-regioner (figur 6), vilket förenklar processen för mutant identifiering vid screening.
Äggen av H. armigera samlas på en svart trasa, vilket gör det enkelt att skilja äggen under mikroskopet i mikroinjektionsprocessen (figur 5B). På grund av de vanliga reproduktiva beteendena hos Lepidopteran moths som parning, oviposition, kläckning och eclosion39,40,41, kan denna ägguppsamlingsteknik också tillämpas för andra Lepidopteran malar.
Sammanfattningsvis har CRISPR/Cas9-systemet visat sig vara ett tillförlitligt verktyg för att underlätta funktionella genomikstudier i H. armigera. De stegvisa beskrivningarna gör det möjligt för användare att slutföra en integrerad genredigeringsprocess.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Författarna har inga intressekonflikter.
Acknowledgments
Detta arbete stöddes av National Natural Science Foundation of China (31725023, 31861133019 till GW och 31171912 till CY).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 2kb DNA ladder | TransGen Biotech | BM101 | |
| Capillary Glass | World Precision Instrucments | 504949 | referred to as "capillary glass" in the protocol |
| Double Sided Tape | Minnesota Mining and Manufacturing Corporation | 665 | |
| Eppendorf FemtoJet 4i Microinjector | Eppendorf Corporate | E5252000021 | |
| Eppendorf InjectMan 4 micromanipulator | Eppendorf Corporate | 5192000051 | |
| Eppendorf Microloader Pipette Tips | Eppendorf Corporate | G2835241 | |
| GeneArt Precision gRNA Synthesis Kit | Thermo Fisher Scientific | A29377 | |
| Microscope Slide | Sail Brand | 7105 | |
| Olympus Microscope | Olympus Corporation | SZX16 | |
| PrimeSTAR HS (Premix) | Takara Biomedical Technology | R040 | used for mutant detection |
| Sutter Micropipette Puller | Sutter Instrument Company | P-1000 | |
| TIANamp Genomic DNA Kit | TIANGEN Corporate | DP304-03 | |
| TrueCut Cas9 Protein v2 | Thermo Fisher Scientific | A36499 |
References
- Cong, L., et al. Multiplex genome engineering using CRISPR/Cas systems. Science. 339 (6121), 819-823 (2013).
- Garneau, J. E., et al. The CRISPR/Cas bacterial immune system cleaves bacteriophage and plasmid DNA. Nature. 468 (7320), 67-71 (2010).
- Jinek, M., et al. A programmable dual-RNA-guided DNA endonuclease in adaptive bacterial immunity. Science. 337 (6096), 816-821 (2012).
- Doudna, J. A., Charpentier, E. The new frontier of genome engineering with CRISPR-Cas9. Science. 346 (6213), 1258096 (2014).
- Ding, Q., et al. Enhanced efficiency of human pluripotent stem cell genome editing through replacing TALENs with CRISPRs. Cell Stem Cell. 12 (4), 393-394 (2013).
- Collins, P. J., Hale, C. M., Xu, H. Edited course of biomedical research: leaping forward with CRISPR. Pharmacological Research. 125, 258-265 (2017).
- Huang, J., Wang, Y., Zhao, J. CRISPR editing in biological and biomedical investigation. Journal of Cellular Physiology. 233 (5), 3875-3891 (2018).
- Guan, L., Han, Y., Zhu, S., Lin, J. Application of CRISPR-Cas system in gene therapy: pre-clinical progress in animal model. DNA Repair. 46, 1-8 (2016).
- Wu, J., et al. Gene therapy for glaucoma by ciliary body aquaporin 1 disruption using CRISPR-Cas9. Molecular Therapy. 28 (3), 820-829 (2020).
- Jiao, R., Gao, C. The CRISPR/Cas9 genome editing revolution. Journal of Genetics and Genomics. 43, 227-228 (2016).
- Gupta, M., Gerard, M., Padmaja, S. S., Sastry, R. K. Trends of CRISPR technology development and deployment into Agricultural Production-Consumption Systems. World Patent Information. 60, 101944 (2020).
- Es, I., et al. The application of the CRISPR-Cas9 genome editing machinery in food and agricultural science: Current status, future perspectives, and associated challenges. Biotechnology Advances. 37 (3), 410-421 (2019).
- Tarasava, K., Oh, E. J., Eckert, C. A., Gill, R. T. CRISPR-enabled tools for engineering microbial genomes and phenotypes. Biotechnology Journal. 13 (9), 1700586 (2018).
- Ma, X., Zhu, Q., Chen, Y., Liu, Y. -G. CRISPR/Cas9 platforms for genome editing in plants: developments and applications. Molecular Plant. 9 (7), 961-974 (2016).
- Pandey, P. K., et al. Versatile and multifaceted CRISPR/Cas gene editing tool for plant research. Seminars in Cell & Developmental Biology. 96, 107-114 (2019).
- Friedland, A. E., et al. Heritable genome editing in C. elegans via a CRISPR-Cas9 system. Nature Methods. 10 (8), 741-743 (2013).
- Mojica, F. J., Montoliu, L. On the origin of CRISPR-Cas technology: from prokaryotes to mammals. Trends in Microbiology. 24 (10), 811-820 (2016).
