Summary
O protocolo visa fornecer um método padrão para a vitrificação de oócitos de ovelhas adultas e juvenis. Inclui todos os passos desde a preparação dos meios de amadurecimento in vitro até a cultura pós-aquecimento. Os oócitos são vitrificados na fase MII usando o Cryotop para garantir o volume essencial mínimo.
Abstract
Na pecuária, sistemas de produção de embriões in vitro podem ser desenvolvidos e sustentados graças ao grande número de ovários e oócitos que podem ser facilmente obtidos de um matadouro. Ovários adultos sempre carregam vários folículos antrais, enquanto em doadores pré-pubertal o número máximo de oócitos está disponível às 4 semanas de idade, quando os ovários carregam um número máximo de folículos antral. Assim, cordeiros de 4 semanas são considerados bons doadores, mesmo que a competência de desenvolvimento dos oócitos pré-púricionais seja menor em comparação com sua contraparte adulta.
Pesquisas básicas e aplicações comerciais seriam impulsionadas pela possibilidade de criopreservar oócitos vitrificados obtidos com sucesso tanto de doadores adultos quanto pré-púrias. A vitrificação do oócito coletado de doadores pré-púrias também permitiria encurtar o intervalo de geração e, assim, aumentar o ganho genético em programas de reprodução. No entanto, a perda do potencial de desenvolvimento após a criopreservação torna os oócitos mamíferos provavelmente um dos tipos de células mais difíceis de criopreservar. Entre as técnicas de criopreservação disponíveis, a vitrificação é amplamente aplicada aos oócitos animais e humanos. Apesar dos recentes avanços na técnica, exposições a altas concentrações de agentes crioprotetores, bem como lesões arrepiantes e estresse osmótico ainda induzem várias alterações estruturais e moleculares e reduzem o potencial de desenvolvimento dos oócitos mamíferos. Aqui, descrevemos um protocolo para a vitrificação de oócitos de ovelhas coletados de doadores juvenis e adultos e amadurecidos in vitro antes da criopreservação. O protocolo inclui todos os procedimentos desde oócito na maturação in vitro até o período de vitrificação, aquecimento e incubação pós-aquecimento. Os oócitos vitrificados na fase MII podem de fato ser fertilizados após o aquecimento, mas eles precisam de tempo extra antes da fertilização para restaurar os danos devido aos procedimentos criopreservadores e aumentar seu potencial de desenvolvimento. Assim, as condições e o tempo da cultura pós-aquecimento são passos cruciais para a restauração do potencial de desenvolvimento do oócito, especialmente quando o oócito é coletado de doadores juvenis.
Introduction
O armazenamento a longo prazo dos gametas femininos pode oferecer uma ampla gama de aplicações, como melhorar a reprodução animal doméstica por meio de programas de seleção genética, contribuir para preservar a biodiversidade através do programa de conservação de espécies de animais selvagens ex-situ, e impulsionar pesquisas e aplicações em biotecnologia in vitro graças à disponibilidade de oócitos armazenados a serem incorporados em programas de produção de embriões in vitro ou transplante nuclear1,2,3. A vitrificação de oócitos juvenis também aumentaria o ganho genético, encurtando o intervalo de geração nos programas de reprodução4. A vitrificação por resfriamento ultrarrápido e aquecimento de oócitos é atualmente considerada uma abordagem padrão para oócitos de pecuária criopreservação5. Em ruminantes, antes da vitrificação, os oócitos são geralmente amadurecidos in vitro, após a recuperação de folículos obtidos de ovários derivados do matadouro2. Ovários adultos, e especialmente pré-púbertos4,6, podem de fato fornecer um número praticamente ilimitado de oócitos para serem criopreservados.
No gado, após a vitrificação e oocito vitrificação e aquecimento, os rendimentos do blastocisto em >10% têm sido comumente relatados por vários laboratórios durante a última década3. No entanto, em pequenos ruminantes a vitrificação de oócitos ainda é considerada relativamente nova para os oócitos juvenis e adultos, e um método padrão para vitrificação de oócitos de ovelhas permanece a ser estabelecido2,5. Apesar dos avanços recentes, o oócito vitrificado e aquecido apresenta de fato várias alterações funcionais e estruturais que limitam seu potencial de desenvolvimento7,8,9. Assim, poucos artigos relataram o desenvolvimento de blastocistos em 10% ou mais em oócitos de ovelhas vitrificadas/aquecidas2. Várias abordagens têm sido investigadas para reduzir as alterações acima mencionadas: otimização da composição das soluções de vitrificação e descongelamento10,11; experimentando o uso de diferentes dispositivos criográficos8,12,13; e a aplicação de tratamentos específicos durante a maturação in vitro (IVM)4,14,15 e/ou durante o tempo de recuperação após o aquecimento6.
Aqui descrevemos um protocolo para a vitrificação de oócitos de ovelhas coletados de doadores juvenis e adultos e amadurecidos in vitro antes da criopreservação. O protocolo inclui todos os procedimentos desde oócito na maturação in vitro até o período de vitrificação, aquecimento e cultura pós-aquecimento.
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Protocol
O protocolo animal e os procedimentos implementados descritos abaixo estão de acordo com as diretrizes éticas vigentes na Universidade de Sassari, em conformidade com a Diretiva da União Europeia 86/609/CE e a recomendação da Comissão das Comunidades Europeias 2007/526/CE.
1. Preparação de mídia para manipulação de oócitos
- Prepare o meio para o transporte de ovários coletados suplementando o soro fisco tamponado de Fosfato de Dulbecco com penicilina de 0,1 g/L e estreptomicina de 0,1 g/L (PBS).
- Prepare o meio para coleta e maturação de oócitos diluindo 9,5 g de Tissue Culture Medium (TCM) 199 em pó com 1 L de água Milli-Q suplementada com penicilina (0,1%) e estreptomicina (0,1%).
- Após a diluição, filtre 100 mL de médio e armazene-o a 4 °C como Stock Maturation Medium (SMM) a ser usado por uma semana.
- Prepare o meio de coleta (CM) suplementando os 900 mL restantes com HEPES de 25 mM, bicarbonato de 0,36 g/L e 0,1% (w/v) álcool polivinyl (PVA) (pH 7,3, osmolalidade 290 mOsm/kg).
- Prepare o meio de maturação com SMM suplementado com 0,021 g/L bicarbonato, 10% soro de ovelhas tratado a calor, 1 UI/mL FSH, 1 UI/mL LH, 100 μL de cisteamina e 8 mg/mL de piruvato.
NOTA: O meio de maturação em um volume de 10 mL deve ser incubado em condições padrão (em uma atmosfera máxima umidificada a 39 °C em 5% de CO2 no ar) por pelo menos 4h antes do uso. - Prepare o meio base (BM) para manipulação de oócito após a maturação in vitro, consistindo em PBS sem Ca++ e Mg++, suplementado com soro de bezerro fetal de 20% (FCS).
2. Coleta e maturação de oócitos
- Recuperar os oócitos de ovários juvenis (30-40 dias de idade, peso corporal de 6-10 kg) e ovários adultos.
- Transporte os ovários coletados do matadouro comercial para o laboratório dentro de 1-2 h na PBS a 27 °C.
- Depois de lavar em meio fresco PBS, corte os ovários em CM usando uma micro-lâmina para liberar o conteúdo do folículo.
- Sob um exame estereomicroscópio com ampliação de 60x, selecione complexos cumulus-oócitos (COCs) para maturação in vitro, escolhendo aqueles com 4-10 camadas de células de granulosa, oócito com um citoplasma uniforme, distribuição homogênea de gotículas lipídicas no citoplasma e com o diâmetro externo de cerca de 90 μm (média).
- Lave os COCs selecionados três vezes em CM e, finalmente, transfira-os em meio de maturação.
NOTA: Para osócitos juvenis, para melhorar a sobrevida após a vitrificação, suplemente o meio de maturação com trehalose de 100 μM. - Para maturação in vitro, transfira 30-35 COCs em 600 μL de meio de maturação em placas de Petri de quatro poços, cobertas com 300 μL de óleo mineral e incuba-los para 22 (oócitos adultos)/24 (oócitos juvenis) h em 5% CO2 no ar a 39 °C.
- Após a maturação in vitro, denude COCs de células cumulus por pipetação suavemente. Após o exame sob um estereótipo com ampliação de 60x, selecione apenas aqueles que mostram a extrusão no primeiro corpo polar e, portanto, no estágio metafase II (MII), para vitrificação.
3. Procedimentos de coleta de sêmen, congelamento e descongelamento
- Prepare o meio base para criopreservação de sêmen consistindo em extensor de carneiro (200 mM Tris; ácido cítrico de 70 mM; 55 mM de frutose; pH 7.2, osmolalidade 300 mOsm/kg) suplementado com gema de ovo 20% (v/v).
- Recolher o sêmen somente durante a estação de criação de ovinos (outubro a novembro).
- Obter ejaculações por vagina artificial de carneiros adultos (idades de 2 a 5 anos), mantidos em ambiente ao ar livre e alimentados com uma ração de manutenção de peso vivo. Mantenha os carneiros isolados em canetas separadas, mas com contato visual entre si.
- Repita a coleta de sêmen uma por semana durante toda a estação de reprodução para obter pelo menos 8 ejaculações de cada macho.
- Transporte as amostras de sêmen para o laboratório em temperatura ambiental dentro de 5 minutos após a coleta e processo imediato. Acumule as ejaculações de dois ou três carneiros e avalie a espectrofotometria da concentração de esperma.
- Após a piscina, diluir as ejaculações até 400 x 106 espermatozoides/mL com meio base para criopreservação de sêmen suplementada com 4% de glicerol. Em seguida, esfrie o sêmen diluído a 4 °C durante um período de 2h e equilibre-o por 20 minutos antes de congelar.
- Congele as amostras de sêmen em forma de pelotas (0,25 mL) em gelo seco e, em seguida, mergulhe-as em nitrogênio líquido.
- Para descongelar, coloque a pelota em um falcão de vidro esterilizado e mergulhe-a em um banho de água por 20 s a 39 °C.
4. Fertilização in vitro e cultura de embriões
- Prepare os estoques para a constituição do fluido oviductal sintético (SOF).
- Preparar estoque A: 99,4 mL de água milliq; 6,29 g de NaCl; 0,534 g de KCl; 0,161 g de KH2PO4; 0,182 g de MgSO4 ·7H2O; e 0,6 mL de Lactato de Sódio. Mantenha-se a 4 °C por até 3 meses.
- Preparar estoque B: 10 mL de água milliq; 0.210 g de NaHCO3; e 2-3 g de Phenol Red. Mantenha-se a 4 °C por 1 mês.
- Preparar estoque C: 10 mL de água milliq; e 0,051 g de piruvato de sódio. Mantenha-se a 4 °C por 1 mês.
- Preparar estoque D: 10 mL de água milliq; e 0,262 g de CaCl2 2H2O. Mantenha-se a 4 °C por 1 mês.
- Prepare 10 mL de SOF consistindo de 7.630 mL de água MilliQ, 1 mL de Estoque A, 1 mL de Estoque B, 0,07 mL de Estoque C e 0,7 mL de estoque D.
- Prepare o meio de fertilização in vitro (FIV): SOF suplementado com 2% de soro de ovelhas estrous tratados a calor, heparina de 10 μg/mL e hipoutarina de 1 μg/mL (osmolalidade 280-290 mOsm/kg).
NOTA: O meio de FIV em um volume de 10 mL deve ser incubado em condições padrão (em uma atmosfera máxima umidificada a 39 °C em 5% DE CO2, 5% O2 e 90% N2) pelo menos 4 horas antes do uso.
- Transfira alíquotas de sêmen congelada/descongelada em um tubo cônico de vidro esterilizado abaixo de 1,5 mL de meio de FIV aquecido e incuba-os por 15 min a 39 °C em uma atmosfera umidificada a 5% de CO2 no ar.
- Após a incubação, os espermatozoides motil nadam em direção à porção apical da coluna líquida. Colete a camada superior e observe para avaliação de motilidade do esperma.
NOTA: Os parâmetros de motilidade do esperma devem ser avaliados utilizando-se um sistema de análise de esperma assistido por computador (CASA) com as seguintes configurações: 25 quadros adquiridos para evitar a sobreposição de faixas de espermatozoides, contraste mínimo 10, velocidade mínima de 30 μm/s e motilidade progressiva > retidão de 80%. Este sistema tem uma configuração específica para avaliação de esperma de carneiro. Para cada amostra, 5 μL subsample de suspensão de esperma são carregados em uma câmara de análise pré-aquecida com uma profundidade de 10 μm. A motilidade do esperma é avaliada a 37 °C a 40x usando um microscópio de contraste de fase e um mínimo de 500 espermatozoides por subsampleção deve ser analisado em pelo menos quatro diferentes campos microscópicos. Foi avaliado o percentual de espermatozoides motile total e progressivo. Para a FIV, o percentual de espermatozoides motile progressivo deve ser de ≥ 30%. - Diluir o espermatozoide derivado de motil derivado em 1 x 106 concentração final de espermatozoides/mL e co-incuba-los com oócitos MII em 300 μL de fiv médio coberto com óleo mineral em placas de Petri de quatro poços.
- Após 22 h de transferência os zigotes presuntivos em pratos petri de quatro poços contendo SOF suplementado com 0,4% de albumina de soro bovino e aminoácidos essenciais e não essenciais na concentração oviductal, conforme relatado por16 sob óleo mineral e cultural-los em condições padrão até o estágio blastocísta.
- Em 22-, 26-e 32-h pós-inseminação, regise o número de oócitos cerrados, mostrando dois blastomeres distintos, pelo exame sob um estereomicroscópio com ampliação de 60x.
- Observe os embriões diariamente a partir do quinto ao nono dia de cultura e os blastocistos recém-formados devem ser registrados pelo exame sob um estereoscópio com ampliação de 60x.
5. Vitrificação e aquecimento de Oócitos
NOTA: Realize a vitrificação seguindo o método de volume essencial mínimo (MEV) utilizando criotops do dispositivo17.
- Equilibre um grupo de cinco oócitos a 38,5 °C por 2 min em BM. O uso de BM garante baixa concentração de cálcio ([Ca2++] 2,2 mg/dL)10.
- Desidratar os oócitos com uma solução de equilíbrio de 3 minutos contendo 7,5% (v/v) sulfóxido de dimetil (DMSO) e 7,5% (v/v) glicol de etileno (EG) em BM.
- Transfira os oócitos para a solução de vitrificação contendo 16,5% (v/v) DMSO, 16,5% (v/v) EG e 0,5 M de trehalose em BM antes de carregá-los em um dispositivo criotop e ingô-los diretamente em nitrogênio líquido dentro de 30 s.
- Para aquecer a uma temperatura biológica, transfira o conteúdo de cada dispositivo de vitrificação de nitrogênio líquido para gotas de 200 μL de 1,25 M de trehalose em BM por 1 min a 38,5 °C, e mexa suavemente para facilitar a mistura.
- Para promover a remoção de crioprotetores intracelulares, transfira oócitos stepwise em 200 μL gotas de soluções de trehalose decrescentes (0,5 M, 0,25 M, 0,125 M trehalose em BM) para 30 s a 38,5 °C antes de ser equilibrado por 10 min a 38,5 °C em BM.
6. Avaliação da qualidade do oócito pós-aquecimento
- Após o aquecimento, incubar os oócitos por 6h em PBS sem Ca++ e Mg++ mais 20% FCS (BM) em 5% de CO2 no ar a 38,5 °C.
NOTA: A capacidade oócito de restaurar características biológicas e estruturais após a vitrificação é em relação às espécies e classes de oócitos usados. - Uma vez que a capacidade oócito de recuperar danos criopreservadores é dependente do tempo, avalie a qualidade do oócito em diferentes pontos de tempo da cultura in vitro (0h, 2h, 4h, 6h) após o aquecimento, para definir a janela de tempo ideal para fertilização oócica.
NOTA: No oócito de ovelhas adultas, o tempo ideal é 4h após o aquecimento; para oócito prepubertal, o tempo ideal é 2 h pós-aquecimento.
7. Avaliação de sobrevivência de Oócito
- Imediatamente após o aquecimento e para cada ponto de tempo da cultura pós-aquecimento, avalia morfologicamente osócitos usando um microscópio invertido com ampliação de 100x.
NOTA: Os oócitos com alterações estruturais, como citoplasma fraco, dano zona pellucida e/ou membrana devem ser classificados como degenerados. - Valide a avaliação da integridade da membrana usando uma coloração fluorescente dupla diferencial.
- Incubar os oócitos em 2 mL de BM contendo iodeto de propídio (PI; 10 μg/mL) e Hoechst 33342 (10 μg/mL) por 5 min em 5% CO2 no ar a 38,5 °C.
- Depois de lavar três vezes em BM fresco, observe os oócitos sob um microscópio fluorescente usando um filtro de excitação de 350 nm e emissão de 460 nm para Hoechst 33342 e um filtro de excitação de 535 nm e emissão de 617 nm para PI.
NOTA: Oócitos com membrana intacta podem ser reconhecidos pela fluorescência azul do DNA colorido com Hoechst 33342. Oócito com membranas danificadas mostram uma fluorescência vermelha devido à coloração de DNA com PI.
8. Avaliação da atividade mitocondrial e dos níveis intracelulares ROS por microscopia de varredura a laser confocal
- Prepare a sonda MitoTracker Red CM-H2XRos (MT-Red).
- Diluir o teor de 1 frasco (50 μg) com 1 mL de DMSO para obter uma solução de 1 mM. Mantenha o frasco diluído em nitrogênio líquido.
- Diluir a solução 1 mM com o DMSO para obter a solução de estoque de 100 μM e armazená-la a -80 °C no escuro.
- Prepare a sonda diacetato de 2′,7'-diclorodihidrofluoresceína (H2DCF-DA).
- Diluir o H2DCF-DA em 0,1% de pyrrolidone polivinyl (PVA)/PBS para obter a primeira solução de 100 mM. Mantenha a solução a -80 °C no escuro .
- Diluir a primeira solução em PVA/PBS de 0,1% para obter a solução de estoque de 100 μM. Armazená-lo a -20 °C no escuro.
- Prepare o meio de montagem (MM): para 10 mL de MM, adicione 5 mL de glicerol, 5 mL de PBS e 250 mgs de azida de sódio. Armazená-lo a -20 °C até usar.
- Incubar os oócitos por 30 min a 38,5 °C em BM com 500 nM MT-Red (solução de estoque: 100 μM em DMSO).
- Após a incubação com a sonda MT-Red, lave os oócitos três vezes em BM e incubar por 20 minutos na mesma mídia contendo 5 μM H2DCF-DA (solução de estoque: 100 μM em BM).
- Após a exposição às sondas, lave os oócitos em BM e fixe em 2,5% glutaraldeído/PBS por pelo menos 15 min.
- Após a fixação, lave os oócitos três vezes em BM e monte em lâminas de vidro em uma gota de 4 μL de MM com 1 mg/mL Hoechst 33342 usando almofadas de cera para evitar a compressão das amostras.
- Armazene slides a 4 °C no escuro até a avaliação.
- Realize a análise de seções imunolabelladas com um microscópio de varredura a laser confocal. O microscópio é equipado com lasers Ar/He/Ne, usando um objetivo de óleo de 40/60x. Analise as seções por excitação sequencial.
- Para avaliação mitocondrial, observe as amostras com um laser multifotônio para detectar MT-Red (exposição: 579 nm; emissão: 599 nm).
- Use um raio laser de íons de argônio a 488 nm e o filtro B-2 A (exposição de 495 nm e emissão de 519 nm) para apontar o diclorofluoresceína (DCF)18.
- Em cada oócito individual, meça as intensidades de fluorescência MT-Red e DCF no plano equatorial19.
- Manter parâmetros relacionados à intensidade da fluorescência em valores constantes durante todas as aquisições de imagem (energia laser 26%, Configurações sequenciais 1: PMT1 ganhar 649-PMT2 ganho 482; Configuração sequencial 2: PMT1 ganhar 625-PMT2 ganho 589; compensação 0; tamanho do pinhole: 68).
- Realize a análise quantitativa da intensidade da fluorescência utilizando o pacote de software de análise de imagem Leica LAS AF Lite, seguindo os procedimentos padronizados até20.
- Capture as imagens uma vez, movendo-se no eixo Z, até chegar ao plano equatorial.
- Para cada foto, transformar-se em escala cinza e desligar o canal 1 (relacionado ao azul Hoechst) foi desligado. Em seguida, desenhe manualmente uma região de interesse (ROI) em uma área circunscrita, que fica ao redor do eixo meiotic.
NOTA: O software pode ler automaticamente o valor médio do pixel no canal 2 (FITC), subtraindo o valor do plano de fundo a partir dele. - Regissuas médias dos pixels e submeta-se para análise estatística.
9. Análises Estatísticas
- Analise as seguintes diferenças: taxas de sobrevivência em oócitos juvenis vs adultos, taxas de sobrevivência e competência de desenvolvimento no controle e oócitos juvenis tratados com trehalose, taxas de sobrevivência e ativação partenogenética e competência de desenvolvimento de oócitos adultos vitrificados com diferentes meios de concentração de cálcio, taxas de fertilização e produção de embriões em oócitos juvenis vitrificados com baixa ou alta concentração de cálcio, fenótipos mitocondrias ativos em oócitos vitrificados juvenis durante diferentes pontos de tempo da cultura pós-aquecimento e taxas de ativação partenogenética entre oócitos vitrificados adultos e juvenis usando o teste quadrado chi.
- Analise a taxa de decote e a saída de embriões em oócitos adultos vitrificados durante diferentes pontos de tempo da cultura pós-aquecimento, intensidade de fluorescência da atividade mitocondrial e níveis intracelulares ROS em oócitos vitrificados juvenis durante diferentes pontos de tempo da cultura pós-aquecimento pela ANOVA após análise para homogeneidade de variância pelo teste de Levene. Use um teste de tukey pós-hoc para destacar diferenças entre e entre grupos.
- Realizar análises estatísticas utilizando o programa de software estatístico e considerar uma probabilidade de P < 0,05 ser o nível mínimo de significância. Todos os resultados são expressos como ± S.E.M.
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Representative Results
A criotolerância do oócito de doadores juvenis é menor em comparação com as adultas. O primeiro efeito observado é uma menor taxa de sobrevivência pós-aquecimento em comparação com os oócitos adultos (Figura 1A; χ2 teste P<0,001). Os oócitos juvenis apresentaram menor integridade da membrana após o aquecimento(Figura 1B). O uso de trehalose no meio de maturação destinava-se a verificar se esse açúcar poderia reduzir os crioinjuutos em oócitos juvenis. Os dados demonstraram23 que os oócitos amadureceram por 24h com suplementação de trehalose apresentaram maiores taxas de sobrevivência após vitrificação/aquecimento em relação ao grupo não tratado (Tabela 1: 85,7% vs 75,3% respectivamente; χ2 teste P<0,05). A suplementação de trehalose foi de fato associada à maior integridade da membrana após o aquecimento(Figura 2A). Assim, o uso de trehalose durante a maturação in vitro de oócitos juvenis aumentou as taxas de sobrevivência após a vitrificação (85,7%) a valores comparáveis aos adultos (90,3%). No entanto, as taxas de decote, fertilização e desenvolvimento de oócitos juvenis não foram aumentadas por suplementação de trehalose(Tabela 1).
Para melhorar a competência do oócito após a vitrificação testamos em oócitos oceístos ovinos adultos diferentes meios de vitrificação com concentrações de cálcio variando de 9,9 a 0,4 mg/dL10. Os resultados obtidos mostraram que o uso de mídia com concentração de cálcio igual a 2,2 mg/dL aumentou as taxas de sobrevivência pós-aquecimento, melhorou a competência de desenvolvimento e reduziu a ativação partenogenética do oócito adulto10 (Tabela 2). Testamos, assim, os meios de vitrificação de cálcio baixo para a vitrificação de oócitos juvenis. Como mostrado na Tabela 3,oócitos juvenis vitrificados com baixa concentração de cálcio evidenciaram maiores taxas de fertilização em comparação com oócitos vitrificados com alta concentração de cálcio (44,35% vs 32,29 % respectivamente; P<0,05), mas não foram encontradas diferenças na produção de embriões.
Os oócitos vitrificados/aquecidos precisam de tempo extra antes da fertilização para restaurar os danos devido aos procedimentos de criopreservação e aumentar seu potencial de desenvolvimento. Um estudo anterior demonstrou de fato que a concentração intracelular ATP, a atividade mitocondrial e a competência in vitro do desenvolvimento são reduzidas em oócitos vitrificados/descongelados, que também apresentam altas concentrações de ROS intracelulares6. Essas alterações são particularmente marcadas imediatamente após o aquecimento. Durante a cultura pós-aquecimento, tanto os oócitos adultos quanto juvenis são capazes de se recuperar parcialmente dos danos sofridos durante os procedimentos de vitrificação6,24. Comparando a cultura pós-aquecimento de diferentes durações (0, 2, 4 e 6 h), mostramos que após 4h de oócitos culturais coletados de ovelhas adultas são capazes de recuperar o equilíbrio energético6 e a configuração microtubular24 e restaurar a competência de desenvolvimento com decote superior (50,7 ± 3,9%; P< 0,01 ANOVA) e taxas de blastocisto (14,40 ± 1,3%; ANOVA P< 0,01) em comparação com outros pontos de tempo (0, 2 e 6 h; Tabela 4). Assim, 4h de cultura pós-aquecimento representa a janela de tempo ideal para fertilização de oócitos adultos vitrificados/aquecidos6.
Quando o mesmo experimento foi repetido com oócitos coletados de doadores juvenis, esses resultados foram parcialmente confirmados. A atividade mitocondrial foi maior em oócitos juvenis vitrificados/aquecidos após 4h de cultura pós-aquecimento em comparação com outros pontos de tempo (0, 2, 6; Figura 3: ANOVA P<0,01). Vários padrões de distribuição mitocondrial são observados e classificados nos três grupos a seguir (conforme relatado por21 ): Padrão A: MULTA homogênea com pequenas granulações espalhadas pelo citoplasma; Padrão B: GRANULAR homogêneo com grandes granulações espalhadas pelo citoplasma; Padrão C: clustered heterogêneo quando granulações particularmente grandes estavam presentes, espalhadas por todo o citoplasma ou localizadas em domínios citoplasmados específicos. Os diferentes fenótipos na distribuição do citoplasma do mitocondrial ativo no MII podem estar relacionados à competência de desenvolvimento oócito. Uma distribuição homogênea FINE é um indicador de baixa competência de desenvolvimento, enquanto uma distribuição GRANULAR e CLUSTERED estão relacionadas a uma atividade de mitocôndrias aumentada e, consequentemente, maior competência de desenvolvimento22. Os padrões de distribuição mitocondrial mudaram durante 6h de cultura pós-aquecimento. A Figura 4 mostra exemplos de oócitos juvenis com diferentes padrões de distribuição mitocondrial e suas flutuações durante a cultura pós-aquecimento. O padrão A aumenta significativamente durante a incubação prolongada e atinge o maior valor em 6h após o aquecimento (Figura 4Aa: χ2 P<0,05), o padrão B não apresentou alterações significativas durante o post cultura de aquecimento(Figura 4Bb),o padrão C não foi encontrado em nenhum oócito vitrificado/aquecido juvenil durante a incubação prolongada (Figura 4Cc: χ2 P<0,05).
Além disso, os níveis intracelulares ros foram significativamente menores em oócitos juvenis em 2h de cultura pós-aquecimento em comparação com 0, 4 e 6 h (Figura 5: ANOVA P<0,001). No entanto, e ao contrário do que foi encontrado nos oócitos adultos, a taxa de ativação partenogenética espontânea aumentou durante a cultura pós-aquecimento nos oócitos juvenis(Figura 6). Por essa razão, o ponto de tempo recomendado para fertilização em oócitos juvenis seria de 2h após a cultura pós-aquecimento.
Figura 1. Taxas de sobrevivência de oócito oócido vitrificado/aquecido coletado de doadores juvenis e adultos. a Oócito foi vitrificado após a maturação in vitro. As taxas de sobrevivência foram determinadas após a vitrificação e o aquecimento por manchas fluorescentes com iodeto de propídio (10 μg/mL) e Hoechst 33342 (10 μg/mL). N = 165 oócitos adultos e 170 oócitos juvenis. Diferentes letras indicam diferenças significativas entre oócitos adultos e juvenis: χ2 teste P<0.001. (B-C) Exemplos de oócitos juvenis vitrificados/aquecidos com membrana plasmática intacta (B) e membrana plasmática danificada (C) na avaliação morfológica (microscópio invertido com ampliação de 100x). Barra de escala = 10 μm. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 2. Taxas de sobrevivência de oócitos oceístas juvenis e competência in vitro de desenvolvimento após o amadurecimento com (TRH) e sem (CTR) trehalose (100 mM em meio de maturação). (A-B) Exemplos de oócitos juvenis vitrificados após a maturação in vitro em mídia suplementada (A) com ou (B) sem trehalose na avaliação morfológica (microscópio invertido com ampliação de 100x). Barra de escala = 30 μm. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 3. Quantificação da intensidade ativa de fluorescência mitocondrial em oócitos juvenis vitrificados/aquecidos em diferentes pontos de tempo (0, 2, 4, 6) durante a cultura in vitro pós-aquecimento. Os oócitos IVM foram utilizados como controle (CTR N = 77). No total, 163 (0 h N = 45; 2 h N = 39; 4 h N = 40; 6 h N = 39) oócitos juvenis foram vitrificados e aquecidos em três experimentos independentes. Diferentes letras indicam diferenças estatisticamente significativas (ANOVA P = 0,0000). Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 4. Distribuição do padrão mitocondrial em oócitos juvenis vitrificados/aquecidos durante 6 horas de cultura in vitro pós-aquecimento. Imagens representativas da distribuição mitocondrial Fina (A),Granular (B) e Agrupada (C) em oócitos juvenis vitrificados/aquecidos. (D) Percentual de oócitos vitrificados/aquecidos juvenis que mostram uma distribuição mitocondrial fina; (E) Percentual de oócitos vitrificados/aquecidos juvenis mostrando distribuição mitocondrial granular; (F) Percentual de oócitos vitrificados/aquecidos juvenis mostrando uma distribuição mitocondrial agrupada. Os oócitos juvenis IVM foram utilizados como controle (CTR; N = 77). No total foram utilizados 163 (0 h N = 45; 2 h N = 39; 4 h N = 40; 6 h N = 39) oócitos juvenis vitrificados e aquecidos em três experimentos independentes. Diferentes letras indicam diferenças estatisticamente significativas (Aa: χ2 P = 0,026; Bb: χ2 P = 0,097; Cc: χ2 P = 0,014). Barra de escala = 30 μm. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 5. Quantificação da intensidade de fluorescência ros intracelular em oócitos juvenis vitrificados durante 6 horas pós-aquecimento na cultura in vitro. (A-B) Imagens representativas da intensidade da fluorescência ROS em oócitos juvenis in vitro amadurecidos (A) e vitrificados(B). (C) Níveis intracelulares de ROS conforme determinado pela quantificação da intensidade da fluorescência em oócitos juvenis vitrificados em diferentes pontos de tempo (0 h N=45; 2 h N=39; 4 h N=40; 6 h N=39) durante o pós-aquecimento na cultura vitro. Os oócitos juvenis vencidos in vitro foram utilizados como controle (CTR N = 77). Diferentes letras indicam diferenças estatisticamente significativas (ANOVA P = 0,0000). Barra de escala = 50 μm. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 6. Ativação partegenética em oócitos juvenis vitrificados durante 6 horas de cultura in vitro pós-aquecimento. (A-B) Imagens representativas da ativação partenogenética oócito: (A) oócito na transição metafase II-telophase II e (B) formação pronucleus. (C) Percentuais de oócitos adultos e juvenis ativados parcialmente em diferentes pontos de tempo (0, 2, 4, 6 h) durante a cultura in vitro pós-aquecimento. Asteriscos indicam diferenças estatísticas entre oócitos juvenis e adultos em cada ponto de incubação (ANOVA P = 0,000). Este valor foi modificado a partir de Serra et al.24 Escala barra = 50 μm. Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
| Oócitos (n) | Taxa de sobrevivência (%) | FIV (n) | A fertilizouum (%) | Cleavedb (%) | Blastocistosc (%) | |
| Ctr | 73 | 75.3* | 452 | 91.1 | 96.1 | 14.3 |
| Trh | 77 | 85.7 | 470 | 92.5 | 95.4 | 13 |
| * Teste quadrado de chi p<0.5 | ||||||
| a Percentuais são calculados em oócitos de FIV | ||||||
| b Os percentuais são calculados sobre oócitos fertilizados | ||||||
| c Os percentuais são calculados sobre oócitos cerrados | ||||||
Mesa 1. As taxas de sobrevivência dos ocitodos ovinos juvenis e a competência in vitro de desenvolvimento após o amadurecimento com e sem trehalose e vitrificação. TRH = oócitos juvenis amadurecidos com suplementação de trehalose (100 mM em meio de maturação). CTR = controle oócitos juvenis amadurecidos sem suplementação de trehalose. As taxas de sobrevivência foram determinadas após a coloração fluorescente com iodeto de propídio (10 μg/mL) e Hoechst 33342 (10 μg/mL) de oócitos vitrificados/aquecidos. A competência de desenvolvimento oócito foi determinada após a incorporação em um sistema de produção in vitro. um Os percentuais são calculados em oócitos de FIV. b Os percentuais são calculados sobre oócitos fertilizados. c Os percentuais são calculados sobre oócitos cortados. * χ2 teste P<0,5. Esta tabela foi modificada de Berlinguer et al.23
| Grupos | [Ca++] mg/dL | N oocyte | Ativação partenogenética espontânea (%) | Oócitos vitrificados | Oócitos de fertilização in vitro sobreviveram e fertilização in vitro (%) | Decote (%) | Saída de blastocistos (%) |
| TCM/FCS | 9.9 | 80 | 33 (41.2)a | 150 | 124 (82.7)a | 40 (32.5)a | 2 (1.6)a |
| PBS/FCS | 4.4 | 82 | 29 (35.3)ac | 115 | 88 (76,5)a | 33 (37.5)ae | 1 (1.1)a |
| PBSCaMg grátis/FCS | 2.2 | 86 | 11 (12,7)b | 126 | 115 (91.3)b | 74 (64,3)b | 12 (10.4)b |
| PBS/BSA | 3.2 | 83 | 21 (25.3)c | 110 | 90 (81.8)a | 18 (20)c | 0 (0)a |
| PBSCaMg grátis/BSA | 0.4 | 87 | 10 (11.5)b | 149 | 123 (82,5)a | 57 (46.3)de | 3 (2.4)b |
Mesa 2. Competência de desenvolvimento de oócitos adultos in vitro maturados vitrificados em meios vitrificação (16,5% etileno glicol + 16,5% de sulfóxido de dimetil) contendo diferentes concentrações de cálcio. As taxas de sobrevivência e fertilização são calculadas sobre oócitos vitrificados; as taxas totais de decote e blastocisto são calculadas em oócitos sobreviventes. Valores com subscritos diferentes dentro da mesma coluna são significativamente diferentes: χ2 teste P<0,05. Esta tabela foi modificada a partir de Succu et al.10
| [Ca 2++] em mídia de vitrificação | Não. Ovócitos | Taxa de sobrevivência pós-vitrificação (%) | Taxa de fertilização (%) | Decote (%) | Saída de blastocisto (%) |
| Alta [9,9 mg/dL] | 190 | 161 (84.73) | 52/161 (32.29)a | 43/161 (26.7) | 0 |
| Baixo [2,2 mg/dL] | 150 | 124 (82.66) | 55/124 (44.35)b | 41/124 (33.1) | 0 |
Mesa 3. Taxas de fertilização e desenvolvimento após fertilização in vitro e cultura de oócito juvenil vitrificado/aquecido utilizando alta ([Ca 2++] = 9,9 mg/dL) e baixa ([Ca 2++] = 2,2 mg/dL) concentração de cálcio em meios vitrificação. Diferentes letras indicam diferença estatística (≠ b P<0,05 χ2 teste).
| Horas de incubação pós-aquecimento | Taxa de decote(n) | Saída de embrião(n) |
| 0 | 19,2 ± 3%a (82) | 0%a (17) |
| 2 | 41,8 ± 3%b (100) | 6,5 ± 1,3%b (42) |
| 4 | 50,7 ± 3%b (92) | 14,4 ± 1,3%c (48) |
| 6 | 26 ± 3%a (92) | 0%a (23) |
Mesa 4. Taxa de decote e saída de embriões em oócitos adultos vitrificados/aquecidos fertilizados em diferentes pontos de tempo da cultura pós-aquecimento. Letras diferentes indicam diferença estatística dentro da mesma coluna: ANOVA P<0,01.
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Discussion
A criopreservação de oócito em animais domésticos pode permitir não apenas a conservação a longo prazo dos recursos genéticos femininos, mas também avançar no desenvolvimento de biotecnologias embrionárias. Assim, o desenvolvimento de um método padrão de vitrificação oócito beneficiaria tanto a pecuária quanto o setor de pesquisa. Neste protocolo, é apresentado um método completo para vitrificação de oócitos de ovelhas adultas e pode representar um ponto de partida sólido para o desenvolvimento de um sistema eficiente de vitrificação para oócito juvenil.
Uma das principais vantagens do método proposto é que ele inclui todas as etapas da coleta de oócitos, maturação in vitro, vitrificação e aquecimento. Além disso, inclui um período de cultura pós-aquecimento para permitir que os oócitos se recuperem dos danos incorridos durante o procedimento de vitrificação antes de serem fertilizados. O tempo ideal para a fertilização deve ser adaptado de acordo com o método de criopreservação, qualidade inicial do oócito, idade do paciente e espécie, sendo essencial considerar ambos os aspectos da recuperação do tempo e envelhecimento oócito25,26. Assim, a escolha da duração do período de incubação pós-aquecimento é desafiadora e pode impactar o resultado de programas de vitrificação oócito. Com base nos resultados obtidos em termos de taxas de decote e produção de embriões, e nas condições descritas no protocolo apresentado, o tempo ideal para fertilização de oócitos de ovelhas adultas vitrificadas é após 4 horas de incubação pós-aquecimento(Tabela 4)6. Essas informações são cruciais ao projetar um programa de vitrificação oócito.
Este protocolo, no entanto, ao mesmo tempo em que dá resultados aceitáveis em termos de produção de embriões de oócitos adultos vitrificados/aquecidos, ainda leva a embriões baixos a zero se aplicados a oócitos juvenis. Várias limitações estruturais e funcionais prejudicam a competência de desenvolvimento do oócito pré-púria, como tamanho pequeno, acoplamento defeituoso entre células cumulus e oócitos, diminuição na absorção de aminoácidos, síntese de proteínas reduzidas e metabolismo energético 27,28,29. Em estudo anterior, relatamos que os oócitos prepubertal apresentam alta sensibilidade ao procedimento de vitrificação30. A baixa competência de desenvolvimento demonstrada após a vitrificação e o aquecimento é provavelmente o resultado de danos a fatores citoplasmísticos envolvidos na reorganização do citoesqueleto e (ou) na ativação do fator promotor de maturação30. Como mostrado na Tabela 1, a suplementação do meio de maturação com trehalose, um crioprotetor não permeável, foi capaz de aumentar as taxas de sobrevivência após a vitrificação e aquecimento a valores comparáveis aos dos oócitos adultos4. Da mesma forma, o uso de solução de vitrificação com baixas concentrações de cálcio aumenta as taxas de fertilização de oócitos juvenis após a vitrificação e o aquecimento, como mostra a Tabela 3. Assim, tanto a otimização das condições culturais durante a maturação in vitro quanto a composição da mídia de vitrificação podem ajudar a aumentar a qualidade do oócito juvenil após a vitrificação e o aquecimento. Os oócitos juvenis mostram alguma capacidade de se recuperar dos danos induzidos pelo procedimento de vitrificação, conforme mostrado nas Figuras 3,4 e 5.
No entanto, as altas taxas de ativação partenogenética espontânea durante a cultura pós-aquecimento ainda limitam seu potencial de desenvolvimento. O etileno glicol e o DMSO, que são comumente usados como agentes crioprotetores, podem ativar artificialmente o oócito antes da fertilização real, limitando assim o sucesso da fertilização e o desenvolvimento de embriões. Podem, de fato, causar um aumento transitório na concentração intracelular Ca2+ 31,desencadeando assim exocitose de grânulo cortical, formação pronuclei e retomada meiotic32. De fato, a vitrificação pode ativar artificialmente o oócito antes da fertilização real, limitando assim o sucesso da fertilização e o desenvolvimento de embriões. O quequerador de cálcio pode, assim, ser usado para limitar ainda mais a disponibilidade de cálcio durante o processo de vitrificação com o objetivo de limitar a taxa de ativação espontânea em oócitos juvenis.
Deve-se considerar também que, ao contrário do congelamento lento, a vitrificação é uma técnica exclusivamente manual e, portanto, é dependente do operador33,34. Assim, a disponibilidade de pessoal treinado é um fator-chave para o sucesso desse método. Em primeiro lugar, o operador tem que selecionar adequadamente os oócitos para ser vitrificado. Após IVM, os oócitos são suavemente desnudados de células cumulus e avaliados sob um estereótipo para selecionar para criopreservação apenas aqueles com um citoplasma uniforme, distribuição homogênea de gotículas lipídicas no citoplasma e com o diâmetro externo de cerca de 90 μm. Além disso, apenas oócitos que mostram a extrusão no primeiro corpo polar e, portanto, na fase MII, devem ser selecionados.
A avaliação morfológica dos oócitos deve ser concluída em poucos minutos e sendo dependente do operador, é muito sensível às variações em sua implementação adequada. Para ajudar a padronizar o procedimento de seleção, o método sugere limitar o tempo de cultura para maturação in vitro a 22 h para oócitos adultos. Neste momento, oócitos ovinos de alta qualidade já completaram a primeira divisão meiotic22 e podem ser selecionados para criopreservação. Desta forma, a eliminação de oócitos de baixa qualidade, que são os mais lentos na conclusão da primeira divisão meiotic, deve ser mais simples.
O operador também deve respeitar estritamente o tempo definido para o procedimento de vitrificação, desde a primeira exposição ao crioprotetor até a imersão em nitrogênio líquido. Outro passo crítico é o carregamento do oócito no dispositivo de vitrificação utilizado. O procedimento deve utilizar volumes mínimos de amostra para aumentar a taxa de resfriamento e ajudar as células a passar rapidamente pela temperatura de transição de fase, diminuindo assim os danos crioinus35. O criotop usa uma tira de polipropileno presa a um suporte. Neste método, os oócitos da solução de vitrificação (<0,1 μL) são rapidamente carregados com um capilar de vidro no topo da tira de filme. Em seguida, a solução deve ser removida, deixando para trás uma camada fina suficiente para cobrir as células a serem criopreservadas. Mais uma vez, esta etapa deve ser concluída o mais rápido possível para limitar a exposição dos oócitos às altas concentrações crioprotetores da solução vitrificação, que podem causar choque osmótico e são tóxicas para as células.
Por essas razões, um grande desafio associado a este método é a necessidade de manuseio manual e técnico qualificado. Outros autores relataram que o desfecho da vitrificação oótida aparece influenciado por um efeito "curva de aprendizagem", uma vez que a aquisição de habilidades manuais pode reduzir significativamente o dano biológico induzido pelo procedimento de vitrificação34. Os pesquisadores devem, portanto, levar em consideração o "efeito operador" na avaliação do resultado do procedimento de vitrificação.
Outros estudos se concentrarão tanto na padronização do processo de seleção de oócitos quanto na melhor adaptação da composição da mídia e das condições culturais às necessidades dos oócitos juvenis. Nesse sentido, tanto o uso de queladores de cálcio quanto antioxidantes podem oferecer oportunidades promissoras. Da mesma forma, a otimização do protocolo permitirá aumentar a competência de desenvolvimento de oócitos adultos vitrificados/aquecidos.
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Disclosures
Os autores declaram que não têm interesses financeiros concorrentes.
Acknowledgments
Os autores não receberam nenhum financiamento específico para este trabalho. A professora Maria Grazia Cappai e a Dra.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 2′,7′-Dichlorofluorescin diacetate | Sigma-Aldrich | D-6883 | |
| Albumin bovine fraction V, protease free | Sigma-Aldrich | A3059 | |
| Bisbenzimide H 33342 trihydrochloride (Hoechst 33342) | Sigma-Aldrich | 14533 | |
| Calcium chloride (CaCl2 2H20) | Sigma-Aldrich | C8106 | |
| Citric acid | Sigma-Aldrich | C2404 | |
| Confocal laser scanning microscope | Leica Microsystems GmbH,Wetzlar | TCS SP5 DMI 6000CS | |
| Cryotop Kitazato | Medical Biological Technologies | ||
| Cysteamine | Sigma-Aldrich | M9768 | |
| D- (-) Fructose | Sigma-Aldrich | F0127 | |
| D(+)Trehalose dehydrate | Sigma-Aldrich | T0167 | |
| Dimethyl sulfoxide (DMSO) | Sigma-Aldrich | D2438 | |
| Dulbecco Phosphate Buffered Saline | Sigma-Aldrich | D8537 | |
| Egg yolk | Sigma-Aldrich | P3556 | |
| Ethylene glycol (EG) | Sigma-Aldrich | 324558 | |
| FSH | Sigma-Aldrich | F4021 | |
| Glutamic Acid | Sigma-Aldrich | G5638 | |
| Glutaraldehyde | Sigma-Aldrich | G5882 | |
| Glycerol | Sigma-Aldrich | G5516 | |
| Glycine | Sigma-Aldrich | G8790 | |
| Heparin | Sigma-Aldrich | H4149 | |
| HEPES | Sigma-Aldrich | H4034 | |
| Hypoutarine | Sigma-Aldrich | H1384 | |
| Inverted microscope | Diaphot, Nikon | ||
| L-Alanine | Sigma-Aldrich | A3534 | |
| L-Arginine | Sigma-Aldrich | A3784 | |
| L-Asparagine | Sigma-Aldrich | A4284 | |
| L-Aspartic Acid | Sigma-Aldrich | A4534 | |
| L-Cysteine | Sigma-Aldrich | C7352 | |
| L-Cystine | Sigma-Aldrich | C8786 | |
| L-Glutamine | Sigma-Aldrich | G3126 | |
| LH | Sigma-Aldrich | L6420 | |
| L-Histidine | Sigma-Aldrich | H9511 | |
| L-Isoleucine | Sigma-Aldrich | I7383 | |
| L-Leucine | Sigma-Aldrich | L1512 | |
| L-Lysine | Sigma-Aldrich | L1137 | |
| L-Methionine | Sigma-Aldrich | M2893 | |
| L-Ornithine | Sigma-Aldrich | O6503 | |
| L-Phenylalanine | Sigma-Aldrich | P5030 | |
| L-Proline | Sigma-Aldrich | P4655 | |
| L-Serine | Sigma-Aldrich | S5511 | |
| L-Tyrosine | Sigma-Aldrich | T1020 | |
| L-Valine | Sigma-Aldrich | V6504 | |
| Magnesium chloride heptahydrate (MgSO4.7H2O) | Sigma-Aldrich | M2393 | |
| Makler Counting Chamber | Sefi-Medical Instruments ltd.Biosigma S.r.l. | ||
| Medium 199 | Sigma-Aldrich | M5017 | |
| Mineral oil | Sigma-Aldrich | M8410 | |
| MitoTracker Red CM-H2XRos | ThermoFisher | M7512 | |
| New born calf serum heat inactivated (FCS) | Sigma-Aldrich | N4762 | |
| Penicillin G sodium salt | Sigma-Aldrich | P3032 | |
| Phenol Red | Sigma-Aldrich | P3532 | |
| Polyvinyl alcohol (87-90% hydrolyzed, average mol wt 30,000-70,000) | Sigma-Aldrich | P8136 | |
| Potassium Chloride (KCl) | Sigma-Aldrich | P5405 | |
| Potassium phosphate monobasic (KH2PO4) | Sigma-Aldrich | P5655 | |
| Propidium iodide | Sigma-Aldrich | P4170 | |
| Sheep serum | Sigma-Aldrich | S2263 | |
| Sodium azide | Sigma-Aldrich | S2202 | |
| Sodium bicarbonate (NaHCO3) | Sigma-Aldrich | S5761 | |
| Sodium chloride (NaCl) | Sigma-Aldrich | S9888 | |
| Sodium dl-lactate solution syrup | Sigma-Aldrich | L4263 | |
| Sodium pyruvate | Sigma-Aldrich | P2256 | |
| Sperm Class Analyzer | Microptic S.L. | S.C.A. v 3.2.0 | |
| Statistical software Minitab 18.1 | 2017 Minitab | ||
| Stereo microscope | Olimpus | SZ61 | |
| Streptomycin sulfate | Sigma-Aldrich | S9137 | |
| Taurine | Sigma-Aldrich | T7146 | |
| TRIS | Sigma-Aldrich | 15,456-3 |
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