Summary
Qui è presentato un protocollo di microiniezione embrionale Helicoverpa armigera (Hübner) e identificazione di mutanti knockout creati dall'editing del genoma CRISPR / Cas9. Gli insetti mutanti consentono ulteriori ricerche sulla funzione genica e sull'interazione tra diversi geni in vivo.
Abstract
Il verme del cotone, Helicoverpa armigera, è uno dei parassiti più distruttivi al mondo. Una combinazione di genetica molecolare, fisiologia, genomica funzionale e studi comportamentali ha reso H. armigera una specie modello in Lepidoptera Noctuidae. Per studiare le funzioni in vivo e le interazioni tra geni diversi, la tecnologia di editing del genoma a brevi ripetizioni palindrome raggruppate regolarmente intervallate (CRISPR) / proteina 9 associata (Cas9) è un metodo conveniente ed efficace utilizzato per eseguire studi genomici funzionali. In questo studio, forniamo un metodo sistematico passo-passo per completare il knockout genico in H. armigera utilizzando il sistema CRISPR / Cas9. La progettazione e la sintesi dell'RNA guida (gRNA) sono descritte in dettaglio. Quindi, vengono riepilogate le fasi successive costituite dalla progettazione di primer gene-specifici per la creazione di RNA guida (gRNA), la raccolta di embrioni, la microiniezione, l'allevamento di insetti e il rilevamento di mutanti. Infine, vengono forniti consigli e note per la risoluzione dei problemi per migliorare l'efficienza dell'editing genetico. Il nostro metodo servirà come riferimento per l'applicazione dell'editing del genoma CRISPR / Cas9 in H. armigera e in altre falene lepidottere.
Introduction
L'applicazione della tecnologia di editing del genoma fornisce uno strumento efficiente per ottenere mutanti del gene bersaglio in diverse specie. L'emergere del sistema clustered regularly interspaced short palindromic repeats (CRISPR)/associated protein 9 (Cas9) fornisce un nuovo metodo per manipolare i genomi1. Il sistema CRISPR/Cas9 è costituito da un RNA guida (gRNA) e dall'endonucleasi Cas92,3, mentre il gRNA può essere ulteriormente diviso in due parti, un RNA CRISPR complementare bersaglio (crRNA) e un crRNA trans-attivante (tracrRNA). Il gRNA si integra con l'endonucleasi Cas9 e forma una ribonucleoproteina (RNP). Con il gRNA, l'endonucleasi Cas9 può essere diretta a un sito specifico del genoma tramite la complementazione di base. I domini RuvC e HNH del Cas9 fendono il sito bersaglio del genoma tre basi prima della sequenza del motivo adiacente al protospacer (PAM) e creano una rottura a doppio filamento (DSB). La scissione del DNA può quindi essere riparata attraverso due meccanismi, l'unione finale non omologa (NHEJ) o la riparazione diretta dall'omologia (HDR)4. La riparazione del DSB introduce inserzioni o delezioni come un modo per inattivare il gene bersaglio, causando potenzialmente una completa perdita della funzione genica. Quindi, l'ereditarietà e la specificità del sistema CRISPR/Cas9 lo rendono un metodo robusto per caratterizzare le funzioni geniche in vivo e analizzare le interazioni geniche5.
Con numerosi meriti, il sistema CRISPR /Cas9 è stato applicato a vari campi, tra cui la biomedicina6,7, la terapia genica8,9 e l'agricoltura10,11,12, ed è stato utilizzato per vari sistemi biologici tra cui microrganismi13, piante14,15, nematodi16 e mammiferi17 . Negli invertebrati, molte specie di insetti sono state sottoposte a modifica del genoma CRISPR / Cas9, come il moscerino della frutta Drosophila melanogaster e oltre18,19,20,21,22.
