Summary
הפרוטוקול נועד לספק שיטה סטנדרטית לרטט של ביציות כבשים בוגרות וצעירות. הוא כולל את כל השלבים מהכנת אמצעי ההבשלה במבחנה לתרבות שלאחר ההתחממות. אוציטים עוברים רטט בשלב MII באמצעות Cryotop כדי להבטיח את עוצמת הקול החיונית המינימלית.
Abstract
במשק החי, מערכות ייצור עובר במבחנה ניתן לפתח ומתקיים הודות למספר רב של שחלות וביצים שניתן להשיג בקלות מבית מטבחיים. השחלות הבוגרות נושאות תמיד מספר זקיקי נמלים, ואילו בתורמים לפני גיל ההתבגרות המספרים המקסימליים של ביציות זמינים בגיל 4 שבועות, כאשר השחלות נושאות מספר שיא של זקיקים antral. לכן, כבשים בני 4 שבועות נחשבים לתורמים טובים, גם אם היכולת ההתפתחותית של ביציות טרום-דוקטורט נמוכה יותר בהשוואה למקבילם הבוגר.
מחקר בסיסי ויישומים מסחריים יקודמו על ידי האפשרות של cryopreserving בהצלחה ביציות vitrified שהושגו מתורמים מבוגרים וקדם-פתורליים כאחד. הוויטריפיקציה של ביצית שנאספה מתורמים טרום-פתריאליים תאפשר גם לקצר את מרווח הייצור ובכך להגדיל את הרווח הגנטי בתוכניות הרבייה. עם זאת, אובדן הפוטנציאל ההתפתחותי לאחר cryopreservation עושה ביציות יונקים כנראה אחד מסוגי התאים הקשים ביותר cryopreserve. בין טכניקות ההקפאה הזמינות, רטט מוחל באופן נרחב על ביציות בעלי חיים ובני אדם. למרות ההתקדמות האחרונה בטכניקה, חשיפות לריכוזים גבוהים של סוכנים קריופרוטקטיביים, כמו גם פציעה מצמררת ומתח אוסמוטי עדיין גורמים למספר שינויים מבניים ומולקולריים ומפחיתים את הפוטנציאל ההתפתחותי של ביציות יונקים. כאן, אנו מתארים פרוטוקול להסתבכות של ביציות כבשים שנאספו מתורמים צעירים ובוגרים והתבגרו במבחנה לפני ההקפאה. הפרוטוקול כולל את כל ההליכים החל מהבשלת ביצית במבחנה ועד תקופת ההזדווגות, ההתחממות והדגירה שלאחר ההתחממות. אוציטים הנבטים בשלב MII אכן יכולים להיות מופרים לאחר ההתחממות, אך הם זקוקים לזמן נוסף לפני ההפריה כדי לשחזר נזק עקב הליכי cryopreservation ולהגדיל את הפוטנציאל ההתפתחותי שלהם. לכן, תנאי תרבות שלאחר ההתחממות ותזמון הם צעדים חיוניים לשיקום הפוטנציאל ההתפתחותי ביצית, במיוחד כאשר ביצית נאספים מתורמים צעירים.
Introduction
אחסון ארוך טווח של הגמטות הנשיות יכול להציע מגוון רחב של יישומים, כגון שיפור הרבייה של בעלי חיים ביתיים על ידי תוכניות בחירה גנטית, תרומה לשימור המגוון הביולוגי באמצעות תוכנית שימור מינים לשעבר של חיות בר, וחיזוק המחקר והיישומים הביוטכנולוגיים במבחנה הודות לזמינות של ביציות מאוחסנות שישולבו בייצור עוברי במבחנה או בתוכניות השתלה גרעינית1,2,3. ויטריפיקציה של ביציות לנוער גם תגדיל את הרווח הגנטי על ידי קיצור מרווח הייצור בתוכניות הרבייה4. רטט על ידי קירור מהיר במיוחד והתחממות של ביציות נחשב כיום גישה סטנדרטית עבור הקפאה ביציות בעלי חיים5. ב הרהורים, לפני vitrification, ביציות הם בדרך כלל התבגרו במבחנה, לאחר אחזור זקיקיים המתקבלים שחלות נגזר בית מטבחיים2. מבוגרים, ובמיוחד השחלות prepubertal4,6, אכן יכול לספק מספר כמעט בלתי מוגבל של ביציות להיות cryopreserved.
בבקר, לאחר ויטריפיקציה של ביציות והתחממות, יבולי בלסטוציסט ב ->10% דווחו בדרך כלל על ידי מספר מעבדות במהלך העשור האחרון3. עם זאת, בהרהורים קטנים oocyte vitrification עדיין נחשב חדש יחסית עבור ביציות נוער ומבוגרים כאחד, שיטה סטנדרטית עבור ויטריפיקציה ביצית כבשים נשאר להקים2,5. למרות ההתקדמות האחרונה, ביצית מחוממת ואכן מציגה מספר שינויים פונקציונליים ומבניים המגבילים את הפוטנציאל ההתפתחותי שלהם7,8,9. לפיכך, מאמרים מעטים דיווחו על התפתחות בלסטוציסט ב 10% או יותר ביציות כבשים מחוממים / מחוממים2. מספר גישות נחקרו כדי להפחית את השינויים שהוזכרו לעיל: אופטימיזציה של הרכב פתרונות vitrification והפשרה10,11; ניסויים בשימוש במכשירי קריו שונים8,12,13; והחלת טיפולים ספציפיים במהלך התבגרות במבחנה (IVM)4,14,15 ו / או במהלך זמן ההחלמה לאחר התחממות6.
כאן אנו מתארים פרוטוקול לרטט של ביציות כבשים שנאספו מתורמים צעירים ובוגרים והתבגרו במבחנה לפני ההקפאה. הפרוטוקול כולל את כל ההליכים החל מהתבגרות ביצית במבחנה ועד לתרבות של ויטריפיקציה, התחממות ותרבות לאחר התחממות.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
פרוטוקול בעלי החיים והנהלים המיושמים להלן תואמים את ההנחיות האתיות החלות באוניברסיטת ססארי, בהתאם להנחיית האיחוד האירופי 86/609/EC ולהמלצת נציבות הקהילות האירופיות 2007/526/EC.
1. הכנת מדיה למניפולציה ביצית
- הכן את המדיום להובלת השחלות שנאספו על ידי שכשהם מלוחים אגירה פוספט של Dulbecco עם 0.1 g / L פניצילין ו 0.1 g / L סטרפטומיצין (PBS).
- הכן את המדיום עבור אוסף ביציות והתבגרות על ידי דילול 9.5 גרם של רקמות תרבית בינונית (TCM) 199 באבקה עם 1 L של מים מילי-Q בתוספת פניצילין (0.1%) וסטרפטומיצין (0.1%).
- לאחר דילול, לסנן 100 מ"ל של בינוני ולאחסן אותו ב 4 °C (70 °F) כמו בינוני התבגרות מלאי (SMM) לשמש במשך שבוע אחד.
- הכן את מדיום האוסף (CM) על ידי השלמת 900 מ"ל הנותרים עם 25 מ"מ HEPES, 0.36 g / L ביקרבונט ו 0.1% (w / v) אלכוהול פוליוויניל (PVA) (pH 7.3, osmolality 290 mOsm /kg).
- הכינו את מדיום ההבשלה עם SMM בתוספת 0.021 גרם / ליטר ביקרבונט, 10% סרום כבשים אסטרוס שטופלו בחום, 1 IU / mL FSH, 1 IU / mL LH, 100 μL של ציסטאמין ו 8 מ"ג / מ"ל של פירובט.
הערה: יש להדגיר את מדיום ההבשלה בנפח של 10 מ"ל בתנאים סטנדרטיים (באווירה לחה מקסימלית ב-39°C ב-5% CO2 באוויר) לפחות 4 שעות לפני השימוש. - הכן את מדיום הבסיס (BM) למניפולציה של ביצית לאחר התבגרות במבחנה, המורכב PBS ללא Ca++ ו Mg++, בתוספת 20% סרום עגל עוברי (FCS).
2. אוסף ביצית והתבגרות
- לשחזר את הביציות מן הילדות (30-40 ימים של גיל, משקל גוף 6-10 ק"ג) ושחלות למבוגרים.
- להעביר את השחלות שנאספו מן המשחטה המסחרית למעבדה בתוך 1-2 שעות PBS ב 27 °C (69 °F).
- לאחר שטיפה במדיום PBS טרי, פורסים את השחלות ב- CM באמצעות מיקרו-להב כדי לשחרר את תכולת הזקיק.
- תחת בדיקת סטריאומיקרוסקופ עם הגדלה של 60x, בחר קומולוס-ביצית קומפלקסים (COCs) עבור התבגרות במבחנה על ידי בחירת אלה עם 4-10 שכבות של תאי גרנולוזה, ביצית עם ציטופלסמה אחידה, התפלגות הומוגנית של טיפות שומנים בציטופלסמה ועם הקוטר החיצוני של כ 90 מיקרומטר (ממוצע).
- לשטוף את COCs שנבחרו שלוש פעמים ב CM ולבסוף להעביר אותם במדיום התבגרות.
הערה: עבור ביציות לנוער, כדי לשפר את ההישרדות לאחר vitrification, להשלים את מדיום התבגרות עם 100 μM trehalose. - עבור התבגרות במבחנה, להעביר 30-35 COCs ב 600 μL של מדיום התבגרות בצלחות פטרי ארבע באר, מכוסה 300 μL של שמן מינרלי לדגור אותם עבור 22 (ביציות למבוגרים)/24 (ביציות לנוער) h ב 5% CO2 באוויר ב 39 °C (69 °F).
- לאחר התבגרות במבחנה, DENUDE COCs של תאים cumulus על ידי צינור בעדינות. לאחר הבדיקה תחת סטריאומיקרוסקופ עם הגדלה של פי 60, בחר רק את אלה המציגים את ההבלטה על גוף הקוטב הראשון, ובכך בשלב מטפאזה II (MII), עבור vitrification.
3. אוסף זרע, הקפאת הליכי הפשרה והפשרה
- מכינים את מדיום הבסיס לזרע קריו-שימור המורכב ממאריך ראם (200 מ"מ טריס; 70 מ"מ חומצת לימון; 55 מ"מ פרוקטוז; pH 7.2, osmolality 300 mOsm/kg) בתוספת חלמון ביצה 20% (v/v).
- לאסוף את הזרע רק בעונת הרבייה כבשים (אוקטובר-נובמבר).
- להשיג שפיכה על ידי נרתיק מלאכותי מאיילים בוגרים (בגילאי 2-5 שנים), מתוחזקים בסביבה חיצונית והאכילו מנת תחזוקה במשקל חי. שמור על אילים מבודדים בעטים נפרדים, אבל עם מגע חזותי אחד בין השני.
- חזור על אוסף הזרע אחד בשבוע במהלך כל עונת הרבייה כדי לקבל לפחות 8 שפיכה מכל זכר.
- להעביר את דגימות הזרע למעבדה בטמפרטורה סביבתית בתוך 5 דקות לאחר האיסוף ומיד לעבד. בריכה השפיכה של שני-שלושה אילים ולהעריך ספקטרופוטומיה ריכוז הזרע.
- לאחר איגום, לדלל את השפיכה עד 400 x 106 זרעונים / מ"ל עם מדיום בסיס עבור cryopreservation זרע בתוספת 4% גליצרול. לאחר מכן לקרר את הזרע מדולל ל 4 מעלות צלזיוס על פני תקופה של 2 שעות ושוויון זה במשך 20 דקות לפני ההקפאה.
- להקפיא את דגימות הזרע בצורת גלולה (0.25 מ"ל) על קרח יבש ולאחר מכן לצלול אותם לתוך חנקן נוזלי.
- להפשרה, לשים את גלולה בז זכוכית מעוקר לצלול אותו באמבט מים במשך 20 s ב 39 מעלות צלזיוס.
4. הפריה חוץ גופית ותרבות העובר
- הכן מניות לחוקה של נוזל oviductal סינתטי (SOF).
- הכן מלאי A: 99.4 מ"ל של מי מילי-קיו; 6.29 גרם של NaCl; 0.534 גרם של KCl; 0.161 גרם של KH2PO4; 0.182 גרם של MgSO4 ·7H2O; ו-0.6 מ"ל של נתרן לקטט. יש לשמור על 4 מעלות צלזיוס עד 3 חודשים.
- הכן מלאי B: 10 מ"ל של מי מילי-קיו; 0.210 גרם של NaHCO3; ו 2-3 גרם של פנול אדום. שמור על 4 מעלות צלזיוס במשך חודש אחד.
- הכן מלאי C: 10 מ"ל של מי מילי-קיו; ו-0.051 גרם נתרן פירובט. שמור על 4 מעלות צלזיוס במשך חודש אחד.
- הכן מלאי D: 10 מ"ל של מי מילי-קיו; ו-0.262 גרם של CaCl2 2H2O. שמור על 4 °C (60 °F) למשך חודש אחד.
- הכן 10 מ"ל של SOF המורכב 7.630 מ"ל של מים MilliQ, 1 מ"ל של סטוק A, 1 מ"ל של סטוק B, 0.07 מ"ל של סטוק C ו 0.7 מ"ל של מניות D.
- הכן הפריה חוץ גופית (הפריה חוץ גופית) בינונית: SOF בתוספת 2% סרום כבשים estrous שטופלו בחום, 10 מיקרוגרם / מ"ל הפרין ו 1 מיקרוגרם / מ"ל hypoutarine (osmolality 280-290 mOsm /kg).
הערה: יש להדגיר את מדיום ה-IVF בנפח של 10 מ"ל בתנאים סטנדרטיים (באווירה לחה מקסימלית ב-39°C ב-5% CO2, 5% O2 ו-90% N2) לפחות 4 שעות לפני השימוש.
- להעביר aliquots זרע קפוא / מופשר בצינור חרוט זכוכית מעוקרת מתחת 1.5 מ"ל של מדיום IVF מחומם לדקור אותם במשך 15 דקות ב 39 °C (69 °F) באווירה לחה ב 5% CO2 באוויר.
- לאחר הדגירה, זרעון מוטיב לשחות לכיוון החלק האפור של העמודה הנוזלית. לאסוף את השכבה העליונה להתבונן להערכת תנועתיות הזרע.
הערה: יש להעריך את הפרמטרים של תנועתיות הזרע באמצעות מערכת ניתוח זרע בסיוע מחשב (CASA) עם ההגדרות הבאות: 25 מסגרות שנרכשו כדי למנוע חפיפה של מסלול הזרע, ניגודיות מינימלית 10, מהירות מינימלית של נתיב ממוצע 30 מיקרומטר / ים, ותנועתיות מתקדמת > 80% ישרות. מערכת זו יש התקנה ספציפית להערכת זרע איל. עבור כל מדגם, 5 μL subsample של השעיית זרע נטענים לתוך תא ניתוח מחומם מראש עם עומק של 10 מיקרומטר. תנועתיות הזרע מוערכת ב 37 °C (70 °F) ב 40x באמצעות מיקרוסקופ ניגודיות פאזה מינימום של 500 זרע לכל subsample יש לנתח לפחות ארבעה שדות מיקרוסקופיים שונים. אחוז הזרע הכולל מוטיל וזרע מוטיל פרוגרסיבי הוערכו. עבור IVF, אחוז זרע מוטיב פרוגרסיבי צריך להיות ≥ 30%. - לדלל לשחות למעלה נגזר זרע מוטיב ב 1 x 106 spermatozoa / mL ריכוז סופי ושיתוף דגירה אותם עם ביציות MII ב 300 μL של IVF בינוני מכוסה שמן מינרלי במנות פטרי ארבע באר.
- לאחר 22 שעות להעביר את zygotes המשוערות ארבע באר פטרי מנות המכילות SOF בתוספת 0.4% סרום שור אלבומין וחומצות אמינו חיוניות ולא חיוניות בריכוז oviductal כפי שדווח על ידי16 תחת שמן מינרלי ותרבות אותם בתנאים סטנדרטיים עד לשלב blastocyst.
- ב 22, 26- ו 32 שעות לאחר ההזרעה, להקליט את מספר הביציות שסוע, מראה שני בלאסטרים נפרדים, על ידי הבדיקה תחת סטריאומיקרוסקופ עם הגדלה 60x.
- שים לב העוברים מדי יום החל מהיום החמישי עד התשיעי של תרבות בלסטוציסטים שזה עתה נוצרו צריך להיות מתועד על ידי הבדיקה תחת stereomicroscope עם הגדלה 60x.
5. ויטריפיקציה של ביצית והתחממות
הערה: בצע vitrification בעקבות השיטה של נפח חיוני מינימלי (MEV) באמצעות cryotops המכשיר17.
- השווה קבוצה של חמישה ביציות ב 38°C למשך 2 דקות ב- BM. השימוש ב-BM מבטיח ריכוז סידן נמוך ([Ca2++] 2.2 מ"ג/ד"ל)10.
- לייבש את ביציות עם חשיפה של 3 דקות תמיסת שיווי משקל המכיל 7.5% (v / v) דימתיל סולפוקסיד (DMSO) ו 7.5% (v / v) אתילן גליקול (EG) ב- BM.
- להעביר את הביציות לפתרון vitrification המכיל 16.5% (v / v) DMSO, 16.5% (v / v) EG ו 0.5 M trehalose ב- BM לפני טעינת אותם במכשיר cryotop ישירות צולל אותם לתוך חנקן נוזלי בתוך 30 s.
- כדי להתחמם לטמפרטורה ביולוגית, העבירו את התוכן של כל מכשיר ויטריפיקציה מחנקן נוזלי ל-200 טיפות μL של 1.25 מ' טרהלוז ב-BM למשך דקה אחת ב-38°C, ומערבבים בעדינות כדי להקל על הערבוב.
- כדי לקדם הסרה של cryoprotectants תאיים, להעביר ביציות צעד לתוך 200 טיפות μL של פתרונות trehalose הפחתת (0.5 M, 0.25 M, 0.125 M trehalose ב- BM) עבור 30 s ב 38°C לפני להיות שווה במשך 10 דקות ב 38°C ב BM.
6. הערכת איכות ביצית לאחר ההתחממות
- לאחר ההתחממות, דגירה ביציות עבור 6 שעות PBS ללא Ca++ ו Mg++ בתוספת 20% FCS (BM) ב 5% CO2 באוויר ב 38 °C (60 °F).
הערה: היכולת של ביצית לשחזר תכונות ביולוגיות ומבניות לאחר הרטט היא ביחס למינים ולשיעורים של ביציות משומשות. - מאז היכולת ביצית לשחזר נזקי cryopreservation הוא תלוי זמן, להעריך את איכות ביצית בנקודות זמן שונות של תרבות במבחנה (0 h, 2 h, 4 שעות, 6 שעות) לאחר ההתחממות, כדי להגדיר את חלון הזמן האופטימלי להפריה ביצית.
הערה: ביצית כבשים למבוגרים, הזמן האופטימלי הוא 4 שעות לאחר ההתחממות; עבור ביצית prepubertal, הזמן האופטימלי הוא 2 שעות לאחר ההתחממות.
7. הערכת הישרדות ביצית
- מיד לאחר ההתחממות ועל כל נקודת זמן של תרבות שלאחר התחממות, מורפולוגית להעריך ביציות באמצעות מיקרוסקופ הפוך עם הגדלה 100x.
הערה: אוציטים עם שינויים מבניים, כגון ציטופלסמה חלשה, נזק zona pellucida ו/או קרום יש לסווג מנוון. - לאמת את הערכת שלמות הממברנה באמצעות כתמי פלואורסצנט דיפרנציאלי כפול.
- דגירה ביציות ב 2 מ"ל של BM המכיל פרובידיום יודיד (PI; 10 מיקרוגרם / מ"ל) ו Hoechst 33342 (10 מיקרוגרם / מ"ל) במשך 5 דקות ב 5% CO2 באוויר ב 38 °C (38 °F).
- לאחר שטיפה שלוש פעמים BM טרי, להתבונן ביציות תחת מיקרוסקופ פלואורסצנטי באמצעות מסנן עירור של 350 ננומטר ופליטה של 460 ננומטר עבור Hoechst 33342 ומסנן עירור של 535 ננומטר ופליטה של 617 ננומטר עבור PI.
הערה: ביציות עם קרום שלם ניתן לזהות על ידי הפלואורסצנטיות הכחולה של DNA צבעוני עם Hoechst 33342. ביצית עם ממברנות פגומות להראות פלואורסצנטיות אדומה עקב כתמי DNA עם PI.
8. הערכת פעילות המיטוכונדריה ורמות תאיים ROS על ידי מיקרוסקופיה סריקת לייזר confocal
- הכינו את הגשוש האדום MitoTracker CM-H2XRos (MT-Red).
- לדלל את התוכן של 1 בקבוקון (50 מיקרוגרם) עם 1 מ"ל של DMSO כדי להשיג פתרון 1 מ"מ. שמור את הבקבוקון המדולל בחנקן נוזלי.
- לדלל את הפתרון 1 מ"מ עם DMSO כדי להשיג את הפתרון 100 μM מלאי ולאחסן אותו ב -80 °C (70 °F) בחושך.
- הכן 2′,7′-dichlorodihydrofluorescein דיאצטט (H2DCF-DA) בדיקה.
- לדלל את H2DCF-DA ב 0.1% פוליוויניל pyrrolidone (PVA)/PBS כדי להשיג את הפתרון הראשון 100 מ"מ. שמור את הפתרון ב -80 מעלות צלזיוס בחושך.
- לדלל את הפתרון הראשון ב 0.1% PVA / PBS כדי להשיג את פתרון 100 μM המניה. אחסן אותו ב -20 מעלות צלזיוס בחושך.
- הכינו את מדיום ההרכבה (MM): ל-10 מ"ל מ"מ, הוסיפו 5 מ"ל גליצרול, 5 מ"ל PBS ו-250 מ"ג נתרן אזיד. אחסן אותו ב -20 מעלות צלזיוס עד השימוש.
- דגירה ביציות במשך 30 דקות ב 38 °C (70 °F) ב BM עם 500 nM MT-אדום (פתרון מלאי: 100 מיקרומטר ב DMSO).
- לאחר הדגירה עם בדיקה MT-Red, לשטוף את ביציות שלוש פעמים BM ודגרת במשך 20 דקות באותה מדיה המכילה 5 מיקרומטר H2DCF-DA (פתרון מלאי: 100 מיקרומטר ב- BM).
- לאחר החשיפה לבדיקות, לשטוף את ביציות BM ולתקן 2.5% glutaraldehyde / PBS לפחות 15 דקות.
- לאחר הקיבעון, לשטוף את ביציות שלוש פעמים BM ולהרכיב על שקופיות זכוכית טיפה 4 μL של MM עם 1 מ"ג / מ"ל Hoechst 33342 באמצעות כריות שעווה כדי למנוע דחיסה של דגימות.
- אחסן שקופיות ב- 4 °C (60 °F) בחושך עד להערכה.
- בצע את הניתוח של מקטעים immunolabelled עם מיקרוסקופ סריקת לייזר confocal. המיקרוסקופ מצויד בלייזר Ar/He/Ne, תוך שימוש במטרה של 40/60x שמן. נתח את המקטעים לפי עירור רציף.
- להערכה מיטוכונדרית, לבחון את הדגימות עם לייזר מולטי פוטון כדי לזהות MT-אדום (חשיפה: 579 ננומטר; פליטה: 599 ננומטר).
- השתמש קרן לייזר יונים ארגון ב 488 ננומטר ואת מסנן B-2 A (495 ננומטר חשיפה ו 519 ננומטר פליטה) כדי להצביע על dichlorofluorescein (DCF)18.
- בכל ביצית בודדת, למדוד MT-אדום ועוצמות פלואורסצנטי DCF במישור קו המשווה19.
- לשמור על פרמטרים הקשורים עוצמת פלואורסצנטיות בערכים קבועים במהלך כל רכישות התמונה (לייזר אנרגיה 26%, הגדרות רציפות 1: PMT1 רווח 649-PMT2 רווח 482; הגדרה רציפה 2: PMT1 רווח 625-PMT2 רווח 589; היסט 0; גודל חור סיכה: 68).
- בצע ניתוח כמותי של עוצמת הפלואורסצנטיות באמצעות חבילת התוכנה לניתוח תמונות Leica LAS AF Lite, בהתאם להליכים המתוקננים על ידי20.
- לכוד את התמונות פעם אחת, נע על ציר Z, עד להגעה למישור המשווה.
- עבור כל תמונה, הפעלה לקנה מידה אפור וסגירת ערוץ 1 (הקשור לכחול Hoechst) בוטלה. לאחר מכן לצייר באופן ידני אזור של עניין (ROI) על אזור מוגבל, כי הוא סביב ציר meiotic.
הערה: התוכנה יכולה לקרוא באופן אוטומטי את הערך הממוצע פיקסל בערוץ 2 (FITC), חיסור הערך של הרקע ממנו. - רשום את הערכים הממוצעים של פיקסלים ושלח לניתוח סטטיסטי.
9. ניתוחים סטטיסטיים
- לנתח את ההבדלים הבאים: שיעורי ההישרדות של ביציות לנוער לעומת מבוגרים, שיעורי ההישרדות והיכולת ההתפתחותית בשליטה וביציטים לנוער שטופלו בטרהאלוז, שיעורי הישרדות והפעלה פרתנוגנטית ויכולת התפתחותית של ביציות בוגרות הנוטפות עם מדיה שונה של ריכוז סידן, שיעורי הפריה וייצור עוברים בביצים לנוער שרוטטים בריכוז סידן נמוך או גבוה, פנוטיפים פעילים של מיטוכונדריה בביוטות נעורים. נקודות זמן שונות של תרבות שלאחר התחממות ושיעורי הפעלה parthenogenetic בין ביציות vitrified למבוגרים ולנוער באמצעות מבחן ריבוע צ'י.
- לנתח את קצב המחשוף ואת תפוקת העובר ביציות מבוגרים vitrified במהלך נקודות זמן שונות של תרבות שלאחר ההתחממות, עוצמת פלואורסצנטיות של פעילות המיטוכונדריה ו ROS רמות תאיים ב ביציות רטט לנוער במהלך נקודות זמן שונות של תרבות שלאחר התחממות על ידי ANOVA לאחר ניתוח הומוגניות של שונות על ידי הבדיקה של לוין. השתמש במבחן של Tukey לאחר הבדיקה כדי להדגיש את ההבדלים בין קבוצות ובין קבוצות.
- בצע ניתוח סטטיסטי באמצעות התוכנה הסטטיסטית ושקול את ההסתברות של P < 0.05 להיות הרמה המינימלית של משמעות. כל התוצאות מבוטאות כמשמעותיות ± S.E.M.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
ההקפאה של ביצית מתורמים צעירים נמוכה יותר בהשוואה למבוגרים. ההשפעה הראשונה שנצפתה היא שיעור הישרדות נמוך יותר לאחר התחממות לעומת ביציות למבוגרים (איור 1A;χ2 מבחן P<0.001). ביציות נעורים הראו שלמות קרום נמוכה יותר לאחר ההתחממות (איור 1B). השימוש בטרהלוז במדיום ההבשלה נועד לאמת אם סוכר זה יכול להפחית קריו-ינחוי ביציות לנוער. הנתונים הראו23 כי ביציות התבגרו במשך 24 שעות עם תוספי trehalose הראו שיעורי הישרדות גבוהים יותר לאחר vitrification / התחממות לעומת הקבוצה שאינה מטופלת (טבלה 1: 85.7% לעומת 75.3% בהתאמה; χ2 מבחן P<0.05). תוספי Trehalose אכן היו קשורים לשלמות קרום גבוהה יותר לאחר ההתחממות (איור 2A). לכן, השימוש trehalose במהלך התבגרות במבחנה של ביציות לנוער הגדיל את שיעורי ההישרדות לאחר vitrification (85.7%) לערכים דומים לאלה של מבוגרים (90.3%). עם זאת, מחשוף, הפריה ושיעורים התפתחותיים של ביציות לנוער לא גדלו על ידי תוספי trehalose (טבלה 1).
כדי לשפר את יכולת הביצית לאחר הרטט בדקנו בביצית ביציות למבוגרים מדיה שונים vitrification עם ריכוזי סידן הנעים בין 9.9 ל 0.4 מ"ג / ד"ל10. תוצאות שהתקבלו הראו כי השימוש במדיה עם ריכוז סידן השווה ל-2.2 מ"ג/ד"ל הגדיל את שיעורי ההישרדות לאחר ההתחממות, שיפר את יכולת ההתפתחותית והפחית את ההפעלה הפרתנוגנטית של ביצית בוגרת10 (טבלה 2). לכן בדקנו את המדיה vitrification סידן נמוך עבור vitrification של ביציות לנוער. כפי שמוצג בטבלה 3, ביציות נעורים רוטטות עם ריכוז סידן נמוך מעידות על שיעורי הפריה גבוהים יותר בהשוואה ביציות רוטטות עם ריכוז סידן גבוה (44.35% לעומת 32.29% בהתאמה; P<0.05), אך לא נמצאו הבדלים בייצור העובר.
ביציות מחוממות/מחוממות זקוקות לזמן נוסף לפני ההפריה כדי לשחזר נזק עקב הליכי הקפאה ולהגדיל את הפוטנציאל ההתפתחותי שלהן. מחקר קודם אכן הוכיח כי ריכוז תאיים ATP, פעילות מיטוכונדרית ויכולת התפתחותית במבחנה מופחתים ביציות vitrified/מופשר, אשר גם מראים ריכוזים גבוהים של ROS תאיים6. שינויים אלה מסומנים במיוחד מיד לאחר ההתחממות. במהלך התרבות שלאחר ההתחממות, ביציות מבוגרות ונוער כאחד מסוגלות להתאושש חלקית מהנזקים שנגרמו במהלך הליכי הרטט6,24. על ידי השוואת תרבות שלאחר ההתחממות של משכי זמן שונים (0, 2, 4 ו -6 שעות), הראינו כי לאחר 4 שעות של ביציות תרבות שנאספו מ ewes מבוגרים מסוגלים לשחזר את האיזון האנרגטי6 ו microtubular ההתקנה24 כדי לשחזר את היכולת ההתפתחותית עם מחשוף גבוה יותר (50.7 ± 3.9%; P< 0.01 ANOVA) ושיעורי בלסטוציסט (14.40 ± 1.3%; ANOVA P< 0.01) בהשוואה לנקודות זמן אחרות (0, 2 ו-6 שעות; טבלה 4). לפיכך, 4 שעות של תרבות שלאחר ההתחממות מייצג את חלון הזמן האידיאלי להפריה של ביציות מבוגרים מחוממים / מחוממים6.
כאשר אותו ניסוי חזר על עצמו עם ביציות שנאספו מתורמים צעירים, תוצאות אלה אושרו חלקית. הפעילות המיטוכונדרית הייתה גבוהה יותר ביציות נעורים מחוממים/מחוממים לאחר 4 שעות של תרבות שלאחר ההתחממות בהשוואה לנקודות זמן אחרות (0, 2, 6; איור 3: ANOVA P<0.01). מספר דפוסים של התפלגות המיטוכונדריה נצפו ומסווגים לשלוש הקבוצות הבאות (כפי שדווח על ידי21 ): תבנית A: בסדר הומוגני עם גרגירים קטנים הפזורים לאורך הציטופלסמה; תבנית B: גרגירי הומוגני עם גרגירים גדולים להתפשט על פני ציטופלסמה; תבנית C: הטרוגני CLUSTERED כאשר גרגרי גדול במיוחד היו נוכחים, התפשט בכל רחבי ציטופלסמה או ממוקם בתחומים ציטופלזמיים ספציפיים. הפנוטיפים השונים בהתפלגות הציטופלסמה של המיטוכונדריה הפעילה ב- MII יכולים להיות קשורים ליכולת התפתחותית של ביצית. התפלגות הומוגנית בסדר הוא אינדיקטור של יכולת התפתחותית ירודה בעוד התפלגות פרטנית מקובצים קשורים לפעילות המיטוכונדריה מוגברת וכתוצאה מכך יכולת התפתחותית גבוהה יותר22. דפוסי ההפצה המיטוכונדרית השתנו במהלך 6 שעות של תרבות שלאחר ההתחממות. איור 4 מציג דוגמאות של ביציות נעורים בעלות דפוסים שונים של הפצה מיטוכונדרית והתנודות שלהן במהלך התרבות שלאחר ההתחממות. תבנית A גדלה באופן משמעותי במהלך הדגירה הממושכת ומגיעה לערך הגבוה יותר ב-6 שעות לאחר ההתחממות (איור 4Aa: χ2 P<0.05), תבנית ב' לא הראתה שינויים משמעותיים במהלך הפוסט-התחממות תרבות ההתחממות(איור 4Bb),התבנית C לא נמצאה בשום ביצית צעירה מחוממת/מחוממת במהלך הדגירה הממושכת(איור 4Cc:χ2 P<0.05).
יתר על כן, רמות תאיים ROS היו נמוכים באופן משמעותי ביציות לנוער ב 2 שעות של תרבות שלאחר התחממות לעומת 0, 4 ו 6 שעות(איור 5: ANOVA P<0.001). עם זאת, ובניגוד למה שנמצא ביציות למבוגרים, שיעור ההפעלה הפרתנוגנטית הספונטנית עלה במהלך התרבות שלאחר ההתחממות ביציות לנוער(איור 6). מסיבה זו, נקודת הזמן המומלצת להפריה בביצית לנוער תהיה 2 שעות לאחר תרבות התחממות הפוסט.
איור 1. שיעורי ההישרדות של ביצית ביצית מחוממת/מחוממת שנאספו מתורמים צעירים ומבוגרים. (א) אוסייט התבגר לאחר התבגרות במבחנה. שיעורי ההישרדות נקבעו לאחר vitrification והתחממות על ידי כתמים פלואורסצנטיים עם יודיד propidium (10 מיקרוגרם / מ"ל) ו Hoechst 33342 (10 מיקרוגרם / מ"ל). N = 165 ביציות למבוגרים ו-170 ביציות לנוער. אותיות שונות מצביעות על הבדלים משמעותיים בין ביציות למבוגרים ולנוער: χ2 מבחן P<0.001. (B-C) אני לא יכול לעשות את זה. דוגמאות לביציתות נעורים מחוממות/מחוממות עם שלם (B) וקרום פלזמה פגום (C) בהערכה המורפולוגית (מיקרוסקופ הפוך עם הגדלה של 100x). סרגל קנה מידה = 10 מיקרומטר.
איור 2. שיעורי ההישרדות של ביצית ביצית לנוער ויכולת התפתחותית במבחנה לאחר התבגרות עם (TRH) וללא (CTR) trehalose (100 מ"ר במדיום התבגרות). (א-ב) אני לא יכול לעשות את זה. דוגמאות של ביציות לנוער vitrified לאחר התבגרות במבחנה במדיה בתוספת (A) עם או (B) ללא trehalose בהערכה מורפולוגית (מיקרוסקופ הפוך עם הגדלה 100x). סרגל קנה מידה = 30 מיקרומטר.
איור 3. כימות של עוצמת פלואורסצנטיות מיטוכונדרית פעילה בביציות נעורים מחוממות/מחוממות בנקודות זמן שונות (0, 2, 4, 6) במהלך תרבות במבחנה שלאחר ההתחממות. ביציות IVM שימשו כפקד (CTR N = 77). בסך הכל 163 (0 שעות N = 45; 2 שעות N = 39; 4 שעות N = 40; 6 שעות N = 39) ביציות לנוער היו vitrified והתחממו בשלושה ניסויים עצמאיים. אותיות שונות מציינות הבדלים מובהקים סטטיסטית (ANOVA P = 0.0000). לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.
איור 4. הפצה של דפוס מיטוכונדריאלי ביציות נעורים מחוממים /מחוממים במהלך 6 שעות של תרבות במבחנה שלאחר ההתחממות. תמונות מייצגות של פיין (A),פרטני (B) והפצה מיטוכונדרית מקובצים באשכולות (C) בביצית צעירה מחוממת/מחוממת. (ד) אחוז ביציות נעורים מחוממים/מחוממים המציגים התפלגות מיטוכונדרית עדינה; (ה) אחוז ביציות נעורים מחוממים/מחוממים המציגים התפלגות מיטוכונדרית פרטנית; (ו) אחוז ביציות נעורים מחוממים/מחוממים המציגים התפלגות מיטוכונדרית מקובצים באשכולות. ביציות לנוער IVM שימשו כשליטה (CTR; N = 77). בסך הכל 163 (0 שעות N = 45; 2 שעות N = 39; 4 שעות N = 40; 6 שעות N = 39) ביציות לנוער רוטטות ומחוממים בשלושה ניסויים עצמאיים שימשו. אותיות שונות מציינות הבדלים מובהקים סטטיסטית (Aa: χ2 P = 0.026; Bb: χ2 P = 0.097; עותק: χ2 P = 0.014). סרגל קנה מידה = 30 מיקרומטר.
איור 5. כימות של עוצמת פלואורסצנטיות ROS תאיים ביציות לנוער vitrified במהלך 6 שעות לאחר התחממות בתרבות במבחנה. (א-ב) אני לא יכול לעשות את זה. תמונות מייצגות של עוצמת הפלואורסצנטיות של ROS במבחנה התבגרו (A) ו vitrified (B) ביציות נעורים. (C)רמות תאיים של ROS כפי שנקבע על ידי כימות של עוצמת פלואורסצנטיות ביציות לנוער vitrified בנקודות זמן שונות (0 h N = 45; 2 h N = 39; 4 h N = 40; 6 h N = 39) במהלך תרבות במבחנה שלאחר ההתחממות. אין ויטרו התבגר ביציות לנוער שימשו כפקד (CTR N = 77). אותיות שונות מציינות הבדלים מובהקים סטטיסטית (ANOVA P = 0.0000). סרגל קנה מידה = 50 מיקרומטר.
איור 6. הפעלה פרתנוגנטית ביציות לנוער ולמבוגרים במהלך 6 שעות של תרבות במבחנה שלאחר ההתחממות. (A-B) תמונות מייצגות של הפעלה פרתנוגנטית ביצית: (( A) ביצית במעבר מטפאאז II-telophase II ו - (B) היווצרות פרונוקלאוס. (ג)אחוזים של פרתנוגנטיקה מופעל מבוגרים ונוער ביציות בנקודות זמן שונות (0, 2, 4, 6 שעות) במהלך תרבות במבחנה שלאחר ההתחממות. כוכביות מצביעות על הבדלים סטטיסטיים בין ביציות לנוער ולמבוגרים בכל נקודת דגירה (ANOVA P = 0.000). איור זה שונה מ Serra ואח '24 סרגל סולם = 50 מיקרומטר. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.
| ביציות (n) | שיעור ההישרדות (%) | IVF (n) | מופרית (%) | קלבדב' (%) | בלסטוציסטסג' (%) | |
| CTR | 73 | 75.3* | 452 | 91.1 | 96.1 | 14.3 |
| TRH (לא כולל) | 77 | 85.7 | 470 | 92.5 | 95.4 | 13 |
| * צ'י מרובע מבחן p<0.5 | ||||||
| אחוזים מחושבים על ביציות IVF | ||||||
| bאחוזים מחושבים על ביציות מופרות | ||||||
| c האחוזים מחושבים על ביציות שסועפות | ||||||
שולחן 1. ביציות נעורים ביציות שיעורי ההישרדות ואת יכולת התפתחותית במבחנה לאחר התבגרות עם וללא trehalose ו vitrification. TRH = ביציות לנוער התבגרו עם תוספי trehalose (100 מ"ר במדיום התבגרות). CTR = בקרת ביציות לנוער התבגרו ללא תוספי trehalose. שיעורי ההישרדות נקבעו לאחר כתמים פלואורסצנטיים עם יודיד פרופידיום (10 מיקרוגרם / מ"ל) והוצ'סט 33342 (10 מיקרוגרם / מ"ל) של ביציות מחוממות / מחוממות. כשירות התפתחותית של Oocyte נקבעה לאחר התאגדות במערכת ייצור במבחנה. א האחוזים מחושבים על ביציות של IVF. bאחוזים מחושבים על ביציות מופרות. c האחוזים מחושבים על ביציות שסועפות. * χ2 מבחן P<0.5. טבלה זו שונתה מברלינגואר ואח'23
| קבוצות | [Ca++] מ"ג / ד"ל | N ביצית | הפעלה פרתנוגנטית ספונטנית (%) | ביציות רוטטות | ביציות ששרדו והפריה חוץ גופית (%) | מחשוף (%) | פלט בלסטוציסט (%) |
| TCM/FCS | 9.9 | 80 | 33 (41.2)א | 150 | 124 (82.7)א | 40 (32.5)א | 2 (1.6)א |
| PBS/FCS | 4.4 | 82 | 29 (35.3)AC | 115 | 88 (76.5)א | 33 (37.5)ae | 1 (1.1)א |
| PBSCaMg חינם/ FCS | 2.2 | 86 | 11 (12.7)b | 126 | 115 (91.3)b | 74 (64.3)ב | 12 (10.4)b |
| PBS/BSA | 3.2 | 83 | 21 (25.3)ג | 110 | 90 (81.8)א | 18 (20)ג | 0 (0)א |
| PBSCaMg חינם/ BSA | 0.4 | 87 | 10 (11.5)b | 149 | 123 (82.5)א | 57 (46.3)דה | 3 (2.4)b |
שולחן 2. יכולת התפתחותית של במבחנה התבגרה ביציות למבוגרים רוטט במדיה vitrification (16.5% אתילן גליקול + 16.5% דימתיל סולפוקסיד) המכיל ריכוזי סידן שונים. שיעורי ההישרדות וההפריה מחושבים על ביציות רטט; סה"כ מחשוף ושיעורי בלסטוציסט מחושבים על ביציות ששרדו. ערכים עם כתב תחתי שונה בתוך אותה עמודה שונים באופן משמעותי: χ2 P<0.05. טבלה זו שונתה מ- Succu ואח '10
| [Ca 2++] במדיית ויטריפיקציה | לא. ביציות (oocytes) | שיעור ההישרדות לאחר הוויטריפיקציה (%) | שיעור ההפריה (%) | מחשוף (%) | פלט בלסטוציסט (%) |
| גבוה [9.9 מ"ג/ד"ל] | 190 | 161 (84.73) | 52/161 (32.29)a | 43/161 (26.7) | 0 |
| נמוך [2.2 מ"ג/ד"ל] | 150 | 124 (82.66) | 55/124 (44.35)b | 41/124 (33.1) | 0 |
שולחן 3. הפריה ושיעורים התפתחותיים לאחר הפריה חוץ גופית ותרבות של ביצית צעירה מחוממת/מחוממת באמצעות ריכוז סידן גבוה ([Ca 2++] = 9.9 מ"ג/ד"ל) ונמוך ([Ca 2++] = 2.2 מ"ג/ד"ל) ריכוז סידן במדיה vitrification. אותיות שונות מציינות הבדל סטטיסטי (≠ b P<0.05 χ2).
| שעות של דגירה שלאחר ההתחממות | קצב מחשוף (n) | פלט עוברי (n) |
| 0 | 19.2 ± 3%a (82) | 0%א (17) |
| 2 | 41.8 ± 3%b (100) | 6.5 ± 1.3%b (42) |
| 4 | 50.7 ± 3%b (92) | 14.4 ± 1.3%c (48) |
| 6 | 26 ± 3%a (92) | 0%א (23) |
שולחן 4. קצב המחשוף ותפוקת העובר בביצית בוגרים מחוממת/מחוממת מופרים בנקודות זמן שונות של תרבות שלאחר ההתחממות. אותיות שונות מציינות הבדל סטטיסטי בתוך אותה עמודה: ANOVA P<0.01.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
הקפאה של ביציות במשפחה יכולה לאפשר לא רק שימור ארוך טווח של משאבים גנטיים נשיים, אלא גם לקדם את הפיתוח של ביוטכנולוגיה עוברית. לפיכך, פיתוח שיטה סטנדרטית עבור ויטריפיקציה ביצית ינצל הן את בעלי החיים והן את מגזר המחקר. בפרוטוקול זה, מוצגת שיטה מלאה להסתערות ביציות כבשים למבוגרים ויכולה להוות נקודת התחלה איתנה לפיתוח מערכת ויטריפיקציה יעילה עבור ביצית לנוער.
אחד היתרונות העיקריים של השיטה המוצעת הוא שהיא כוללת את כל השלבים מאוסף ביציות, התבגרות במבחנה, ויטריפיקציה והתחממות. יתר על כן, הוא כולל תקופת תרבות שלאחר ההתחממות כדי לאפשר ביציות להתאושש מהנזקים שנגרמו במהלך הליך הרטט לפני ההפריה. הזמן האופטימלי להפריה צריך להיות מותאם על פי שיטת cryopreservation, איכות ביצית ראשונית, גיל המטופל, ומינים, להיות חיוני כדי לשקול את שני ההיבטים של התאוששות זמן ביצית הזדקנות25,26. לכן, בחירת משך תקופת הדגירה שלאחר ההתחממות היא מאתגרת והיא עשויה להשפיע על התוצאה של תוכניות ויטריפיקציה ביצית. בהתבסס על התוצאות המתקבלות במונחים של שיעורי מחשוף ותפוקת העובר, ותנאים המתוארים בפרוטוקול המוצג, הזמן האופטימלי להפריה של ביציות כבשים בוגרות רטט הוא לאחר 4 שעות של דגירה שלאחר התחממות (טבלה 4)6. מידע זה חיוני בעת תכנון תוכנית ויטריפיקציה של ביציות.
פרוטוקול זה, לעומת זאת, תוך מתן תוצאות מקובלות במונחים של תפוקת העובר מ ביציות מבוגרים מחוממים/ מחוממים, עדיין מוביל נמוך לאפס עוברים אם מוחל על ביציות לנוער. מספר מגבלות מבניות ותפקודיות פוגעות ביכולת ההתפתחותית של ביציות טרום-פוטאליות, כגון גודל קטן, צימוד פגום בין תאי קומולוס וביצית, ירידה בספיגת חומצות אמינו, סינתזת חלבונים מופחתת ומטבוליזם אנרגיה 27,28,29. במחקר קודם דיווחנו כי ביציות prepubertal להראות רגישות גבוהה להליך vitrification30. היכולת ההתפתחותית הנמוכה המוצגת לאחר ויטריפיקציה והתחממות היא כנראה תוצאה של נזקים לגורמים ציטופלזמיים המעורבים בארגון מחדש של הציטוסקלטון ו (או) בהפעלת גורם קידום התבגרות30. כפי שמוצג בטבלה 1, תוספת של מדיום התבגרות עם trehalose, cryoprotectant שאינו חדיר, הצליח להגדיל את שיעורי ההישרדות לאחר vitrification והתחממות לערכים דומים לאלה של ביציות למבוגרים4. באותו אופן, השימוש בתמיסת ויטריפיקציה עם ריכוזי סידן נמוכים מגביר את שיעורי ההפריה של ביציות לנוער לאחר הרטט וההתחממות, כפי שמוצג בטבלה 3. לכן, הן אופטימיזציה על תנאי תרבות במהלך התבגרות במבחנה והן של הרכב התקשורת vitrification עשוי לעזור בהגדלת איכות הביצית לנוער לאחר vitrification והתחממות. ביציות נעורים מראות יכולת מסוימת להתאושש מהנזקים הנגרמים על ידי הליך הרטט, כפי שמוצג באיור 3, 4 ו - 5.
עם זאת, השיעורים הגבוהים של הפעלה פרתנוגנטית ספונטנית במהלך תרבות שלאחר ההתחממות עדיין מגבילים את הפוטנציאל ההתפתחותי שלהם. אתילן גליקול ו- DMSO, שהם סוכנים קריופרוטקטיביים נפוצים, עשויים להפעיל באופן מלאכותי את הביצית לפני ההפריה בפועל, ובכך להגביל את הצלחת ההפריה ואת התפתחות העובר. הם אכן יכולים לגרום לעלייה חולפת בריכוז תאיים Ca2+ 31, ובכך לעורר exocytosis גרגירים קליפת המוח, היווצרות pronuclei, וחידוש מיוטי32. למעשה, vitrification עשוי להפעיל באופן מלאכותי את הביצית לפני ההפריה בפועל, ובכך להגביל את הצלחת ההפריה והתפתחות העובר. סידן chelator ולכן ניתן להשתמש כדי להגביל עוד יותר את זמינות הסידן במהלך תהליך vitrification במטרה להגביל את קצב ההפעלה הספונטנית ביציות לנוער.
כמו כן יש לקחת בחשבון כי, שלא כמו איטי הקפאה, vitrification היא טכניקה ידנית בלבד ולכן הוא תלוי באופרטור33,34. לכן, הזמינות של כוח אדם מיומן היא גורם מפתח להצלחת שיטה זו. קודם כל, המפעיל צריך לבחור כראוי את ביציות להיות vitrified. לאחר IVM, ביציות הם denuded בעדינות של תאים קומולוס מוערך תחת stereomicroscope כדי לבחור עבור cryopreservation רק אלה עם ציטופלסמה אחידה, התפלגות הומוגנית של טיפות השומנים בציטופלסמה עם הקוטר החיצוני של כ 90 מיקרומטר. יתר על כן, רק ביציות המציגות את ההבלטה על גוף הקוטב הראשון, ולכן בשלב MII, יש לבחור.
ההערכה המורפולוגית של ביציות יש להשלים בתוך כמה דקות ולהיות אופרטור תלוי, הוא רגיש מאוד וריאציות ביישום הנכון שלה. כדי לעזור לתקנן את הליך הבחירה, השיטה מציעה להגביל את זמן התרבות עבור התבגרות במבחנה ל 22 שעות עבור ביציות למבוגרים. בשלב זה, ביציות כבשים באיכות גבוהה כבר השלימו את החלוקה הביוטית הראשונה22 וניתן לבחור אותן להקפאה. בדרך זו חיסול ביציות באיכות נמוכה, שהן האיטיות ביותר בהשלמת החטיבה המיאוטית הראשונה, צריך להיות פשוט יותר.
המפעיל חייב גם לכבד בקפדנות את העיתוי שנקבע עבור הליך vitrification, מן החשיפה הראשונה cryoprotectant לטבילה חנקן נוזלי. צעד קריטי נוסף הוא טעינת הביצית במכשיר הוויטריפיקציה שבו נעשה שימוש. ההליך חייב להשתמש בנפחי מדגם מינימליים כדי להגדיל את קצב הקירור ולעזור לתאים לעבור את טמפרטורת המעבר הפאזה במהירות, ובכך להפחית cryoinjuries35. Cryotop משתמש ברצועת פוליפרופילן המחוברת למחזיק. בשיטה זו, הביציות בתמיסת הרטט (<0.1 μL) נטענות במהירות עם נימי זכוכית על גבי רצועת הסרט. לאחר מכן, יש להסיר את הפתרון, ולהשאיר מאחור שכבה דקה מספיק כדי לכסות את התאים להיות cryopreserved. שוב, שלב זה חייב להסתיים מהר ככל האפשר כדי להגביל את החשיפה של ביציות לריכוזים cryoprotectant גבוה של פתרון vitrification, אשר יכול לגרום להלם אוסמוטי רעילים לתאים.
מסיבות אלה, אתגר מרכזי הקשור לשיטה זו הוא הצורך בטיפול ידני וטכנאי מיומן. מחברים אחרים דיווחו כי תוצאת ויטריפיקציה ביצית מופיע מושפע אפקט "עקומת למידה", כמו רכישת מיומנויות ידניות יכול להפחית באופן משמעותי את הנזק הביולוגי לגרום על ידי הליך vitrification34. לפיכך, החוקרים צריכים לקחת בחשבון את "אפקט המפעיל" בהערכת התוצאה של הליך הוויטריפיקציה.
מחקרים נוספים יתמקדו הן בתקינה של הליך בחירת ביציות והן בהתאמה טובה יותר של הרכב המדיה ותנאי התרבות לצרכים של ביציות לנוער. בהקשר זה, הן השימוש בכלטור סידן והן בחומרים נוגדי חמצון עשויים להציע הזדמנויות מבטיחות. באופן דומה, אופטימיזציה של הפרוטוקול תאפשר להגדיל את היכולת ההתפתחותית של ביציות מבוגרים מחוממים/מחוממים.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
המחברים מצהירים שאין להם אינטרסים כלכליים מתחרים.
Acknowledgments
המחברים לא קיבלו מימון ספציפי לעבודה זו. פרופסור מריה גרציה Cappai וד"ר ולריה Pasciu הם הודה בהכרת תודה על קריינות וידאו ועל הקמת המעבדה במהלך עשיית וידאו.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 2′,7′-Dichlorofluorescin diacetate | Sigma-Aldrich | D-6883 | |
| Albumin bovine fraction V, protease free | Sigma-Aldrich | A3059 | |
| Bisbenzimide H 33342 trihydrochloride (Hoechst 33342) | Sigma-Aldrich | 14533 | |
| Calcium chloride (CaCl2 2H20) | Sigma-Aldrich | C8106 | |
| Citric acid | Sigma-Aldrich | C2404 | |
| Confocal laser scanning microscope | Leica Microsystems GmbH,Wetzlar | TCS SP5 DMI 6000CS | |
| Cryotop Kitazato | Medical Biological Technologies | ||
| Cysteamine | Sigma-Aldrich | M9768 | |
| D- (-) Fructose | Sigma-Aldrich | F0127 | |
| D(+)Trehalose dehydrate | Sigma-Aldrich | T0167 | |
| Dimethyl sulfoxide (DMSO) | Sigma-Aldrich | D2438 | |
| Dulbecco Phosphate Buffered Saline | Sigma-Aldrich | D8537 | |
| Egg yolk | Sigma-Aldrich | P3556 | |
| Ethylene glycol (EG) | Sigma-Aldrich | 324558 | |
| FSH | Sigma-Aldrich | F4021 | |
| Glutamic Acid | Sigma-Aldrich | G5638 | |
| Glutaraldehyde | Sigma-Aldrich | G5882 | |
| Glycerol | Sigma-Aldrich | G5516 | |
| Glycine | Sigma-Aldrich | G8790 | |
| Heparin | Sigma-Aldrich | H4149 | |
| HEPES | Sigma-Aldrich | H4034 | |
| Hypoutarine | Sigma-Aldrich | H1384 | |
| Inverted microscope | Diaphot, Nikon | ||
| L-Alanine | Sigma-Aldrich | A3534 | |
| L-Arginine | Sigma-Aldrich | A3784 | |
| L-Asparagine | Sigma-Aldrich | A4284 | |
| L-Aspartic Acid | Sigma-Aldrich | A4534 | |
| L-Cysteine | Sigma-Aldrich | C7352 | |
| L-Cystine | Sigma-Aldrich | C8786 | |
| L-Glutamine | Sigma-Aldrich | G3126 | |
| LH | Sigma-Aldrich | L6420 | |
| L-Histidine | Sigma-Aldrich | H9511 | |
| L-Isoleucine | Sigma-Aldrich | I7383 | |
| L-Leucine | Sigma-Aldrich | L1512 | |
| L-Lysine | Sigma-Aldrich | L1137 | |
| L-Methionine | Sigma-Aldrich | M2893 | |
| L-Ornithine | Sigma-Aldrich | O6503 | |
| L-Phenylalanine | Sigma-Aldrich | P5030 | |
| L-Proline | Sigma-Aldrich | P4655 | |
| L-Serine | Sigma-Aldrich | S5511 | |
| L-Tyrosine | Sigma-Aldrich | T1020 | |
| L-Valine | Sigma-Aldrich | V6504 | |
| Magnesium chloride heptahydrate (MgSO4.7H2O) | Sigma-Aldrich | M2393 | |
| Makler Counting Chamber | Sefi-Medical Instruments ltd.Biosigma S.r.l. | ||
| Medium 199 | Sigma-Aldrich | M5017 | |
| Mineral oil | Sigma-Aldrich | M8410 | |
| MitoTracker Red CM-H2XRos | ThermoFisher | M7512 | |
| New born calf serum heat inactivated (FCS) | Sigma-Aldrich | N4762 | |
| Penicillin G sodium salt | Sigma-Aldrich | P3032 | |
| Phenol Red | Sigma-Aldrich | P3532 | |
| Polyvinyl alcohol (87-90% hydrolyzed, average mol wt 30,000-70,000) | Sigma-Aldrich | P8136 | |
| Potassium Chloride (KCl) | Sigma-Aldrich | P5405 | |
| Potassium phosphate monobasic (KH2PO4) | Sigma-Aldrich | P5655 | |
| Propidium iodide | Sigma-Aldrich | P4170 | |
| Sheep serum | Sigma-Aldrich | S2263 | |
| Sodium azide | Sigma-Aldrich | S2202 | |
| Sodium bicarbonate (NaHCO3) | Sigma-Aldrich | S5761 | |
| Sodium chloride (NaCl) | Sigma-Aldrich | S9888 | |
| Sodium dl-lactate solution syrup | Sigma-Aldrich | L4263 | |
| Sodium pyruvate | Sigma-Aldrich | P2256 | |
| Sperm Class Analyzer | Microptic S.L. | S.C.A. v 3.2.0 | |
| Statistical software Minitab 18.1 | 2017 Minitab | ||
| Stereo microscope | Olimpus | SZ61 | |
| Streptomycin sulfate | Sigma-Aldrich | S9137 | |
| Taurine | Sigma-Aldrich | T7146 | |
| TRIS | Sigma-Aldrich | 15,456-3 |
References
- Arav, A.
- Mullen, S. F., Fahy, G. M. A chronologic review of mature oocyte vitrification research in cattle, pigs, and sheep. Theriogenology. 78 (8), 1709-1719 (2012).
- Hwang, I. S., Hochi, S. Recent progress in cryopreservation of bovine oocytes. BioMed Research International. 2014, (2014).
- Berlinguer, F., et al. Effects of trehalose co-incubation on in vitro matured prepubertal ovine oocyte vitrification. Cryobiology. 55 (1), (2007).
- Quan, G., Wu, G., Hong, Q. Oocyte Cryopreservation Based in Sheep: The Current Status and Future Perspective. Biopreservation and Biobanking. 15 (6), 535-547 (2017).
- Succu, S., et al. A recovery time after warming restores mitochondrial function and improves developmental competence of vitrified ovine oocytes. Theriogenology. 110, (2018).
- Succu, S., et al. Vitrification of in vitro matured ovine oocytes affects in vitro pre-implantation development and mRNA abundance. Molecular Reproduction and Development. 75 (3), (2008).
- Succu, S., et al. Vitrification Devices Affect Structural and Molecular Status of In Vitro Matured Ovine Oocytes. Molecular Reproduction and Development. 74, 1337-1344 (2007).
- Hosseini, S. M., Asgari, V., Hajian, M., Nasr-Esfahani, M. H. Cytoplasmic, rather than nuclear-DNA, insufficiencies as the major cause of poor competence of vitrified oocytes. Reproductive BioMedicine Online. , (2015).
- Succu, S., et al. Calcium concentration in vitrification medium affects the developmental competence of in vitro matured ovine oocytes. Theriogenology. 75 (4), (2011).
- Sanaei, B., et al. An improved method for vitrification of in vitro matured ovine oocytes; beneficial effects of Ethylene Glycol Tetraacetic acid, an intracellular calcium chelator. Cryobiology. 84, 82-90 (2018).
- Quan, G. B., Wu, G. Q., Wang, Y. J., Ma, Y., Lv, C. R., Hong, Q. H. Meiotic maturation and developmental capability of ovine oocytes at germinal vesicle stage following vitrification using different cryodevices. Cryobiology. 72 (1), 33-40 (2016).
- Fernández-Reyez, F., et al. maturation and embryo development in vitro of immature porcine and ovine oocytes vitrified in different devices. Cryobiology. 64 (3), 261-266 (2012).
- Ahmadi, E., Shirazi, A., Shams-Esfandabadi, N., Nazari, H. Antioxidants and glycine can improve the developmental competence of vitrified/warmed ovine immature oocytes. Reproduction in Domestic Animals. 54 (3), 595-603 (2019).
- Barrera, N., et al. Impact of delipidated estrous sheep serum supplementation on in vitro maturation, cryotolerance and endoplasmic reticulum stress gene expression of sheep oocytes. PLoS ONE. 13 (6), (2018).
- Walker, S. K., Hill, J. L., Kleemann, D. O., Nancarrow, C. D. Development of Ovine Embryos in Synthetic Oviductal Fluid Containing Amino Acids at Oviductal Fluid Concentrations. Biology of Reproduction. 55 (3), 703-708 (1996).
- Kuwayama, M., Vajta, G., Kato, O., Leibo, S. P. Highly efficient vitrification method for cryopreservation of human oocytes. Reproductive BioMedicine Online. 11 (3), 300-308 (2005).
- Wu, X., Jin, X., Wang, Y., Mei, Q., Li, J., Shi, Z. Synthesis and spectral properties of novel chlorinated pH fluorescent probes. Journal of Luminescence. 131 (4), 776-780 (2011).
- Dell'Aquila, M. E., et al. Prooxidant effects of verbascoside, a bioactive compound from olive oil mill wastewater, on in vitro developmental potential of ovine prepubertal oocytes and bioenergetic/oxidative stress parameters of fresh and vitrified oocytes. BioMed Research International. 2014, (2014).
- Gadau, S. D. Morphological and quantitative analysis on α-tubulin modifications in glioblastoma cells. Neuroscience Letters. 687, 111-118 (2018).
- los Reyes, M. D., Palomino, J., Parraguez, V. H., Hidalgo, M., Saffie, P. Mitochondrial distribution and meiotic progression in canine oocytes during in vivo and in vitro maturation. Theriogenology. , (2011).
- Leoni, G. G., et al. Differences in the kinetic of the first meiotic division and in active mitochondrial distribution between prepubertal and adult oocytes mirror differences in their developmental competence in a sheep model. PLoS ONE. 10 (4), (2015).
- Berlinguer, F., et al. Effects of trehalose co-incubation on in vitro matured prepubertal ovine oocyte vitrification. Cryobiology. 55 (1), 27-34 (2007).
- Serra, E., Gadau, S. D., Berlinguer, F., Naitana, S., Succu, S. Morphological features and microtubular changes in vitrified ovine oocytes. Theriogenology. 148, 216-224 (2020).
- Asgari, V., Hosseini, S. M., Ostadhosseini, S., Hajian, M., Nasr-Esfahani, M. H. Time dependent effect of post warming interval on microtubule organization, meiotic status, and parthenogenetic activation of vitrified in vitro matured sheep oocytes. Theriogenology. 75 (5), 904-910 (2011).
- Ciotti, P. M., et al. Meiotic spindle recovery is faster in vitrification of human oocytes compared to slow freezing. Fertility and Sterility. 91 (6), 2399-2407 (2009).
- Ledda, S., Bogliolo, L., Leoni, G., Naitana, S. Cell Coupling and Maturation-Promoting Factor Activity in In Vitro-Matured Prepubertal and Adult Sheep Oocytes1. Biology of Reproduction. 65 (1), 247-252 (2001).
- Palmerini, M. G., et al. In vitro maturation is slowed in prepubertal lamb oocytes: ultrastructural evidences. Reproductive Biology and Endocrinology. 12, (2014).
- Leoni, G. G., et al. Relations between relative mRNA abundance and developmental competence of ovine oocytes. Molecular Reproduction and Development. 74 (2), 249-257 (2007).
- Succu, S., et al. Effect of vitrification solutions and cooling upon in vitro matured prepubertal ovine oocytes. Theriogenology. 68 (1), 107-114 (2007).
- Larman, M. G., Sheehan, C. B., Gardner, D. K. Calcium-free vitrification reduces cryoprotectant-induced zona pellucida hardening and increases fertilization rates in mouse oocytes. Reproduction. 131 (1), 53-61 (2006).
- Yeste, M., Jones, C., Amdani, S. N., Patel, S., Coward, K. Oocyte activation deficiency: a role for an oocyte contribution. Human Reproduction Update. 22 (1), 23-47 (2016).
- Rienzi, L., et al. Oocyte, embryo and blastocyst cryopreservation in ART: systematic review and meta-analysis comparing slow-freezing versus vitrification to produce evidence for the development of global guidance. Human Reproduction Update. 23 (2), 139-155 (2017).
- De Santis, L., et al. Oocyte vitrification: influence of operator and learning time on survival and development parameters. Placenta. 32, 280-281 (2011).
- Zhang, X., Catalano, P. N., Gurkan, U. A., Khimji, I., Demirci, U. Emerging technologies in medical applications of minimum volume vitrification. Nanomedicine. 6 (6), London, England. 1115-1129 (2011).
