Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Neuroscience
Click here for the English version

Neuroscience

En tidseffektiv fluorescensspektroskopibaseret analyse til evaluering af Actin polymeriseringsstatus i gnavere og humane hjernevæv

Published: June 3, 2021 doi: 10.3791/62268
Automatic Translation
1, 1
1Department of Anatomy, School of Biomedical Sciences, University of Otago

Summary

Vi rapporterer om en enkel, tidseffektiv og højgennemstrømningsspektroskopibaseret analyse til kvantificering af aktinfilamenter i ex vivo biologiske prøver fra hjernevæv fra gnavere og mennesker.

Abstract

Actin, den vigtigste komponent i cytoskeleton, spiller en afgørende rolle i vedligeholdelsen af neuronal struktur og funktion. Under fysiologiske tilstande forekommer actin i ligevægt i sine to former: monomerisk kugleformet (G-actin) og polymeriseret filamentøs (F- actin). Ved synaptiske terminaler danner actin cytoskeleton grundlaget for kritiske præ- og postsynaptiske funktioner. Desuden er dynamiske ændringer i actin polymeriseringsstatus (interkonvertering mellem kugleformede og filamentøse former for actin) tæt forbundet med plastisk-relaterede ændringer i synaptisk struktur og funktion. Vi rapporterer her en modificeret fluorescensbaseret metode til vurdering af polymeriseringsstatus for actin under ex vivo-forhold. Analysen anvender fluorescerende mærket falloidin, et phallotoxin, der specifikt binder sig til actin filamenter (F-actin), hvilket giver et direkte mål for polymeriseret filamentøs actin. Som et principbevis fremlægger vi dokumentation for analysens egnethed både i gnavere og post mortem humane hjernevæv homogenater. Ved hjælp af latrunculin A (et lægemiddel, der depolymeriserer actin filamenter), bekræfter vi nytten af analysen i overvågningen af ændringer i F-actin niveauer. Derudover udvider vi analysen til biokemiske fraktioner af isolerede synaptiske terminaler, hvori vi bekræfter øget actin polymerisering ved stimulering ved depolarisering med høj ekstracellulær K+.

Introduction

Cytoskeletal protein actin er involveret i flere cellulære funktioner, herunder strukturel støtte, cellulær transport, cellemotilitet og division. Actin forekommer i ligevægt i to former: monomerisk globular actin (G-actin) og polymeriseret filamentous actin (F-actin). Hurtige ændringer i actins polymeriseringsstatus (interkonvertering mellem dets G- og F-former) resulterer i hurtig glødetrådssamling og demontering og ligger til grund for dens regulerende roller inden for cellulær fysiologi. Actin danner den vigtigste komponent i den neuronale cytoskeletale struktur og påvirker en bred vifte af neuronale funktioner1,2. Det skal bemærkes, at actin cytoskelet udgør en integreret del af synaptiske terminalers strukturelle platform. Som sådan er det en vigtig determinant for synaptisk morfogenese og fysiologi og spiller en grundlæggende rolle i kontrollen af størrelse, antal og morfologi af synapser3,4,5. Især er dynamisk actin polymerisering-depolymerisering en vigtig determinant for den synaptiske ombygning forbundet med synaptisk plasticitet, der ligger til grund for hukommelses- og læringsprocesserne. Faktisk både presynaptic (såsom neurotransmitter frigivelse6,7,8,9,10) og postsynaptiske funktioner (plasticitet relaterede dynamisk remodeling11,12,13,14) kritisk stole på dynamiske ændringer i polymerisering status actin cytoskeleton.

Under fysiologiske forhold reguleres F-actin-niveauer dynamisk og stramt gennem en multimodal vej, der involverer posttranslational modifikation4,15,16 samt actin-bindende proteiner (ABP' er)4,17. ABP'er kan påvirke actindynamik på flere niveauer (såsom igangsættelse eller hæmning af polymerisering, inducerende glødetrådsforgrening, afskæring af filamenter til mindre stykker, fremme afpolymerisering og beskyttelse mod depolymerisering) og er igen under en streng modulær kontrol, der er følsom over for forskellige ekstra- og intracellulære signaler18,19,20. Sådanne regulatoriske kontroller på flere niveauer dikterer en streng regulering af actin dynamik på synaptisk cytoskeleton, finjustering pre- og postsynaptiske aspekter af neuronal fysiologi både på basale og aktivitet-induceret stater.

I betragtning af de vigtige roller af actin i neuronal fysiologi er det ikke overraskende, at flere undersøgelser har givet bevis for ændringer i actindynamik som kritiske patogene begivenheder forbundet med en bred vifte af neurologiske lidelser, herunder neurodegeneration, psykologiske sygdomme samt neuroudviklingsmæssige lidelser3,21,22,23,24,25,26,27. På trods af de mange forskningsdata, der peger på de vigtigste roller, som actin spiller inden for neuronal fysiologi og patofysiologi, er der dog stadig betydelige huller i forståelsen af actindynamik, især i det synaptiske cytoskeleton. Flere forskningsundersøgelser er nødvendige for at få en bedre forståelse af neuronal actin og dens ændringer under patologiske forhold. Et vigtigt fokusområde i denne sammenhæng er vurderingen af actin polymerisering status. Der er vestlige blotting-baserede kommercielle kits (G-Actin / F-Actin in vivo assay biokemiske kit; Cytoskeleton SKU BK03728,29) og hjemmelavede analysemetoder til vurdering af F-actin niveau6. Men da disse kræver biokemisk isolering af F-actin og G-actin, og fordi deres efterfølgende kvantificering er baseret på immunoblotting protokoller, kan de være tidskrævende. Vi heri rapporterer en fluorescensspektroskopibaseret analyse tilpasset fra en tidligere undersøgelse30 med modifikationer, der kan bruges til at evaluere begge basale niveauer af F-actin, samt dynamiske ændringer i dens samlingsdemontering. Især har vi effektivt ændret den oprindelige protokol, der kræver prøver egnet til en 1 mL cuvette til den nuværende 96-godt plade format. Den ændrede protokol har derfor reduceret mængden af væv/prøver betydeligt, der kræves til analysen. Derudover fremlægger vi bevis for, at protokollen er egnet til ikke kun hjernevæv homogeniserer, men også subcellulære fraktioner såsom isolerede synaptiske terminaler (synaptosomer og synaptoneurosomer). Endelig kan analysen anvendes til frisk dissekeret gnaver hjernevæv og langtidsopbemandede post mortem menneskelige hjerneprøver. Bemærk, mens analysen præsenteres i en neuronal sammenhæng, kan den passende udvides til andre celletyper og fysiologiske processer, der er forbundet med dem.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

Alle forsøgsprocedurer blev udført i overensstemmelse med reglerne fra University of Otago Committee on Ethics in the Care and Use of Laboratory Animals (Ethics Protocol No. AUP95/18 og AUP80/17) og New Zealand lovgiver. Humane hjernevæv blev fremstillet fra Neurological Tissue Bank of Hospital Clínic-IDIBAPS BioBank i Barcelona, Spanien. Alle vævsopsamlingsprotokoller blev godkendt af den etiske komité for Hospital Clínic, Barcelona, og informeret samtykke blev indhentet fra familierne.

