Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Neuroscience
Click here for the English version

Neuroscience

En tidseffektiv fluorescensspektroskopibasert analyse for evaluering av Actin-polymerisasjonsstatus hos gnagere og humant hjernevev

Published: June 3, 2021 doi: 10.3791/62268
Automatic Translation
1, 1
1Department of Anatomy, School of Biomedical Sciences, University of Otago

Summary

Vi rapporterer en enkel, tidseffektiv og høy-gjennomstrømning fluorescens spektroskopi-basert analyse for kvantifisering av aktinfilamenter i ex vivo biologiske prøver fra hjernevev av gnagere og mennesker.

Abstract

Actin, hovedkomponenten i cytoskjelett, spiller en kritisk rolle i vedlikehold av nevronstruktur og funksjon. Under fysiologiske tilstander forekommer aktin i likevekt i sine to former: monomerisk kuleformet (G-aktin) og polymerisert filamentøs (F-aktin). På synaptiske terminaler danner aktin cytoskeleton grunnlaget for kritiske pre- og postsynaptiske funksjoner. Videre er dynamiske endringer i aktinpolymeriseringsstatusen (interkonversjon mellom kuleformede og filamentøse former for aktin) nært knyttet til plastisitetsrelaterte endringer i synaptisk struktur og funksjon. Vi rapporterer her en modifisert fluorescensbasert metodikk for å vurdere polymerisasjonsstatusen til aktin under ex vivo-forhold. Analysen benytter fluorescerende merket falloidin, et fallotoksin som spesifikt binder seg til aktinfilamenter (F-aktin), og gir et direkte mål på polymerisert filamentøs aktin. Som et prinsippbevis gir vi bevis for analysens egnethet både hos gnagere og post-mortem humane hjernevev homogenater. Ved hjelp av latrunculin A (et stoff som depolymeriserer aktinfilamenter), bekrefter vi nytten av analysen i overvåking av endringer i F-aktinnivåer. Videre utvider vi analysen til biokjemiske fraksjoner av isolerte synaptiske terminaler der vi bekrefter økt aktinpolymerisering ved stimulering ved depolarisering med høy ekstracellulær K+.

Introduction

Cytoskeletal protein actin er involvert i flere cellulære funksjoner, inkludert strukturell støtte, cellulær transport, cellemotilitet og divisjon. Aktin forekommer i likevekt i to former: monomerisk kuleformet aktin (G-aktin) og polymerisert filamentøs aktin (F-aktin). Raske endringer i polymerisasjonsstatusen til aktin (interkonversjon mellom G- og F-formene) resulterer i rask filamentmontering og demontering og ligger til grunn for dens regulatoriske roller i cellulær fysiologi. Actin danner hovedkomponenten i den nevronale cytoskeletale strukturen og påvirker et bredt spekter av nevronfunksjoner1,2. Vær oppmerksom på at actin cytoskeleton danner en integrert del av den strukturelle plattformen til synaptiske terminaler. Som sådan er det en stor determinant for synaptisk morfogenese og fysiologi og spiller en grunnleggende rolle i kontroll av størrelsen, antallet og morfologien til synapser3,4,5. Spesielt er dynamisk aktinpolymerisering en nøkkeldeterminant for den synaptiske ombyggingen forbundet med synaptisk plastisitet som ligger til grunn for minnet og læringsprosessene. Faktisk er både presynaptiske (for eksempel nevrotransmitterutløsning6,7,8,9,10) og postsynaptiske funksjoner (plastisitetsrelatert dynamisk ombygging11,12,13,14) kritisk avhengig av dynamiske endringer i polymerisasjonsstatusen til aktin cytoskeleton.

Under fysiologiske forhold er F-aktinnivåer dynamisk og tett regulert gjennom en multimodal vei som involverer posttranslasjonsmodifisering4,15,16 samt aktinbindende proteiner (ABPer)4,17. ABPer kan påvirke aktindynamikk på flere nivåer (for eksempel initiere eller hemme polymerisering, indusere filamentforgrening, severing av filamenter til mindre biter, fremme depolymerisering og beskytte mot depolymerisering), og er i sin tur under en streng modulatorisk kontroll som er følsom for ulike ekstra- og intracellulære signaler18,19,20. Slike regulatoriske kontroller på flere nivåer dikterer en streng regulering av aktindynamikk ved synaptisk cytoskjelett, finjustering av pre- og postsynaptiske aspekter ved nevronal fysiologi både ved basale og aktivitetsinduserte tilstander.

Gitt de viktige rollene til aktin i nevronal fysiologi, er det ikke overraskende at flere studier har gitt bevis for endringer i aktindynamikk som kritiske patogene hendelser knyttet til et bredt spekter av nevrologiske lidelser, inkludert nevrodegenerasjon, psykologiske sykdommer samt nevrodevelopmentale plager3,21,22,23,24,25,26,27. Til tross for rikdommen av forskningsdata som peker på sentrale roller i aktin i nevronal fysiologi og patofysiologi, forblir imidlertid betydelige hull fortsatt i forståelsen av aktindynamikk, spesielt ved synaptisk cytoskeleton. Flere forskningsstudier er nødvendig for å få en bedre forståelse av nevronal aktin og dens endringer under patologiske forhold. Et hovedfokus i denne sammenhengen er vurderingen av aktinpolymerisasjonsstatus. Det er vestlige blotting-baserte kommersielle sett (G-Actin / F-Actin in vivo assay biokjemisk sett; Cytoskeleton SKU BK03728,29) og hjemmelagde analyser for vurdering av F-aktin nivå6. Men fordi disse krever biokjemisk isolasjon av F-aktin og G-aktin, og fordi deres påfølgende kvantifisering er basert på immunoblottingsprotokoller, kan de være tidkrevende. Vi rapporterer heri en fluorescensspektroskopibasert analyse tilpasset fra en tidligere studie30 med modifikasjoner som kan brukes til å evaluere både basale nivåer av F-aktin, samt dynamiske endringer i monteringsdemonteringen. Spesielt har vi effektivt modifisert den opprinnelige protokollen som krever prøver som passer for en 1 ml cuvette til det nåværende 96-brønns plateformatet. Den modifiserte protokollen har derfor redusert vevet/prøvemengden som kreves for analysen betydelig. Videre gir vi bevis på at protokollen er egnet for ikke bare hjernevev homogenater, men også subcellulære fraksjoner som isolerte synaptiske terminaler (synaptosomer og synaptoneurosomer). Til slutt kan analysen brukes til fersk dissekert gnagerhjernevev og langsiktige lagrede post-mortem menneskelige hjerneprøver. Vær oppmerksom på at mens analysen presenteres i en nevronal kontekst, kan den tilpasses andre celletyper og fysiologiske prosesser forbundet med dem.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

Alle eksperimentelle prosedyrer ble utført i samsvar med regelverket i Universitetet i Otagos etiske komité for pleie og bruk av forsøksdyr (etikkprotokollnr. AUP95/18 og AUP80/17) og New Zealand lovgivende forsamling. Humant hjernevev ble hentet fra Neurological Tissue Bank of Hospital Clínic-IDIBAPS BioBank i Barcelona, Spania. Alle vevsinnsamlingsprotokoller ble godkjent av Etikkkomiteen for sykehus Clínic, Barcelona, og informert samtykke ble innhentet fra familiene.