Helicoverpa armigera è uno dei parassiti più distruttivi al mondo23 e danneggia numerose colture, tra cui cotone, soia e sorgo24,25. Con lo sviluppo della tecnologia di sequenziamento, il genoma di H. armigera, così come quello di una serie di specie di insetti Lepidotteri, sono stati sequenziati completamente26,27,28,29. Un gran numero di geni di resistenza e recettori olfattivi sono stati identificati e caratterizzati da questi insetti negli ultimi anni19,27,28,29. Alcuni geni correlati alla resistenza sono stati identificati in H. armigera, come i geni che codificano per la caderina30, un trasportatore di cassette che lega l'ATP31,32, così come HaTSPAN133. Il knockout di questi geni utilizzando la tecnologia CRISPR/Cas9 si traduce in un alto livello di resistenza alla tossina Bacillus thuringiensis (BT) nei ceppi sensibili. Inoltre, Chang et al. (2017) hanno eliminato un recettore dei feromoni, che ha convalidato la sua funzione significativa nella regolazione del tempo di accoppiamento19. Questi rapporti suggeriscono che CRISPR / Cas9 può agire come uno strumento efficace per studiare la funzione genica in vivo nei sistemi di insetti. Tuttavia, una procedura dettagliata per la modifica CRISPR/Cas9 nei sistemi di insetti rimane incompleta, il che limita il suo campo di applicazione nella genomica funzionale degli insetti.
Qui, presentiamo un protocollo per eliminare un gene funzionale in H. armigera usando il sistema CRISPR / Cas9. Viene fornito un protocollo dettagliato passo-passo, compresa la progettazione e la preparazione di primer gene-specifici per la produzione di gRNA, la raccolta di embrioni, la microiniezione, l'allevamento di insetti e l'identificazione mutante. Questo protocollo serve come un prezioso riferimento per manipolare qualsiasi gene funzionale in H. armigera e può essere esteso ad altre specie di lepidotteri.
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Protocol
1. Progettazione di primer gene-specifici e preparazione di sgRNA
- Verificare una regione genomica conservata nel gene di interesse attraverso l'amplificazione PCR e le analisi di sequenziamento. Amplificare il gene bersaglio dal DNA del genoma di H. armigera e distinguere gli esoni e gli introni.
NOTA: la specificità della sequenza del sito guida è necessaria per evitare l'editing genetico fuori bersaglio. I possibili siti guida di ricerca negli esoni sono vicini ai 5' UTR del gene. Quindi, è importante assicurarsi che il gene sia completamente non funzionale. Un riepilogo del percorso di flusso per la preparazione di sgRNA è illustrato nella Figura 1. - Scegli i target sgRNA. Utilizzare il sito web online CRISPR CRISPOR (Versione 4.97) (http://crispor.tefor.net/crispor.py) per cercare possibili siti guida negli esoni vicini all'UTR 5' del gene. Inserisci la sequenza dell'esone nella casella di testo e seleziona il genoma target di Helicoverpa armigera (Harm_1.0). Scegli l'opzione protospacer adjacent motif (PAM) di "20 bp-NGG" e lascia le altre impostazioni sui parametri predefiniti in base ai manuali utente dei siti web.
- Confronta le sequenze di guida previste dal software e scegli la sequenza guida con la massima efficienza prevista e il minor numero di disallineamenti per migliorare l'efficienza di editing e ridurre l'editing fuori target. Si consiglia una sequenza di guida di 20 bp contenente uno o due G sull'UTR da 5' in quanto potrebbe aumentare l'efficienza di taglio.
NOTA: si consiglia inoltre una coppia di gRNA nelle regioni degli esoni per ottenere una delezione di segmenti di grandi dimensioni, che semplifica il rilevamento dei mutanti nelle fasi successive. Assicurarsi che la distanza di spaziatura tra le due sequenze di guida selezionate sia di almeno 100 bp. In questo protocollo, scegliamo la proteina SpCas9 comunemente usata, che riconosce il motivo NGG. Secondo le istruzioni del produttore, la sequenza di guida priva di G è accettabile anche quando si sceglie il promotore T7 perché il promotore aggiunge una G all'UTR 5' della sequenza. - Progettare oligonucleotidi avanti e indietro. Impostare l'ordine della sequenza su 5'-20 bp sequenza guida-NGG-3' e invertire completare la sequenza guida. Aggiungere la sequenza del promotore T7 alla sequenza guida del filamento avanti e inverso, rispettivamente in base alla guida per l'utente del kit di sintesi del gRNA.
NOTA: La sequenza PAM NGG deve essere esclusa dalla sequenza oligonucleotidica. - Generare lo sgRNA utilizzando il kit di sintesi del gRNA. Questo processo include tre fasi: assemblaggio del modello di DNA, trascrizione in vitro e purificazione di sgRNA (Figura 2). Eseguire ogni passaggio in conformità con le istruzioni per l'utente.
2. Preparazione e raccolta degli embrioni
- Separare le pupe maschili e femminili come descritto da Hongtao et al.34 e separarle in due diverse gabbie nette. Dopo l'eclosione, dar loro da mangiare ~ 30 ml di soluzione di zucchero bianco al 10% (p / v) in cotone assorbente in una capsula di Petri.
NOTA: 3 g di zucchero bianco sono stati sciolti in 30 ml di acqua sterile per preparare la soluzione di zucchero bianco al 10% (p/v). - Seleziona 50 individui sani da maschi di 3 giorni e femmine di 2 giorni, rispettivamente, e mescolali in una gabbia di rete pulita. Mettere un pezzo di cotone contenente il 10% (p/v) di soluzione zuccherina nella gabbia e mantenere il cotone umido. Coprire le gabbie della rete con una garza e fissare la garza con un elastico. Spruzzare acqua sulla garza per mantenere l'umidità.
- Lascia che le falene maschili e femminili selezionate nel passaggio 2 si accoppiano completamente e osservino la quantità di deposizione delle uova.
NOTA: Il picco di ovodeposizione di H. armigera appare dopo le 9:00 p.m. Pertanto, il tempo dell'accoppiamento dovrebbe essere considerato per garantire un numero sufficiente di uova nelle fasi successive. Al culmine dell'ovodeposizione, sostituire la garza con un panno nero e consentire l'ovodeposizione libera per 30 minuti. Sostituire il panno nero ogni 30 minuti per raccogliere le uova fresche (Figura 3A). - Tagliare il panno nero in patch di forma irregolare con una dimensione di 3 mm circa. Assicurati più uova su ogni cerotto.
NOTA: Evitare di scegliere uova rugose in quanto di solito non sono fecondate. - Incollare del nastro biadesivo su un vetrino per microscopio (25 mm x 75 mm) (Figura 3B). Usando la pinza, incolla le patch con le uova di fila sulla superficie del nastro biadesivo. Premere il margine di ogni cerotto per assicurarsi che si attacchino saldamente al nastro. Raccogliere 50-100 uova per vetrino al microscopio (Figura 3C).
NOTA: Le patch devono coprire l'intera superficie del nastro biadesivo, altrimenti la larva da cova avrà difficoltà a strisciare fuori. - Prima della microiniezione, tenere il vetrino del microscopio sul ghiaccio per ritardare lo sviluppo degli embrioni.
3. Microiniezione di embrioni
- Preparare l'ago tirando un vetro capillare usando un estrattore di micropipette (Figura 4A). Impostare Calore su 540, Tiro su 80, Vel su 75, Tempo su 170 e Pressione su 450. Macinare la punta dell'ago usando una micro smerigliatrice. L'ago ideale mostra una punta affilata (Figura 4B).
- Preparazione di soluzioni iniettabili. Aggiungere 2 μL di proteina Cas9 commercializzata (1 mg/mL) e sgRNA (concentrazione finale 300-500 ng/μL) all'acqua priva di RNasi in un tubo PCR per ottenere una miscela di volume di 10 μL. Il volume di sgRNA dipende dalla sua concentrazione. Mescolare bene con il pipettaggio e metterlo sul ghiaccio.
NOTA: tutte le punte delle pipette e i tubi PCR utilizzati in questo passaggio sono privi di RNasi. - Impostare i parametri del microiniettore elettronico. Impostare la pressione di iniezione (pi) a 1.500 hPa, il tempo di iniezione (ti) a 0,1 s e la pressione di compensazione (pc) a 30 hPa.
- Caricare 2 μL della miscela in un ago utilizzando una punta di pipetta micro caricatore. L'aria residua nella punta dell'ago deve essere esaurita il più possibile.
- Collegare l'ago per iniezione a un micromanipolatore e garantire una stretta connessione tra le due parti.
- Posizionare un vetrino in una capsula di Petri (100 mm) e metterli sul palco del microscopio (Figura 5A).
- Regolare la posizione della punta dell'ago al microscopio ottico fino a quando sia la punta dell'ago che gli embrioni sono visibili al microscopio (Figura 5B).
- Regolare il volume della goccia. Premere il pedale e osservare la goccia di liquido sulla punta dell'ago. Regolare la pressione di iniezione del microiniettore fino a quando il volume di una goccia di liquido è circa un decimo del volume degli embrioni.
NOTA: La qualità dell'ago per iniezione è vitale per il tasso di sopravvivenza degli embrioni. - Inserire con attenzione la punta dell'ago nell'emisfero superiore di un embrione con un angolo di 45 gradi (Figura 5C). Premere il pedale per consegnare la miscela nell'embrione. L'iniezione porta ad una leggera espansione dell'embrione. Ritrarre immediatamente l'ago dall'embrione e spostare la capsula di Petri con una mano fino a quando l'embrione successivo è in prossimità dell'ago e iniettare l'embrione successivo con la stessa procedura.
NOTA: Il deflusso citoplasmatico al foro stenopeico è accettabile. Se la perdita citoplasmatica è eccessiva, regolare l'angolo dell'ago su un angolo più severo fino a quando il deflusso del fluido non è controllato. - Iniettare almeno 300 embrioni per garantire una quantità sufficiente di schiusa. Coprire il coperchio della/e capsula/e di Petri dopo l'iniezione.
NOTA: Il tempo dall'ovodeposizione all'iniezione dei 50-100 embrioni è limitato a 2 ore. La maggior parte degli embrioni sono ancora allo stadio unicellulare entro questo lasso di tempo. In generale, è utile ripetere la procedura di deposizione dell'ovodeporzione durante l'iniezione dell'embrione per promuovere l'efficienza.
4. Allevamento di insetti post-iniezione
- Propagazione di embrioni G0.
- Incubare gli embrioni al 60% di umidità relativa e 28°C in una scatola climatica artificiale con 14 ore di luce/10 ore di buio.
- Controllare lo sviluppo degli embrioni ogni giorno dopo l'iniezione. Quando il colore superficiale degli embrioni si è oscurato, metti la dieta artificiale nella capsula di Petri attorno al vetrino del microscopio e controlla lo sviluppo degli embrioni ogni 12 ore.
NOTA: La dieta artificiale è preparata come descritto da Wu et al.35 e Jha et al.36. - Preparare piatti di coltura a 24 pozzetti e riempire ogni pozzo a un terzo della sua capacità volumetrica con una dieta artificiale.
- Scegli le larve da cova (Figura 5D) usando un piccolo pennello e trasferiscile sulla piastra di coltura a 24 pozzetti. Inserire una larva per pozzo per garantire che ogni larva abbia abbastanza cibo per sopravvivere.
NOTA: Le larve di H. armigera sono state allevate individualmente in ogni pozzo poiché di solito si cannibalizzavano a vicenda.
- Allevamento di larve G0
- Allevare le larve nelle stesse condizioni degli embrioni.
- Controlla le larve tratteggiate ogni giorno. Quando le larve crescono fino al terzo stadio instar, trasferire ogni larva in un nuovo dactylethrae di vetro, riempiendo un quinto del volume con una dieta artificiale.
- Circa 12 d dopo l'incubazione, le larve mature dovrebbero iniziare a impuparsi.
- Le pupe mature G0 si distinguono in base al sesso e poste in gabbie separate prima dell'eclosione. Vengono preparate anche le pupe della stessa età di tipo selvatico.
- G0 adulti allevamento
- Controlla quotidianamente l'eclosione di pupe selvatiche e mutanti.
- Trasferire gli adulti maschi G0 appena chiusi e gli adulti femmine selvatici in una gabbia netta fresca e rendere il rapporto tra G0 e tipo selvatico a circa 1: 1. Fornire loro una soluzione di zucchero al 10% (p/v) lasciata cadere in batuffoli di cotone.
- Insetti allevati usando il metodo di routine sopra fino alla pupa della prima generazione (G1).
- Utilizzando un dactylethrae, trasferire la singola coppia di adulti G1 appena chiusa in un barattolo di plastica (13 cm x 12 cm x 12 cm) fornito con soluzione di zucchero al 10% (p/v). Coprire ogni barattolo con una garza. Prendi circa 50 paia di adulti G1 in totale.
NOTA: L'eclosione delle falene femminili precede quella delle falene maschili. In generale, un maschio di 3 giorni e una femmina di 2 giorni sono sessualmente maturi e pronti ad accoppiarsi. Gli adulti appena chiusi non si accoppiano nel loro primo periodo di luce senza nutrirsi. - Raccogli gli adulti G1 in un barattolo di plastica dopo che hanno deposto le uova. Metti ogni falena adulta in un tubo centrifugo da 1,5 ml.
5. Rilevamento di mutanti knock-out
- Progettare una coppia di primer che coprono il sito troncato previsto. I primer devono essere impostati ad almeno 50 bp di distanza su entrambi i lati (a monte e a valle) dal sito di destinazione.
NOTA: i primer per l'identificazione della sequenza target spesso coprono grandi intervalli per amplificarsi in modo efficiente. - Eseguire la reazione PCR utilizzando i primer di genotipizzazione con DNA del genoma estratto nel paragrafo 1. Eseguire cicli PCR a 95 °C per 20 s; 35 cicli di 95 °C per 20 s, 55 °C per 20 s, 72 °C per 1 min; 72 °C per 5 minuti e 4 °C in attesa. Verificare il prodotto di reazione tramite gel di agarosio all'1% (p/v). La coppia selezionata di primer di rilevamento è stata confermata dalla qualità del prodotto PCR. Se le bande sono evidenti e specifiche, i primer potrebbero essere utilizzati per un ulteriore rilevamento dei mutanti in base alle dimensioni dell'amplicon.
- Schermo per potenziali individui modificati. Rimuovere con attenzione una zampa posteriore usando una pinza e mettere ogni gamba in un tubo a matrice di lisi, rispettivamente. Etichettare il tubo a matrice di lisatura in modo coerente con il numero sul vetro dactylethrae.
- Omogeneizzare la zampa posteriore usando un omogeneizzatore di tessuto. Impostare la velocità a 6,0 m/s e il tempo a 60 s. Estrarre il DNA genomico del campione omogeneizzato utilizzando un kit di estrazione gDNA commerciale secondo le istruzioni del produttore.
- Amplificare il segmento genico utilizzando primer di genotipizzazione con le stesse condizioni di reazione PCR descritte nella fase 2. Confermare il genotipo da un servizio di sequenziamento genico. Una volta rilevati i genotipi mutanti G1 (target dello stesso sito) contenuti nello stesso barattolo, mantenere la progenie G1 e rinominarla come generazione due (G2).
- Metti gli individui G1 dello stesso genotipo in una gabbia di rete. Auto-incrociare le progenie G1 e continuare a schermare usando gli stessi metodi.
- Amplificare il segmento genico e confermare il genotipo con la stessa procedura descritta nella fase 2. Ottenere linee omozigoti G2 e mantenere la linea mutante knock-out.
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Representative Results
Questo protocollo fornisce passaggi dettagliati per ottenere linee di knock-out genico di H. armigera utilizzando la tecnologia CRISPR / Cas9. I risultati rappresentativi ottenuti da questo protocollo sono riassunti per la selezione del gDNA, la raccolta e l'iniezione di embrioni, l'allevamento di insetti e il rilevamento di mutanti.
In questo studio, il sito target del nostro gene di interesse si trovava nel suo secondo esone (Figura 2A). Questo sito è stato altamente conservato e il frammento di banda bersaglio di sgRNA sintetizzato è stato confermato utilizzando l'elettroforesi su gel di agarosio (Figura 2B, C, D).
Le falene maschio e femmina sono state inizialmente allevate in gabbie di rete separate per evitare l'accoppiamento prima del previsto e per garantire una quantità sufficiente di embrioni il più possibile. In generale, è stato raccolto un numero totale di 300 uova fecondate e sono state immediatamente iniettate con la miscela proteica sgRNA/Cas9 (300-500 ng/μL di sgRNA, 200 ng/μL di proteina Cas9) allo stadio unicellulare. Il volume dell'iniezione era circa un decimo di quello degli embrioni. Dopo la microiniezione, gli embrioni sono stati allevati come descritto nel paragrafo 4 e il 40%-60% degli embrioni iniettati è sopravvissuto.
Il rilevamento mutante di un singolo bersaglio sgRNA è stato eseguito sequenziando i prodotti PCR da adulti genitori G1 (Figura 6B). Abbiamo anche testato l'efficacia dell'uso di coppie di sgRNA non sovrapposte su diversi esoni. La grande delezione dei mutanti (Figura 6C,D) può essere facilmente distinta dalle bande di tipo selvatico (Figura 6A).
Il tasso di mutazione calcolato in questo protocollo è stato dell'87,50% quando 16 individui sono stati testati in modo casuale, indicando che questo protocollo era altamente efficiente. I risultati del knockout genico sono stati mostrati in diversi genotipi, ma la maggior parte dei mutanti identificati dal nostro screening erano di tipo -2 bp. Le mutazioni hanno provocato la cessazione prematura della traduzione proteica nel genoma, che successivamente ha portato alla perdita della funzione genica.
Figura 1: Il diagramma di flusso per la preparazione di sgRNA. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Figura 2: Selezione e sintesi di sgRNA bersaglio da H. armigera. (A) Il dominio giallo rappresenta l'esone, mentre la linea nera rappresenta l'introne. Le sequenze rosse indicano la sequenza di destinazione e le sequenze blu indicano il motivo adiacente del protospacer (PAM). (B) Assemblaggio PCR del modello di DNA sgRNA. (C) Il prodotto di trascrizione in vitro. (D) Purificazione di sgRNA. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Figura 3: Raccolta di embrioni. (A) Una gabbia a rete ricoperta di stoffa nera. Le falene maschio e femmina di H. armigera si stavano accoppiando. (B) Il vetrino del microscopio senza embrioni. (C) Il vetrino del microscopio contenente 50-100 embrioni su pezzi di stoffa nera. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Figura 4: Preparazione dell'ago. (A) Estrattore di micropipette. (B) Punta di un ago per microiniezione dopo aver tirato da un estrattore di micropipette. La scatola tratteggiata indica la punta dell'ago ingrandita. La barra della scala rappresenta 1 mm. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Figura 5: Microiniezioni embrionali. (A) L'intero insieme di un sistema di microiniezione contenente un microscopio (al centro) e un microiniettore elettronico (a sinistra) collegato a un micromanipolatore (a destra). (B) Embrioni e ago per microiniezione. (C) Il sito di iniezione dell'embrione è etichettato con la freccia rossa. La barra della scala rappresenta 200 μm. (D) Una larva tratteggiata al microscopio. La barra della scala rappresenta 1 mm. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Figura 6: Rilevazione di mutanti mediante PCR ed elettroforesi su gel. Le frecce nere e le linee rosse indicano i siti target dello sgRNA. (A) La banda nella corsia 1 rappresenta il frammento di amplificazione derivato dal wild type. (B) Le bande nelle corsie 2 e 3 rappresentano il frammento di amplificazione derivato dal mutante utilizzando un singolo bersaglio sgRNA. (C) La rilevazione di un eterozigote utilizzando una coppia di sgRNA non sovrapposti. Le bande nelle corsie 4 e 5 rappresentano il frammento di amplificazione derivato dalla mutazione di due bersagli sgRNA. Le bande inferiori indicano una grande cancellazione di frammenti. (D) I risultati derivano da un omozigote. Le bande nelle corsie 6 e 7 indicano la cancellazione di grandi frammenti. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
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Discussion
L'applicazione del sistema CRISPR/Cas9 ha fornito un potente supporto tecnico per l'analisi della funzione genica e dell'interazione tra vari geni. Il protocollo dettagliato che presentiamo qui dimostra la generazione di un mutante omozigote in H. armigera tramite l'editing del genoma CRISPR / Cas9. Questa procedura affidabile fornisce un modo semplice per la mutagenesi genica diretta in H. armigera.
La scelta dei siti bersaglio crispr potrebbe influire sull'efficienza della mutagenesi37. In questo protocollo, abbiamo confrontato e analizzato più risultati dal sito web online CRISPOR per ottenere un sito di destinazione appropriato. In silico, le previsioni del gRNA presentano alcuni vantaggi. In primo luogo, analizzano l'intero genoma di H. armigera durante la progettazione di sgRNA per ridurre al minimo gli effetti fuori bersaglio. Le risorse online sopra menzionate, così come CHOPCHOP (http://chopchop.cbu.uib.no/), funzionano con un certo numero di genomi di lepidotteri, che potrebbero essere utili per l'editing genetico in altre falene di lepidotteri. In secondo luogo, la classifica degli sgRNA candidati confronta direttamente le possibilità, ma potrebbe includere alcune variazioni basate sui diversi algoritmi. La sequenza di candidati con valutazioni elevate in entrambe le liste tende ad essere più affidabile. Tuttavia, una delle principali limitazioni di questo protocollo è che un gran numero di genomi di insetti sono assenti nei database dei siti Web, quindi esiste un potenziale per effetti fuori bersaglio. Un'altra limitazione è che la sequenza PAM è necessaria per la progettazione di sgRNA, il che può comportare l'incapacità di trovare un sito target appropriato.
Anche i tessuti utilizzati per lo screening dei mutanti sono un fattore cruciale. Il tasso di sopravvivenza, il ciclo di vita e le funzioni fisiologiche degli insetti non dovrebbero essere influenzati. Nel nostro processo di esplorazione del metodo di estrazione ottimale del gDNA, l'estrazione di micro-emolinfa dalle larve è stata tentata per il rilevamento dei mutanti per risparmiare tempo ed evitare l'accoppiamento (dati non pubblicati). Tuttavia, questo metodo ha portato più sfide per quanto riguarda l'efficienza dell'amplificazione PCR e i tassi di sopravvivenza degli adulti (dati non mostrati). Inoltre, Zheng et al.38 hanno riportato un metodo non distruttivo per l'estrazione del gDNA utilizzando l'esuviato o la puparia. Sulla base di questi risultati, abbiamo modificato ed esplorato un approccio che utilizza le zampe posteriori per l'estrazione del gDNA, che consente alle falene adulte di sopravvivere e accoppiarsi naturalmente, migliorando significativamente l'accuratezza del rilevamento di un determinato genotipo. Pertanto, abbiamo sviluppato un nuovo metodo per aumentare il tasso di successo dell'estrazione del gDNA rimuovendo una delle zampe posteriori da ciascun candidato adulto. Abbiamo inoltre confermato che questa operazione non ha influenzato il tasso di sopravvivenza e la frequenza di accoppiamento delle falene adulte. Inoltre, abbiamo scoperto che la delezione di grandi frammenti può essere facilmente osservata dall'elettroforesi su gel quando co-iniettata con una coppia di gRNA attraverso le regioni degli esoni (Figura 6), il che semplifica il processo di identificazione dei mutanti durante lo screening.
Le uova di H. armigera sono raccolte su un panno nero, che rende facile distinguere le uova al microscopio nel processo di microiniezione (Figura 5B). A causa dei comportamenti riproduttivi comuni delle falene lepidottere come l'accoppiamento, l'ovideposizione, la schiusa e l'eclosion39,40,41, questa tecnica di raccolta delle uova potrebbe essere applicata anche ad altre falene lepidottere.
In conclusione, il sistema CRISPR/Cas9 ha dimostrato di essere uno strumento affidabile per facilitare gli studi di genomica funzionale in H. armigera. Le descrizioni dettagliate consentono agli utenti di completare un processo di modifica genetica integrale.
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Disclosures
Gli autori non hanno conflitti di interesse.
Acknowledgments
Questo lavoro è stato sostenuto dalla National Natural Science Foundation of China (31725023, 31861133019 a GW e 31171912 a CY).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 2kb DNA ladder | TransGen Biotech | BM101 | |
| Capillary Glass | World Precision Instrucments | 504949 | referred to as "capillary glass" in the protocol |
| Double Sided Tape | Minnesota Mining and Manufacturing Corporation | 665 | |
| Eppendorf FemtoJet 4i Microinjector | Eppendorf Corporate | E5252000021 | |
| Eppendorf InjectMan 4 micromanipulator | Eppendorf Corporate | 5192000051 | |
| Eppendorf Microloader Pipette Tips | Eppendorf Corporate | G2835241 | |
| GeneArt Precision gRNA Synthesis Kit | Thermo Fisher Scientific | A29377 | |
| Microscope Slide | Sail Brand | 7105 | |
| Olympus Microscope | Olympus Corporation | SZX16 | |
| PrimeSTAR HS (Premix) | Takara Biomedical Technology | R040 | used for mutant detection |
| Sutter Micropipette Puller | Sutter Instrument Company | P-1000 | |
| TIANamp Genomic DNA Kit | TIANGEN Corporate | DP304-03 | |
| TrueCut Cas9 Protein v2 | Thermo Fisher Scientific | A36499 |
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