1. Tilberedning af buffere og reagenser

  1. Forbered følgende buffere til homogenisering af hjernevæv og forberedelse af beriget fraktion af synaptiske terminaler:
    Homogeniseringsbuffer: 5 mM HEPES, pH 7,4 suppleret med 0,32 M saccharose
    Resuspensionsbuffer: 5 mM Tris, pH 7,4 suppleret med 0,32 M saccharose
    Vaskebuffer: 5 mM Tris, pH 8,1
    1,2 M saccharose
    1,0 M saccharose
    0,85 mio.
  2. Tilsæt hjemmelavet eller kommerciel blanding af protease- og fosfatasehæmmere.
    BEMÆRK: Vi har brugt EDTA-fri version af Complete Protease Inhibitor mix (1 tablet pr. 10 mL buffer) og Phosphatase inhibitor cocktail IV (1:100; volumen: volumen).
  3. Der fremstilles følgende buffere og reagenser til fiksering, gennemtrængning og binding af falloidin:
    Krebs buffer: 118,5 mM NaCl, 4,7 mM KCl, 1,2 mM MgCl2,2 mM CaCl2, 0,1 mM KH2PO4, 5 mM NaHCO3, 10 mM glukose, 20 mM HEPES, pH 7,4
    1 M KCl
    25% glutaraldehyd (stamopløsning)
    Krebs buffer indeholdende 0,1 % Triton X-100 og 1 mg/mL NaBH4
    400x Alexa Fluor 647 Falloidin i DMSO
    Krebs buffer indeholdende 0,32 M saccharose
    50 μM latrunculin A i DMSO (lageropløsning)
    1 M KCl (lagerløsning)
    ADVARSEL: Falloidin er giftigt (LD50 = 2 mg/kg) og skal håndteres med forsigtighed. Indånding af glutaraldehyd er giftigt, og det skal håndteres i en røghætte.
  4. Bufferne opbevares ved 4 °C og falloidin og latrunculin A ved -20 °C til langtidsopbevaring.
    BEMÆRK: Langtidslagring af buffere anbefales ikke. Protokollen kan sættes på pause her.

2. Homogenisering af hjernevæv

  1. Homogenisere kryopreserveret eller frisk dissekeret rottehjernevæv i 10 bind homogeniseringsbuffer i etPotter-Elvehjem glasrør og støder på is.
    BEMÆRK: Optimal homogenisering opnås ved 15-20 slag af pestlen i hånden for hjernevæv. Vellykket homogenisering kan bekræftes ved jævn strøm af suspensionen gennem glasrøret. Protokollen kan sættes på pause her.
  2. Proteinkoncentrationen i homogenatet bestemmes ved hjælp af en Bradford-analyse31.
    BEMÆRK: Alternative hjemmelavede eller kommercielle assays til protein estimering kan også bruges.
  3. Homogeniseres homogenatprøver i Krebs buffer i en koncentration på 2-3 mg protein/mL i et volumen på 50 μL.
    BEMÆRK: I nogle af vores forsøg inkuberer vi homogenater med 2 μM latrunculin A eller DMSO (kontrol) ved 37 °C i 1 time. Til dette formål genbruges homogenater i 48 μL Krebs buffer, og der tilsættes 2 μL på 50 μM latrunculin A eller 2 μL DMSO. Yderligere til immunoblotting opsamles en lille mængde prøve (10 μg) efter inkubationen.
  4. Homogenatprøverne fikseres (punkt 5).