1. Utarbeidelse av buffere og reagenser

  1. Forbered følgende buffere for homogenisering av hjernevev og fremstilling av beriket brøkdel av synaptiske terminaler:
    Homogeniseringsbuffer: 5 mM HEPES, pH 7,4 supplert med 0,32 M sukrose
    Resuspension buffer: 5 mM Tris, pH 7.4 supplert med 0,32 M sukrose
    Vaskebuffer: 5 mM Tris, pH 8.1
    1,2 M sukrose
    1,0 M sukrose
    0,85 M sukrose
  2. Tilsett hjemmelaget eller kommersiell blanding av protease og fosfatasehemmere.
    MERK: Vi har brukt EDTA-fri versjon av Complete Protease Inhibitor mix (1 tablett per 10 ml buffer) og Fosfatasehemmer cocktail IV (1:100; volum: volum).
  3. Forbered følgende buffere og reagenser for fiksering, permeabilisering og binding av falloidin:
    Krebs buffer: 118,5 mM NaCl, 4,7 mM KCl, 1,2 mM MgCl2, 2 mM CaCl2, 0,1 mM KH2PO4,5 mM NaHCO3, 10 mM glukose, 20 mM HEPES, pH 7,4
    1 M KCl
    25% glutaraldehyd (lagerløsning)
    Krebs buffer som inneholder 0,1 % Triton X-100 og 1 mg/ml NaBH4
    400x Alexa Fluor 647 Phalloidin i DMSO
    Krebs buffer som inneholder 0,32 M sukrose
    50 μM latrunculin A i DMSO (lagerløsning)
    1 M KCl (lagerløsning)
    FORSIKTIG: Phalloidin er giftig (LD50 = 2 mg/kg) og må håndteres med forsiktighet. Innånding av glutaraldehyd er giftig og det skal håndteres i en avtrekkshette.
  4. Oppbevar bufferne ved 4 °C og falloidin og latrunculin A ved -20 °C for langtidslagring.
    MERK: Langsiktig lagring av buffere anbefales ikke. Protokollen kan settes på pause her.

2. Homogenisering av hjernevev

  1. Homogeniser kryopreservert eller ny dissekert rottehjernevev i 10 bind homogeniseringsbuffer i et Potter-Elvehjem glassrør og pestle på is.
    MERK: Optimal homogenisering oppnås ved 15-20 slag av pestle for hånd for hjernevev. Vellykket homogenisering kan bekreftes ved jevn strøm av suspensjonen gjennom glassrøret. Protokollen kan settes på pause her.
  2. Bestem proteinkonsentrasjonen i homogenatet ved hjelp av en Bradford-analyse31.
    MERK: Alternative hjemmelagde eller kommersielle analyser for proteinestimering kan også brukes.
  3. Fortynn homogenatprøver i Krebs buffer ved en konsentrasjon på 2-3 mg protein/ml i et volum på 50 μL.
    MERK: I noen av våre eksperimenter inkuberer vi homogenater med 2 μM latrunculin A eller DMSO (kontroller) ved 37 °C i 1 time. For dette blir homogenater resuspendert i 48 μL Krebs buffer, og 2 μL 50 μM latrunculin A eller 2 μL DMSO tilsettes. Videre for immunoblotting samles en liten mengde prøve (10 μg) etter inkubasjonen.
  4. Fest homogenatprøvene (avsnitt 5).

