Summary
Vi rapporterar en enkel, tidseffektiv och hög genomströmning fluorescens spektroskopi-baserade analys för kvantifiering av aktin filament i ex vivo biologiska prover från hjärnvävnader av gnagare och mänskliga ämnen.
Abstract
Actin, den viktigaste komponenten i cytoskeleton, spelar en avgörande roll i upprätthållandet av neuronal struktur och funktion. Under fysiologiska tillstånd förekommer aktin i jämvikt i sina två former: monomeriskt klotformigt (G-aktin) och polymeriserat filamentöst (F- aktin). Vid synaptiska terminaler utgör actin cytoskeleton grunden för kritiska pre- och postsynaptiska funktioner. Dessutom är dynamiska förändringar i aktinpolymeriseringsstatus (interkonvertering mellan klotformiga och filamentösa former av aktin) nära kopplade till plasticitetsrelaterade förändringar i synaptisk struktur och funktion. Vi rapportera här en modifierad fluorescens-baserad metodik för att bedöma polymerisation status för aktin i ex vivo villkor. Analysen använder fluorescerande märkt falloidin, ett fallotoxin som specifikt binder till aktinfilament (F-aktin), vilket ger ett direkt mått på polymeriserat filamentöst aktin. Som ett principbevis ger vi bevis för lämpligheten av analysen både hos gnagare och post-mortem mänsklig hjärnvävnad homogenerar. Med hjälp av latrunculin A (ett läkemedel som depolymeriserar aktinfilament), bekräftar vi nyttan av analysen i övervakning av förändringar i F-aktinnivåer. Vidare utökar vi analysen till biokemiska fraktioner av isolerade synaptiska terminaler där vi bekräftar ökad aktinpolymerisering vid stimulering genom depolarisering med hög extracellulär K+.
Introduction
Cytoskeletal protein aktin är involverad i flera cellulära funktioner, inklusive strukturellt stöd, cellulär transport, cellmotilitet och uppdelning. Aktin förekommer i jämvikt i två former: monomeriskt klotformigt aktin (G-aktin) och polymeriserat filamentöst aktin (F-aktin). Snabba förändringar i polymerisationsstatusen för aktin (interkonvertering mellan dess G- och F- former) resulterar i snabb glödtrådsmontering och demontering och ligger till grund för dess regulatoriska roller i cellulär fysiologi. Actin utgör den viktigaste komponenten i den neuronala cytoskeletala strukturen och påverkar ett brett spektrum av neuronalafunktioner 1,2. Observera att aktin cytoskeleton utgör en integrerad del av den strukturella plattformen för synaptiska terminaler. Som sådan är det en viktig determinant för synaptisk morfogenes och fysiologi och spelar en grundläggande roll för att kontrollera storleken, antalet och morfologin hos synapser3,4,5. I synnerhet är dynamisk aktinpolymerisering-depolymerisering en viktig determinant för den synaptiska ombyggnad som är associerad med synaptisk plasticitet som ligger till grund för minnes- och inlärningsprocesserna. Faktum är att både presynaptiska (såsom neurotransmittorfrisättning6,7,8,9,10) och postsynaptiska funktioner (plasticitetsrelaterad dynamisk ombyggnad11,12,13,14) kritiskt förlitar sig på dynamiska förändringar i polymerisationsstatusen för aktincytoletten.
Under fysiologiska förhållanden regleras F-aktinnivåerna dynamiskt och tätt genom en multimodal väg som inbegriper posttranslationalmodifiering 4,15,16 samt aktinbindande proteiner (ABPs)4,17. ABPs kan påverka aktindynamiken på flera nivåer (såsom att initiera eller hämma polymerisering, inducera glödtråd förgrening, bryta av filament till mindre bitar, främja depolymerisering och skydda mot depolymerisering), och är i sin tur under en strikt modulatorisk kontroll känslig för olika extra- och intracellulära signaler18,19,20. Sådana regulatoriska kontroller på flera nivåer dikterar en strikt reglering av aktindynamiken vid synaptiska cytoskeleton, finjusterande pre- och postsynaptiska aspekter av neuronal fysiologi både vid de basala och aktivitetsinducerade tillstånden.
Med tanke på de viktiga rollerna för aktin i neuronal fysiologi är det inte förvånande att flera studier har gett bevis för förändringar i aktindynamik som kritiska patogena händelser kopplade till ett brett spektrum av neurologiska sjukdomar inklusive neurodegeneration, psykologiska sjukdomar samt neurodevelopmental sjukdomar3,21,22,23,24,25,26,27. Trots den rikedom av forskningsdata som pekar på nyckelroller av aktin i neuronal fysiologi och patofysiologi, kvarstår dock betydande luckor i förståelsen av aktindynamik, särskilt vid synaptiska cytoskeleton. Fler forskningsstudier behövs för att få en bättre förståelse för neuronal aktin och dess förändringar under patologiska förhållanden. Ett viktigt fokusområde i detta sammanhang är bedömningen av aktinpolymeriseringsstatus. Det finns västerländska blotting-baserade kommersiella kit (G-Actin/F-Actin in vivo-analys biokemiska kit; Cytoskeleton SKU BK03728,29) och hemgjorda analyser för bedömning av F-aktinnivåer6. Men eftersom dessa kräver biokemisk isolering av F-aktin och G-aktin och eftersom deras efterföljande kvantifiering är baserad på immunoblotting protokoll, de kan vara tidskrävande. Vi häri rapportera en fluorescens spektroskopi-baserade analys anpassad från en tidigare studie30 med modifieringar som kan användas för att utvärdera både basala nivåer av F-aktin, samt dynamiska förändringar i dess montering-demontering. I synnerhet har vi effektivt modifierat det ursprungliga protokollet som kräver prover som är lämpliga för en 1 mL cuvette till det nuvarande 96-brunnsplåtformatet. Det ändrade protokollet har därför avsevärt minskat den vävnads-/provmängd som krävs för analysen. Vidare ger vi bevis för att protokollet är lämpligt för inte bara hjärnvävnad homogenates, men också subcellulära fraktioner såsom isolerade synaptiska terminaler (synaptosomer och synaptoneurosomes). Slutligen kan analysen användas för nyupptäckta gnagare hjärnvävnader och långtidslagrade post-mortem mänskliga hjärnprover. Notera, medan analysen presenteras i ett neuronalt sammanhang, kan den lämpligt utvidgas till andra celltyper och fysiologiska processer i samband med dem.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Alla försöksförfaranden utfördes i enlighet med bestämmelserna från Universitetet i Otagos etikkommitté för vård och användning av laboratoriedjur (etikprotokoll nr. AUP95/18 och AUP80/17) och Nya Zeelands lagstiftande församling. Mänskliga hjärnvävnader erhölls från Neurologiska vävnadsbanken på sjukhus Clínic-IDIBAPS BioBank i Barcelona, Spanien. Alla protokoll för vävnadsinsamling godkändes av etikkommittén för sjukhus Clínic, Barcelona, och informerat samtycke erhölls från familjerna.
1. Beredning av buffertar och reagenser
- Förbered följande buffertar för homogenisering av hjärnvävnad och beredning av berikad fraktion av synaptiska terminaler:
Homogeniseringsbuffert: 5 mM HEPES, pH 7,4 kompletterat med 0,32 M sackaros
Resuspension buffert: 5 mM Tris, pH 7,4 kompletterat med 0,32 M sackaros
Tvättbuffert: 5 mM Tris, pH 8,1
1,2 M sackaros
1,0 M sackaros
0,85 M sackaros - Tillsätt hemlagad eller kommersiell blandning av proteas- och fosfatashämmare.
OBS: Vi har använt EDTA-fri version av Complete Protease Inhibitor mix (1 tablett per 10 ml buffert) och Fosfatashämmare cocktail IV (1:100; volym: volym). - Förbereda följande buffertar och reagenser för fixering, permeabilisering och bindning av falloidin:
Krebs buffert: 118,5 mM NaCl, 4,7 mM KCl, 1,2 mM MgCl2,2 mM CaCl2,0,1 mM KH2PO4,5 mM NaHCO3, 10 mM glukos, 20 mM HEPES, pH 7,4
1 M KCl
25% glutaraldehyd (stamlösning)
Krebs buffert innehållande 0,1 % Triton X-100 och 1 mg/ml NaBH4
400x Alexa Fluor 647 Falloidin i DMSO
Krebs buffert innehållande 0,32 M sackaros
50 μM latrunculin A i DMSO (stamlösning)
1 M KCl (lagerlösning)
VARNING: Falloidin är giftigt (LD50 = 2 mg/kg) och måste hanteras varsamt. Inandning av glutaraldehyd är giftigt och det bör hanteras i en rökhuv. - Förvara buffertarna vid 4 °C och falloidin och latrunculin A vid -20 °C för långtidslagring.
OBS: Långsiktig lagring av buffertar rekommenderas inte. Protokollet kan pausas här.
2. Homogenisering av hjärnvävnad
- Homogenisera den kryopreserverade eller nyupptäckta råtthjärnvävnaden i 10 volymer homogeniseringsbuffert i ett Potter-Elvehjem-glasrör och mortel på is.
OBS: Optimal homogenisering uppnås med 15-20 slag av pestlen för hand för hjärnvävnader. Framgångsrik homogenisering kan bekräftas genom jämnt flöde av suspensionen genom glasröret. Protokollet kan pausas här. - Bestäm proteinkoncentrationen i homogenatet med hjälp av en Bradford-analys31.
OBS: Alternativa hemlagade eller kommersiella analyser för proteinuppskattning kan också användas. - Späd homogenisera prover i Krebs buffert vid en koncentration av 2-3 mg protein/ml i en volym av 50 μL.
OBS: I några av våra experiment inkuberar vi homogenates med 2 μM latrunculin A eller DMSO (kontroller) vid 37 °C i 1 timme. För detta återanvänds homogenater i 48 μL Krebs buffert och 2 μL 50 μM latrunculin A eller 2 μL DMSO tillsätts. Vidare för immunoblotting samlas en liten mängd prov (10 μg) in efter inkubationen. - Fixera homogenproverna (avsnitt 5).
3. Förberedelse av isolerade nervterminaler
- Förberedelse av synaptosomer
OBS: Alternativa protokoll32,33 för synaptosomer kan också användas.- Centrifughjärna homogenerar vid 1 200 x g i 10 min vid 4 °C.
- Kassera pelleten, som är den råa kärnfraktionen.
- Ytterligare centrifugera supernatanten (S1) som erhålls i steg 3.1.1 vid 12 000 x g i 15 min vid 4 °C.
- Ta bort supernatanten (S2), som är den lösliga cytosoliska fraktionen.
- Återanvänd pelleten (P2) som erhålls i steg 3.1.3, som är den råa synaptosomala fraktionen i återsuspensionsbufferten.
OBS: Volymen av återsuspensionsbuffert beror på mängden startvävnad och mängden pellet som erhålls. Till exempel, när man börjar med 150-300 mg hjärnvävnader, pelleten erhålls kan återanvändas i 200 μL återpensionsbuffert. - Ladda de återanvända råsynaptosomerna på en diskontinuerlig sackarosgradient av lika stora volymer 0,85-1,0-1,2 M sackaros.
OBS: Vi använder vanligtvis 1 ml var och en av sackaroslösningen (för 150-300 mg vävnad). Detta kan ändras beroende på större vävnadsmängder. Diskontinuerliga lutningar kan göras med en 25G-spruta tryckt mot den inre väggen i ultracentrifugeröret och mild skiktning av sackarosskikten. - Centrifugera vid 85 000 x g i 2 timmar vid 4 °C.
OBS: På grund av centrifugeringshastigheten krävs en ultracentrifuge som kan skapa ett vakuum för att minska uppvärmningen. - Samla den synaptosomala fraktionen vid gränssnittet mellan 1,0 och 1,2 M sackaros med en rörspets på 200 μL.
- Tvätta synaptosomalfraktionen med iskallt tvättbuffert genom centrifugering vid 18 000 x g i 10 minuter vid 4 °C.
OBS: För tvättning samlas den synaptosomala fraktionen som erhålls vid gränssnittet 1,0 och 1,2 M sackaros i ett färskt 1,5 ml-rör och en lika stor mängd tvättbuffert tillsätts, vilket säkerställer avlägsnande av höga sackaros från mediet. - Tvätta synaptosomalpelleten igen med iskallt homogeniseringsbuffert vid 12 000 g i 10 minuter vid 4 °C.
- Återanvänd synaptosomerna i homogeniseringsbufferten på is.