3. Forberedelse af isolerede nerveterminaler

  1. Udarbejdelse af synaptosomer
    BEMÆRK: Alternative protokoller32,33 for synaptosomer kan også bruges.
    1. Centrifugehjernen homogeniseres ved 1.200 x g i 10 min ved 4 °C.
    2. Kassér pellet, som er den rå nukleare fraktion.
    3. Yderligere centrifuge supernatanten (S1), der er opnået i trin 3.1.1 ved 12.000 x g i 15 minutter ved 4 °C.
    4. Fjern supernatanten (S2), som er den opløselige cytosolske fraktion.
    5. Den pellet (P2), der er opnået i trin 3.1.3, som er den rå synaptosomale fraktion i resuspensionsbuffer, opsættes igen.
      BEMÆRK: Mængden af resuspensionsbuffer afhænger af mængden af udgangsvæv og mængden af opnået pellet. For eksempel, når man starter med 150-300 mg hjernevæv, kan den opnåede pellet genbruges i 200 μL resuspensionsbuffer.
    6. De genopsnyttede råsynaptosomer læsses på en diskontinuerlig saccharosegradient af samme volumen på 0,85-1,0-1,2 M saccharose.
      BEMÆRK: Vi bruger typisk 1 ml hver af saccharoseopløsningen (til 150-300 mg væv). Dette kan ændres i henhold til større vævsmængder. Diskontinuerlige stigninger kan laves ved hjælp af en 25G sprøjte presset mod den indre væg af ultracentrifugerøret og blid lagdeling af saccharoselagene.
    7. Centrifuge ved 85.000 x g for 2 timer ved 4 °C.
      BEMÆRK: På grund af centrifugeringens høje hastighed er der behov for en ultracentrifuge, der er i stand til at skabe et vakuum for at reducere opvarmningen.
    8. Synaptosomalfraktionen opsamles ved grænsefladen mellem 1,0 og 1,2 M saccharose ved hjælp af en 200 μL pipetspids.
    9. Synaptosomalfraktionen vaskes med iskold vaskebuffer ved centrifugering ved 18.000 x g i 10 minutter ved 4 °C.
      BEMÆRK: Til vask opsamles den synaptosomale fraktion, der opnås ved grænsefladen mellem 1,0 og 1,2 M saccharose, i et friskt 1,5 mL rør, og der tilsættes en tilsvarende mængde vaskebuffer, hvilket sikrer fjernelse af høj saccharose fra mediet.
    10. Synaptosomal pelleten vaskes igen med iskold homogeniseringsbuffer ved 12.000 g i 10 minutter ved 4 °C.
    11. Ophæld synaptosomerne i homogeniseringsbuffer på is.
      BEMÆRK: Protokollen kan kortvarigt sættes på pause her.
    12. Bestem proteinkoncentrationen ved hjælp af en Bradford-analyse.
    13. Synaptosomerne i Krebs buffer blev opsnået i en koncentration på 2-3 mg protein/mL i et volumen på 50 μL (47,5 μL, hvis synaptosomerne skal afpolitiseres af KCl; se afsnit 4).
      BEMÆRK: Ved genoplivning spundet synaptosomalfraktionen først ved 12.000 x g i 5 min ved 4 °C, og supernatanten (bufferen) fjernes. Synaptosomal pelleten genbruges derefter i Krebs buffer ved blid pipetting ved hjælp af en 200 μL pipetspids.
    14. Fortsæt med depolarisering (afsnit 4).
  2. Fremstilling af synaptoneurosomer
    BEMÆRK: Alternative protokoller34,35 for synaptoneurosomer kan også bruges.
    1. Hjernen homogeniseres gennem et forvædet netfilter på 100 μm porestørrelse i en filterholder ved hjælp af en 1 mL sprøjte.
      BEMÆRK: Forbætning af alle filtre er vigtig for at undgå tab af prøve og bør udføres ved hjælp af homogeniseringsbuffer. Til dette gennemgås homogeniseringsbufferen gennem filtrene i filterholderen ved hjælp af en 1 mL sprøjte, indtil bufferen strømmer ud.
    2. Filtrat (F1) opsamles i et forkølet 1,5 mL rør på is.
    3. Gentag processen (trin 3.2.1 og 3.2.2) for F1-fraktion for at opnå det andet filtrat (F2).
    4. F2-filtrat gennem et netfilter på 5 μm porestørrelse.
    5. Filtratet (F3) opsamles i et forkølet 1,5 mL rør på is.
    6. Centrifuge filtrat F3 ved 1.500 x g i 10 min ved 4 °C.
    7. Pelletpen (synaptoneurosomer) i Krebs buffer på isen opsuspendes ved en koncentration på 2-3 mg protein/mL i et volumen på 50 μL (47,5 μL, hvis KCl skal afpolere synaptosomerne).
      BEMÆRK: Protokollen kan kortvarigt sættes på pause her.
    8. Anslå proteinkoncentrationen ved hjælp af en Bradford-analyse.
    9. Fortsæt med depolarisering (afsnit 4).

4. KCl-medieret afpolarisering af isolerede synaptiske terminaler

  1. Ekvilibrer synaptosomer/synaptoneurosomer ved 37 °C i 5-10 min.
  2. Stimulere synaptosomer/synaptoneurosomer ved at tilføje KCl for at øge ekstracellulær K+ til 50 mM for 30 s ved 37 °C og tilføje lige stor mængde Krebs buffer til det respektive ikke-stimulerede kontrolsæt.
    BEMÆRK: Der tilsættes f.eks. og tilsæt 2,5 μL Krebs buffer til de respektive ikke-formulerede kontrolsynaptosom. For forsøg, hvor der er tale om et stort antal prøver, skal der ikke foretages mere end 2 prøver ad gangen, således at afpolariseringstiden ikke overstiger 30 s.
  3. Afslutte stimuleringen ved at tilsætte glutaraldehyd (afsnit 5).

5. Fiksering og falloidisk farvning af prøver

  1. Der tilsættes glutaraldehyd til homogene/synaptosomale/synaptoneurosomale prøver til en endelig koncentration på 2,5% i 2-3 minutter ved stuetemperatur.
    BEMÆRK: Vi tilføjede 6 μL 25% glutaraldehydopløsning, således at den endelige koncentration af glutaraldehyd i 50 μL-prøverne (homogenater/synaptosomer/synaptoneurosomer) var ca. 2,5%. Fiksering er kritisk og bør være hurtig og dermed umiddelbart efter tilsætning af glutaraldehyd, skal prøven hvirvles kraftigt.
  2. Sediment prøverne på 20.000 x g i 5 min.
  3. Fjern supernatanten.
    BEMÆRK: Supernatanten kasseres i en røghætte, da glutaraldehyd er giftigt.
  4. Pelleten gennemtrænges ved resuspension i 100 μL Krebs buffer indeholdende 0,1% Triton X-100 og 1 mg/mL NaHB4 i 2-3 min ved stuetemperatur.
  5. Sediment prøverne på 20.000 x g i 5 min.
  6. Fjern gennemstætningsbufferen.
  7. Pelleten vaskes med 200 μL Krebs buffer ved centrifugering ved 20.000 x g i 5 min.
  8. Genbrug og plette pellet med 1x Alexa Fluor 647 Phalloidin (svarende til 500 μU) i 100 μL Krebs buffer i 10 minutter i mørke ved stuetemperatur.
    BEMÆRK: Andre sorter af fluorescerende falloidinanaloger er kommercielt tilgængelige og kan udskiftes til analysen. Koncentrationen af falloidin og det samlede prøvevolumen af inkubation kan være nødt til at blive ændret i forhold til mængden og typen af væv/prøve, der testes, og de optimale betingelser bør standardiseres i overensstemmelse hermed.
  9. Centrifuge de farvede prøver ved 20.000 x g i 5 min.
  10. Fjern den ubundne falloidin (supernatant).
  11. Prøven vaskes med 200 μL Krebs buffer ved centrifugering ved 20.000 x g i 5 min.
  12. Resuspend i 200 μL Krebs buffer indeholdende 0,32 M saccharose.
    BEMÆRK: Protokollen kan kortvarigt sættes på pause her.

6. Fluoranalyse og lysspredning

  1. Dispenser Alexa Fluor 647 Phalloidin-farvede prøver i en sort 96-brønd plade.
  2. Fluorescensintensiteten måles ved en excitationsbølgelængde på 645 nm og en emissionsbølgelængde på 670 nm i en pladelæser ved stuetemperatur.
  3. Prøverne overføres fra den sorte 96-brøndsplade til den gennemsigtige 96-brønds plade ved hjælp af 200 μL pipetspidser.
  4. Mål lysspredningen ved 540 nm for at korrigere for eventuelle tab, der måtte være opstået under de foregående trin i fiksering, gennemtrængning og farvning.
    BEMÆRK: Variationer i biologisk materiale, der tilbageholdes i de farvede prøver, kan være mere fremtrædende for mindre mængder udgangsmateriale (se diskussion).
  5. Medtag et sæt Alexa Fluor 647 Phalloidin i Krebs buffer i forskellige koncentrationer (0,05x, 0,1x, 0,25x, 0,35x, 0,75x, 0,5x og 1x svarende til 25, 50, 125, 175, 250, 375 og 500 μU) for hvert parti af analysen som en standardkurve.
    BEMÆRK: Dette er et valgfrit trin og påvirker ikke resultaterne af analysen, især når F-actin niveauer udtrykkes på en relativ måde (afsnit 7). Protokollen kan sættes på pause her.

7. Dataanalyse

  1. Mængden af F-actin i prøverne er direkte proportional med fluorescensintensiteten af bundet falloidin. Udtrykkes i absolutte tal af phalloidinenheder, der er bundet ud fra den lineære kurve for den mærkede falloidinstandard.
    BEMÆRK: Som eksempel kan du se figur 2A-B, 3A, 4A-B og supplerende figur 2.
  2. Ekspres F-actin niveauer som en brøkdel af kontrolprøverne.
    BEMÆRK: Som eksempel kan du se Figur 5A-B.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

Linearitet af analysen for evaluering af F-actin niveauer
For det første blev der konstateret en standardkurve for den lineære stigning i alexa fluor fluor 647 Phalloidin, og den blev gentaget for hvert sæt forsøg (figur 1). For at undersøge analysens lineære rækkevidde blev forskellige mængder hjerne homogenater fra gnavere (figur 2A og 2B) og post mortem-forsøgspersoner (figur 3A og 3B) behandlet. Analysen viste sig at være lineær i intervallet 50-200 μg protein som vurderet ved mængder af mærket falloidin bevaret. Lysspredning ved 540 nm blev brugt til at bekræfte de forskellige mængder prøver(figur 2C og figur 3C).

Latrunculin, en actin depolymerizing agent reducerer binding af mærket falloidin
Latrunculin A er kendt for at depolymerisere actin filamenter og reducere niveauet af F-actin36,37,38,39. Homogenater fra enten gnavere eller humane hjernevæv blev inkuberet med 2 μM latrunculin A i 1 time ved 37 °C for at depolymerisere aktinfilamenter. De respektive ubehandlede kontrolsæt blev inkuberet med DMSO i samme periode på 1 time ved 37 °C. Analysen målte kraftigt tabet af F-actin-niveauer fra 95,7 ± 6,6 (middel ± SEM) i kontrolprøver til 72,0 ± 3,2 (middel ± SEM) μU bundet falloidin i latrunculin A-behandlede prøver i gnaverehjerne homogenater (Figur 4A). Et lignende fald (fra 83,7 ± 3,9 til 66,9 ± 4,2 μU) i tilbageholdelsen af mærket falloidin blev også observeret, når homogenater fra humane hjernevæv blev underkastet latrunculin A-behandling (Figur 4B). Bemærkelsesværdige, samlede actinniveauer, vurderet ved immunoblotting, ændrede sig ikke ved behandling med latrunculin A hos både rotter (supplerende figur 1A-B) og humane (supplerende figur 1C-D) hjerne homogenater.

Afpolarisering af isolerede synaptiske terminalerstimulerer actin polymerisering og glødetråd dannelse
Ex vivo depolarisering af isolerede synaptiske terminaler har vist sig at resultere i hurtig stimulering af actin polymerisering6,30,40, og dette fænomen blev brugt som en yderligere bekræftelse af analysen rapporteret heri. Biokemiske fraktioner beriget med synaptiske terminaler blev fremstillet på to forskellige måder; en gradientbaseret ultracentrifugeringsmetode til at opnå "synaptosomer"41,42,43,44 og en sekventiel filtreringsbaseret protokol for at opnå "synaptoneurosomes"43,45,46. Fordi udbyttet for sidstnævnte er højere, vi brugte det til humane post mortem hjernevæv, hvori væv mængder er ofte begrænsende. På den anden side foretrak vi at bruge synaptosomer med en højere grad af berigelse af synaptiske fragmenter41 til vores rottehjernevævseksperimenter.

Depolarisering af synaptosomer eller synaptoneurosomer og stimulering af actin polymerisering blev opnået ved en kort (30 sekunder) brast af stigning i ekstracellulær K+ til 50 mM. KCl-eksponeringen resulterede i øget falloidinbinding med næsten 40% i gnaverhjernesynaptosomer sammenlignet med de respektive mock-stimulerede kontroller (Figur 5A; se også supplerende figur 2A). En mindre (ca. 20%) men der blev også observeret en konstant stigning i humane synaptoneurosomer behandlet med KCl(figur 5B; se også supplerende figur 2A). Disse eksperimenter validere robusthed af vores analyse i fastsættelsen af ændringer i F-actin niveauer i hjernen vævsprøver, herunder isolerede synaptiske terminaler.

Figure 1
Figur 1. Standardkurve for fluorescens af Alexa Fluor 647 Phalloidin.  Fluorescensemissionens linearitet af forskellige mængder (25-500 μU) mærket falloidin blev bekræftet ved fluorescensspektroskopi ved en excitation på 645 nm og en emission på 670 nm (R2 = 0,9942). Data repræsenteres som middelværdi ± SEM (n=3). Klik her for at se en større version af dette tal.

Figure 2
Figur 2. Linearitet af falloidin binding til hele celle homogenater fra rotte hjernevæv.  (A) Der blev vurderet binding af falloidin til forskellige mængder homogenater (50-300 μg protein). (B) Bindingen var lineær i intervallet 50-200 μg protein (R2 = 0,9602). (C) Spredning ved 540 nm blev anvendt til at bekræfte forskellige mængder af prøverne (R2 = 0,8319). Data repræsenteres som middelværdi ± SEM (n=4). Klik her for at se en større version af dette tal.

Figure 3
Figur 3. Falloidin binding til helcelle homogenater fra post mortem humant hjernevæv.  (A) Phalloidinretention i en række homogenater (50-300 μg protein) blev evalueret. (B) Phalloidinbinding viste sig at være lineær i intervallet 50-200 μg protein (R2 = 0,8832). (C) Spredning ved 540 nm bekræftede de varierende mængder af prøverne (R2 = 0,9730). Data repræsenteres som middelværdi ± SEM (n=4). Klik her for at se en større version af dette tal.

Figure 4
Figur 4. Virkningerne af latrunculin A på F-actin niveauer.  Behandling af hjerne homogenater med actindepolymeriseringsmiddel Latrunculin A (2 μM, 1 timer ved 37 °C) resulterede i et betydeligt fald i mængden af actinfilamenter sammenlignet med de respektive mock-behandlede kontrolprøver som vurderet ved opbevaring af mærket falloidin både hos gnavere (p = 0,0034; parret to-tailed Student's t-test)(A) og post mortem humane væv (p = 0,0011; parret to-tailed Student's t-test)(B). Data repræsenteres som middelværdi ± SEM (n=6 par). Klik her for at se en større version af dette tal.

Figure 5
Figur 5. Virkningerne af KCl-medieret afpolarisering på F-actin beløb i isolerede synaptiske terminaler.  (A) Inkubation af synaptosomer fra rottehjerne med 50 mM KCl i 30'ere ved 37 °C stimulerede polymerisering, hvilket derfor resulterede i en stigning i phalloidinbinding (p = 0,0014; parret tosidet Student's t-test). (B) Der blev også observeret en mindre stigning i synaptoneurosomal fraktion fra post mortem humane hjernevæv (p = 0,014; parret to-tailed Student's t-test). Data repræsenteres som middelværdi ± SEM (n=6 par). Klik her for at se en større version af dette tal.

Supplerende figur 1. Latrunculin A's indvirkning på det samlede actinniveau.  Hjerne homogenater blev inkuberet med latrunculin A (2 μM, 1 time ved 37 °C) eller lige stor mængde DMSO (1 time ved 37 °C). Der blev indsamlet 10 μg protein pr. prøve (latrunculin A-behandlede og DMSO-mockbehandlede kontroller) inden fikseringen. De samlede actinniveauer blev vurderet ved immunoblotting. Repræsentative blots er vist for rotte (A) og human (C) hjerne homogeniserer. Latrunculin A ændrede ikke det samlede actinniveau hos både rotte (B; p = 0,40; parret tosidet Student's t-test) og human (D; p = 0,42; parret to-tailed Student's t-test) hjerne homogeniserer. Data repræsenteres som middelværdi ± SEM (n=3 par). Klik her for at hente denne fil.

Supplerende figur 2. Virkningerne af KCl-medieret afpolarisering på F-actin niveauer i rottesynaptosomer og humane synaptoneurosomer.  (A) Inkubation af synaptosomer fra rottehjerne med 50 mM KCl (30 s ved 37 °C) stimuleret actin polymerisering og en deraf følgende stigning i falloidinbinding (p = 0,0019; parret to-tailed Student's t-test). (B) Stigning i falloidin retention blev også observeret i human synaptoneurosomal fraktion depolariseret af KCl i forhold til de respektive ikke-formulerede kontroller (p = 0,015; parret to-tailed Student's t-test). Data repræsenteres som middelværdi ± SEM (n=6 par). Klik her for at hente denne fil.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Analysen, der er beskrevet her, hovedsagelig tilpasset fra en tidligere undersøgelse30 med modifikationer, anvender et phallotoxin, falloidin mærket med en fluorescerende etiket. Fluorescerende falloidinanaloger anses for at være guldstandarden for farvning af actinfilamenter i fast væv47,48,49. Faktisk er de de ældste værktøjer til specifikt at identificere actin filamenter50 og er stadig de mest anvendte instrumenter til at detektere actin filamenter, især for efterfølgende fluorescensmikroskopibaserede analyser. Det er vigtigt, at falloidin har vist sig at plette selv løs, uregelmæssigt meshwork af korte actin filamenter51, hvilket indikerer, at phalloidinbinding ikke afhænger af glødetrådens længde. Vores protokol er på den anden side afhængig af fluorescensspektroskopi for at analysere actindynamik i ex vivo biologiske prøver, for eksempel hjernevæv fra gnavere og mennesker.

Den største fordel ved protokollen er, at den reducerer den tid, det tager med hensyn til de eksisterende protokoller, der først kræver en højhastigheds centrifugeringsbaseret biokemisk isolering af F-actin (adskillelse fra G-actin baseret på insolubilitet af actin filamenter i visse vaskemidler som Triton X-100) og efterfølgende analyse af immunoreaktive niveauer ved hjælp af vestlige blotting6,28,29. Tidseffektiviteten af vores analyse er også en fordel med hensyn til falloidinbaserede immunocytokemiteknikker40,52, selvom der kan være nogle andre fordele forbundet med sidstnævnte. En anden fordel er, at det kan anvendes til kryopreserveret post mortem menneskelige hjernevæv, indkøb, som altid er forbundet med nogle post mortem forsinkelse. Med hensyn til den oprindelige protokol30, hvorfra denne metode er blevet ændret, har vi desuden reduceret kravet om vævsmængden betydeligt fra 1 mL cuvette til en enkelt brønd af en 96-brønds plade. På grund af medtagelsen af en falloidinstandardkurve i hvert forsøgssæt kan vores protokol desuden kvantificere absolutte niveauer af aktinfilamenter i enheder af falloidin bundet(figur 2A-B, 3A, 4A-B; se også supplerende figur 2) samt niveauerne i forhold til kontrolprøver(figur 5A-B).

Det skal bemærkes, at anvendelsen af falloidin til vurdering af F-actin niveauer dog er begrænset til faste celler og prøver, både for vores analyse protokol samt mikroskopi-baserede protokoller. Dette skyldes, at falloidin i det væsentlige er en giftig bicyklisk heptapeptid, der binder specifikt på grænsefladen mellem F-actin underenheder med høj affinitet og stabiliserer disse actin filamenter, hvilket gør dem ude af stand til at depolymerisere og faktisk øge nettoomdannelsen af G-actin til F-actin40,53,54. Derfor stabiliserer falloidin actin filamenter in vivo og in vitro, og kan resultere i betydelige ændringer i ligevægtsstatus for actin pr . Som en sådan evaluering af actin polymerisering status medieret af fluorescerende falloidin er baseret på anholdt glødetråd strukturer. På grund af sin lave permeabilitet gennem lipid bilayer er falloidinbaserede metoder desuden afhængige af gennemtrængning af cellerne eller biologiske prøver. Ufølsomhed af en tidsforløb levende celle assay er derfor en væsentlig begrænsning af protokollen som med immunocytochemistry-baserede metoder, der anvender falloidin.

Manglende mulighed for falloidinbaserede metoder til at evaluere dynamiske ændringer i aktin filamenter i levende ikke-fastgjorte celler rejser spørgsmålet om, hvorvidt der er alternative procedurer til at gøre det. Der er faktisk gjort fremskridt i denne henseende med eksogene udtryk for fluorescerende actin-analoger forud for analyse ved hjælp af protokoller som videomikrografi36,56, fluorescens, der genvindes efter fotobleaching (FRAP)38 eller fluorescens resonansenergioverførsel (FRET)39. Heterologt udtryk for fluorescerende mærkede peptider og proteiner, der binder actin filamenter er også ansat til at studere actin dynamik i levende celler; der er dog ulemper og begrænsninger forbundet med dem samt med det heterologe udtryk for fluorescerende mærket actin47,49,57. For eksempel er G-actin, der omfatter 50-70% af den samlede actin i de fleste celler opløselige og frit diffusible i cytosolen, hvilket resulterer i en højere baggrund, der forårsager udfordringer med at skelne signaler fra actin filamenter specifikt57.

En kritisk faktor i analysen er den, der er vist i figur 2 og figur 3; det er ikke lineært i hele rækken af testede proteinmængder. Derfor bør en optimal mængde protein, der er egnet til analysen, bestemmes først, eller mængden af falloidin analog bør justeres, så den ikke længere begrænser (ved større mængder proteiner). Et andet kritisk aspekt af protokollen er, at de mange centrifugeringsbaserede trin til fjernelse af fiksativ, gennemtrængningsmiddel og ubundet falloidin kan føre til varierende tab af proteiner (og F-actin bundet falloidin) fra prøverne, især når der anvendes lavere mængder prøver. Derfor er det vigtigt at normalisere mængden af prøve, der tilbageholdes ved at overvåge lysspredning ved 540 nm. Endelig bør fastsættelsen være hurtig, da handling er i en dynamisk tilstand af interkonvertering mellem dens F- og G-formularer. Et mindre relateret kritisk aspekt af analysen er, at vi ikke kunne evaluere dens effektivitet i vurderingen af farmakologisk actin polymerisering. I modsætning til farmakologisk actin depolymerisering af latrunculin A har jasplakinolide (et pålideligt og udbredt actin polymeriseringsmiddel) overlappende bindingssteder med falloidin og hæmmer konkurrencedygtigt dets binding til actin filamenter58,59. Ikke desto mindre, ansættelse af KCl-stimuleret synaptiske terminaler som en ex vivo model for øget actin polymerisering viser, at vores analyse også kan detektere stigninger i F-actin niveauer.

Afslutningsvis beskriver vi en robust tidseffektiv og høj gennemstrømningsanalyse til analyse af actinfilamenter (F-actin) og dens vekslen i fysiologiske og patofysiologiske tilstande, der passer til et 96-brønds pladeformat. I kombination med andre eksisterende metoder til evaluering af F-actin i faste og ikke-fastgjorte prøver vil protokollen vise sig at være et vigtigt redskab i actin-relaterede undersøgelser på neurovidenskabsområdet samt andre områder af biologisk videnskabsforskning.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Forfatterne har intet at afsløre.

Acknowledgments

Dette arbejde blev støttet af Neurological Foundation of New Zealand (1835-PG), New Zealand Health Research Council (#16-597) og Department of Anatomy, University of Otago, New Zealand. Vi står i gæld til Den Neurologiske Tissue Bank of HCB-IDIBAPS BioBank (Spanien) for humane hjernevæv. Vi takker Jiaxian Zhang for hendes hjælp til optagelse og redigering af videoen.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
3.5 mL, open-top thickwall polycarbonate tube Beckman Coulter 349622 For gradient centrifugation (synaptosome prep)
Alexa Fluor 647 Phalloidin Thermo Fisher Scientific A22287 F-actin specific ligand
Antibody against  b-actin Santa Cruz Biotechnology Sc-47778 For evaluation of total actin levels by immunoblotting
Antibody against GAPDH Abcam Ab181602 For evaluation of GAPDH levels by immunoblotting
Bio-Rad Protein Assay Dye Reagent Concentrate Bio-Rad 5000006 Bradford based protein estimation
Calcium chloride dihydrate (CaCl2·2H2O) Sigma-Aldrich C3306 Krebs buffer component
cOmplete, Mini, EDTA-free Protease Inhibitor Cocktail Sigma-Aldrich 4693159001 For inhibition of endogenous protease activity during sample preparation
Corning 96-well Clear Flat Bottom Polystyrene Corning 3596 For light-scattering measurements
D-(+)-Glucose Sigma-Aldrich G8270 Krebs buffer component
Dimethyl sulfoxide Sigma-Aldrich D5879 Solvent for phalloidin and latrunculin A
Fluorescent flatbed scanner (Odyssey Infrared Scanner) Li-Cor Biosciences For detection of immunoreactive signals on immunoblots
Glutaraldehyde solution (25% in water) Grade II Sigma-Aldrich G6257 Fixative
HEPES Sigma-Aldrich H3375 Buffer ingredient for sample preparation and Krebs buffer component
Latrunculin A Sigma-Aldrich L5163 Depolymerizer of actin filaments
Magnesium chloride hexahydrate (MgCl2·6H2O) Sigma-Aldrich M2670 Krebs buffer component
Microplates
Mitex membrane filter 5 mm Millipore LSWP01300 Preparation of synaptoneurosomes
Nunc F96 MicroWell Black Plate Thermo Fisher Scientific 237105 For fluorometric measurements
Nylon net filter 100 mm Millipore NY1H02500 Preparation of synaptoneurosomes
Phosphatase Inhibitor Cocktail IV Abcam ab201115 For inhibition of endogenous phosphatase activity during sample preparation
Potassium chloride (KCl) Sigma-Aldrich P9541 Krebs buffer component and for depolarization of synaptic terminals
Potassium phosphate monobasic ((KH2PO4) Sigma-Aldrich P9791 Krebs buffer component
Sodium borohydride (NaBH4) Sigma-Aldrich 71320 Component of Permeabilization buffer
Sodium chloride (NaCl) LabServ (Thermo Fisher Scientific) BSPSL944 Krebs buffer component
Sodium hydrogen carbonate (NaHCO3) LabServ (Thermo Fisher Scientific) BSPSL900 Krebs buffer component
SpectraMax i3x Molecular Devices For fluorometric measurements
Sucrose Fisher Chemical S/8600/60 Buffer ingredient for sample preparation
Swimnex Filter Holder Millipore Sx0001300 Preparation of synaptoneurosomes
Tissue grinder 5 mL Potter-Elvehjem Duran Wheaton Kimble 358034 For tissue homogenization
Triton X-100 Sigma-Aldrich X100 Component of Permeabilization buffer
Trizma base Sigma-Aldrich T6066 Buffer ingredient for sample preparation

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Penzes, P., Rafalovich, I. Regulation of the actin cytoskeleton in dendritic spines. Advances in Experimental Medicine and Biology. 970, 81-95 (2012).
  2. Venkatesh, K., Mathew, A., Koushika, S. P. Role of actin in organelle trafficking in neurons. Cytoskeleton. 77 (3-4), 97-109 (2020).
  3. Shirao, T., González-Billault, C. Actin filaments and microtubules in dendritic spines. Journal of Neurochemistry. 126 (2), 155-164 (2013).
  4. Bertling, E., Hotulainen, P. New waves in dendritic spine actin cytoskeleton: From branches and bundles to rings, from actin binding proteins to post-translational modifications. Molecular and Cellular Neuroscience. 84, 77-84 (2017).
  5. Bellot, A., et al. The structure and function of actin cytoskeleton in mature glutamatergic dendritic spines. Brain Research. 1573, 1-16 (2014).
  6. Wolf, M., et al. ADF/Cofilin controls synaptic actin dynamics and regulates synaptic vesicle mobilization and exocytosis. Cerebral Cortex. 25 (9), 2863-2875 (2015).
  7. Morales, M., Colicos, M. A., Goda, Y. Actin-dependent regulation of neurotransmitter release at central synapses. Neuron. 27 (3), 539-550 (2000).
  8. Doussau, F., Augustine, G. J. The actin cytoskeleton and neurotransmitter release: An overview. Biochimie. 82 (4), 353-363 (2000).
  9. Sakaba, T., Neher, E. Involvement of actin polymerization in vesicle recruitment at the calyx of held synapse. Journal of Neuroscience. , (2003).
  10. Lee, J. S., Ho, W. K., Lee, S. H. Actin-dependent rapid recruitment of reluctant synaptic vesicles into a fast-releasing vesicle pool. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. , (2012).
  11. Rust, M. B., et al. Learning, AMPA receptor mobility and synaptic plasticity depend on n-cofilin-mediated actin dynamics. EMBO Journal. 29, 1889-1902 (2010).
  12. Bosch, M., et al. Structural and molecular remodeling of dendritic spine substructures during long-term potentiation. Neuron. 82, 444-459 (2014).
  13. Hanley, J. G. Actin-dependent mechanisms in AMPA receptor trafficking. Frontiers in Cellular Neuroscience. 8, 381 (2014).
  14. Kasai, H., Fukuda, M., Watanabe, S., Hayashi-Takagi, A., Noguchi, J. Structural dynamics of dendritic spines in memory and cognition. Trends in Neurosciences. 33, 121-129 (2010).
  15. Terman, J. R., Kashina, A. Post-translational modification and regulation of actin. Current Opinion in Cell Biology. 25 (1), 30-38 (2013).
  16. Wilson, C., Terman, J. R., González-Billault, C., Ahmed, G. Actin filaments-A target for redox regulation. Cytoskeleton. 73, 577-595 (2016).
  17. Borovac, J., Bosch, M., Okamoto, K. Regulation of actin dynamics during structural plasticity of dendritic spines: Signaling messengers and actin-binding proteins. Molecular and Cellular Neuroscience. 91, 122-130 (2018).
  18. Saneyoshi, T., Hayashi, Y. The Ca2+ and Rho GTPase signaling pathways underlying activity-dependent actin remodeling at dendritic spines. Cytoskeleton. 69 (8), 545-554 (2012).
  19. Mizuno, K. Signaling mechanisms and functional roles of cofilin phosphorylation and dephosphorylation. Cellular Signalling. 25 (2), 457-469 (2013).
  20. Dos Remedios, C. G., et al. Actin binding proteins: Regulation of cytoskeletal microfilaments. Physiological Reviews. 83 (2), 433-473 (2003).
  21. Bamburg, J. R., Bernstein, B. W. Actin dynamics and cofilin-actin rods in Alzheimer disease. Cytoskeleton. 73 (9), 477-497 (2016).
  22. Penzes, P., VanLeeuwen, J. E. Impaired regulation of synaptic actin cytoskeleton in Alzheimer's disease. Brain Research Reviews. 67 (1-2), 184-192 (2011).
  23. Pelucchi, S., Stringhi, R., Marcello, E. Dendritic spines in Alzheimer's disease: How the actin cytoskeleton contributes to synaptic failure. International Journal of Molecular Sciences. 21 (3), 908 (2020).
  24. Kounakis, K., Tavernarakis, N. The Cytoskeleton as a Modulator of Aging and Neurodegeneration. Advances in Experimental Medicine and Biology. 1178, 227-245 (2019).
  25. Nishiyama, J. Plasticity of dendritic spines: Molecular function and dysfunction in neurodevelopmental disorders. Psychiatry and Clinical Neurosciences. 73 (9), 541-550 (2019).
  26. Michaelsen-Preusse, K., Feuge, J., Korte, M. Imbalance of synaptic actin dynamics as a key to fragile X syndrome. Journal of Physiology. 596 (14), 2773-2782 (2018).
  27. Hensel, N., Claus, P. The Actin Cytoskeleton in SMA and ALS: How Does It Contribute to Motoneuron Degeneration. Neuroscientist. 24 (1), 54-72 (2018).
  28. Kommaddi, R. P., et al. Aβ mediates F-actin disassembly in dendritic spines leading to cognitive deficits in alzheimer's disease. Journal of Neuroscience. 38 (5), 1085-1099 (2018).
  29. Kommaddi, R. P., et al. Glutaredoxin1 Diminishes Amyloid Beta-Mediated Oxidation of F-Actin and Reverses Cognitive Deficits in an Alzheimer's Disease Mouse Model. Antioxidants and Redox Signaling. 31 (18), 1321-1338 (2019).
  30. Bernstein, B. W., Bamburg, J. R. Cycling of actin assembly in synaptosomes and neurotransmitter release. Neuron. 3 (2), 257-265 (1989).
  31. Sapan, C. V., Lundblad, R. L., Price, N. C. Colorimetric protein assay techniques. Biotechnology and applied biochemistry. 29 (2), Pt 2 99-108 (1999).
  32. Kolodziej, A., et al. High resolution quantitative synaptic proteome profiling of mouse brain regions after auditory discrimination learning. Journal of Visualized Experiments. (118), e54992 (2016).
  33. Byun, Y. G., Chung, W. S. A novel in vitro live-imaging assay of astrocyte-mediated phagocytosis using pH indicator-conjugated synaptosomes. Journal of Visualized Experiments. (132), e56647 (2018).
  34. Chmielewska, J. J., Kuzniewska, B., Milek, J., Urbanska, K., Dziembowska, M. Neuroligin 1, 2, and 3 Regulation at the Synapse: FMRP-Dependent Translation and Activity-Induced Proteolytic Cleavage. Molecular Neurobiology. 56 (4), 2741-2759 (2019).
  35. Kuzniewska, B., Chojnacka, M., Milek, J., Dziembowska, M. Preparation of polysomal fractions from mouse brain synaptoneurosomes and analysis of polysomal-bound mRNAs. Journal of Neuroscience Methods. 293, 226-233 (2018).
  36. Fischer, M., Kaech, S., Knutti, D., Matus, A. Rapid actin-based plasticity in dendritic spines. Neuron. 20 (5), 847-854 (1998).
  37. Caesar, M., Felk, S., Aasly, J. O., Gillardon, F. Changes in actin dynamics and F-actin structure both in synaptoneurosomes of LRRK2(R1441G) mutant mice and in primary human fibroblasts of LRRK2(G2019S) mutation carriers. Neuroscience. 284, 311-324 (2015).
  38. Star, E. N., Kwiatkowski, D. J., Murthy, V. N. Rapid turnover of actin in dendritic spines and its regulation by activity. Nature Neuroscience. 5, 239-246 (2002).
  39. Okamoto, K. I., Nagai, T., Miyawaki, A., Hayashi, Y. Rapid and persistent modulation of actin dynamics regulates postsynaptic reorganization underlying bidirectional plasticity. Nature Neuroscience. 7, 1104-1112 (2004).
  40. Bernstein, B. W., Dewit, M., Bamburg, J. R. Actin disassembles reversibly during electrically induced recycling of synaptic vesicles in cultured neurons. Molecular Brain Research. 53 (1-2), 236-250 (1998).
  41. Ahmad, F., Liu, P. Synaptosome as a tool in Alzheimer's disease research. Brain Research. 1746, 147009 (2020).
  42. Ahmad, F., et al. Isoform-specific hyperactivation of calpain-2 occurs presymptomatically at the synapse in Alzheimer's disease mice and correlates with memory deficits in human subjects. Scientific Reports. 8 (1), 13119 (2018).
  43. Ahmad, F., et al. Reactive Oxygen Species-Mediated Loss of Synaptic Akt1 Signaling Leads to Deficient Activity-Dependent Protein Translation Early in Alzheimer's Disease. Antioxidants and Redox Signaling. 27 (16), 1269-1280 (2017).
  44. Ahmad, F., et al. Developmental lead (Pb)-induced deficits in redox and bioenergetic status of cerebellar synapses are ameliorated by ascorbate supplementation. Toxicology. 440, 152492 (2020).
  45. Ahmad, F., Salahuddin, M., Alsamman, K., Herzallah, H. K., Al-Otaibi, S. T. Neonatal maternal deprivation impairs localized de novo activity-induced protein translation at the synapse in the rat hippocampus. Bioscience Reports. 38 (3), 0118 (2018).
  46. Ahmad, F., Salahuddin, M., Alsamman, K., Almulla, A. A., Salama, K. F. Developmental lead (Pb)-induced deficits in hippocampal protein translation at the synapses are ameliorated by ascorbate supplementation. Neuropsychiatric Disease and Treatment. 14, 3289-3298 (2018).
  47. Melak, M., Plessner, M., Grosse, R. Actin visualization at a glance. Journal of Cell Science. 130 (3), 525-530 (2017).
  48. Adams, A. E. M., Pringle, J. R. Staining of actin with fluorochrome-conjugated phalloidin. Methods in Enzymology. 194, 729-731 (1991).
  49. Belin, B. J., Goins, L. M., Mullins, R. D. Comparative analysis of tools for live cell imaging of actin network architecture. BioArchitecture. 4 (6), 189-202 (2014).
  50. Wulf, E., Deboben, A., Bautz, F. A., Faulstich, H., Wieland, T. Fluorescent phallotoxin, a tool for the visualization of cellular actin. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 76, 4498-4502 (1979).
  51. Taffarel, M., de Souza, M. F., Machado, R. D., de Souza, W. Localization of actin in the electrocyte of Electrophorus electricus L. Cell and Tissue Research. 242, 453-455 (1985).
  52. Glebov, O. O. Distinct molecular mechanisms control levels of synaptic F-actin. Cell Biology International. 44 (1), 336-342 (2020).
  53. Dancker, P., Löw, I., Hasselbach, W., Wieland, T. Interaction of actin with phalloidin:. Polymerization and stabilization of F-actin. BBA - Protein Structure. , (1975).
  54. Lengsfeld, A. M., Löw, I., Wieland, T., Dancker, P., Hasselbach, W. Interaction of phalloidin with actin. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 71 (7), 2803-2807 (1974).
  55. Coluccio, L. M., Tilney, L. G. Phalloidin enhances actin assembly by preventing monomer dissociation. Journal of Cell Biology. 99, 529-535 (1984).
  56. Colicos, M. A., Collins, B. E., Sailor, M. J., Goda, Y. Remodeling of synaptic actin induced by photoconductive stimulation. Cell. 107 (5), 605-616 (2001).
  57. Lemieux, M. G., et al. Visualization of the actin cytoskeleton: Different F-actin-binding probes tell different stories. Cytoskeleton. 71, 157-169 (2014).
  58. Bubb, M. R., Senderowicz, A. M. J., Sausville, E. A., Duncan, K. L. K., Korn, E. D. Jasplakinolide, a cytotoxic natural product, induces actin polymerization and competitively inhibits the binding of phalloidin to F-actin. Journal of Biological Chemistry. , (1994).
  59. Holzinger, A. Jasplakinolide: an actin-specific reagent that promotes actin polymerization. Methods in molecular biology. 269, Clifton, N.J. 14869-14871 (2009).

Tags

Tilbagetrækning Udsendelse 172 synaptosomer synaptoneurosomer F-actin cytoskeleton depolarisering latrunculin A falloidin fluorescens
En tidseffektiv fluorescensspektroskopibaseret analyse til evaluering af Actin polymeriseringsstatus i gnavere og humane hjernevæv
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Ahmad, F., Liu, P. A Time-Efficient… More

Ahmad, F., Liu, P. A Time-Efficient Fluorescence Spectroscopy-Based Assay for Evaluating Actin Polymerization Status in Rodent and Human Brain Tissues. J. Vis. Exp. (172), e62268, doi:10.3791/62268 (2021).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter