Summary
Protokol, yetişkin ve yavru koyun oositlerinin vitrifikasyonu için standart bir yöntem sağlamayı amaçlamaktadır. Tüp bebek medyasının hazırlanmasından ısınma sonrası kültüre kadar tüm adımları içerir. Oositler, minimum temel hacmi sağlamak için Cryotop kullanılarak MII aşamasında vitrifiye edilir.
Abstract
Hayvancılıkta, bir mezbahadan kolayca elde edilebilen çok sayıda yumurtalık ve oosit sayesinde in vitro embriyo üretim sistemleri geliştirilebilir ve sürdürülebilir. Yetişkin yumurtalıklar her zaman birkaç antral folikül taşırken, pubertal öncesi donörlerde, yumurtalıkların antral foliküllerin en yüksek sayılarını taşıdığı 4 haftalıkken maksimum sayıda oosit mevcuttur. Bu nedenle, 4 haftalık kuzular, prepubertal oositlerin gelişimsel yeterliliği yetişkin meslektaşlarına kıyasla daha düşük olsa bile iyi donör olarak kabul edilir.
Temel araştırmalar ve ticari uygulamalar, hem yetişkin hem de prepubertal donörlerden elde edilen vitrifiye oositlerin başarıyla kriyoprezer tasarrufu olasılığı ile artırılacaktır. Prepubertal donörlerden toplanan oositlerin vitrifikasyonu da üretim aralığının kısaltılmasına ve böylece üreme programlarındaki genetik kazancın artırılmasına olanak sağlayacaktır. Bununla birlikte, kriyoprezervasyondan sonra gelişimsel potansiyelin kaybı, memeli oositleri muhtemelen kriyoprezervasyonu en zor hücre türlerinden biri haline getirir. Mevcut kriyoprezervasyon teknikleri arasında vitrifikasyon hayvan ve insan oositlerine yaygın olarak uygulanmaktadır. Teknikteki son gelişmelere rağmen, yüksek konsantrasyonlarda kriyoprotektif ajanların yanı sıra ürpertici yaralanma ve ozmotik strese maruz kalmak hala birkaç yapısal ve moleküler değişikliğe neden olmakta ve memeli oositlerin gelişim potansiyelini azaltmaktadır. Burada, çocuk ve yetişkin donörlerden toplanan ve kriyoprezervasyondan önce olgunlaşmış in vitro koyun oositlerinin vitrifikasyonu için bir protokol açıklıyoruz. Protokol, oosit in vitro olgunlaşmadan vitrifikasyona, ısınma ve ısınma sonrası kuluçka dönemine kadar tüm prosedürleri içerir. MII aşamasında vitrifiye edilen oositler ısınmadan sonra gerçekten döllenebilir, ancak kriyoprezervasyon prosedürleri nedeniyle hasarı geri yüklemek ve gelişim potansiyellerini artırmak için döllenmeden önce ekstra zamana ihtiyaçları vardır. Bu nedenle, ısınma sonrası kültür koşulları ve zamanlama, özellikle oositler genç donörlerden toplandığında, oosit gelişim potansiyelinin restorasyonu için çok önemli adımlardır.
Introduction
Dişi gametlerin uzun süreli depolanmasının, genetik seçim programlarıyla evcil hayvan yetiştiriciliğinin iyileştirilmesi, ex-situ yaban hayatı türlerinin korunması programı ile biyoçeşitliliğin korunmasına katkıda bulunması ve in vitro embriyo üretimi veya nükleer transplantasyon programlarına dahil edilecek depolanmış oositlerin mevcudiyeti sayesinde in vitro biyoteknoloji araştırma ve uygulamalarının artırılması gibi çok çeşitli uygulamalar sunabilir1,2,3. Juvenil oosit vitrifikasyonu da üreme programlarında üretim aralığını kısaltarak genetik kazancı artıracaktır4. Oositlerin ultra hızlı soğutulması ve ısıtılması ile vitrifikasyon şu anda hayvancılık oositleri kriyoprezervasyonu için standart bir yaklaşım olarak kabul edilir5. Ruminantlarda, vitrifikasyondan önce, oositler genellikle in vitro olarak olgunlaştırılır, a sittoir türevi yumurtalıklardan elde edilen foliküllerden alındıktan sonra2. Yetişkin ve özellikle prepubertal yumurtalıklar4,6, gerçekten kriyoprezerserved için neredeyse sınırsız sayıda oosit sağlayabilir.
Sığırlarda, oosit vitrifikasyonu ve ısınmadan sonra, son on yılda birkaç laboratuvar tarafından yaygın olarak bildirilen % 10'> blastosist verimi3. Bununla birlikte, küçük ruminantlarda oosit vitrifikasyonu hem genç hem de yetişkin oositler için hala nispeten yeni kabul edilir ve koyun oosit vitrifikasyonu için standart bir yöntem kurulmaya devam eder2,5. Son gelişmelere rağmen, vitrifiye edilmiş ve ısıtılmış oosit gerçekten de gelişim potansiyellerini sınırlayan çeşitli fonksiyonel ve yapısal değişiklikler sunar7,8,9. Bu nedenle, çok az makale% 10 veya daha fazla vitrifiye / ısıtılmış koyun oositleri2blastosist gelişimini bildirmiştir. Yukarıda belirtilen değişiklikleri azaltmak için çeşitli yaklaşımlar araştırılmıştır: vitrifikasyon ve çözülme çözeltilerinin bileşimini optimize etmek10,11; farklı kriyo cihazlarının kullanımı ile deneme8,12,13; ve in vitro olgunlaşma (IVM)4, 14,15ve/veya ısınmadan sonraki iyileşme süresi sırasında özel tedaviler uygulamak6.
Burada, çocuk ve yetişkin donörlerden toplanan ve kriyoprezervasyondan önce in vitro olarak olgunlaşan koyun oositlerinin vitrifikasyonu için bir protokol açıklıyoruz. Protokol, oosit in vitro olgunlaşmadan vitrifikasyona, ısınma ve ısınma sonrası kültür dönemine kadar tüm prosedürleri içerir.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Hayvan protokolü ve aşağıda açıklanan prosedürler, Sassari Üniversitesi'nde yürürlükte olan etik yönergelere, Avrupa Birliği Direktifi 86/609/EC'ye ve Avrupa Toplulukları Komisyonu 2007/526/EC'nin tavsiyesine uygundur.
1. Oosit manipülasyonu için medyanın hazırlanması
- Dulbecco'nun fosfat tamponlu salinini 0,1 g/L penisilin ve 0,1 g/L streptomisin (PBS) ile destekleyerek toplanan yumurtalıkların taşınması için ortamı hazırlayın.
- 9,5 g Doku Kültürü Ortamı (TCM) 199'u penisilinle desteklenmiş 1 L Milli-Q su ile toz halinde seyrelterek oosit toplama ve olgunlaşma için ortamı hazırlayın (%0,1) ve streptomisinin (%0.1).
- Seyreltmeden sonra, 100 mL orta filtreleyin ve bir hafta boyunca kullanılmak üzere Stok Olgunlaşma Ortamı (SMM) olarak 4 °C'de saklayın.
- Kalan 900 mL'yi 25 mM HEPES, 0,36 g/L bikarbonat ve %0,1 (w/v) polivinil alkol (PVA) (pH 7,3, osmolality 290 mOsm/kg) ile destekleyerek toplama ortamını (CM) hazırlayın.
- Olgunlaşma ortamını 0.021 g/L bikarbonat, %10 ısıl işlem görmüş östrus koyun serumu, 1 IU/mL FSH, 1 IU/mL LH, 100 μL sisteamin ve 8 mg/mL piruvat ile desteklenmiş SMM ile hazırlayın.
NOT: 10 mL hacimdeki olgunlaşma ortamı, kullanımdan önce en az 4 saat boyunca standart koşullarda (havada % 5 CO2'de 39 °C'de maksimum nemlendirilmiş atmosferde) inkübe edilmelidir. - Baz ortamı (BM) in vitro olgunlaşmadan sonra oosit manipülasyonu için hazırlayın, Ca++ ve Mg++içermeyen PBS'de% 20 fetal baldır serumu (FCS) ile desteklenmiştir.
2. Oosit toplama ve olgunlaşma
- Oositleri gençlerden (30-40 günlük yaş, vücut ağırlığı 6-10 kg) ve yetişkin yumurtalıklardan kurtarın.
- Toplanan yumurtalıkları ticari mezbahadan 27 °C'de PBS'de 1-2 saat içinde laboratuvara taşıyın.
- PBS taze ortamda yıkadıktan sonra, folikül içeriğini serbest bırakmak için yumurtalıkları bir mikro bıçak kullanarak CM olarak dilimleyin.
- 60x büyütmeli stereomikroskop muayenesi altında, 4-10 kat granüloza hücreli, düzgün sitoplazmalı oosit, sitoplazmada lipit damlacıklarının homojen dağılımı ve yaklaşık 90 μm (ortalama) dış çapı olanları seçerek in vitro olgunlaşma için kümülüs-oosit komplekslerini (COC' ler) seçin.
- Seçilen COC'leri CM'de üç kez yıkayın ve son olarak olgunlaşma ortamında aktarın.
NOT: Juvenil oositler için, vitrifikasyondan sonra sağkalımını iyileştirmek için, olgunlaşma ortamını 100 μM trehaloz ile destekleyin. - İn vitro olgunlaşma için, 300 μL mineral yağ ile kaplanmış dört kuyulu Petri kaplarında 600 μL olgunlaşma ortamında 30-35 CO'ları aktarın ve 39 ° C'de havada% 5 CO2'de 22 (yetişkin oositler)/24 (juvenil oositler) için kuluçkaya aktarın.
- In vitro olgunlaşmadan sonra, kümülüs hücrelerinin TÜB'lerini hafifçe pipetleme ile denude. 60x büyütmeli stereomikroskop altında yapılan incelemeyi takiben, vitrifikasyon için sadece ilk kutup gövdesinde ve dolayısıyla metafaz II (MII) aşamasında ekstrüzyonu gösterenleri seçin.
3. Sperm toplama, dondurma ve çözme prosedürleri
- Baz ortamı, %20 yumurta sarısı (v/v) ile desteklenmiş ram extender (200 mM Tris; 70 mM sitrik asit; 55 mM fruktoz; pH 7.2, osmolality 300 mOsm/kg) ile takviye edilen semen kriyoprezervasyonu için hazırlayın.
- Meniyi sadece koyun yetiştirme mevsiminde (Ekim-Kasım) toplayın.
- Yetişkin koçlardan (2-5 yaş arası), dış ortamda tutulan ve canlı ağırlık bakım rasyonunu besleyen yapay vajina ile boşalmalar elde edin. Koçları ayrı kalemlerde izole edin, ancak birbirleri arasında görsel temas vardır.
- Her erkekten en az 8 boşalma elde etmek için tüm üreme mevsimi boyunca haftada bir kez sperm toplamayı tekrarlayın.
- Sperm örneklerini toplama işleminden sonra 5 dakika içinde çevresel sıcaklıkta laboratuvara taşıyın ve hemen işleyin. İki-üç koç boşalmalarını bire bir edin ve sperm konsantrasyon spektrofotometrisini değerlendirin.
- Havuzlamadan sonra, boşalmaları% 4 gliserol ile desteklenmiş sperm kriyoprezervasyonu için baz ortam ile 400 x 106 spermatozoa / mL'ye kadar seyreltin. Daha sonra seyreltilmiş meniyi 2 saat boyunca 4 °C'ye soğutun ve donmadan önce 20 dakika boyunca dengelendirin.
- Meni örneklerini kuru buz üzerinde pelet formunda (0,25 mL) dondurun ve ardından sıvı nitrojene daldırın.
- Çözülme için, peleni sterilize edilmiş bir cam şahine koyun ve 39 ° C'de 20 s su banyosuna daldırın.
4. Tüp bebek ve embriyo kültürü
- Sentetik ögüktal sıvının (SOF) yapısı için stokları hazırlayın.
- Stok A Hazırlayın: 99,4 mL MilliQ-su; 6.29 g NaCl; 0.534 g KCl; 0.161 g KH2PO4; 0.182 g MgSO4 ·7H2O; ve 0.6 mL Sodyum Laktat. 3 aya kadar 4 °C'de tutun.
- Stok B Hazırlayın: 10 mL MiliQ-su; 0.210 g NaHCO3; ve 2-3 g Fenol Kırmızısı. 1 ay boyunca 4 °C'de tutun.
- Stok C: 10 mL MilliQ-su hazırlayın; ve 0.051 g sodyum piruvat. 1 ay boyunca 4 °C'de tutun.
- Stok D Hazırlayın: 10 mL MilliQ-su; ve 0.262 g CaCl2 2H2O. 1 ay boyunca 4 °C'de tutun.
- 7.630 mL MilliQ su, 1 mL Stok A, 1 mL Stok B, 0.07 mL Stok C ve 0.7 mL stok D'den oluşan 10 mL SOF hazırlayın.
- In vitro fertilizasyon (IVF) ortamı hazırlayın: SOF% 2 ısıl işlem görmüş östrous koyun serumu, 10 μg / mL heparin ve 1 μg / mL hipoutarin (osmolality 280-290 mOsm / kg) ile desteklenir.
NOT: 10 mL hacimdeki IVF ortamı standart koşullarda (%5 CO2'de39 °C'de maksimum nemlendirilmiş atmosferde%5O 2 ve %90 N2)kullanımdan önce en az 4 saat kuluçkaya yatırılmalıdır.
- Donmuş/çözülmüş meni aliquots 1.5 mL ılık IVF ortamının altında sterilize edilmiş bir cam konik tüpte aktarın ve havada% 5 CO2'de nemlendirilmiş bir atmosferde 39 ° C'de 15 dakika kuluçkaya bırakın.
- Kuluçkadan sonra, hareketli spermatozoa sıvı sütunun apikal kısmına doğru yüzer. Üst tabakayı toplayın ve sperm hareketliliği değerlendirmesi için gözlemleyin.
NOT: Sperm hareketliliği parametreleri aşağıdaki ayarlara sahip bilgisayar destekli bir sperm analizi (CASA) sistemi kullanılarak değerlendirilmelidir: Sperm izinin çakışmasını önlemek için elde edilen 25 kare, minimum kontrast 10, ortalama yol 30 μm / s'nin minimum hızı ve aşamalı hareketlilik% 80 düzlük >. Bu sistem ram sperm değerlendirme için özel bir kuruluma sahiptir. Her örnek için, 5 μL sperm süspansiyonu alt örneği, 10 μm derinliğe sahip önceden ısıtılmış bir analiz odasına yüklenir. Sperm hareketliliği faz kontrast mikroskobu kullanılarak 40x'te 37 °C'de değerlendirilir ve en az dört farklı mikroskobik alanda alt örneklem başına en az 500 sperm analiz edilmelidir. Total motile ve progresif motile sperm yüzdesi değerlendirildi. IVF için progresif motile spermatozoa yüzdesi% 30'≥ olmalıdır. - Yüzme türevi motile spermatozoayı 1 x 106 spermatozoa/mL son konsantrasyonda seyreltin ve dört kuyulu Petri kaplarında mineral yağ ile kaplı 300 μL IVF ortamında MII oositleri ile birlikte kuluçkaya yatırın.
- 22 saat sonra, %0,4 sığır serum albümini ve oviductal konsantrasyonda esansiyel ve esansiyel olmayan amino asitlerle desteklenmiş SOF içeren dört kuyulu Petri yemeklerindeki varsayımsal zigotları, mineral yağ altında16 kişi tarafından rapor edildiği gibi aktarın ve blastosist aşamasına kadar standart koşullar altında kültüre edin.
- 22, 26 ve 32- s tohumlama sonrası, 60x büyütmeli stereomikroskop altında yapılan incelemede, iki farklı blastomer gösteren bölünmüş oosit sayısını kaydedin.
- Embriyoları kültürün beşinci gününden başlayarak dokuzuncu gününe kadar günlük olarak gözlemleyin ve yeni oluşan blastosistler 60x büyütmeli stereomikroskop altında muayene ile kayıt altına alınmalıdır.
5. Oosit vitrifikasyonu ve ısınması
NOT: Cihaz kriyotoplarını kullanarak minimum temel hacim (MEV) yöntemini izleyerek vitrifikasyongerçekleştirin 17.
- BM'de 2 dakika boyunca 38,5 °C'de beş oositlik bir grubu dengeler. BM kullanımı düşük kalsiyum konsantrasyonu garanti eder ([Ca2++] 2.2 mg/dL)10.
- BM'de %7,5 (v/v) dimetil sülfit (DMSO) ve %7,5 (v/v) etilen glikol (EG) içeren equilibrasyon çözeltisine 3 dk maruz kalarak oositleri susuzlaştırın.
- Oositleri bir kriyotop cihazına yüklemeden ve 30 s içinde doğrudan sıvı nitrojene sokmadan önce BM'de %16,5 (v/v) DMSO, %16,5 (v/v) EG ve 0,5 M trehaloz içeren vitrifikasyon çözeltisine aktarın.
- Biyolojik bir sıcaklığa ısınmak için, her vitrifikasyon cihazının içeriğini sıvı azottan BM'de 38,5 °C'de 1 dakika boyunca 1,25 M trehalozun 200 μL damlasına aktarın ve karıştırmayı kolaylaştırmak için hafifçe karıştırın.
- Hücre içi kriyoprotektantların çıkarılmasını teşvik etmek için, Oositleri BM'de 38,5 °C'de 10 dakika boyunca dengelenmeden önce 38,5 °C'de 30 sn için 200 μL azalan trehaloz çözeltisi damlasına (BM'de 0,5 M, 0,25 M, 0,125 M trehaloz) adım adım aktarın.
6. Isınma sonrası oosit kalitesinin değerlendirilmesi
- Isındıktan sonra, oositleri PBS'de Ca++ ve Mg++ artı% 20 FCS (BM) olmadan 6 saat boyunca 38,5 ° C'de havada% 5 CO2'de kuluçkaya yatırın.
NOT: Vitrifikasyon sonrası biyolojik ve yapısal özellikleri geri kazanma oosit yeteneği, kullanılan oositlerin türleri ve sınıfları ile ilişkilidir. - Kriyoprezervasyon hasarlarını geri kazanma oosit yeteneği zamana bağlı olduğundan, oosit döllenmesi için en uygun zaman penceresini tanımlamak için, ısınmadan sonra in vitro kültürün farklı zaman noktalarında (0 h, 2 h, 4 h, 6 h) oosit kalitesini değerlendirin.
NOT: Yetişkin koyun oositinde, en uygun süre ısınma sonrası 4 saattir; prepubertal oosit için en uygun süre ısınma sonrası 2 saattir.
7. Oosit hayatta kalma değerlendirmesi
- Isınmadan hemen sonra ve ısınma sonrası kültürün her zaman noktası için, 100x büyütmeli ters bir mikroskop kullanarak oositleri morfolojik olarak değerlendirin.
NOT: Silik sitoplazma, hasar zona pellucida ve/veya membran gibi yapısal değişikliklere sahip oositler dejenere olarak sınıflandırılmalıdır. - Çift diferansiyel floresan boyama kullanarak membran bütünlüğü değerlendirmesini doğrulayın.
- Oositleri propidium iyodür (PI; 10 μg/mL) ve Hoechst 33342 (10 μg/mL) içeren 2 mL'lik BM'de 38,5 °C'de havada %5 CO2'de 5 dakika kuluçkaya yaslanın.
- Taze BM'de üç kez yıkadıktan sonra, Hoechst 33342 için 350 nm'lik bir uyarılma filtresi ve 460 nm emisyon ve 535 nm'lik bir uyarı filtresi ve PI için 617 nm emisyon kullanarak floresan mikroskop altında oositleri gözlemleyin.
NOT: Sağlam bir zara sahip oositler Hoechst 33342 ile renkli DNA'nın mavi floresanıyla tanınabilir. Hasarlı membranlı oosit, PI ile DNA lekesi nedeniyle kırmızı bir floresan gösterir.
8. Mitokondriyal aktivitenin ve ROS hücre içi düzeylerinin konfokal lazer tarama mikroskopisi ile değerlendirilmesi
- MitoTracker Red CM-H2XRos (MT-Red) probunu hazırlayın.
- 1 mM çözelti elde etmek için 1 şişe (50 μg) içeriğini 1 mL DMSO ile seyreltin. Seyreltilmiş şişeyi sıvı nitrojende tutun.
- Çözeltiyi DMSO ile 1 mM seyrelterek 100 μM stok çözeltisini elde edin ve karanlıkta -80 °C'de saklayın.
- 2′,7′-diklorodihydrofluorescein diasetat (H2DCF-DA) probu hazırlayın.
- İlk 100 mM çözeltiyi elde etmek için H2DCF-DA'yı% 0,1 polivinil pirrolidon (PVA)/ PBS'de seyreltin. Çözeltiyi karanlıkta -80 °C'de tutun.
- 100 μM stok çözeltisini elde etmek için ilk çözeltiyi% 0,1 PVA / PBS'de seyreltin. Karanlıkta -20 °C'de saklayın.
- Montaj ortamını (MM) hazırlayın: 10 mL MM için 5 mL gliserol, 5 mL PBS ve 250 mg sodyum azit ekleyin. Kullanıma kadar -20 °C'de saklayın.
- 500 nM MT-Red (stok çözeltisi: DMSO'da 100 μM) ile BM'de 38,5 °C'de 30 dakika boyunca oositleri kuluçkaya yaslanın.
- MT-Red probu ile inkübasyondan sonra, oositleri BM'de üç kez yıkayın ve 5 μM H 2 DCF-DA (stok çözeltisi: BM'de 100 μM) içeren aynı ortamda20dakika kuluçkaya yatırın.
- Problara maruz kaldıktan sonra, oositleri BM'de yıkayın ve% 2,5 glutaraldehit / PBS'de en az 15 dakika sabitlenin.
- Sabitleme işleminden sonra, oositleri BM'de üç kez yıkayın ve numunelerin sıkıştırılmasını önlemek için balmumu yastıkları kullanarak 1 mg/ mL Hoechst 33342 ile 4 μL MM'lik bir damla cam kaydıraklara monte edin.
- Slaytları değerlendirmeye kadar karanlıkta 4 °C'de saklayın.
- Konfokal lazer tarama mikroskobu ile immünal zilli bölümlerin analizini gerçekleştirin. Mikroskop, 40/60x yağ hedefi kullanılarak Ar/He/Ne lazerleri ile donatılmıştır. Bölümleri sıralı ekscitasyona göre analiz edin.
- Mitokondriyal değerlendirme için, MT-Red'i tespit etmek için örnekleri çoktoğraf lazerle gözlemleyin (pozlama: 579 nm; emisyon: 599 nm).
- Diklorofluorescein (DCF) 18'i belirtmek için 488 nm'de bir argon iyon lazer ışını ve B-2 A filtresi (495 nm maruz kalma ve519 nmemisyon) kullanın.
- Her bir oositte, ekvatoral düzlemde MT-Red ve DCF floresan yoğunluklarını ölçün19.
- Tüm görüntü alımları sırasında floresan yoğunluğu ile ilgili parametreleri sabit değerlerde koruyun (lazer enerjisi %26, Sıralı Ayarlar 1: PMT1 kazanç 649-PMT2 kazanç 482; Sıralı Ayar 2: PMT1 kazanç 625-PMT2 kazanç 589; uzaklık 0; iğne deliği boyutu: 68).
- Leica LAS AF Lite görüntü analizi yazılım paketini kullanarak floresan yoğunluğunun nicel analizinigerçekleştirin, 20tarafından standartlaştırılan prosedürleri izleyerek .
- Ekvator düzlemine ulaşana kadar Z ekseninde hareket ederek resimleri bir kez yakalayın.
- Her fotoğraf için gri skalaya dönüştürün ve kanal 1'i kapatın (Hoechst mavisi ile ilgili) kapatıldı. Daha sonra meiotik iğ çevresinde, çevrelenmiş bir alana manuel olarak bir ilgi alanı (YATıRıM YGsi) çizin.
NOT: Yazılım, kanal 2'deki (FITC) piksel ortalama değerini otomatik olarak okuyabilir ve arka planın değerini ondan çıkarabilir. - Piksellerin ortalama değerlerini kaydedin ve istatistiksel analiz için gönderin.