- Taning, C. N. T., Van Eynde, B., Yu, N., Ma, S., Smagghe, G. CRISPR/Cas9 in insects: Applications, best practices and biosafety concerns. Journal of Insect Physiology. 98, 245-257 (2017).
- Chang, H., et al. A pheromone antagonist regulates optimal mating time in the moth Helicoverpa armigera. Current Biology. 27 (11), 1610-1615 (2017).
- Yan, H., et al. An engineered orco mutation produces aberrant social behavior and defective neural development in ants. Cell. 170 (4), 736-747 (2017).
- Koutroumpa, F., et al. Heritable genome editing with CRISPR/Cas9 induces anosmia in a crop pest moth. Scientific Reports. 6 (1), 29620 (2016).
- Chen, D., et al. CRISPR/Cas9-mediated genome editing induces exon skipping by complete or stochastic altering splicing in the migratory locust. BMC Biotechnology. 18 (1), 1-9 (2018).
- Fitt, G. P. The ecology of Heliothis species in relation to agroecosystems. Annual Review of Entomology. 34 (1), 17-53 (1989).
- Jallow, M. F., Cunningham, J. P., Zalucki, M. P. Intra-specific variation for host plant use in Helicoverpa armigera (Hübner)(Lepidoptera: Noctuidae): implications for management. Crop Protection. 23 (10), 955-964 (2004).
- Ai, D., et al. Gene cloning, prokaryotic expression, and biochemical characterization of a soluble trehalase in Helicoverpa armigera Hübner (Lepidoptera: Noctuidae). Journal of Insect Science. 18 (3), 22 (2018).
- Wan, F., et al. A chromosome-level genome assembly of Cydia pomonella provides insights into chemical ecology and insecticide resistance. Nature Communications. 10 (1), 1-14 (2019).
- Cheng, T., et al. Genomic adaptation to polyphagy and insecticides in a major East Asian noctuid pest. Nature Ecology & Evolution. 1 (11), 1747-1756 (2017).
- Xu, W., Papanicolaou, A., Zhang, H. J., Anderson, A. Expansion of a bitter taste receptor family in a polyphagous insect herbivore. Science Reports. 6, 23666 (2016).
- Gouin, A., et al. Two genomes of highly polyphagous lepidopteran pests (Spodoptera frugiperda, Noctuidae) with different host-plant ranges. Scientific Reports. 7 (1), 1-12 (2017).
- Wang, J., et al. Functional validation of cadherin as a receptor of Bt toxin Cry1Ac in Helicoverpa armigera utilizing the CRISPR/Cas9 system. Insect Biochemistry and Molecular Biology. 76, 11-17 (2016).
- Wang, J., Wang, H., Liu, S., Liu, L., Wu, Y. CRISPR/Cas9 mediated genome editing of Helicoverpa armigera with mutations of an ABC transporter gene HaABCA2 confers resistance to Bacillus thuringiensis Cry2A toxins. Insect Biochemistry and Molecular biology. 87, 147 (2017).
- Wang, J., Ma, H., Zhao, S., Huang, J., Wu, Y. Functional redundancy of two ABC transporter proteins in mediating toxicity of Bacillus thuringiensis to cotton bollworm. PLoS Pathogens. 16 (3), 1008427 (2020).
- Jin, L., et al. Dominant point mutation in a tetraspanin gene associated with field-evolved resistance of cotton bollworm to transgenic Bt cotton. Proceedings of the National Academy of Sciences. 115 (46), 11760-11765 (2018).
- Hongtao, Z., Jianan, L., Lian, T., Yang, Z. Sexing of Helicoverpa assulta and Helicoverpa armigera pupae based on machine vision. Tobacco Sciene & Technology. 53 (2), 21-26 (2019).
- Wu, K., Gong, P. A new and practical artificial diet for the cotton boll-worm. Insect science. 4 (3), 277-282 (1997).
- Jha, R. K., Chi, H., Li-Cheng, T. A Comparison of Artificial Diet and Hybrid Sweet Corn for the Rearing of Helicoverpa armigera (Hübner) (Lepidoptera: Noctuidae) Based on Life Table Characteristics. Environmental Entomology. (1), 30 (2012).
- Bassett, A. R., Tibbit, C., Ponting, C. P., Liu, J. -L. Highly efficient targeted mutagenesis of Drosophila with the CRISPR/Cas9 system. Cell Reports. 4 (1), 220-228 (2013).
- Zheng, M. -Y., et al. A non-destructive method of genotyping individual insects from the exuviate of final instar larvae, or puparia. Chinese Journal of Applied Entomology. (2), 21 (2018).
- Pashley, D. P., Hammond, A. M., Hardy, T. N. Reproductive isolating mechanisms in fall armyworm host strains (Lepidoptera: Noctuidae). Annals of The Entomological Society of America. 85 (4), 400-405 (1992).
- Kamimura, M., Tatsuki, S. Diel rhythms of calling behavior and pheromone production of oriental tobacco budworm moth, Helicoverpa assulta(Lepidoptera: Noctuidae). Journal of Chemical Ecology. 19 (12), 2953-2963 (1993).
- Edwards, K. D. Activity rhythms of lepidopterous defoliators: ii. Halisidota argentata pack. (arctiidae), and nepytia phantasmaria stkr. (GEOMETRIDAE). Canadian Journal of Zoology. 42 (6), 939-958 (1964).