3. Forberedelse av isolerte nerveterminaler

  1. Fremstilling av synaptosomer
    MERK: Alternative protokoller32,33 for synaptosomer kan også brukes.
    1. Sentrifuger hjernen homogenat ved 1200 x g i 10 min ved 4 °C.
    2. Kast pelletsen, som er den rå kjernefysiske fraksjonen.
    3. Videre sentrifugere supernatanten (S1) oppnådd i trinn 3.1.1 ved 12.000 x g i 15 min ved 4 °C.
    4. Fjern supernatanten (S2), som er den oppløselige cytosoliske fraksjonen.
    5. Resuspend pellet (P2) oppnådd i trinn 3.1.3, som er den rå synaptosomale fraksjonen i resuspension buffer.
      MERK: Volumet av resuspensasjonsbuffer avhenger av mengden startvev og mengden pellet oppnådd. For eksempel, når du starter med 150-300 mg hjernevev, kan pelletsen som oppnås, brukes på nytt i 200 μL resuspensionbuffer.
    6. Last de resuspenderte råsynaptosomene på en diskontinuerlig sukrosegradient laget av like store volumer på 0,85-1,0-1,2 M sukrose.
      MERK: Vi bruker vanligvis 1 ml hver av sukroseoppløsningen (for 150-300 mg vev). Dette kan endres i henhold til større vevsmengder. Diskontinuerlige gradienter kan gjøres ved hjelp av en 25G-sprøyte presset mot den indre veggen på ultracentrifugerøret og skånsom lagdeling av sukroselagene.
    7. Sentrifuge ved 85 000 x g i 2 timer ved 4 °C.
      MERK: På grunn av den høye hastigheten på sentrifugering er det nødvendig med en ultracentrifuge som er i stand til å lage et vakuum for å redusere oppvarming.
    8. Samle den synaptosomale fraksjonen ved grensesnittet mellom 1,0 og 1,2 M sukrose ved hjelp av en 200 μL pipetspiss.
    9. Vask den synaptosomale fraksjonen med iskald vaskebuffer ved sentrifugering ved 18 000 x g i 10 minutter ved 4 °C.
      MERK: For vask samles den synaptosomale fraksjonen oppnådd ved grensesnittet på 1,0 og 1,2 M sukrose i et friskt 1,5 ml rør, og et likt volum vaskebuffer tilsettes, noe som sikrer fjerning av høy sukrose fra mediet.
    10. Vask den synaptosomale pelletsen igjen med iskald homogeniseringsbuffer ved 12 000 g i 10 minutter ved 4 °C.
    11. Resuspend synaptosomene i homogenisering buffer på is.
      MERK: Protokollen kan settes på pause her.
    12. Bestem proteinkonsentrasjonen ved hjelp av en Bradford-analyse.
    13. Resuspend synaptosomene i Krebs buffer ved en konsentrasjon på 2-3 mg protein/ml i et volum på 50 μL (47,5 μL hvis synaptosomer skal depolariseres av KCl; se pkt. 4).
      MERK: For resuspension blir den synaptosomale fraksjonen først spunnet ved 12.000 x g i 5 min ved 4 °C og supernatanten (bufferen) fjernes. Den synaptosomale pelletsen blir deretter resuspendert i Krebs buffer ved skånsom pipettering ved hjelp av en 200 μL pipetspiss.
    14. Fortsett med depolarisering (avsnitt 4).
  2. Fremstilling av synaptoneurosomer
    MERK: Alternative protokoller34,35 for synaptoneurosomer kan også brukes.
    1. Før hjernen homogenat gjennom et forhånds fuktet nettfilter på 100 μm porestørrelse i en filterholder ved hjelp av en 1 ml sprøyte.
      MERK: Pre-fukting av alle filtre er viktig for å unngå tap av prøve og bør gjøres ved hjelp av homogeniseringsbuffer. For dette overføres homogeniseringsbufferen gjennom filtrene i filterholderen ved hjelp av en 1 ml sprøyte til bufferen strømmer ut.
    2. Samle filtratet (F1) i et forhåndskjølt 1,5 ml rør på is.
    3. Gjenta prosessen (trinn 3.2.1 og 3.2.2) for F1-brøk for å få det andre filtratet (F2).
    4. Før F2-filtratet gjennom et nettfilter på 5 μm porestørrelse.
    5. Samle filtratet (F3) i et forhåndskjølt 1,5 ml rør på is.
    6. Sentrifugefiltrat F3 ved 1500 x g i 10 min ved 4 °C.
    7. Resuspend pellet (synaptoneurosomer) i Krebs buffer på is i en konsentrasjon på 2-3 mg protein/ml i et volum på 50 μL (47,5 μL hvis synaptosomer skal depolariseres av KCl; se avsnitt 4).
      MERK: Protokollen kan settes på pause her.
    8. Beregn proteinkonsentrasjonen ved hjelp av en Bradford-analyse.
    9. Fortsett med depolarisering (avsnitt 4).

4. KCl-mediert depolarisering av isolerte synaptiske terminaler

  1. Likevekt synaptosomer/synaptoneurosomer ved 37 °C i 5–10 minutter.
  2. Stimulere synaptosomer/synaptoneurosomer ved å legge til KCl for å øke ekstracellulær K+ til 50 mM i 30 s ved 37 °C og legge til like mye Krebs buffer til det respektive ustimulerte kontrollsettet.
    MERK: Legg for eksempel 2,5 μL 1 M KCl til synaptosomer som er resuspendert i 47,5 μL Krebs buffer; og tilsett 2,5 μL Krebs buffer til det respektive ustimulerte kontrollsynaptosomet. For eksperimenter der et stort antall prøver er involvert, fortsett med ikke mer enn 2 prøver om gangen, slik at depolariseringstiden ikke overstiger 30 s.
  3. Avslutt stimulering ved å tilsette glutaraldehyd (avsnitt 5).

5. Fiksering og falloidinfarging av prøver

  1. Tilsett glutaraldehyd til homogenat/synaptosomale/synaptoneurosomale prøver i en endelig konsentrasjon på 2,5% i 2-3 min ved romtemperatur.
    MERK: Vi la til 6 μL 25% glutaraldehydoppløsning slik at den endelige konsentrasjonen av glutaraldehyd i 50 μL-prøvene (homogenater/synaptosomer/synaptoneurosomer) var ca. 2,5%. Fiksering er kritisk og bør være rask og dermed umiddelbart etter tilsetning av glutaraldehyd, bør prøven være kraftig virvelet.
  2. Sediment prøvene på 20.000 x g i 5 min.
  3. Fjern supernatanten.
    MERK: Kast supernatanten i en avtrekkshette da glutaraldehyd er giftig.
  4. Permeabiliser pellet ved resuspension i 100 μL Krebs buffer som inneholder 0,1% Triton X-100 og 1 mg/ml NaHB4 i 2-3 min ved romtemperatur.
  5. Sediment prøvene på 20.000 x g i 5 min.
  6. Fjern permeabiliseringsbufferen.
  7. Vask pelletsen med 200 μL Krebs buffer ved sentrifugering ved 20.000 x g i 5 min.
  8. Resuspend og flekk pelletsen med 1x Alexa Fluor 647 Phalloidin (tilsvarende 500 μU) i 100 μL Krebs buffer i 10 minutter i mørke ved romtemperatur.
    MERK: Andre varianter av fluorescerende falloidinanaloger er kommersielt tilgjengelige og kan byttes ut for analysen. Konsentrasjonen av falloidin og totalt prøvevolum av inkubasjon kan måtte endres i henhold til mengden og typen vev / prøve som testes og optimale forhold bør standardiseres tilsvarende.
  9. Sentrifuger de fargede prøvene på 20.000 x g i 5 min.
  10. Fjern det ubundne falloidinet (supernatant).
  11. Vask prøven med 200 μL Krebs buffer ved sentrifugering ved 20.000 x g i 5 min.
  12. Resuspend i 200 μL Krebs buffer som inneholder 0,32 M sukrose.
    MERK: Protokollen kan settes på pause her.

6. Fluorometrisk analyse og lysspredning

  1. Dispenser Alexa Fluor 647 Phalloidin-fargede prøver i en svart 96-brønnsplate.
  2. Mål fluorescensintensiteten ved en eksitasjonsbølgelengde på 645 nm og en utslippsbølgelengde på 670 nm i en plateleser ved romtemperatur.
  3. Overfør prøvene fra den svarte 96-brønnsplaten til den gjennomsiktige 96-brønnsplaten ved hjelp av 200 μL pipetspisser.
  4. Mål lysspredningen ved 540 nm for å korrigere for eventuelle tap som kan ha oppstått i løpet av de forrige trinnene for fiksering, permeabilisering og farging.
    MERK: Variasjoner i biologisk materiale som beholdes i de fargede prøvene, kan være mer fremtredende for mindre mengder startmateriale (se Diskusjon).
  5. Inkluder et sett med Alexa Fluor 647 Phalloidin i Krebs buffer ved forskjellige konsentrasjoner (0,05x, 0,1x, 0,25x, 0,35x, 0,75x, 0,5x og 1x tilsvarende 25, 50, 125, 175, 250, 375 og 500 μU) for hver batch av analysen som en standardkurve.
    MERK: Dette er et valgfritt trinn og påvirker ikke resultatene av analysen, spesielt når F-aktinnivåer uttrykkes på en relativ måte (avsnitt 7). Protokollen kan settes på pause her.

7. Dataanalyse

  1. Mengden F-aktin i prøvene er direkte proporsjonal med fluorescensintensiteten til bundet falloidin. Uttrykk i absolutte termer av enheter av falloidin bundet beregnet fra den lineære kurven til den taggede falloidinstandarden.
    MERK: Som et eksempel kan du se figur 2A-B, 3A, 4A-B og tilleggs figur 2.
  2. Uttrykk F-aktinnivåer som en brøkdel av kontrollprøvene.
    MERK: Som et eksempel kan du se Figur 5A-B.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

Linearitet av analysen for evaluering av F-aktinnivåer
Først ble en standardkurve for den lineære økningen i fluorescens av Alexa Fluor 647 Phalloidin fastslått og ble gjentatt for hvert sett med eksperimenter (Figur 1). For å undersøke det lineære spekteret av analysen ble forskjellige mengder hjernehomogenater fra gnagere (figur 2A og 2B) og post-mortem mennesker (figur 3A og 3B) behandlet. Analysen ble funnet å være lineær i området 50-200 μg protein som vurdert av mengder merket falloidin beholdt. Lysspredning ved 540 nm ble brukt til å bekrefte de forskjellige mengdene prøver (Figur 2C og Figur 3C).

Latrunculin, et aktindepolymeriserende middel reduserer bindingen av merket falloidin
Latrunculin A er kjent for å depolymerisere aktinfilamenter og redusere nivåene av F-aktin36,37,38,39. Homogenater fra enten gnagere eller humant hjernevev ble inkubert med 2 μM latrunculin A i 1 time ved 37 °C for å depolymerisere aktinfilamenter. Respektive ubehandlede kontrollsett ble inkubert med DMSO i samme varighet på 1 time ved 37 °C. Analysen målte kraftig tapet av F-aktinnivåer fra 95,7 ± 6,6 (gjennomsnittlig ± SEM) i kontrollprøver til 72,0 ± 3,2 (gjennomsnittlig ± SEM) μU av bundet falloidin i latrunculin A-behandlede prøver hos gnagerhjernerogenater (figur 4A). En lignende reduksjon (fra 83,7 ± 3,9 til 66,9 ± 4,2 μU) ved oppbevaring av merket falloidin ble også observert når homogenater fra humant hjernevev ble utsatt for latrunculin A-behandling (figur 4B). Bemerkelsesverdige, totale aktinnivåer, som vurdert ved immunoblotting, endret seg ikke ved behandling med latrunculin A hos både rotte (Supplerende figur 1A-B) og humane (Supplerende figur 1C-D) hjernehomogenater.

Depolarisering av isolerte synaptiske terminalerstimulerer aktinpolymerisering og filamentdannelse
Ex vivo depolarisering av isolerte synaptiske terminaler har vist seg å resultere i rask stimulering av aktinpolymerisering6,30,40, og dette fenomenet ble brukt som en ytterligere bekreftelse på analysen rapportert heri. Biokjemiske fraksjoner beriket i synaptiske terminaler ble utarbeidet på to forskjellige måter; en gradientbasert ultracentrifugation -metode for å oppnå "synaptosomer"41,42,43,44 og en sekvensiell filtreringsbasert protokoll for å oppnå "synaptoneurosomer"43,45,46. Fordi utbyttet for sistnevnte er høyere, brukte vi det til humant post-mortem hjernevev der vevsmengdene ofte er begrensende. På den annen side foretrakk vi å bruke synaptosomer med en høyere grad av berikelse av synaptiske fragmenter41 for våre rotte hjernevevseksperimenter.

Depolarisering av synaptosomer eller synaptoneurosomer og stimulering av aktinpolymerisering ble oppnådd ved en kort (30 sekunder) utbrudd av økning i ekstracellulær K+ til 50 mM. KCl-eksponering resulterte i økt falloidinbinding med nesten 40% i gnagerhjernesynaptosomer sammenlignet med de respektive mock-stimulerte kontrollene (Figur 5A; se også Supplerende figur 2A). En mindre (rundt 20%) men konsistent økning ble også observert hos humane synaptoneurosomer behandlet med KCl (Figur 5B; se også Supplerende figur 2A). Disse eksperimentene validerer robustheten til analysen vår for å bestemme endringer i F-aktinnivåer i hjernevevsprøver, inkludert isolerte synaptiske terminaler.

Figure 1
Figur 1. Standardkurve for fluorescens av Alexa Fluor 647 Phalloidin.  Linearitet av fluorescensutslipp av forskjellige mengder (25-500 μU) merket falloidin ble bekreftet ved fluorescensspektroskopi ved en eksitasjon på 645 nm og utslipp av 670 nm (R2 = 0,9942). Data representeres som gjennomsnittlige ± SEM (n=3). Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.

Figure 2
Figur 2. Linearitet av falloidinbinding til helcellede homogenater fra rotte hjernevev.  (A) Binding av falloidin til ulike mengder homogenater (50-300 μg protein) ble vurdert. (B) Bindingen var lineær i området 50-200 μg protein (R2 = 0,9602). (C) Spredning ved 540 nm ble brukt til å bekrefte ulike mengder av prøvene (R2 = 0,8319). Data representeres som gjennomsnittlig ± SEM (n=4). Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.

Figure 3
Figur 3. Phalloidinbinding til helcellede homogenater fra post-mortem humant hjernevev.  (A) Phalloidin oppbevaring i en rekke mengder homogenater (50-300 μg protein) ble evaluert. (B) Phalloidinbinding ble funnet å være lineær i området 50-200 μg protein (R2 = 0,8832). (C) Spredning ved 540 nm bekreftet de varierende mengdene av prøvene (R2 = 0,9730). Data representeres som gjennomsnittlig ± SEM (n=4). Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.

Figure 4
Figur 4. Effekter av latrunculin A på F-aktin nivåer.  Behandling av hjernehomogenater med aktindepolymeriserende middel Latrunculin A (2 μM, 1 t ved 37°C) resulterte i betydelig reduksjon i mengden aktinfilamenter sammenlignet med de respektive mock-behandlede kontrollprøvene som vurdert ved oppbevaring av merket falloidin både hos gnagere (p = 0,0034; parret to-tailed Student's t-test) (A) og post-mortem humant vev (p = 0,0011; parret to-tailed Student's t-test) (B). Data representeres som gjennomsnittlige ± SEM (n=6 par). Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.

Figure 5
Figur 5. Effekter av KCl-mediert depolarisering på F-aktinmengder i isolerte synaptiske terminaler.  (A) Inkubasjon av synaptosomer fra rottehjerne med 50 mM KCl i 30 s ved 37 °C stimulert aktinpolymerisering som følgelig resulterte i en økning i falloidinbinding (p = 0,0014; parret tosidig Student t-test). (B) En mindre økning ble også observert i synaptoneurosomal brøkdel fra post-mortem humant hjernevev (p = 0,014; parret to-tailed Student'st-test). Data representeres som gjennomsnittlige ± SEM (n=6 par). Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.

Supplerende figur 1. Effekter av latrunculin A på totale aktinnivåer.  Hjernehomogenater ble inkubert med latrunculin A (2 μM, 1 t ved 37 °C) eller like stort volum DMSO (1 t ved 37 °C). 10 μg protein per prøve (latrunculin A behandlet og DMSO mock-behandlet kontroller) ble samlet inn før fiksering. Totale aktinnivåer ble vurdert ved immunoblotting. Representative flekker er vist for rotte (A) og menneskelige (C) hjerne homogenater. Latrunculin A endret ikke de totale aktinnivåene hos begge rotter (B; p = 0,40; parret to-tailed Student's t-test) og human (D; p = 0,42; parret to-tailed Student's t-test) hjerne homogenater. Data representeres som gjennomsnittlige ± SEM (n=3 par). Klikk her for å laste ned denne filen.

Supplerende figur 2. Effekter av KCl-mediert depolarisering på F-aktinnivåer i rottesynaptosomer og humane synaptoneurosomer.  (A) Inkubasjon av synaptosomer fra rottehjerne med 50 mM KCl (30 s ved 37 °C) stimulert aktinpolymerisering og en påfølgende økning i falloidinbinding (p = 0,0019; parret to-tailed Student t-test). (B) Økning i falloidinretensjon ble også observert i human synaptoneurosomal brøkdel depolarisert av KCl sammenlignet med de respektive ustimulerte kontrollene (p = 0,015; parret to-tailed Student t-test). Data representeres som gjennomsnittlige ± SEM (n=6 par). Klikk her for å laste ned denne filen.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Analysen som er beskrevet her, i hovedsak tilpasset fra en tidligere studie30 med modifikasjoner, bruker et fallotoksin, falloidin merket med et fluorescerende merke. Fluorescerende falloidinanaloger anses å være gullstandarden for farging av aktinfilamenter i fast vev47,48,49. Faktisk er de de eldste verktøyene for å spesifikt identifisere aktinfilamenter50 og fortsatt være de mest brukte instrumentene for å oppdage aktinfilamenter spesielt for etterfølgende fluorescensmikroskopibaserte analyser. Viktigst, falloidin har vist seg å flekke selv løs, uregelmessig netting av korte aktinfilamenter51, noe som indikerer at falloidinbinding ikke er avhengig av filamentlengden. Vår protokoll er derimot avhengig av fluorescensspektroskopi for å analysere aktindynamikk i ex vivo biologiske prøver, for eksempel hjernevev fra gnagere og mennesker.

Den største fordelen med protokollen er at den reduserer tiden som tas betydelig med hensyn til de eksisterende protokollene som først krever en høyhastighets sentrifugeringsbasert biokjemisk isolasjon av F-aktin (separasjon fra G-aktin basert på uoppløselighet av aktinfilamenter i visse vaskemidler som Triton X-100) og påfølgende analyse av immunaktive nivåer ved bruk av vestlig blotting6,28,29. Tidseffektiviteten til analysen vår er også en fordel med hensyn til falloidinbaserte immunocytokjemiteknikker40,52, selv om det kan være noen andre fordeler forbundet med sistnevnte. En annen fordel er at den kan brukes på kryopreservert post-mortem humant hjernevev, hvis anskaffelse alltid er forbundet med noen post-mortem forsinkelse. Videre, med hensyn til den opprinnelige protokollen30 som denne metoden er modifisert fra, har vi betydelig redusert kravet til vevsmengden fra 1 ml cuvette til en enkelt brønn av en 96-brønns plate. Videre, på grunn av inkludering av en falloidin standardkurve i hvert sett av eksperiment, kan vår protokoll kvantisere absolutte nivåer av aktinfilamenter i enheter av falloidinbundet (Figur 2A-B, 3A, 4A-B; se også Supplerende figur 2), i tillegg til nivåene i forhold til kontrollprøver (Figur 5A-B).

Det skal bemerkes at anvendelsen av falloidin for å vurdere F-aktinnivåer imidlertid er begrenset til faste celler og prøver, både for vår analyseprotokoll så vel som mikroskopibaserte protokoller. Dette er fordi falloidin egentlig er en giftig bisyklisk heptapeptid som binder seg spesielt ved grensesnittet mellom F-aktinunderenheter med høy affinitet og stabiliserer disse aktinfilamentene, noe som gjør dem ute av stand til å depolymerisere og faktisk øke nettokonverteringen av G-aktin til F-aktin40,53,54. Derfor stabiliserer falloidin aktinfilamenter in vivo og in vitro, og kan resultere i betydelige endringer i likevektsstatusen til aktin per se47,55. Som en slik evaluering av aktin polymerisasjon status mediert av fluorescerende falloidin er basert på arrestert filament strukturer. Videre, på grunn av sin lave permeabilitet gjennom lipidbilayeren, er falloidinbaserte metoder avhengige av permeabilisering av cellene eller biologiske prøver. Infeasibility av et tidskurs live-celle analyse er derfor en stor begrensning av protokollen som med immunocytokjemi-baserte metoder som bruker falloidin.

Infeasibility av falloidin-baserte metoder for å evaluere dynamiske endringer i aktinfilamenter i levende uløste celler stiller spørsmålet om det er alternative prosedyrer for å gjøre det. Faktisk har det blitt gjort fremskritt i denne forbindelse med eksogene uttrykk for fluorescerende aktinanaloger før analyse ved hjelp av protokoller som videomikrografi36,56, fluorescensgjenvinning etter fotobleaching (FRAP)38 eller fluorescens resonans energioverføring (FRET)39. Heterologt uttrykk for fluorescerende taggede peptider og proteiner som binder aktinfilamenter, brukes også til å studere aktindynamikk i levende celler; det er imidlertid ulemper og begrensninger forbundet med dem, så vel som med det heterologe uttrykket av fluorescerende merket aktin47,49,57. For eksempel er G-aktin som består av 50-70% av total aktin i de fleste celler løselig og fritt diffusibel i cytosolen, noe som resulterer i en høyere bakgrunn som forårsaker utfordringer i å skille signaler fra aktinfilamenter spesielt57.

En kritisk faktor i analysen er at som vist i figur 2 og figur 3; det er ikke lineært i hele spekteret av proteinmengder testet. Derfor bør en optimal mengde protein som passer for analysen først bestemmes, eller mengden falloidinanalog bør justeres slik at den ikke lenger er begrensende (ved høyere mengder proteiner). Et annet kritisk aspekt ved protokollen er at de mange sentrifugeringsbaserte trinnene for fjerning av fikserings-, permeabiliseringsmiddel og ubundet falloidin kan føre til varierende tap av proteiner (og F-aktinbundet falloidin) fra prøvene, spesielt når lavere mengder prøver brukes. Derfor er det viktig å normalisere mengden prøve som beholdes ved å overvåke lysspredning ved 540 nm. Til slutt, siden aktin er i en dynamisk tilstand av interkonversjon mellom F- og G-formene, bør fiksering være rask. Et mindre kritisk kritisk aspekt ved analysen er at vi ikke kunne evaluere effektiviteten i vurderingen av farmakologisk aktinpolymerisering. I motsetning til farmakologisk actin depolymerisering ved latrunculin A, jasplakinolide (et pålitelig og mye brukt aktinpolymeriseringsmiddel) har overlappende bindingssteder med falloidin og hemmer konkurransedyktig bindingen til aktinfilamenter58,59. Likevel indikerer sysselsetting av KCl-stimulerte synaptiske terminaler som en ex vivo-modell for økt aktinpolymerisering at vår analyse også kan oppdage økninger i F-aktinnivåer.

Til slutt beskriver vi en robust tidseffektiv og høygjennomstrømningsanalyse for analyse av aktinfilamenter (F-aktin) og dens vekslinger i fysiologiske og patofysiologiske tilstander egnet for et 96-brønns plateformat. I kombinasjon med andre eksisterende metoder for evaluering av F-aktin i faste og uløste prøver, vil protokollen vise seg å være et viktig verktøy i aktinrelaterte studier innen nevrovitenskapelig felt, samt andre områder av biologisk vitenskapsforskning.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Forfatterne har ingenting å avsløre.

Acknowledgments

Dette arbeidet ble støttet av Neurological Foundation of New Zealand (1835-PG), New Zealand Health Research Council (#16-597) og Institutt for anatomi, University of Otago, New Zealand. Vi står i gjeld til Neurological Tissue Bank of HCB-IDIBAPS BioBank (Spania) for humant hjernevev. Vi takker Jiaxian Zhang for hennes hjelp til innspilling og redigering av videoen.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
3.5 mL, open-top thickwall polycarbonate tube Beckman Coulter 349622 For gradient centrifugation (synaptosome prep)
Alexa Fluor 647 Phalloidin Thermo Fisher Scientific A22287 F-actin specific ligand
Antibody against  b-actin Santa Cruz Biotechnology Sc-47778 For evaluation of total actin levels by immunoblotting
Antibody against GAPDH Abcam Ab181602 For evaluation of GAPDH levels by immunoblotting
Bio-Rad Protein Assay Dye Reagent Concentrate Bio-Rad 5000006 Bradford based protein estimation
Calcium chloride dihydrate (CaCl2·2H2O) Sigma-Aldrich C3306 Krebs buffer component
cOmplete, Mini, EDTA-free Protease Inhibitor Cocktail Sigma-Aldrich 4693159001 For inhibition of endogenous protease activity during sample preparation
Corning 96-well Clear Flat Bottom Polystyrene Corning 3596 For light-scattering measurements
D-(+)-Glucose Sigma-Aldrich G8270 Krebs buffer component
Dimethyl sulfoxide Sigma-Aldrich D5879 Solvent for phalloidin and latrunculin A
Fluorescent flatbed scanner (Odyssey Infrared Scanner) Li-Cor Biosciences For detection of immunoreactive signals on immunoblots
Glutaraldehyde solution (25% in water) Grade II Sigma-Aldrich G6257 Fixative
HEPES Sigma-Aldrich H3375 Buffer ingredient for sample preparation and Krebs buffer component
Latrunculin A Sigma-Aldrich L5163 Depolymerizer of actin filaments
Magnesium chloride hexahydrate (MgCl2·6H2O) Sigma-Aldrich M2670 Krebs buffer component
Microplates
Mitex membrane filter 5 mm Millipore LSWP01300 Preparation of synaptoneurosomes
Nunc F96 MicroWell Black Plate Thermo Fisher Scientific 237105 For fluorometric measurements
Nylon net filter 100 mm Millipore NY1H02500 Preparation of synaptoneurosomes
Phosphatase Inhibitor Cocktail IV Abcam ab201115 For inhibition of endogenous phosphatase activity during sample preparation
Potassium chloride (KCl) Sigma-Aldrich P9541 Krebs buffer component and for depolarization of synaptic terminals
Potassium phosphate monobasic ((KH2PO4) Sigma-Aldrich P9791 Krebs buffer component
Sodium borohydride (NaBH4) Sigma-Aldrich 71320 Component of Permeabilization buffer
Sodium chloride (NaCl) LabServ (Thermo Fisher Scientific) BSPSL944 Krebs buffer component
Sodium hydrogen carbonate (NaHCO3) LabServ (Thermo Fisher Scientific) BSPSL900 Krebs buffer component
SpectraMax i3x Molecular Devices For fluorometric measurements
Sucrose Fisher Chemical S/8600/60 Buffer ingredient for sample preparation
Swimnex Filter Holder Millipore Sx0001300 Preparation of synaptoneurosomes
Tissue grinder 5 mL Potter-Elvehjem Duran Wheaton Kimble 358034 For tissue homogenization
Triton X-100 Sigma-Aldrich X100 Component of Permeabilization buffer
Trizma base Sigma-Aldrich T6066 Buffer ingredient for sample preparation

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Penzes, P., Rafalovich, I. Regulation of the actin cytoskeleton in dendritic spines. Advances in Experimental Medicine and Biology. 970, 81-95 (2012).
  2. Venkatesh, K., Mathew, A., Koushika, S. P. Role of actin in organelle trafficking in neurons. Cytoskeleton. 77 (3-4), 97-109 (2020).
  3. Shirao, T., González-Billault, C. Actin filaments and microtubules in dendritic spines. Journal of Neurochemistry. 126 (2), 155-164 (2013).
  4. Bertling, E., Hotulainen, P. New waves in dendritic spine actin cytoskeleton: From branches and bundles to rings, from actin binding proteins to post-translational modifications. Molecular and Cellular Neuroscience. 84, 77-84 (2017).
  5. Bellot, A., et al. The structure and function of actin cytoskeleton in mature glutamatergic dendritic spines. Brain Research. 1573, 1-16 (2014).
  6. Wolf, M., et al. ADF/Cofilin controls synaptic actin dynamics and regulates synaptic vesicle mobilization and exocytosis. Cerebral Cortex. 25 (9), 2863-2875 (2015).
  7. Morales, M., Colicos, M. A., Goda, Y. Actin-dependent regulation of neurotransmitter release at central synapses. Neuron. 27 (3), 539-550 (2000).
  8. Doussau, F., Augustine, G. J. The actin cytoskeleton and neurotransmitter release: An overview. Biochimie. 82 (4), 353-363 (2000).
  9. Sakaba, T., Neher, E. Involvement of actin polymerization in vesicle recruitment at the calyx of held synapse. Journal of Neuroscience. , (2003).
  10. Lee, J. S., Ho, W. K., Lee, S. H. Actin-dependent rapid recruitment of reluctant synaptic vesicles into a fast-releasing vesicle pool. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. , (2012).
  11. Rust, M. B., et al. Learning, AMPA receptor mobility and synaptic plasticity depend on n-cofilin-mediated actin dynamics. EMBO Journal. 29, 1889-1902 (2010).
  12. Bosch, M., et al. Structural and molecular remodeling of dendritic spine substructures during long-term potentiation. Neuron. 82, 444-459 (2014).
  13. Hanley, J. G. Actin-dependent mechanisms in AMPA receptor trafficking. Frontiers in Cellular Neuroscience. 8, 381 (2014).
  14. Kasai, H., Fukuda, M., Watanabe, S., Hayashi-Takagi, A., Noguchi, J. Structural dynamics of dendritic spines in memory and cognition. Trends in Neurosciences. 33, 121-129 (2010).
  15. Terman, J. R., Kashina, A. Post-translational modification and regulation of actin. Current Opinion in Cell Biology. 25 (1), 30-38 (2013).
  16. Wilson, C., Terman, J. R., González-Billault, C., Ahmed, G. Actin filaments-A target for redox regulation. Cytoskeleton. 73, 577-595 (2016).
  17. Borovac, J., Bosch, M., Okamoto, K. Regulation of actin dynamics during structural plasticity of dendritic spines: Signaling messengers and actin-binding proteins. Molecular and Cellular Neuroscience. 91, 122-130 (2018).
  18. Saneyoshi, T., Hayashi, Y. The Ca2+ and Rho GTPase signaling pathways underlying activity-dependent actin remodeling at dendritic spines. Cytoskeleton. 69 (8), 545-554 (2012).
  19. Mizuno, K. Signaling mechanisms and functional roles of cofilin phosphorylation and dephosphorylation. Cellular Signalling. 25 (2), 457-469 (2013).
  20. Dos Remedios, C. G., et al. Actin binding proteins: Regulation of cytoskeletal microfilaments. Physiological Reviews. 83 (2), 433-473 (2003).
  21. Bamburg, J. R., Bernstein, B. W. Actin dynamics and cofilin-actin rods in Alzheimer disease. Cytoskeleton. 73 (9), 477-497 (2016).
  22. Penzes, P., VanLeeuwen, J. E. Impaired regulation of synaptic actin cytoskeleton in Alzheimer's disease. Brain Research Reviews. 67 (1-2), 184-192 (2011).
  23. Pelucchi, S., Stringhi, R., Marcello, E. Dendritic spines in Alzheimer's disease: How the actin cytoskeleton contributes to synaptic failure. International Journal of Molecular Sciences. 21 (3), 908 (2020).
  24. Kounakis, K., Tavernarakis, N. The Cytoskeleton as a Modulator of Aging and Neurodegeneration. Advances in Experimental Medicine and Biology. 1178, 227-245 (2019).
  25. Nishiyama, J. Plasticity of dendritic spines: Molecular function and dysfunction in neurodevelopmental disorders. Psychiatry and Clinical Neurosciences. 73 (9), 541-550 (2019).
  26. Michaelsen-Preusse, K., Feuge, J., Korte, M. Imbalance of synaptic actin dynamics as a key to fragile X syndrome. Journal of Physiology. 596 (14), 2773-2782 (2018).
  27. Hensel, N., Claus, P. The Actin Cytoskeleton in SMA and ALS: How Does It Contribute to Motoneuron Degeneration. Neuroscientist. 24 (1), 54-72 (2018).
  28. Kommaddi, R. P., et al. Aβ mediates F-actin disassembly in dendritic spines leading to cognitive deficits in alzheimer's disease. Journal of Neuroscience. 38 (5), 1085-1099 (2018).
  29. Kommaddi, R. P., et al. Glutaredoxin1 Diminishes Amyloid Beta-Mediated Oxidation of F-Actin and Reverses Cognitive Deficits in an Alzheimer's Disease Mouse Model. Antioxidants and Redox Signaling. 31 (18), 1321-1338 (2019).
  30. Bernstein, B. W., Bamburg, J. R. Cycling of actin assembly in synaptosomes and neurotransmitter release. Neuron. 3 (2), 257-265 (1989).
  31. Sapan, C. V., Lundblad, R. L., Price, N. C. Colorimetric protein assay techniques. Biotechnology and applied biochemistry. 29 (2), Pt 2 99-108 (1999).
  32. Kolodziej, A., et al. High resolution quantitative synaptic proteome profiling of mouse brain regions after auditory discrimination learning. Journal of Visualized Experiments. (118), e54992 (2016).
  33. Byun, Y. G., Chung, W. S. A novel in vitro live-imaging assay of astrocyte-mediated phagocytosis using pH indicator-conjugated synaptosomes. Journal of Visualized Experiments. (132), e56647 (2018).