Protokollet kan pausas en kort stund här. - Bestäm proteinkoncentrationen med hjälp av en Bradford-analys.
- Återanvänd synaptosomerna i Krebs buffert vid en koncentration av 2-3 mg protein/ml i en volym av 50 μL (47,5 μL om synaptosomer ska depolariseras av KCl; se avsnitt 4).
OBS: För återsuspension snurras den synaptosomala fraktionen först vid 12 000 x g i 5 min vid 4 °C och supernaten (bufferten) avlägsnas. Den synaptosomala pelleten återanvänds sedan i Krebs buffert genom skonsam pipetting med en rörspets på 200 μL. - Fortsätt med depolarisering (avsnitt 4).
- Förberedelse av synaptoneurosomes
OBS: Alternativa protokoll34,35 för synaptoneurosomes kan också användas.- Passera hjärnan homogen genom ett förtröstat nätfilter med 100 μm porstorlek i en filterhållare med en 1 ml spruta.
OBS: Förtrappning av alla filter är viktigt för att undvika förlust av prov och bör göras med hjälp av homogeniseringsbuffert. För detta överförs homogeniseringsbufferten genom filtren i filterhållaren med en 1 ml spruta tills bufferten flödar ut. - Samla filtratet (F1) i ett förkylt 1,5 ml-rör på is.
- Upprepa processen (steg 3.2.1 och 3.2.2) för F1-fraktion för att erhålla den andra filtratet (F2).
- Passera F2-filtrate genom ett nätfilter med 5 μm porstorlek.
- Samla filtratet (F3) i ett förkylt 1,5 ml-rör på is.
- CentrifugfiltraT F3 vid 1 500 x g i 10 min vid 4 °C.
- Återanvänd pelleten (synaptoneurosomes) i Krebs buffert på is vid en koncentration av 2-3 mg protein/ml i en volym av 50 μL (47,5 μL om synaptosomer ska depolariseras av KCl; se avsnitt 4).
Protokollet kan pausas en kort stund här. - Uppskatta proteinkoncentrationen med hjälp av en Bradford-analys.
- Fortsätt med depolarisering (avsnitt 4).
- Passera hjärnan homogen genom ett förtröstat nätfilter med 100 μm porstorlek i en filterhållare med en 1 ml spruta.
4. KCl-medierad depolarisering av isolerade synaptiska terminaler
- Jämviktssynaptosomer/synaptoneurosomes vid 37 °C i 5-10 min.
- Stimulera synaptosomer/synaptoneurosomer genom att lägga till KCl för att öka extracellulära K+ till 50 mM för 30 s vid 37 °C och tillsätt lika stor volym Krebs-buffert till respektive ostimulerad kontrolluppsättning.
OBS: Lägg till exempel till 2,5 μL 1 M KCl till synaptosomer som återanvänds i 47,5 μL Krebs-buffert; och tillsätt 2,5 μL Krebs-buffert till respektive ostimulerad kontrollsynaptosom. För experiment där ett stort antal prover är inblandade, fortsätt med högst 2 prover åt gången så att depolariseringstiden inte överstiger 30 s. - Avsluta stimuleringen genom att tillsätta glutaraldehyd (avsnitt 5).
5. Fixering och falloidinfärgning av prover
- Tillsätt glutaraldehyd till homogena/synaptosomala/synaptoneurosomala prover till en slutlig koncentration på 2,5% i 2-3 min vid rumstemperatur.
OBS: Vi lade till 6 μL glutaraldehydlösning 25% så att den slutliga koncentrationen av glutaraldehyd i 50 μL-proverna (homogenates/synaptosomer/synaptoneurosomer) var ca 2,5%. Fixering är kritisk och bör vara snabb och därför omedelbart efter tillsats av glutaraldehyd, provet bör vara kraftigt virvel. - Sedimentera proverna vid 20 000 x g i 5 min.
- Ta bort supernaten.
OBS: Kassera supernatanten i en rökhuv eftersom glutaraldehyd är giftigt. - Permeabilisera pelleten med återsuspension i 100 μL Krebs buffert som innehåller 0,1% Triton X-100 och 1 mg/mL NaHB4 i 2-3 min vid rumstemperatur.
- Sedimentera proverna vid 20 000 x g i 5 min.
- Ta bort permeabiliseringsbufferten.
- Tvätta pelleten med 200 μL Krebs buffert genom centrifugering vid 20 000 x g i 5 min.
- Återanvänd och färga pelleten med 1x Alexa Fluor 647 Phalloidin (motsvarande 500 μU) i 100 μL Krebs buffert i 10 minuter i mörker vid rumstemperatur.
OBS: Andra sorter av fluorescerande falloidinanaloger finns kommersiellt tillgängliga och kan bytas ut mot analysen. Koncentrationen av falloidin och den totala provvolymen av inkubation kan behöva ändras beroende på mängden och typen av vävnad/prov som testas och optimala förhållanden bör standardiseras i enlighet med detta. - Centrifugera de färgade proverna på 20 000 x g i 5 minuter.
- Ta bort den obundna falloidin (supernatant).
- Tvätta provet med 200 μL Krebs buffert genom centrifugering vid 20 000 x g i 5 minuter.
- Återanvänds i 200 μL Krebs buffert som innehåller 0,32 M sackaros.
Protokollet kan pausas en kort stund här.
6. Fluorometrisk analys och ljusspridning
- Dela ut Alexa Fluor 647 falloidinfärgade prover i en svart 96-brunnsplatta.
- Mät fluorescensintensiteten vid en excitationsvåglängd på 645 nm och en utsläppsvåglängd på 670 nm i en plåtläsare vid rumstemperatur.
- Överför proverna från den svarta 96-brunnsplattan till den genomskinliga 96-brunnsplattan med 200 μL rörspetsar.
- Mät ljusspridningen vid 540 nm för att korrigera eventuella förluster som kan ha inträffat under de tidigare stegen för fixering, permeabilisering och färgning.
OBS: Variationer i biologiskt material som behålls i de färgade proverna kan vara mer framträdande för mindre mängder utgångsmaterial (se Diskussion). - Inkludera en uppsättning Alexa Fluor 647 Phalloidin i Krebs buffert vid olika koncentrationer (0,05x, 0,1x, 0,25x, 0,35x, 0,75x, 0,5x och 1x motsvarande 25, 50, 125, 175, 250, 375 och 500 μU) för varje sats av analysen som en standardkurva.
OBS: Detta är ett valfritt steg och påverkar inte resultaten av analysen, särskilt inte när F-aktinnivåerna uttrycks på ett relativt sätt (avsnitt 7). Protokollet kan pausas här.
7. Dataanalys
- Mängden F-aktin i proverna står i direkt proportion till fluorescensintensiteten hos bundet falloidin. Uttryck i absoluta tal för enheter av falloidinbundna beräknade från den linjära kurvan för den märkta falloidinstandarden.
ANM.: Se figurerna 2A-B, 3A, 4A-B och kompletterande figur 2. - Express F-aktinnivåer som en bråkdel av kontrollproverna.
ANM.: Se figurerna 5A-B.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Linjäriteten hos analysen för utvärdering av F-aktinnivåer
För det första fastställdes en standardkurva för den linjära ökningen av fluorescensen hos Alexa Fluor 647 Phalloidin och upprepades för varje uppsättning experiment (figur 1). För att undersöka analysens linjära utfång bearbetades olika mängder hjärnhom homogenater från gnagare (figurerna 2A och 2B) och efter dödens mänskliga försökspersoner (figur 3A och 3B). Analysen konstaterades vara linjär i intervallet 50-200 μg protein enligt bedömning av mängden märkt falloidin som behållits. Ljusspridning vid 540 nm användes för att bekräfta de olika mängderna prover(figur 2C och figur 3C).
Latrunculin, ett actindepolymeriserande medel minskar bindningen av märkt falloidin
Latrunculin A är känd för att depolymerisera aktinfilament och minska nivåerna av F-aktin36,37,38,39. Homogenates från antingen gnagare eller mänskliga hjärnvävnader inkuberades med 2 μM latrunculin A i 1 timme vid 37 °C för att depolymerisera aktinfilament. Respektive obehandlade kontrollsatser inkuberades med DMSO under samma tid av 1 timme vid 37 °C. Analysen mätte kraftigt förlusten av F-aktinnivåer från 95,7 ± 6,6 (medelvärde ± SEM) i kontrollprover till 72,0 ± 3,2 (medelvärde ± SEM) μU av bundet phalloidin i latrunculin A-behandlade prover i gnagarehjärnhom homogenates (figur 4A). En liknande minskning (från 83,7 ± 3,9 till 66,9 ± 4,2 μU) vid kvarhållande av märkt falloidin observerades också när homogenat ämnen från mänskliga hjärnvävnader utsattes för latrunculin A- behandling (figur 4B). Anmärkningsvärda, totala aktinnivåer, som bedöms genom immunoblotting, ändrades inte vid behandling med latrunculin A hos både råtta(kompletterande figur 1A-B)och humana(kompletterande figur 1C-D)hjärnhom homogenat.
Depolarisering av isolerade synaptiska terminalerstimulerar aktinpolymerisering och glödtrådsbildning
Ex vivo depolarization av isolerade synaptiska terminaler har visat sig resultera i snabb stimulering av aktin polymerisation6,30,40, och detta fenomen användes som en ytterligare bekräftelse av analysen rapporteras häri. Biokemiska fraktioner berikade i synaptiska terminaler utarbetades på två olika sätt. En övertoningsbaserad ultracentrifugationsmetod för att erhålla "synaptosomer"41,42,43,44 och ett sekventiellt filtreringsbaserat protokoll för att erhålla "synaptoneurosomes"43,45,46. Eftersom utbytet för det senare är högre, använde vi det för mänskliga hjärnvävnader efter döden där vävnadsmängderna ofta är begränsande. Å andra sidan föredrog vi att använda synaptosomer med en högre grad av berikning av synaptiska fragment41 för våra råtta hjärnvävnad experiment.
Depolarization av synaptosomes eller synaptoneurosomes och stimulering av aktin polymerisation uppnåddes av en kort (30 sekunder) burst av ökning i extracellulära K+ till 50 mM. KCl-exponering resulterade i ökad falloidinbindning med nästan 40 % i synaptosomer för gnagare jämfört med respektive mockstimulerade kontroller (figur 5A, se även kompletterande figur 2A). En mindre (cirka 20%) Men en konsekvent ökning observerades också hos synaptoneurosomer hos människa som behandlats med KCl (figur 5B, se även kompletterande figur 2A). Dessa experiment validerar robustheten i vår analys för att bestämma förändringar i F-aktinnivåer i hjärnvävnadsprover, inklusive isolerade synaptiska terminaler.
Figur 1. Standardkurva för fluorescens av Alexa Fluor 647 Phalloidin. Linjäriteten hos fluorescensutsläpp av olika mängder (25-500 μU) av märkt falloidin bekräftades av fluorescensspektroskopi vid en excitation på 645 nm och utsläpp på 670 nm (R2 = 0,9942). Data representeras som medelvärde ± SEM (n=3). Klicka här om du vill visa en större version av den här figuren.
Figur 2. Linjäritet av falloidinbindning till helcelliga homogenat från råtta hjärnvävnad. A)Bindning av falloidin till olika mängder homogenat (50-300 μg protein) bedömdes. B)Bindningen var linjär i intervallet 50-200 μg protein (R2 = 0,9602). C)Spridning vid 540 nm användes för att bekräfta olika mängder av proverna (R2 = 0,8319). Data representeras som medelvärde ± SEM (n=4). Klicka här om du vill visa en större version av den här figuren.
Bild 3. Falloidin bindning till helcelliga homogenat från post-mortem mänskliga hjärnvävnad. A)Kvarhållning av falloidin i en rad olika mängder homogenat (50-300 μg protein) utvärderades. B)Phalloidinbindning konstaterades vara linjär i intervallet 50-200 μg protein (R2 = 0,8832). C)Spridning vid 540 nm bekräftade de olika mängderna av proverna (R2 = 0,9730). Data representeras som medelvärde ± SEM (n=4). Klicka här om du vill visa en större version av den här figuren.
Figur 4. Effekter av latrunculin A på F-aktin nivåer. Behandling av hjärnhom homogenates med aktindepolymeriserande medel Latrunculin A (2 μM, 1 h vid 37°C) resulterade i en signifikant minskning av mängden aktinfilament jämfört med respektive mockbehandlade kontrollprover som bedömdes genom retention av märkt falloidin båda hos gnagare (p = 0, 0034; parade tvåsidiga Students t-test) (A) och post-mortem mänskliga vävnader (p = 0,0011; parat tvåstjärtade Studentens t-test) (B). Data representeras som medelvärde ± SEM (n=6 par). Klicka här om du vill visa en större version av den här figuren.
Figur 5. Effekter av KCl-medierad depolarisering på F-aktinbelopp i isolerade synaptiska terminaler. (A) Inkubation av synaptosomer från råtta hjärnan med 50 mM KCl för 30 s vid 37°C stimulerad aktin polymerisation som följaktligen resulterade i en ökning av falloidin bindande (p = 0,0014; parat två-tailed Student'st-test). (B) En mindre ökning observerades också i synaptoneurosomal fraktion från post-mortem mänskliga hjärnvävnader (p = 0,014; parat två-tailed Students t-test). Data representeras som medelvärde ± SEM (n=6 par). Klicka här om du vill visa en större version av den här figuren.
Kompletterande figur 1. Effekter av latrunculin A på totala aktinnivåer. Hjärnan homogenates inkuberades med latrunculin A (2 μM, 1 h vid 37°C) eller lika volym DMSO (1 h vid 37°C). 10 μg protein per prov (latrunculin A behandlade och DMSO mock-treated kontroller) samlades in före fixering. Totala aktinnivåer bedömdes genom immunoblotting. Representativa uppblåsthet visas för råtta (A) och mänskliga (C) hjärnan homogenates. Latrunculin A ändrade inte de totala aktinnivåerna hos båda råtta (B; p = 0,40; parat tvåstjärtade Studentens t-test) och mänskliga (D; p = 0,42; parade tvåsidiga Studentens t-test) hjärnhom homogenates. Data representeras som medelvärde ± SEM (n=3 par). Klicka här för att ladda ner den här filen.
Kompletterande figur 2. Effekter av KCl-medierad depolarisering på F-aktin nivåer i råtta synaptosomes och mänskliga synaptoneurosomes. (A) Inkubation av synaptosomer från råtta hjärnan med 50 mM KCl (30s vid 37 °C) stimulerade aktin polymerisation och en därav följande ökning av falloidin bindande (p = 0,0019; parat två-tailed Student'st-test). (B) Ökning av kvarhållningen av falloidin observerades också i human synaptoneurosomal fraktion depolariserad av KCl jämfört med respektive ostimulerade kontroller (p = 0, 015; parat tvåsidiga Students t-test). Data representeras som medelvärde ± SEM (n=6 par). Klicka här för att ladda ner den här filen.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Den analys som beskrivs här, väsentligen anpassad från en tidigare studie30 med modifieringar, använder ett fallotoxin, falloidin märkt med en fluorescerande etikett. Fluorescerande falloidin analoger anses vara guldstandarden för färgning aktin filament i fastavävnader 47,48,49. Faktum är att de är de äldsta verktygen för att specifikt identifiera aktinfilament50 och fortfarande är de mest använda instrumenten för att upptäcka aktinfilament, särskilt för efterföljande fluorescensmikroskopibaserade analyser. Viktigt, falloidin har visat sig färga även lösa, oregelbundna meshwork av korta aktin filament51, vilket indikerar att falloidin bindande inte är beroende av glödtrådens längd. Vårt protokoll, å andra sidan, förlitar sig på fluorescensspektroskopi för att analysera aktindynamik i ex vivo biologiska prover, till exempel hjärnvävnader från gnagare och människor.
Den största fördelen med protokollet är att det avsevärt minskar den tid det tar med avseende på de befintliga protokollen som först kräver en höghastighets centrifugeringsbaserad biokemisk isolering av F-aktin (separation från G-aktin baserat på olöslighet av aktinfilament i vissa tvätt- och rengöringsmedel som Triton X-100) och efterföljande analys av immunoreaktiva nivåer med hjälp av western blotting6,28,29. Tidseffektiviteten hos vår analys är också en fördel när det gäller falloidinbaserade immunocytokemitekniker40,52, även om det kan finnas några andra fördelar förknippade med den senare. En annan fördel är att det kan tillämpas på kryopreserverade mänskliga hjärnvävnader efter döden, vars upphandling alltid är förknippad med någon försening efter slakt. När det gäller det ursprungliga protokoll30 från vilket denna metod har ändrats har vi dessutom avsevärt minskat kravet på vävnadsmängden från 1 ml cuvette till en enda brunn på en 96-brunnsplatta. På grund av införandet av en falloidin standardkurva i varje uppsättning experiment kan vårt protokoll dessutom kvantifiera absoluta nivåer av aktinfilament i enheter av falloidinbundna (figurerna 2A-B, 3A, 4A-B; Se även kompletterande figur 2), liksom halterna i förhållande till kontrollprover(figur 5A-B).
Det bör noteras att tillämpningen av falloidin för att bedöma F-aktin nivåer dock är begränsad till fasta celler och prover, både för vårt analysprotokoll samt mikroskopi-baserade protokoll. Detta beror på att falloidin i huvudsak är en giftig bicyklisk heptapeptid som binder specifikt vid gränssnittet mellan F-aktinunderenheter med hög affinitet och stabiliserar dessa aktinfilament, vilket gör dem oförmögna att avpolymerisera och faktiskt öka nettokonverteringen av G-aktin till F-aktin40,53,54. Därför stabiliserar falloidin aktinfilament in vivo och in vitro, och kan resultera i betydande förändringar i jämviktsstatusen för aktin i sig47,55. Som sådan utvärdering av aktin polymerisation status medieras av fluorescerande falloidin är baserat på arresterade glödtråd strukturer. På grund av dess låga permeabilitet genom lipid gallayer, är falloidinbaserade metoder beroende av permeabilisering av cellerna eller biologiska prover. Ogenomförbarhet av en tidskurs live-cell analys är därför en stor begränsning av protokollet som med immunocytochemistry-baserade metoder som använder falloidin.
Ogenomförbarhet av falloidinbaserade metoder för att utvärdera dynamiska förändringar i aktinfilament i levande unfixerade celler väcker frågan om det finns alternativa förfaranden för att göra det. Faktum är att framsteg har gjorts i detta avseende med exogena uttryck av fluorescerande aktinanaloger före analys med hjälp av protokoll som videomikrografi36,56,fluorescens som återhämtar sig efter fotografering (FRAP)38 eller fluorescens resonansenergiöverföring (FRET)39. Heterologt uttryck för fluorescerande taggade peptider och proteiner som binder aktinfilament används också för att studera aktindynamik i levande celler; emellertid finns det missgynnar och begränsningar som är tillhörande med dem as well as med det heterologous uttryckt av fluorescerande taggat aktin47,49,57. Till exempel är G-aktin som omfattar 50-70% av det totala eten i de flesta celler lösligt och fritt diffusibelt i cytosolen, vilket resulterar i en högre bakgrund som orsakar utmaningar i differentiering av signaler från aktinfilament specifikt57.
En kritisk faktor i analysen är den som visas i figur 2 och figur 3. Det är inte linjärt i hela intervallet av testade proteinmängder. Därför bör en optimal mängd protein som är lämpligt för analysen bestämmas först eller mängden falloidinanalog justeras så att den inte längre begränsar (vid högre mängder proteiner). En annan kritisk aspekt av protokollet är att de flera centrifugationsbaserade stegen för avlägsnande av fixativ, permeabiliseringsmedel och obundet falloidin kan leda till varierande förlust av proteiner (och F-aktinbundet falloidin) från proverna, särskilt när lägre mängder prover används. Därför är det viktigt att normalisera mängden prov som behålls genom att övervaka ljusspridning vid 540 nm. Slutligen, eftersom aktin är i ett dynamiskt tillstånd av interkonvertering mellan dess F- och G-former, bör fixeringen vara snabb. En mindre relaterad kritisk aspekt av analysen är att vi inte kunde utvärdera dess effektivitet vid bedömning av farmakologisk aktinpolymerisering. I motsats till farmakologisk aktindepolymerisering av latrunculin A, jasplakinolid (ett tillförlitligt och allmänt använt aktinpolymeriseringsmedel) har överlappande bindande platser med falloidin och hämmar konkurrenskraftigt dess bindning till aktinfilament58,59. Anställning av KCl-stimulerade synaptiska terminaler som ex vivo-modell för ökad aktinpolymerisering indikerar dock att vår analys också kan upptäcka ökningar av F-aktinnivåer.
Sammanfattningsvis beskriver vi en robust tidseffektiv och hög genomströmningsanalys för analys av aktinfilament (F-aktin) och dess växlingar i fysiologiska och patofysiologiska tillstånd som är lämpliga för ett 96-brunnsplattaformat. I kombination med andra befintliga metoder för utvärdering av F-aktin i fasta och ofixerade prover kommer protokollet att visa sig vara ett viktigt verktyg i aktinrelaterade studier inom neurovetenskapliga områden, liksom andra områden inom biologisk vetenskaplig forskning.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Författarna har inget att avslöja.
Acknowledgments
Detta arbete stöddes av Neurologiska stiftelsen i Nya Zeeland (1835-PG), Nya Zeeland Health Research Council (#16-597) och Institutionen för anatomi, University of Otago, Nya Zeeland. Vi står i skuld till Den neurologiska vävnadsbanken i HCB-IDIBAPS BioBank (Spanien) för mänskliga hjärnvävnader. Vi tackar Jiaxian Zhang för hennes hjälp med att spela in och redigera videon.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 3.5 mL, open-top thickwall polycarbonate tube | Beckman Coulter | 349622 | For gradient centrifugation (synaptosome prep) |
| Alexa Fluor 647 Phalloidin | Thermo Fisher Scientific | A22287 | F-actin specific ligand |
| Antibody against b-actin | Santa Cruz Biotechnology | Sc-47778 | For evaluation of total actin levels by immunoblotting |
| Antibody against GAPDH | Abcam | Ab181602 | For evaluation of GAPDH levels by immunoblotting |
| Bio-Rad Protein Assay Dye Reagent Concentrate | Bio-Rad | 5000006 | Bradford based protein estimation |
| Calcium chloride dihydrate (CaCl2·2H2O) | Sigma-Aldrich | C3306 | Krebs buffer component |
| cOmplete, Mini, EDTA-free Protease Inhibitor Cocktail | Sigma-Aldrich | 4693159001 | For inhibition of endogenous protease activity during sample preparation |
| Corning 96-well Clear Flat Bottom Polystyrene | Corning | 3596 | For light-scattering measurements |
| D-(+)-Glucose | Sigma-Aldrich | G8270 | Krebs buffer component |
| Dimethyl sulfoxide | Sigma-Aldrich | D5879 | Solvent for phalloidin and latrunculin A |
| Fluorescent flatbed scanner (Odyssey Infrared Scanner) | Li-Cor Biosciences | For detection of immunoreactive signals on immunoblots | |
| Glutaraldehyde solution (25% in water) Grade II | Sigma-Aldrich | G6257 | Fixative |
| HEPES | Sigma-Aldrich | H3375 | Buffer ingredient for sample preparation and Krebs buffer component |
| Latrunculin A | Sigma-Aldrich | L5163 | Depolymerizer of actin filaments |
| Magnesium chloride hexahydrate (MgCl2·6H2O) | Sigma-Aldrich | M2670 | Krebs buffer component |
| Microplates | |||
| Mitex membrane filter 5 mm | Millipore | LSWP01300 | Preparation of synaptoneurosomes |
| Nunc F96 MicroWell Black Plate | Thermo Fisher Scientific | 237105 | For fluorometric measurements |
| Nylon net filter 100 mm | Millipore | NY1H02500 | Preparation of synaptoneurosomes |
| Phosphatase Inhibitor Cocktail IV | Abcam | ab201115 | For inhibition of endogenous phosphatase activity during sample preparation |
| Potassium chloride (KCl) | Sigma-Aldrich | P9541 | Krebs buffer component and for depolarization of synaptic terminals |
| Potassium phosphate monobasic ((KH2PO4) | Sigma-Aldrich | P9791 | Krebs buffer component |
| Sodium borohydride (NaBH4) | Sigma-Aldrich | 71320 | Component of Permeabilization buffer |
| Sodium chloride (NaCl) | LabServ (Thermo Fisher Scientific) | BSPSL944 | Krebs buffer component |
| Sodium hydrogen carbonate (NaHCO3) | LabServ (Thermo Fisher Scientific) | BSPSL900 | Krebs buffer component |
| SpectraMax i3x | Molecular Devices | For fluorometric measurements | |
| Sucrose | Fisher Chemical | S/8600/60 | Buffer ingredient for sample preparation |
| Swimnex Filter Holder | Millipore | Sx0001300 | Preparation of synaptoneurosomes |
| Tissue grinder 5 mL Potter-Elvehjem | Duran Wheaton Kimble | 358034 | For tissue homogenization |
| Triton X-100 | Sigma-Aldrich | X100 | Component of Permeabilization buffer |
| Trizma base | Sigma-Aldrich | T6066 | Buffer ingredient for sample preparation |
References
- Penzes, P., Rafalovich, I. Regulation of the actin cytoskeleton in dendritic spines. Advances in Experimental Medicine and Biology. 970, 81-95 (2012).
- Venkatesh, K., Mathew, A., Koushika, S. P. Role of actin in organelle trafficking in neurons. Cytoskeleton. 77 (3-4), 97-109 (2020).
- Shirao, T., González-Billault, C. Actin filaments and microtubules in dendritic spines. Journal of Neurochemistry. 126 (2), 155-164 (2013).
- Bertling, E., Hotulainen, P. New waves in dendritic spine actin cytoskeleton: From branches and bundles to rings, from actin binding proteins to post-translational modifications. Molecular and Cellular Neuroscience. 84, 77-84 (2017).
- Bellot, A., et al. The structure and function of actin cytoskeleton in mature glutamatergic dendritic spines. Brain Research. 1573, 1-16 (2014).
- Wolf, M., et al. ADF/Cofilin controls synaptic actin dynamics and regulates synaptic vesicle mobilization and exocytosis. Cerebral Cortex. 25 (9), 2863-2875 (2015).
- Morales, M., Colicos, M. A., Goda, Y. Actin-dependent regulation of neurotransmitter release at central synapses. Neuron. 27 (3), 539-550 (2000).
- Doussau, F., Augustine, G. J. The actin cytoskeleton and neurotransmitter release: An overview. Biochimie. 82 (4), 353-363 (2000).
- Sakaba, T., Neher, E. Involvement of actin polymerization in vesicle recruitment at the calyx of held synapse. Journal of Neuroscience. , (2003).
- Lee, J. S., Ho, W. K., Lee, S. H. Actin-dependent rapid recruitment of reluctant synaptic vesicles into a fast-releasing vesicle pool. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. , (2012).
- Rust, M. B., et al. Learning, AMPA receptor mobility and synaptic plasticity depend on n-cofilin-mediated actin dynamics. EMBO Journal. 29, 1889-1902 (2010).
- Bosch, M., et al. Structural and molecular remodeling of dendritic spine substructures during long-term potentiation. Neuron. 82, 444-459 (2014).
- Hanley, J. G. Actin-dependent mechanisms in AMPA receptor trafficking. Frontiers in Cellular Neuroscience. 8, 381 (2014).
- Kasai, H., Fukuda, M., Watanabe, S., Hayashi-Takagi, A., Noguchi, J. Structural dynamics of dendritic spines in memory and cognition. Trends in Neurosciences. 33, 121-129 (2010).
- Terman, J. R., Kashina, A. Post-translational modification and regulation of actin. Current Opinion in Cell Biology. 25 (1), 30-38 (2013).
- Wilson, C., Terman, J. R., González-Billault, C., Ahmed, G. Actin filaments-A target for redox regulation. Cytoskeleton. 73, 577-595 (2016).
- Borovac, J., Bosch, M., Okamoto, K. Regulation of actin dynamics during structural plasticity of dendritic spines: Signaling messengers and actin-binding proteins. Molecular and Cellular Neuroscience. 91, 122-130 (2018).
- Saneyoshi, T., Hayashi, Y. The Ca2+ and Rho GTPase signaling pathways underlying activity-dependent actin remodeling at dendritic spines. Cytoskeleton. 69 (8), 545-554 (2012).
- Mizuno, K. Signaling mechanisms and functional roles of cofilin phosphorylation and dephosphorylation. Cellular Signalling. 25 (2), 457-469 (2013).
- Dos Remedios, C. G., et al. Actin binding proteins: Regulation of cytoskeletal microfilaments. Physiological Reviews. 83 (2), 433-473 (2003).
- Bamburg, J. R., Bernstein, B. W. Actin dynamics and cofilin-actin rods in Alzheimer disease. Cytoskeleton. 73 (9), 477-497 (2016).
- Penzes, P., VanLeeuwen, J. E. Impaired regulation of synaptic actin cytoskeleton in Alzheimer's disease. Brain Research Reviews. 67 (1-2), 184-192 (2011).
- Pelucchi, S., Stringhi, R., Marcello, E. Dendritic spines in Alzheimer's disease: How the actin cytoskeleton contributes to synaptic failure. International Journal of Molecular Sciences. 21 (3), 908 (2020).
- Kounakis, K., Tavernarakis, N. The Cytoskeleton as a Modulator of Aging and Neurodegeneration. Advances in Experimental Medicine and Biology. 1178, 227-245 (2019).
- Nishiyama, J. Plasticity of dendritic spines: Molecular function and dysfunction in neurodevelopmental disorders. Psychiatry and Clinical Neurosciences. 73 (9), 541-550 (2019).
- Michaelsen-Preusse, K., Feuge, J., Korte, M. Imbalance of synaptic actin dynamics as a key to fragile X syndrome. Journal of Physiology. 596 (14), 2773-2782 (2018).
- Hensel, N., Claus, P. The Actin Cytoskeleton in SMA and ALS: How Does It Contribute to Motoneuron Degeneration. Neuroscientist. 24 (1), 54-72 (2018).
- Kommaddi, R. P., et al. Aβ mediates F-actin disassembly in dendritic spines leading to cognitive deficits in alzheimer's disease. Journal of Neuroscience. 38 (5), 1085-1099 (2018).
- Kommaddi, R. P., et al. Glutaredoxin1 Diminishes Amyloid Beta-Mediated Oxidation of F-Actin and Reverses Cognitive Deficits in an Alzheimer's Disease Mouse Model. Antioxidants and Redox Signaling. 31 (18), 1321-1338 (2019).
- Bernstein, B. W., Bamburg, J. R. Cycling of actin assembly in synaptosomes and neurotransmitter release. Neuron. 3 (2), 257-265 (1989).
- Sapan, C. V., Lundblad, R. L., Price, N. C. Colorimetric protein assay techniques. Biotechnology and applied biochemistry. 29 (2), Pt 2 99-108 (1999).
- Kolodziej, A., et al. High resolution quantitative synaptic proteome profiling of mouse brain regions after auditory discrimination learning. Journal of Visualized Experiments. (118), e54992 (2016).
- Byun, Y. G., Chung, W. S. A novel in vitro live-imaging assay of astrocyte-mediated phagocytosis using pH indicator-conjugated synaptosomes. Journal of Visualized Experiments. (132), e56647 (2018).
- Chmielewska, J. J., Kuzniewska, B., Milek, J., Urbanska, K., Dziembowska, M. Neuroligin 1, 2, and 3 Regulation at the Synapse: FMRP-Dependent Translation and Activity-Induced Proteolytic Cleavage. Molecular Neurobiology. 56 (4), 2741-2759 (2019).
- Kuzniewska, B., Chojnacka, M., Milek, J., Dziembowska, M. Preparation of polysomal fractions from mouse brain synaptoneurosomes and analysis of polysomal-bound mRNAs. Journal of Neuroscience Methods. 293, 226-233 (2018).
- Fischer, M., Kaech, S., Knutti, D., Matus, A. Rapid actin-based plasticity in dendritic spines. Neuron. 20 (5), 847-854 (1998).
- Caesar, M., Felk, S., Aasly, J. O., Gillardon, F. Changes in actin dynamics and F-actin structure both in synaptoneurosomes of LRRK2(R1441G) mutant mice and in primary human fibroblasts of LRRK2(G2019S) mutation carriers. Neuroscience. 284, 311-324 (2015).
- Star, E. N., Kwiatkowski, D. J., Murthy, V. N. Rapid turnover of actin in dendritic spines and its regulation by activity. Nature Neuroscience. 5, 239-246 (2002).
- Okamoto, K. I., Nagai, T., Miyawaki, A., Hayashi, Y. Rapid and persistent modulation of actin dynamics regulates postsynaptic reorganization underlying bidirectional plasticity. Nature Neuroscience. 7, 1104-1112 (2004).
- Bernstein, B. W., Dewit, M., Bamburg, J. R. Actin disassembles reversibly during electrically induced recycling of synaptic vesicles in cultured neurons. Molecular Brain Research. 53 (1-2), 236-250 (1998).
- Ahmad, F., Liu, P. Synaptosome as a tool in Alzheimer's disease research. Brain Research. 1746, 147009 (2020).
- Ahmad, F., et al. Isoform-specific hyperactivation of calpain-2 occurs presymptomatically at the synapse in Alzheimer's disease mice and correlates with memory deficits in human subjects. Scientific Reports. 8 (1), 13119 (2018).
- Ahmad, F., et al. Reactive Oxygen Species-Mediated Loss of Synaptic Akt1 Signaling Leads to Deficient Activity-Dependent Protein Translation Early in Alzheimer's Disease. Antioxidants and Redox Signaling. 27 (16), 1269-1280 (2017).
- Ahmad, F., et al. Developmental lead (Pb)-induced deficits in redox and bioenergetic status of cerebellar synapses are ameliorated by ascorbate supplementation. Toxicology. 440, 152492 (2020).
- Ahmad, F., Salahuddin, M., Alsamman, K., Herzallah, H. K., Al-Otaibi, S. T. Neonatal maternal deprivation impairs localized de novo activity-induced protein translation at the synapse in the rat hippocampus. Bioscience Reports. 38 (3), 0118 (2018).
- Ahmad, F., Salahuddin, M., Alsamman, K., Almulla, A. A., Salama, K. F. Developmental lead (Pb)-induced deficits in hippocampal protein translation at the synapses are ameliorated by ascorbate supplementation. Neuropsychiatric Disease and Treatment. 14, 3289-3298 (2018).
- Melak, M., Plessner, M., Grosse, R. Actin visualization at a glance. Journal of Cell Science. 130 (3), 525-530 (2017).
- Adams, A. E. M., Pringle, J. R. Staining of actin with fluorochrome-conjugated phalloidin. Methods in Enzymology. 194, 729-731 (1991).
- Belin, B. J., Goins, L. M., Mullins, R. D. Comparative analysis of tools for live cell imaging of actin network architecture. BioArchitecture. 4 (6), 189-202 (2014).
- Wulf, E., Deboben, A., Bautz, F. A., Faulstich, H., Wieland, T. Fluorescent phallotoxin, a tool for the visualization of cellular actin. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 76, 4498-4502 (1979).
- Taffarel, M., de Souza, M. F., Machado, R. D., de Souza, W. Localization of actin in the electrocyte of Electrophorus electricus L. Cell and Tissue Research. 242, 453-455 (1985).
- Glebov, O. O. Distinct molecular mechanisms control levels of synaptic F-actin. Cell Biology International. 44 (1), 336-342 (2020).
- Dancker, P., Löw, I., Hasselbach, W., Wieland, T. Interaction of actin with phalloidin:. Polymerization and stabilization of F-actin. BBA - Protein Structure. , (1975).
- Lengsfeld, A. M., Löw, I., Wieland, T., Dancker, P., Hasselbach, W. Interaction of phalloidin with actin. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 71 (7), 2803-2807 (1974).
- Coluccio, L. M., Tilney, L. G. Phalloidin enhances actin assembly by preventing monomer dissociation. Journal of Cell Biology. 99, 529-535 (1984).
- Colicos, M. A., Collins, B. E., Sailor, M. J., Goda, Y. Remodeling of synaptic actin induced by photoconductive stimulation. Cell. 107 (5), 605-616 (2001).
- Lemieux, M. G., et al. Visualization of the actin cytoskeleton: Different F-actin-binding probes tell different stories. Cytoskeleton. 71, 157-169 (2014).
- Bubb, M. R., Senderowicz, A. M. J., Sausville, E. A., Duncan, K. L. K., Korn, E. D. Jasplakinolide, a cytotoxic natural product, induces actin polymerization and competitively inhibits the binding of phalloidin to F-actin. Journal of Biological Chemistry. , (1994).
- Holzinger, A. Jasplakinolide: an actin-specific reagent that promotes actin polymerization. Methods in molecular biology. 269, Clifton, N.J. 14869-14871 (2009).