9. İstatistiksel Analizler
- Aşağıdaki farklılıkları analiz edin: juvenil ve yetişkin oositlerde sağkalım oranları, kontrol ve trehalozla tedavi edilen juvenil oositlerde sağkalım oranları ve gelişimsel yetkinlik, farklı kalsiyum konsantrasyon ortamı ile vitrifiye edilen erişkin oositlerin sağkalım ve partenogenetik aktivasyon oranları ve gelişimsel yeterliliği, düşük veya yüksek kalsiyum konsantrasyonu ile vitrifiye edilen juvenil oositlerde döllenme oranları ve embriyo üretimi, juvenil vitrifiye oositlerde aktif mitokondri fenotipleri chi kare testi kullanılarak yetişkin ve juvenil vitrifiye oositler arasında ısınma sonrası kültürün farklı zaman noktaları ve partenogenetik aktivasyon oranları.
- Isınma sonrası kültürün farklı zaman noktalarında vitrifiye yetişkin oositlerinde bölünme oranını ve embriyo çıkışını analiz edin, mitokondriyal aktivitenin floresan yoğunluğu ve çocuk vitrifiye oositlerinde ROS hücre içi düzeyler, Levene'nin testi ile varyansın homojenliği için analiz edildikten sonra ANOVA tarafından ısınma sonrası kültürün farklı zaman noktalarında. Gruplar arasındaki ve gruplar arasındaki farkları vurgulamak için geçici bir test Tukey testi kullanın.
- İstatistiksel yazılım programını kullanarak istatistiksel analiz yapın ve P < 0.05 olasılığının minimum önem düzeyi olduğunu düşünün. Tüm sonuçlar S.E.M ± olarak ifade edilir.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Çocuk donörlerden gelen oosit kriyotoleransı yetişkin olanlara göre daha düşüktür. Gözlenen ilk etki, yetişkin oositlere kıyasla ısınma sonrası sağkalım oranının daha düşük olmasıdır(Şekil 1A; χ2 test P<0.001). Juvenil oositler ısındıktan sonra daha düşük bir membran bütünlüğü göstermiştir (Şekil 1B). Olgunlaşma ortamında trehaloz kullanımı, bu şekerin juvenil oositlerdeki kriyoinjuries'i azaltıp azaltamayacağını doğrulamak için tasarlanmıştır. Veriler, trehaloz takviyesi ile24 saat olgunlaşan oositlerin tedavi edilmeyen gruba kıyasla vitrifikasyon/ısınma sonrası sağkalım oranlarının daha yüksek olduğunu göstermiştir(Tablo 1: sırasıyla % 85.7 vs% 75.3; χ2 test P<0.05). Trehaloz takviyesi gerçekten ısınmadan sonra daha yüksek membran bütünlüğü ile ilişkiliydi (Şekil 2A). Böylece, juvenil oositlerin in vitro olgunlaşması sırasında trehaloz kullanımı vitrifikasyon sonrası sağkalım oranlarını artırmıştır (%85,7) yetişkinlerle karşılaştırılabilir değerlere (%90,3). Ancak trehaloz takviyesi ile juvenil oositlerin bölünme, döllenme ve gelişim oranları artmamıştır(Tablo 1).
Vitrifikasyon sonrası oosit yeterliliğini geliştirmek için yetişkin yumurta oositlerinde test ettik, 9.9 ila 0.4 mg/ dL10arasında değişen kalsiyum konsantrasyonları ile farklı vitrifikasyon ortamları. Elde edilen sonuçlar, 2.2 mg/dL'ye eşit kalsiyum konsantrasyonuna sahip ortam kullanımının ısınma sonrası sağkalım oranlarını artırdığını, gelişimsel yeterliliğinin arttığını ve yetişkin oosit10'un partenogenetik aktivasyonunun azaldığını göstermiştir(Tablo 2). Böylece düşük kalsiyum vitrifikasyon ortamını juvenil oositlerin vitrifikasyonu için test ettik. Tablo 3'tegösterildiği gibi, düşük kalsiyum konsantrasyonu ile vitrifiye edilen juvenil oositler, yüksek kalsiyum konsantrasyonu ile vitrifiye edilen oositlere kıyasla daha yüksek döllenme oranlarına işaret etti (sırasıyla% 44.35'e karşı% 32.29; P<0.05), ancak embriyo üretiminde herhangi bir farklılık bulunmadı.
Vitrifiye/ısınmış oositler, kriyoprezervasyon prosedürleri nedeniyle hasarı geri kazanmak ve gelişim potansiyellerini artırmak için döllenmeden önce ekstra zamana ihtiyaç duyarlar. Daha önceki bir çalışma, ATP hücre içi konsantrasyon, mitokondriyal aktivite ve in vitro gelişimsel yeterliliğin, aynı zamanda yüksek hücre içi ROS konsantrasyonları gösteren vitrifiye / çözülmüş oositlerde azaldığını göstermiştir6. Bu değişiklikler özellikle ısınmadan hemen sonra işaretlenir. Isınma sonrası kültür sırasında, hem yetişkin hem de çocuk oositleri vitrifikasyon prosedürleri sırasında maruz kaldıkları zararlardan kısmen kurtulabilir6,24. Farklı sürelerdeki (0, 2, 4 ve 6 h) ısınma sonrası kültürü karşılaştırarak, yetişkin koyunlardan toplanan 4 saatlik kültür oositlerinden sonra enerjik denge6 ve mikrotübüler kurulum24'ü geri kazanabildiğini ve gelişimsel yeterliliği daha yüksek bölünme ile geri kazanabildiğini gösterdik (50.7 ±% 3.9; P< 0.01 ANOVA) ve blastosist oranları (14.40 ± %1.3; ANOVA P< 0,01) diğer zaman noktalarına göre (0, 2 ve 6 saat; Tablo 4). Bu nedenle, 4 saat ısınma sonrası kültür vitrifiye / ısıtılmış yetişkin oositlerin döllenmesi için ideal zaman penceresini temsil eder6.
Aynı deney çocuk donörlerden toplanan oositlerle tekrarlandığında, bu sonuçlar kısmen doğrulandı. Mitokondriyal aktivite, 4 saat ısınma sonrası kültürden sonra vitrifiye/ısıtılmış juvenil oositlerde diğer zaman noktalarına göre daha yüksekti (0, 2, 6; Şekil 3: ANOVA S<0.01). Mitokondriyal dağılımın çeşitli desenleri gözlenir ve aşağıdaki üç gruba ayrılır(21 tarafından bildirildiği gibi): Desen A: sitoplazma boyunca yayılan küçük granülasyonlarla homojen FINE; Desen B: sitoplazma boyunca yayılmış büyük granülasyonlara sahip homojen GRANÜLAR; Desen C: özellikle büyük granülasyonlar mevcut olduğunda heterojen KÜMELİ, sitoplazmın her yerine yayılmış veya belirli sitoplazmik etki alanlarında yer almaktadır. MII'de aktif mitokondriyal sitoplazma dağılımındaki farklı fenotipler oosit gelişimsel yeterliliği ile ilişkili olabilir. İnce homojen dağılım, zayıf gelişimsel yeterliliğin bir göstergesidir, GRANÜLAR ve KÜMELİ dağılımı ise artan bir mitokondri aktivitesi ve dolayısıyla daha yüksek gelişimsel yetkinlik22ile ilgilidir. Mitokondriyal dağılım şekilleri 6 saat ısınma sonrası kültür sırasında değişti. Şekil 4' te, farklı mitokondriyal dağılım kalıplarına sahip genç oositlerin örnekleri ve ısınma sonrası kültür sırasındaki dalgalanmaları göstermektedir. Desen A uzun süreli inkübasyon sırasında önemli ölçüde artar ve ısınma sonrası 6 saat daha yüksek değere ulaşır(Şekil 4Aa: χ2 P<0.05), B deseni sırasında önemli değişiklikler göstermedi ısınma sonrası kültür (Şekil 4Bb), C deseni uzun süreli inkübasyon sırasında herhangi bir juvenil vitrifiye /ısıtılmış oositte bulunamadı(Şekil 4Cc: χ2 P<0.05).
Ayrıca, ROS hücre içi düzeyleri, 0, 4 ve 6 h'ye kıyasla 2 saat ısıtma sonrası kültürde juvenil oositlerde anlamlı olarak daha düşüktü(Şekil 5: ANOVA P<0.001). Bununla birlikte, yetişkin oositlerde bulunanların aksine, juvenil oositlerde ısınma sonrası kültür sırasında spontan partenogenetik aktivasyon oranı artmıştır(Şekil 6). Bu nedenle, juvenil oositlerde döllenme için önerilen zaman noktası, ısınma sonrası kültürden sonra 2 saat olacaktır.
Şekil 1. Çocuk ve yetişkin donörlerden toplanan vitrifiye/ısıtılmış yumurta oositinin sağkalım oranları. (A) Oosit in vitro olgunlaşmadan sonra vitrifiye edildi. Sağkalım oranları vitrifikasyon ve ısınma sonrası propidium iyodür (10 μg/mL) ve Hoechst 33342 (10 μg/mL) ile floresan boyama ile belirlendi. N = 165 yetişkin oosit ve 170 juvenil oosit. Farklı harfler yetişkin ve juvenil oositler arasındaki önemli farklılıkları gösterir: χ2 test P<0.001. (B-C) Morfolojik değerlendirmede bozulmamış (B) ve hasarlı plazma membranlı (C) vitrifiye/ısıtılmış juvenil oosit örnekleri (100x büyütmeli ters mikroskop). Ölçek çubuğu = 10 μm. Bu şeklin daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.
Şekil 2. Juvenil yumurta oosit sağkalım oranları ve (TRH) ve (TO) trehaloz (olgunlaşma ortamında 100 mM) ile olgunlaşma sonrası in vitro gelişimsel yeterlilik. (A-B) Morfolojik değerlendirmede trehaloz olmadan(A) veya(B)ile takviye edilen medyada in vitro olgunlaşmadan sonra vitrifiye edilen juvenil oosit örnekleri (100x büyütmeli ters mikroskop). Ölçek çubuğu = 30 μm. Bu şeklin daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.
Şekil 3. Isınma sonrası in vitro kültür sırasında farklı zaman noktalarında (0, 2, 4, 6) vitrifiye/ısınmış juvenil oositlerde aktif mitokondriyal floresan yoğunluğunun ölçülmesi. Kontrol olarak IVM oositleri kullanıldı (TO N = 77). Üç bağımsız deneyde toplam 163 (0 h N = 45; 2 h N = 39; 4 h N = 40; 6 h N = 39) juvenil oositler vitrifiye edildi ve ısıtıldı. Farklı harfler istatistiksel olarak anlamlı farklılıklar gösterir (ANOVA P = 0.0000). Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.
Şekil 4. Mitokondriyal desenin 6 saatlik ısınma sonrası in vitro kültür boyunca vitrifiye/ısınmış juvenil oositlerde dağılımı. Vitrifiye/ısıtlı juvenil oositlerde İnce (A), Granül (B) ve Kümelenmiş (C) mitokondriyal dağılımın temsili görüntüleri. (D) İnce bir mitokondriyal dağılım gösteren juvenil vitrifiye/ısıtılmış oositlerin yüzdesi; (E) Granül mitokondriyal dağılım gösteren juvenil vitrifiye/ısıtılmış oositlerin yüzdesi; (F) Kümelenmiş mitokondriyal dağılım gösteren juvenil vitrifiye/ısınmış oositlerin yüzdesi. Kontrol olarak IVM juvenil oositler kullanılmıştır (TO; N = 77). Üç bağımsız deneyde vitrifiye edilen ve ısıtılan juvenil oositler toplam 163 (0 h N = 45; 2 h N = 39; 4 h N = 40; 6 h N = 39) kullanılmıştır. Farklı harfler istatistiksel olarak anlamlı farklılıklara işaret ediyor (Aa: χ2 P = 0.026; Bb: χ2 P = 0.097; Bilgi: χ2 P = 0.014). Ölçek çubuğu = 30 μm. Bu şeklin daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.
Şekil 5. İntrasellüler ROS floresan yoğunluğunun vitrifiye juvenil oositlerde 6 saat boyunca ölçülmesi in vitro kültür sonrası. (A-B) Tüp bebekte ROS floresan yoğunluğunun temsili görüntüleri olgunlaştı (A) ve vitrifiye (B) juvenil oositler. (C) Ros'un hücre içi düzeyleri, ısınma sonrası in vitro kültür sırasında vitrifiye juvenil oositlerdeki floresan yoğunluğunun farklı zaman noktalarında (0 h N=45; 2 h N=39; 4 h N=40; 6 h N=39) ölçülmesi ile belirlenir. Kontrol olarak in vitro olgunlaşmış juvenil oositler kullanıldı (TO N = 77). Farklı harfler istatistiksel olarak anlamlı farklılıklar gösterir (ANOVA P = 0.0000). Ölçek çubuğu = 50 μm. Bu şeklin daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.
Şekil 6. 6 saatlik ısınma sonrası in vitro kültür sırasında vitrifiye juvenil ve yetişkin oositlerde partenogenetik aktivasyon. (A-B) Oosit partenogenetik aktivasyonun temsili görüntüleri: (A) metafaz II-telofaz II geçişinde oosit ve (B) pronükleus oluşumu. (C) Isınma sonrası in vitro kültür sırasında farklı zaman noktalarında (0, 2, 4, 6 h) partenogenetik aktive yetişkin ve juvenil oositlerin yüzdeleri. Yıldız işaretleri, inkübasyonun her zaman noktasında juvenil ve yetişkin oositler arasındaki istatistiksel farklılıkları gösterir (ANOVA P = 0.000). Bu rakam Serra ve ark.24 Scale bar = 50 μm'den değiştirilmiştir.
| Oositler (n) | Sağkalım oranı (%) | IVF (n) | Döllenmişa (%) | Bölünenb (%) | Blastosistlerc (%) | |
| To | 73 | 75.3* | 452 | 91.1 | 96.1 | 14.3 |
| Trh | 77 | 85.7 | 470 | 92.5 | 95.4 | 13 |
| * Ki kare testi p<0.5 | ||||||
| IVF oositlerinde yüzdeler hesaplanır | ||||||
| b Yüzdeler döllenmiş oositler üzerinde hesaplanır | ||||||
| c Yüzdeler bölünen oositler üzerinde hesaplanır | ||||||
Tablo 1. Juvenil yumurta, trehaloz ve vitrifikasyon ile olgunlaşmadan ve olgunlaşmadan sonra sağkalım oranlarını ve in vitro gelişimsel yeterliliği oositler. TRH = trehaloz takviyesi ile olgunlaşan juvenil oositler (olgunlaşma ortamında 100 mM). TO = kontrol juvenil oositler trehaloz takviyesi olmadan olgunlaştı. Sağkalım oranları propidium iyodür (10 μg/mL) ve Hoechst 33342 (10 μg/mL) vitrifiye/ısıtılmış oositlerle floresan boyamadan sonra belirlendi. Oosit gelişimsel yeterliliği in vitro üretim sistemine dahil edildikten sonra belirlendi. bir Yüzdeler IVF oositlerinde hesaplanır. b Yüzdeler döllenmiş oositler üzerinde hesaplanır. c Yüzdeler bölünen oositler üzerinde hesaplanır. * χ2 test P<0.5. Bu tablo Berlinguer ve ark.23'ten değiştirilmiştir.
| Grup | [Ca++] mg/dL | N oosit | Spontan partenogenetik aktivasyon (%) | Vitrifiye oositler | Hayatta kalan ve IVF oositleri (%) | Bölünme (%) | Blastocysts çıkışı (%) |
| TCM/FCS | 9.9 | 80 | 33 (41,2)a | 150 | 124 (82,7)a | 40 (32,5)a | 2 (1,6)a |
| PBS/FCS | 4.4 | 82 | 29 (35,3)ac | 115 | 88 (76,5)a | 33 (37,5)ae | 1 (1.1)a |
| PBSCaMg ücretsiz/FCS | 2.2 | 86 | 11 (12,7)b | 126 | 115 (91,3)b | 74 (64.3)b | 12 (10,4)b |
| PBS/BSA | 3.2 | 83 | 21 (25,3)c | 110 | 90 (81,8)a | 18 (20)c | 0 (0)a |
| PBSCaMg ücretsiz/BSA | 0.4 | 87 | 10 (11,5)b | 149 | 123 (82,5)a | 57 (46,3)de | 3 (2.4)b |
Tablo 2. Farklı kalsiyum konsantrasyonları içeren in vitro olgunlaşmış erişkin oositlerin vitrifiye in vitrifikasyon ortamlarının (%16,5 etilen glikol + %16,5 dimetil süloksit) gelişimsel yeterliliği. Sağkalım ve döllenme oranları vitrifiye oositler üzerinde hesaplanır; toplam bölünme ve blastosist oranları hayatta kalan oositler üzerinde hesaplanır. Aynı sütun içinde farklı alt simgeye sahip değerler önemli ölçüde farklıdır: χ2 testi P<0.05. Bu tablo Succu ve ark.10'dan değiştirilmiştir
| [Ca 2++] in vitrifikasyon ortamı | Hayır. Oositler | Vitrifikasyon sonrası sağkalım oranı (%) | Gübreleme oranı (%) | Bölünme (%) | Blastosist çıkışı (%) |
| Yüksek [9,9 mg/dL] | 190 | 161 (84.73) | 52/161 (32,29)a | 43/161 (26.7) | 0 |
| Düşük [2,2 mg/dL] | 150 | 124 (82.66) | 55/124 (44,35)b | 41/124 (33.1) | 0 |
Tablo 3. Tüp bebek sonrası döllenme ve gelişimsel oranlar ve vitrifiye/ısınmış juvenil oosit kültürü yüksek ([Ca 2++] = 9.9 mg/dL) ve düşük ([Ca 2++] = 2.2 mg/dL) kalsiyum konsantrasyonu vitrifikasyon ortamı kullanılarak. Farklı harfler istatistiksel farkı gösterir (≠ b P<0.05 χ2 testi).
| Isınma sonrası kuluçka saatleri | Bölünme oranı (n) | Embriyo çıkışı (n) |
| 0 | 19.2 ± 3%a (82) | %0a (17) |
| 2 | 41.8 ± 3%b (100) | 6.5 ± 1.3%b (42) |
| 4 | 50.7 ± 3%b (92) | 14.4 ± 1.3%c (48) |
| 6 | 26 ± 3%a (92) | %0a (23) |
Tablo 4. Isınma sonrası kültürün farklı zaman noktalarında döllenen vitrifiye/ısınmış erişkin oositlerinde bölünme oranı ve embriyo çıkışı. Farklı harfler aynı sütundaki istatistiksel farkı gösterir: ANOVA P<0.01.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Evcil hayvanlarda oosit kriyoprezervasyonu sadece dişi genetik kaynakların uzun süreli korunmasına izin vermekle kalmaz, aynı zamanda embriyonik biyoteknolojilerin gelişimini de ilerletebilir. Bu nedenle, oosit vitrifikasyonu için standart bir yöntemin geliştirilmesi hem hayvancılık hem de araştırma sektörüne avantaj sağlayacaktır. Bu protokolde, yetişkin koyun oosit vitrifikasyonu için eksiksiz bir yöntem sunulmaktadır ve juvenil oosit için etkili bir vitrifikasyon sisteminin geliştirilmesi için sağlam bir başlangıç noktasını temsil edebilir.
Önerilen yöntemin ana avantajlarından biri, oosit toplama, in vitro olgunlaşma, vitrifikasyon ve ısınmadan tüm adımları içermesidir. Ayrıca, oositlerin döllenmeden önce vitrifikasyon prosedürü sırasında oluşan hasarlardan kurtulmalarını sağlamak için ısınma sonrası bir kültür dönemi içerir. Döllenme için optimum süre kriyoprezervasyon yöntemine, ilk oosit kalitesine, hasta yaşına ve türlere göre uyarlanmalıdır, zaman iyileşmesinin ve oosit yaşlanmasının her iki yönünü de göz önünde bulundurmak için gerekliolmalıdır 25,26. Bu nedenle, ısınma sonrası kuluçka süresinin seçilmesi zordur ve oosit vitrifikasyon programlarının sonucunu etkileyebilir. Bölünme oranları ve embriyo çıktısı açısından elde edilen sonuçlara dayanarak ve sunulan protokolde açıklanan koşullar altında, vitrifiye yetişkin koyun oositlerinin döllenmesi için optimum süre 4 saat ısınma sonrası inkübasyondan sonradır (Tablo 4)6. Bu bilgi bir oosit vitrifikasyon programı tasarlarken çok önemlidir.
Bununla birlikte, bu protokol vitrifiye/ısıtılmış erişkin oositlerden embriyo çıkışı açısından kabul edilebilir sonuçlar verirken, juvenil oositlere uygulandığı takdirde hala düşük ila sıfır embriyoya yol açmaktadır. Küçük boyut, kümülüs hücreleri ve oositler arasında kusurlu bağlantı, amino asit alımında azalma, azaltılmış protein sentezi ve enerji metabolizması gibi çeşitli yapısal ve fonksiyonel sınırlamalar prepubertal oosit gelişimsel yeterliliğini bozar 27,28,29. Daha önceki bir çalışmada prepubertal oositlerin vitrifikasyon prosedürüne yüksek hassasiyet gösterdiğini bildirmiştik30. Vitrifikasyon ve ısınmadan sonra gösterilen düşük gelişimsel yetkinlik, muhtemelen sitoskeletonun yeniden düzenlenmesinde ve (veya) olgunlaşmayı teşvik eden faktörün aktivasyonunda yer alan sitoplazmik faktörlerin zararlarının sonucudur30. Tablo 1'degösterildiği gibi, olgunlaşma ortamının geçirgen olmayan bir kriyoprotektant olan trehaloz ile takviyesi, vitrifikasyon ve ısınmadan sonra sağkalım oranlarını yetişkin oositlerinkiyle karşılaştırılabilir değerlere artırabildi4. Aynı şekilde, düşük kalsiyum konsantrasyonlarına sahip vitrifikasyon çözeltisinin kullanımı, Tablo 3'tegösterildiği gibi, vitrifikasyon ve ısınmadan sonra juvenil oositlerin döllenme oranlarını arttırır. Bu nedenle, hem in vitro olgunlaşma sırasında kültür koşulları üzerindeki optimizasyon hem de vitrifikasyon ortam bileşimi, vitrifikasyon ve ısınmadan sonra juvenil oosit kalitesinin artmasına yardımcı olabilir. Juvenil oositler, Şekil 3,4 ve 5'tegösterildiği gibi, vitrifikasyon prosedürünün neden olduğu hasarlardan kurtulma yeteneğini gösterir.
Bununla birlikte, ısınma sonrası kültür sırasında spontan partenogenetik aktivasyonun yüksek oranları hala gelişim potansiyellerini sınırlamakla birlikte. Yaygın olarak kriyoprotektif ajanlar olarak kullanılan etilen glikol ve DMSO, gerçek döllenmeden önce oositleri yapay olarak aktive edebilir, böylece döllenme başarısını ve embriyo gelişimini sınırlayabilir. Gerçekten hücre içi Ca2 + konsantrasyon31'degeçici bir artışa neden olabilirler, böylece kortikal granül eksositozu, pronüklei oluşumu ve meiotik yeniden başlamasıtetikler 32. Aslında, vitrifikasyon gerçek döllenmeden önce oositleri yapay olarak aktive edebilir, böylece döllenme başarısını ve embriyo gelişimini sınırlayabilir. Kalsiyum şelatör böylece juvenil oositlerde spontan aktivasyon oranını sınırlamak amacıyla vitrifikasyon sürecinde kalsiyum kullanılabilirliğini daha da sınırlamak için kullanılabilir.
Ayrıca, yavaş dondurmanın aksine, vitrifikasyonun sadece manuel bir teknik olduğu ve bu nedenle operatöre bağlı olduğu düşünülmelidir33,34. Bu nedenle, eğitimli personelin mevcudiyeti bu yöntemin başarısı için önemli bir faktördür. Her şeyden önce, operatör vitrifiye edilecek oositleri düzgün bir şekilde seçilmelidir. IVM'den sonra, oositler kümülüs hücrelerinden hafifçe indirilir ve kriyoprezervasyon için seçmek için bir stereomikroskop altında değerlendirilir, sadece tek tip sitoplazma, sitoplazmada lipit damlacıklarının homojen dağılımı ve yaklaşık 90 μm dış çapı olanlar. Ayrıca, sadece ilk kutup gövdesindeki ekstrüzyonu gösteren oositler ve böylece MII aşamasında seçilmelidir.
Oositlerin morfolojik değerlendirmesi birkaç dakika içinde tamamlanmalıdır ve operatöre bağlı olarak, uygun uygulanmasındaki değişikliklere karşı çok hassastır. Seçim prosedürünü standartlaştırmaya yardımcı olmak için yöntem, in vitro olgunlaşma için kültür süresinin yetişkin oositler için 22 saat ile sınırlandırılmasını önerir. Bu noktada, yüksek kalitede koyun oositleri ilk meiotik bölüm22'yi çoktan tamamlamıştır ve kriyoprezervasyon için seçilebilir. Bu şekilde, ilk meiotik bölümün tamamlanmasında en yavaş olanlar olan düşük kaliteli oositlerin ortadan kaldırılması daha basit olmalıdır.
Operatör ayrıca, kriyoprotektantın ilk maruziyetinden sıvı nitrojene daldırılmasına kadar vitrifikasyon prosedürü için ayarlanan zamanlamaya kesinlikle saygı göstermelidir. Bir diğer kritik adım ise oositin kullanılan vitrifikasyon cihazına yüklenmesidir. Prosedür, soğutma hızını artırmak ve hücrelerin faz geçiş sıcaklığından hızla geçmesine yardımcı olmak için minimum numune hacimleri kullanmalıdır, böylece kriyoinjuries35azalır. Kriyotop, tutucuya bağlı bir polipropilen şerit kullanır. Bu yöntemde, vitrifikasyon çözeltisinde (<0.1 μL) bulunan oositler, film şeridinin üzerine hızla cam bir kılcal damar ile yüklenir. Daha sonra, çözelti, kriyoprezerserve edilecek hücreleri örtmek için yeterli ince bir tabaka bırakılarak çıkarılmalıdır. Bir kez daha, oositlerin ozmotik şoka neden olabilen ve hücreler için toksik olan vitrifikasyon çözeltisinin yüksek kriyoprotektan konsantrasyonlarına maruz kalmasını sınırlamak için bu adım mümkün olduğunca hızlı tamamlanmalıdır.
Bu nedenlerden dolayı, bu yöntemle ilgili en büyük zorluk manuel kullanım ve yetenekli teknisyen ihtiyacıdır. Diğer yazarlar, oosit vitrifikasyon sonucunun bir "öğrenme eğrisi" etkisinden etkilendiğini bildirdi, çünkü manuel becerilerin kazanılması vitrifikasyon prosedürü ile ortaya çıkan biyolojik hasarı önemli ölçüde azaltabilir34. Araştırmacılar bu nedenle vitrifikasyon prosedürünün sonucunun değerlendirilmesinde "operatör etkisini" dikkate almalıdır.
Daha fazla çalışma, hem oosit seçim prosedürünü standartlaştırmaya hem de medya kompozisyonunu ve kültür koşullarını genç oositlerin ihtiyaçlarına daha iyi uyarlamaya odaklanacaktır. Bu bakımdan hem kalsiyum şelatör hem de antioksidan kullanımı umut verici fırsatlar sunabilir. Benzer şekilde, protokolün optimizasyonu vitrifiye /ısınmış yetişkin oositlerin gelişimsel yeterliliğinin artırılmasına izin verecektir.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Yazarlar rakip finansal çıkarları olmadığını beyan ederler.
Acknowledgments
Yazarlar bu çalışma için özel bir fon almadılar. Profesör Maria Grazia Cappai ve Dr. Valeria Pasciu, video seslendirmesi ve video yapımı sırasında laboratuvarı kurmaları için minnettar bir şekilde kabul edilmektedir.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 2′,7′-Dichlorofluorescin diacetate | Sigma-Aldrich | D-6883 | |
| Albumin bovine fraction V, protease free | Sigma-Aldrich | A3059 | |
| Bisbenzimide H 33342 trihydrochloride (Hoechst 33342) | Sigma-Aldrich | 14533 | |
| Calcium chloride (CaCl2 2H20) | Sigma-Aldrich | C8106 | |
| Citric acid | Sigma-Aldrich | C2404 | |
| Confocal laser scanning microscope | Leica Microsystems GmbH,Wetzlar | TCS SP5 DMI 6000CS | |
| Cryotop Kitazato | Medical Biological Technologies | ||
| Cysteamine | Sigma-Aldrich | M9768 | |
| D- (-) Fructose | Sigma-Aldrich | F0127 | |
| D(+)Trehalose dehydrate | Sigma-Aldrich | T0167 | |
| Dimethyl sulfoxide (DMSO) | Sigma-Aldrich | D2438 | |
| Dulbecco Phosphate Buffered Saline | Sigma-Aldrich | D8537 | |
| Egg yolk | Sigma-Aldrich | P3556 | |
| Ethylene glycol (EG) | Sigma-Aldrich | 324558 | |
| FSH | Sigma-Aldrich | F4021 | |
| Glutamic Acid | Sigma-Aldrich | G5638 | |
| Glutaraldehyde | Sigma-Aldrich | G5882 | |
| Glycerol | Sigma-Aldrich | G5516 | |
| Glycine | Sigma-Aldrich | G8790 | |
| Heparin | Sigma-Aldrich | H4149 | |
| HEPES | Sigma-Aldrich | H4034 | |
| Hypoutarine | Sigma-Aldrich | H1384 | |
| Inverted microscope | Diaphot, Nikon | ||
| L-Alanine | Sigma-Aldrich | A3534 | |
| L-Arginine | Sigma-Aldrich | A3784 | |
| L-Asparagine | Sigma-Aldrich | A4284 | |
| L-Aspartic Acid | Sigma-Aldrich | A4534 | |
| L-Cysteine | Sigma-Aldrich | C7352 | |
| L-Cystine | Sigma-Aldrich | C8786 | |
| L-Glutamine | Sigma-Aldrich | G3126 | |
| LH | Sigma-Aldrich | L6420 | |
| L-Histidine | Sigma-Aldrich | H9511 | |
| L-Isoleucine | Sigma-Aldrich | I7383 | |
| L-Leucine | Sigma-Aldrich | L1512 | |
| L-Lysine | Sigma-Aldrich | L1137 | |
| L-Methionine | Sigma-Aldrich | M2893 | |
| L-Ornithine | Sigma-Aldrich | O6503 | |
| L-Phenylalanine | Sigma-Aldrich | P5030 | |
| L-Proline | Sigma-Aldrich | P4655 | |
| L-Serine | Sigma-Aldrich | S5511 | |
| L-Tyrosine | Sigma-Aldrich | T1020 | |
| L-Valine | Sigma-Aldrich | V6504 | |
| Magnesium chloride heptahydrate (MgSO4.7H2O) | Sigma-Aldrich | M2393 | |
| Makler Counting Chamber | Sefi-Medical Instruments ltd.Biosigma S.r.l. | ||
| Medium 199 | Sigma-Aldrich | M5017 | |
| Mineral oil | Sigma-Aldrich | M8410 | |
| MitoTracker Red CM-H2XRos | ThermoFisher | M7512 | |
| New born calf serum heat inactivated (FCS) | Sigma-Aldrich | N4762 | |
| Penicillin G sodium salt | Sigma-Aldrich | P3032 | |
| Phenol Red | Sigma-Aldrich | P3532 | |
| Polyvinyl alcohol (87-90% hydrolyzed, average mol wt 30,000-70,000) | Sigma-Aldrich | P8136 | |
| Potassium Chloride (KCl) | Sigma-Aldrich | P5405 | |
| Potassium phosphate monobasic (KH2PO4) | Sigma-Aldrich | P5655 | |
| Propidium iodide | Sigma-Aldrich | P4170 | |
| Sheep serum | Sigma-Aldrich | S2263 | |
| Sodium azide | Sigma-Aldrich | S2202 | |
| Sodium bicarbonate (NaHCO3) | Sigma-Aldrich | S5761 | |
| Sodium chloride (NaCl) | Sigma-Aldrich | S9888 | |
| Sodium dl-lactate solution syrup | Sigma-Aldrich | L4263 | |
| Sodium pyruvate | Sigma-Aldrich | P2256 | |
| Sperm Class Analyzer | Microptic S.L. | S.C.A. v 3.2.0 | |
| Statistical software Minitab 18.1 | 2017 Minitab | ||
| Stereo microscope | Olimpus | SZ61 | |
| Streptomycin sulfate | Sigma-Aldrich | S9137 | |
| Taurine | Sigma-Aldrich | T7146 | |
| TRIS | Sigma-Aldrich | 15,456-3 |
References
- Arav, A.
- Mullen, S. F., Fahy, G. M. A chronologic review of mature oocyte vitrification research in cattle, pigs, and sheep. Theriogenology. 78 (8), 1709-1719 (2012).
- Hwang, I. S., Hochi, S. Recent progress in cryopreservation of bovine oocytes. BioMed Research International. 2014, (2014).
- Berlinguer, F., et al. Effects of trehalose co-incubation on in vitro matured prepubertal ovine oocyte vitrification. Cryobiology. 55 (1), (2007).
- Quan, G., Wu, G., Hong, Q. Oocyte Cryopreservation Based in Sheep: The Current Status and Future Perspective. Biopreservation and Biobanking. 15 (6), 535-547 (2017).
- Succu, S., et al. A recovery time after warming restores mitochondrial function and improves developmental competence of vitrified ovine oocytes. Theriogenology. 110, (2018).
- Succu, S., et al. Vitrification of in vitro matured ovine oocytes affects in vitro pre-implantation development and mRNA abundance. Molecular Reproduction and Development. 75 (3), (2008).
- Succu, S., et al. Vitrification Devices Affect Structural and Molecular Status of In Vitro Matured Ovine Oocytes. Molecular Reproduction and Development. 74, 1337-1344 (2007).
- Hosseini, S. M., Asgari, V., Hajian, M., Nasr-Esfahani, M. H. Cytoplasmic, rather than nuclear-DNA, insufficiencies as the major cause of poor competence of vitrified oocytes. Reproductive BioMedicine Online. , (2015).
- Succu, S., et al. Calcium concentration in vitrification medium affects the developmental competence of in vitro matured ovine oocytes. Theriogenology. 75 (4), (2011).
- Sanaei, B., et al. An improved method for vitrification of in vitro matured ovine oocytes; beneficial effects of Ethylene Glycol Tetraacetic acid, an intracellular calcium chelator. Cryobiology. 84, 82-90 (2018).
- Quan, G. B., Wu, G. Q., Wang, Y. J., Ma, Y., Lv, C. R., Hong, Q. H. Meiotic maturation and developmental capability of ovine oocytes at germinal vesicle stage following vitrification using different cryodevices. Cryobiology. 72 (1), 33-40 (2016).
- Fernández-Reyez, F., et al. maturation and embryo development in vitro of immature porcine and ovine oocytes vitrified in different devices. Cryobiology. 64 (3), 261-266 (2012).
- Ahmadi, E., Shirazi, A., Shams-Esfandabadi, N., Nazari, H. Antioxidants and glycine can improve the developmental competence of vitrified/warmed ovine immature oocytes. Reproduction in Domestic Animals. 54 (3), 595-603 (2019).
- Barrera, N., et al. Impact of delipidated estrous sheep serum supplementation on in vitro maturation, cryotolerance and endoplasmic reticulum stress gene expression of sheep oocytes. PLoS ONE. 13 (6), (2018).
- Walker, S. K., Hill, J. L., Kleemann, D. O., Nancarrow, C. D. Development of Ovine Embryos in Synthetic Oviductal Fluid Containing Amino Acids at Oviductal Fluid Concentrations. Biology of Reproduction. 55 (3), 703-708 (1996).
- Kuwayama, M., Vajta, G., Kato, O., Leibo, S. P. Highly efficient vitrification method for cryopreservation of human oocytes. Reproductive BioMedicine Online. 11 (3), 300-308 (2005).
- Wu, X., Jin, X., Wang, Y., Mei, Q., Li, J., Shi, Z. Synthesis and spectral properties of novel chlorinated pH fluorescent probes. Journal of Luminescence. 131 (4), 776-780 (2011).
- Dell'Aquila, M. E., et al. Prooxidant effects of verbascoside, a bioactive compound from olive oil mill wastewater, on in vitro developmental potential of ovine prepubertal oocytes and bioenergetic/oxidative stress parameters of fresh and vitrified oocytes. BioMed Research International. 2014, (2014).
- Gadau, S. D. Morphological and quantitative analysis on α-tubulin modifications in glioblastoma cells. Neuroscience Letters. 687, 111-118 (2018).
- los Reyes, M. D., Palomino, J., Parraguez, V. H., Hidalgo, M., Saffie, P. Mitochondrial distribution and meiotic progression in canine oocytes during in vivo and in vitro maturation. Theriogenology. , (2011).
- Leoni, G. G., et al. Differences in the kinetic of the first meiotic division and in active mitochondrial distribution between prepubertal and adult oocytes mirror differences in their developmental competence in a sheep model. PLoS ONE. 10 (4), (2015).
- Berlinguer, F., et al. Effects of trehalose co-incubation on in vitro matured prepubertal ovine oocyte vitrification. Cryobiology. 55 (1), 27-34 (2007).
- Serra, E., Gadau, S. D., Berlinguer, F., Naitana, S., Succu, S. Morphological features and microtubular changes in vitrified ovine oocytes. Theriogenology. 148, 216-224 (2020).
- Asgari, V., Hosseini, S. M., Ostadhosseini, S., Hajian, M., Nasr-Esfahani, M. H. Time dependent effect of post warming interval on microtubule organization, meiotic status, and parthenogenetic activation of vitrified in vitro matured sheep oocytes. Theriogenology. 75 (5), 904-910 (2011).
- Ciotti, P. M., et al. Meiotic spindle recovery is faster in vitrification of human oocytes compared to slow freezing. Fertility and Sterility. 91 (6), 2399-2407 (2009).
- Ledda, S., Bogliolo, L., Leoni, G., Naitana, S. Cell Coupling and Maturation-Promoting Factor Activity in In Vitro-Matured Prepubertal and Adult Sheep Oocytes1. Biology of Reproduction. 65 (1), 247-252 (2001).
- Palmerini, M. G., et al. In vitro maturation is slowed in prepubertal lamb oocytes: ultrastructural evidences. Reproductive Biology and Endocrinology. 12, (2014).
- Leoni, G. G., et al. Relations between relative mRNA abundance and developmental competence of ovine oocytes. Molecular Reproduction and Development. 74 (2), 249-257 (2007).
- Succu, S., et al. Effect of vitrification solutions and cooling upon in vitro matured prepubertal ovine oocytes. Theriogenology. 68 (1), 107-114 (2007).
- Larman, M. G., Sheehan, C. B., Gardner, D. K. Calcium-free vitrification reduces cryoprotectant-induced zona pellucida hardening and increases fertilization rates in mouse oocytes. Reproduction. 131 (1), 53-61 (2006).
- Yeste, M., Jones, C., Amdani, S. N., Patel, S., Coward, K. Oocyte activation deficiency: a role for an oocyte contribution. Human Reproduction Update. 22 (1), 23-47 (2016).
- Rienzi, L., et al. Oocyte, embryo and blastocyst cryopreservation in ART: systematic review and meta-analysis comparing slow-freezing versus vitrification to produce evidence for the development of global guidance. Human Reproduction Update. 23 (2), 139-155 (2017).
- De Santis, L., et al. Oocyte vitrification: influence of operator and learning time on survival and development parameters. Placenta. 32, 280-281 (2011).
- Zhang, X., Catalano, P. N., Gurkan, U. A., Khimji, I., Demirci, U. Emerging technologies in medical applications of minimum volume vitrification. Nanomedicine. 6 (6), London, England. 1115-1129 (2011).