  34. Chmielewska, J. J., Kuzniewska, B., Milek, J., Urbanska, K., Dziembowska, M. Neuroligin 1, 2, and 3 Regulation at the Synapse: FMRP-Dependent Translation and Activity-Induced Proteolytic Cleavage. Molecular Neurobiology. 56 (4), 2741-2759 (2019).
  35. Kuzniewska, B., Chojnacka, M., Milek, J., Dziembowska, M. Preparation of polysomal fractions from mouse brain synaptoneurosomes and analysis of polysomal-bound mRNAs. Journal of Neuroscience Methods. 293, 226-233 (2018).
  36. Fischer, M., Kaech, S., Knutti, D., Matus, A. Rapid actin-based plasticity in dendritic spines. Neuron. 20 (5), 847-854 (1998).
  37. Caesar, M., Felk, S., Aasly, J. O., Gillardon, F. Changes in actin dynamics and F-actin structure both in synaptoneurosomes of LRRK2(R1441G) mutant mice and in primary human fibroblasts of LRRK2(G2019S) mutation carriers. Neuroscience. 284, 311-324 (2015).
  38. Star, E. N., Kwiatkowski, D. J., Murthy, V. N. Rapid turnover of actin in dendritic spines and its regulation by activity. Nature Neuroscience. 5, 239-246 (2002).
  39. Okamoto, K. I., Nagai, T., Miyawaki, A., Hayashi, Y. Rapid and persistent modulation of actin dynamics regulates postsynaptic reorganization underlying bidirectional plasticity. Nature Neuroscience. 7, 1104-1112 (2004).
  40. Bernstein, B. W., Dewit, M., Bamburg, J. R. Actin disassembles reversibly during electrically induced recycling of synaptic vesicles in cultured neurons. Molecular Brain Research. 53 (1-2), 236-250 (1998).
  41. Ahmad, F., Liu, P. Synaptosome as a tool in Alzheimer's disease research. Brain Research. 1746, 147009 (2020).
  42. Ahmad, F., et al. Isoform-specific hyperactivation of calpain-2 occurs presymptomatically at the synapse in Alzheimer's disease mice and correlates with memory deficits in human subjects. Scientific Reports. 8 (1), 13119 (2018).
  43. Ahmad, F., et al. Reactive Oxygen Species-Mediated Loss of Synaptic Akt1 Signaling Leads to Deficient Activity-Dependent Protein Translation Early in Alzheimer's Disease. Antioxidants and Redox Signaling. 27 (16), 1269-1280 (2017).
  44. Ahmad, F., et al. Developmental lead (Pb)-induced deficits in redox and bioenergetic status of cerebellar synapses are ameliorated by ascorbate supplementation. Toxicology. 440, 152492 (2020).
  45. Ahmad, F., Salahuddin, M., Alsamman, K., Herzallah, H. K., Al-Otaibi, S. T. Neonatal maternal deprivation impairs localized de novo activity-induced protein translation at the synapse in the rat hippocampus. Bioscience Reports. 38 (3), 0118 (2018).
  46. Ahmad, F., Salahuddin, M., Alsamman, K., Almulla, A. A., Salama, K. F. Developmental lead (Pb)-induced deficits in hippocampal protein translation at the synapses are ameliorated by ascorbate supplementation. Neuropsychiatric Disease and Treatment. 14, 3289-3298 (2018).
  47. Melak, M., Plessner, M., Grosse, R. Actin visualization at a glance. Journal of Cell Science. 130 (3), 525-530 (2017).
  48. Adams, A. E. M., Pringle, J. R. Staining of actin with fluorochrome-conjugated phalloidin. Methods in Enzymology. 194, 729-731 (1991).
  49. Belin, B. J., Goins, L. M., Mullins, R. D. Comparative analysis of tools for live cell imaging of actin network architecture. BioArchitecture. 4 (6), 189-202 (2014).
  50. Wulf, E., Deboben, A., Bautz, F. A., Faulstich, H., Wieland, T. Fluorescent phallotoxin, a tool for the visualization of cellular actin. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 76, 4498-4502 (1979).
  51. Taffarel, M., de Souza, M. F., Machado, R. D., de Souza, W. Localization of actin in the electrocyte of Electrophorus electricus L. Cell and Tissue Research. 242, 453-455 (1985).
  52. Glebov, O. O. Distinct molecular mechanisms control levels of synaptic F-actin. Cell Biology International. 44 (1), 336-342 (2020).
  53. Dancker, P., Löw, I., Hasselbach, W., Wieland, T. Interaction of actin with phalloidin:. Polymerization and stabilization of F-actin. BBA - Protein Structure. , (1975).
  54. Lengsfeld, A. M., Löw, I., Wieland, T., Dancker, P., Hasselbach, W. Interaction of phalloidin with actin. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 71 (7), 2803-2807 (1974).
  55. Coluccio, L. M., Tilney, L. G. Phalloidin enhances actin assembly by preventing monomer dissociation. Journal of Cell Biology. 99, 529-535 (1984).
  56. Colicos, M. A., Collins, B. E., Sailor, M. J., Goda, Y. Remodeling of synaptic actin induced by photoconductive stimulation. Cell. 107 (5), 605-616 (2001).
  57. Lemieux, M. G., et al. Visualization of the actin cytoskeleton: Different F-actin-binding probes tell different stories. Cytoskeleton. 71, 157-169 (2014).
  58. Bubb, M. R., Senderowicz, A. M. J., Sausville, E. A., Duncan, K. L. K., Korn, E. D. Jasplakinolide, a cytotoxic natural product, induces actin polymerization and competitively inhibits the binding of phalloidin to F-actin. Journal of Biological Chemistry. , (1994).
  59. Holzinger, A. Jasplakinolide: an actin-specific reagent that promotes actin polymerization. Methods in molecular biology. 269, Clifton, N.J. 14869-14871 (2009).

Tags

Tilbaketrekning utgave 172 synaptosomer synaptoneurosomer F-aktin cytoskjelett depolarisering latrunculin A falloidin fluorescens
En tidseffektiv fluorescensspektroskopibasert analyse for evaluering av Actin-polymerisasjonsstatus hos gnagere og humant hjernevev
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Ahmad, F., Liu, P. A Time-Efficient… More

Ahmad, F., Liu, P. A Time-Efficient Fluorescence Spectroscopy-Based Assay for Evaluating Actin Polymerization Status in Rodent and Human Brain Tissues. J. Vis. Exp. (172), e62268, doi:10.3791/62268 (2021).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter