Summary
Le protocole vise à fournir une méthode standard pour la vitrification des ovocytes de moutons adultes et juvéniles. Il comprend toutes les étapes de la préparation du milieu de maturation in vitro à la culture post-réchauffement. Les ovocytes sont vitrifiés au stade MII en utilisant Cryotop pour assurer le volume essentiel minimum.
Abstract
Chez le bétail, les systèmes de production d’embryons in vitro peuvent être développés et maintenus grâce au grand nombre d’ovaires et d’ovocytes qui peuvent être facilement obtenus à partir d’un abattoir. Les ovaires adultes portent toujours plusieurs follicules antraux, tandis que chez les donneurs pré-pubertaires, le nombre maximal d’ovocytes est disponible à l’âge de 4 semaines, lorsque les ovaires portent un nombre maximal de follicules antraux. Ainsi, les agneaux âgés de 4 semaines sont considérés comme de bons donneurs, même si la compétence développementale des ovocytes prépubéraux est inférieure à celle de leur homologue adulte.
La recherche fondamentale et les applications commerciales seraient stimulées par la possibilité de cryoconserver avec succès des ovocytes vitrifiés obtenus à partir de donneurs adultes et prépubères. La vitrification des ovocytes prélevés auprès de donneurs prépubéraux permettrait également de raccourcir l’intervalle de génération et ainsi d’augmenter le gain génétique dans les programmes de sélection. Cependant, la perte de potentiel de développement après cryoconservation fait des ovocytes de mammifères probablement l’un des types de cellules les plus difficiles à cryoconserver. Parmi les techniques de cryoconservation disponibles, la vitrification est largement appliquée aux ovocytes animaux et humains. Malgré les progrès récents de la technique, les expositions à des concentrations élevées d’agents cryoprotecteurs ainsi que les dommages de refroidissement et le stress osmotique induisent encore plusieurs changements structurels et moléculaires et réduisent le potentiel de développement des ovocytes de mammifères. Ici, nous décrivons un protocole pour la vitrification des ovocytes de moutons rassemblés des donateurs juvéniles et adultes et mûris in vitro avant cryopreservation. Le protocole comprend toutes les procédures allant de la maturation in vitro des ovocytes à la vitrification, au réchauffement et à la période d’incubation post-réchauffement. Les ovocytes vitrifiés au stade MII peuvent en effet être fécondés après réchauffement, mais ils ont besoin de plus de temps avant la fécondation pour restaurer les dommages dus aux procédures de cryoconservation et pour augmenter leur potentiel de développement. Ainsi, les conditions et le moment de la culture post-réchauffement sont des étapes cruciales pour la restauration du potentiel de développement des ovocytes, en particulier lorsque les ovocytes sont prélevés auprès de donneurs juvéniles.
Introduction
Le stockage à long terme des gamètes femelles peut offrir un large éventail d’applications, telles que l’amélioration de l’élevage d’animaux domestiques par des programmes de sélection génétique, la contribution à la préservation de la biodiversité grâce au programme ex situ de conservation des espèces sauvages, et la stimulation de la recherche et des applications biotechnologiques in vitro grâce à la disponibilité d’ovocytes stockés à incorporer dans la production d’embryons in vitro ou les programmes de transplantation nucléaire1,2,3. La vitrification des ovocytes juvéniles augmenterait également le gain génétique en raccourcissant l’intervalle de génération dans les programmes de sélection4. La vitrification par refroidissement et réchauffement ultra-rapides des ovocytes est actuellement considérée comme une approche standard pour la cryoconservation des ovocytes de bétail5. Chez les ruminants, avant la vitrification, les ovocytes sont généralement mûris in vitro, après récupération à partir de follicules obtenus à partir d’ovaires dérivés d’abattoirs2. Les ovaires adultes, et surtout prépubéraux4,6,peuvent en effet fournir un nombre quasi illimité d’ovocytes à cryoconserver.
Chez les bovins, après vitrification et réchauffement des ovocytes, des rendements en blastocystes à >10% ont été couramment rapportés par plusieurs laboratoires au cours de la dernière décennie3. Cependant, chez les petits ruminants, la vitrification des ovocytes est encore considérée comme relativement nouvelle pour les ovocytes juvéniles et adultes, et une méthode standard pour la vitrification des ovocytes des moutons reste à établir2,5. Malgré des avancées récentes, l’ovocyte vitrifié et réchauffé présente en effet plusieurs altérations fonctionnelles et structurelles qui limitent leur potentiel de développement 7,8,9. Ainsi, peu d’articles ont rapporté le développement de blastocystes à 10% ou plus dans les ovocytes de mouton vitrifiés/réchauffés2. Plusieurs approches ont été étudiées pour réduire les altérations précitées : optimisation de la composition des solutions de vitrification et de décongélation10,11; expérimenter l’utilisation de différents cryo-dispositifs8,12,13; et l’application de traitements spécifiques lors de la maturation in vitro (IVM)4,14,15 et/ou pendant le temps de récupération après réchauffement6.
Ici nous décrivons un protocole pour la vitrification des ovocytes de moutons rassemblés des donateurs juvéniles et adultes et mûris in vitro avant cryopreservation. Le protocole comprend toutes les procédures allant de la maturation in vitro des ovocytes à la vitrification, au réchauffement et à la période de culture post-réchauffement.
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Protocol
Le protocole animal et les procédures mises en œuvre décrites ci-dessous sont conformes aux lignes directrices éthiques en vigueur à l’Université de Sassari, conformément à la Directive 86/609/CE de l’Union européenne et à la recommandation de la Commission des Communautés européennes 2007/526/CE.
1. Préparation du support pour la manipulation des ovocytes
- Préparer le milieu pour le transport des ovaires recueillis en complétant la solution saline tamponnée au phosphate de Dulbecco avec 0,1 g/L de pénicilline et 0,1 g/L de streptomycine (PBS).
- Préparer le milieu pour la collecte et la maturation des ovocytes en diluant 9,5 g de milieu de culture tissulaire (MTC) 199 en poudre avec 1 L d’eau Milli-Q complétée par de la pénicilline (0,1 %) et la streptomycine (0,1 %).
- Après dilution, filtrer 100 mL de milieu et le conserver à 4 °C comme milieu de maturation du stock (SMM) à utiliser pendant une semaine.
- Préparer le milieu de collecte (CM) en complétant les 900 mL restants avec 25 mM hepes, 0,36 g/L de bicarbonate et 0,1 % (p/v) d’alcool polyvinylique (PVA) (pH 7,3, osmolalité 290 mOsm/kg).
- Préparer le milieu de maturation avec du SMM complété par 0,021 g/L de bicarbonate, 10 % de sérum de mouton d’oestrus traité thermiquement, 1 UI/mL de FSH, 1 UI/mL de LH, 100 μL de cystéamine et 8 mg/mL de pyruvate.
NOTA: Le milieu de maturation d’un volume de 10 mL doit être incube aux conditions normales (dans une atmosphère humidifiée maximale à 39 °C dans 5 % deCO2 dans l’air) pendant au moins 4 h avant utilisation. - Préparer le milieu de base (BM) pour la manipulation de l’ovocyte après maturation in vitro, constitué en PBS sans Ca++ et Mg++,complété par 20% de sérum de veau fœtal (FCS).
2. Prélèvement et maturation des ovocytes
- Récupérer les ovocytes des ovaires juvéniles (30-40 jours, poids corporel 6-10 kg) et adultes.
- Transporter les ovaires collectés de l’abattoir commercial au laboratoire dans un délai de 1 à 2 h dans du PBS à 27 °C.
- Après le lavage dans un milieu frais PBS, trancher les ovaires en CM à l’aide d’une micro-lame pour libérer la teneur en follicules.
- Dans le cadre d’un examen stéréomicroscope avec un grossissement 60x, sélectionnez les complexes cumulus-ovocytes (COC) pour la maturation in vitro en choisissant ceux avec 4-10 couches de cellules de granulosa, l’ovocyte avec un cytoplasme uniforme, la distribution homogène des gouttelettes lipidiques dans le cytoplasme et avec le diamètre extérieur d’environ 90 μm (moyenne).
- Lavez les COC sélectionnés trois fois en CM et transférez-les enfin dans un milieu de maturation.
REMARQUE: Pour les ovocytes juvéniles, pour améliorer la survie après vitrification, compléter le milieu de maturation avec 100 μM de tréhalose. - Pour la maturation in vitro, transférer 30 à 35 COC dans 600 μL de milieu de maturation dans des boîtes de Petri à quatre puits, recouvertes de 300 μL d’huile minérale et les incuber pendant 22 (ovocytes adultes)/24 (ovocytes juvéniles) h dans 5 % deCO2 dans l’air à 39 °C.
- Après maturation in vitro, denude COCs des cellules de cumulus en pipetting doucement. Suite à l’examen sous stéréomicroscope à grossissement 60x, sélectionnez uniquement ceux montrant l’extrusion sur le premier corps polaire, et donc au stade de métaphase II (MII), pour la vitrification.
3. Procédures de collecte, de congélation et de décongélation du sperme
- Préparer le milieu de base pour la cryoconservation du sperme consistant en un prolongateur de bélier (Tris 200 mM; acide citrique 70 mM; fructose 55 mM; pH 7,2, osmolalité 300 mOsm/kg) complété par du jaune d’œuf 20% (v/v).
- Collectez le sperme uniquement pendant la saison de reproduction des moutons (octobre-novembre).
- Obtenir des éjaculages par vagin artificiel à partir de béliers adultes (âgés de 2 à 5 ans), maintenus dans un environnement extérieur et nourris avec une ration d’entretien de poids vif. Gardez les béliers isolés dans des enclos séparés, mais avec un contact visuel entre eux.
- Répéter la collecte de sperme une fois par semaine pendant toute la saison de reproduction pour obtenir au moins 8 éjaculages de chaque mâle.
- Transporter les échantillons de sperme au laboratoire à la température ambiante dans les 5 minutes suivant le prélèvement et les traiter immédiatement. Regroupez les éjaculats de deux-trois béliers et évaluez la spectrophotométrie de concentration des spermatozoïdes.
- Après mise en commun, diluer les éjaculats jusqu’à 400 x 106 spermatozoïdes/mL avec milieu de base pour cryoconservation du sperme complété par 4% de glycérol. Refroidir ensuite le sperme dilué à 4 °C sur une période de 2 h et l’équilibrer pendant 20 min avant de le congeler.
- Congeler les échantillons de sperme sous forme de granulés (0,25 mL) sur de la glace carbonique, puis les plonger dans de l’azote liquide.
- Pour la décongélation, mettez la pastille dans un faucon en verre stérilisé et plongez-la au bain-marie pendant 20 s à 39 °C.
4. Fécondation in vitro et culture d’embryons
- Préparer les stocks pour la constitution du liquide oviductal synthétique (SOF).
- Préparer le stock A : 99,4 mL d’eau MilliQ; 6,29 g de NaCl; 0,534 g de KCl; 0,161 g deKH2PO4; 0,182 g de MgSO4·7H2O ; et 0,6 mL de lactate de sodium. Conserver à 4 °C jusqu’à 3 mois.
- Préparer le stock B : 10 mL d’eau MilliQ; 0,210 g de NaHCO3; et 2-3 g de rouge de phénol. Conserver à 4 °C pendant 1 mois.
- Préparer le stock C : 10 mL d’eau MilliQ; et 0,051 g de pyruvate de sodium. Conserver à 4 °C pendant 1 mois.
- Préparer le stock D : 10 mL d’eau MilliQ; et 0,262 g deCaCl2 2H2 O. Conserver à 4 °C pendant 1 mois.
- Préparer 10 mL de SOF comprenant 7,630 mL d’eau MilliQ, 1 mL de stock A, 1 mL de stock B, 0,07 mL de stock C et 0,7 mL de stock D.
- Préparer le milieu de fécondation in vitro (FIV) : SOF complété par 2 % de sérum de mouton œstrus traité thermiquement, 10 μg/mL d’héparine et 1 μg/mL d’hypoutarine (osmolalité 280-290 mOsm/kg).
NOTA : Le milieu FIV d’un volume de 10 mL doit être incube aux conditions normales (dans une atmosphère humidifiée maximale à 39 °C à 5 % deCO2,5 %D’O2 et 90 % deN2)au moins 4 h avant utilisation.
- Transférer les aliquotes de sperme congelées/décongelées dans un tube conique en verre stérilisé sous 1,5 mL de milieu de FIV chauffé et les incuber pendant 15 min à 39 °C dans une atmosphère humidifiée à 5 % deCO2 dans l’air.
- Après incubation, les spermatozoïdes mobiles nagent vers la partie apicale de la colonne liquide. Recueillir la couche supérieure et observer pour l’évaluation de la motilité des spermatozoïdes.
NOTA : Les paramètres de motilité des spermatozoïdes doivent être évalués à l’aide d’un système d’analyse assistée par ordinateur des spermatozoïdes (CASA) avec les paramètres suivants : 25 images acquises pour éviter le chevauchement des trajectoires des spermatozoïdes, contraste minimal de 10, vitesse minimale du trajet moyen de 30 μm/s et motilité progressive > recyté de 80 %. Ce système a une configuration spécifique pour l’évaluation des spermatozoïdes de bélier. Pour chaque échantillon, 5 μL de sous-échantillon de suspension de spermatozoïdes sont chargés dans une chambre d’analyse préchauffée d’une profondeur de 10 μm. La motilité des spermatozoïdes est évaluée à 37 °C à 40x à l’aide d’un microscope à contraste de phase et un minimum de 500 spermatozoïdes par sous-échantillon doit être analysé dans au moins quatre champs microscopiques différents. Le pourcentage de sperme mobile et mobile total progressif ont été évalués. Pour la FIV, le pourcentage de spermatozoïdes mobiles progressifs doit être ≥ 30%. - Diluer les spermatozoïdes mobiles dérivés de swim-up à 1 x 106 spermatozoïdes/mL concentration finale et les co-incuber avec des ovocytes MII dans 300 μL de milieu de FIV recouvert d’huile minérale dans des boîtes de Petri à quatre puits.
- Après 22 h transférer les zygotes présumés dans quatre puits boîtes de Petri contenant SOF complété avec 0,4% albumine sérique bovine et acides aminés essentiels et non essentiels à la concentration oviductal comme rapporté par16 sous huile minérale et les mettre en culture dans des conditions standard jusqu’à l’étape blastocyste.
- À 22- , 26- et 32- h post-insémination, enregistrer le nombre d’ovocytes clivés, montrant deux blastomères distincts, par l’examen sous un stéréomicroscope avec le grossissement 60x.
- Observez les embryons tous les jours à partir du cinquième au neuvième jour de la culture et les blastocystes nouvellement formés doivent être enregistrés par l’examen sous un stéréomicroscope avec un grossissement 60x.
5. Vitrification et réchauffement des ovocytes
REMARQUE: Effectuer la vitrification en suivant la méthode du volume essentiel minimum (MEV) en utilisant le dispositif cryotops17.
- Équilibrer un groupe de cinq ovocytes à 38,5 °C pendant 2 min en BM. L’utilisation de BM garantit une faible concentration en calcium([Ca2++] 2,2 mg/dl)10.
- Déshydrater les ovocytes avec une exposition de 3 minutes à une solution d’équilibrage contenant 7,5% (v/v) de diméthylsulfoxyde (DMSO) et 7,5% (v/v) d’éthylène glycol (EG) dans bm.
- Transférer les ovocytes dans la solution de vitrification contenant 16,5% (v/v) de DMSO, 16,5% (v/v) d’EG et 0,5 M de tréhalose dans BM avant de les charger dans un dispositif cryotop et de les plonger directement dans de l’azote liquide dans les 30 s.
- Pour réchauffer à une température biologique, transférer la teneur de chaque dispositif de vitrification de l’azote liquide dans des gouttes de 200 μL de tréhalose de 1,25 M dans bm pendant 1 min à 38,5 °C, et agiter doucement pour faciliter le mélange.
- Pour favoriser l’élimination des cryoprotecteurs intracellulaires, transférer les ovocytes par étapes dans des gouttes de 200 μL de solutions de tréhalose décroissantes (0,5 M, 0,25 M, 0,125 M de tréhalose dans BM) pendant 30 s à 38,5 °C avant d’être équilibré pendant 10 min à 38,5 °C dans BM.
6. Évaluation de la qualité des ovocytes après le réchauffement
- Après réchauffement, incuber les ovocytes pendant 6 h dans du PBS sans Ca++ et Mg++ plus 20% de FCS (BM) dans 5% deCO2 dans l’air à 38,5 °C.
REMARQUE: La capacité des ovocytes à restaurer les caractéristiques biologiques et structurelles après vitrification est en relation avec les espèces et les classes d’ovocytes utilisés. - Étant donné que la capacité des ovocytes à récupérer les dommages causés par la cryoconservation dépend du temps, évaluez la qualité des ovocytes à différents points temporels de la culture in vitro (0 h, 2 h, 4 h, 6 h) après le réchauffement, afin de définir la fenêtre de temps optimale pour la fécondation des ovocytes.
REMARQUE: Chez l’ovocyte des moutons adultes, le temps optimal est de 4 h après le réchauffement; pour l’ovocyte prépubertal, le temps optimal est de 2 h après le réchauffement.
7. Évaluation de la survie des ovocytes
- Immédiatement après le réchauffement et pour chaque point temporel de la culture post-réchauffement, évaluer morphologiquement les ovocytes à l’aide d’un microscope inversé avec un grossissement 100x.
REMARQUE: Les ovocytes présentant des altérations structurelles, tels que le cytoplasme faible, les dommages à la zone pellucide et/ou à la membrane doivent être classés comme dégénérés. - Valider l’évaluation de l’intégrité de la membrane à l’aide d’une double coloration fluorescente différentielle.
- Incuber les ovocytes dans 2 mL de BM contenant de l’iodure de propidium (PI; 10 μg/mL) et du Hoechst 33342 (10 μg/mL) pendant 5 min dans 5 % deCO2 dans l’air à 38,5 °C.
- Après lavage trois fois en BM frais, observer les ovocytes sous un microscope fluorescent à l’aide d’un filtre d’excitation de 350 nm et d’une émission de 460 nm pour Hoechst 33342 et d’un filtre d’excitation de 535 nm et d’une émission de 617 nm pour PI.
REMARQUE: Les ovocytes avec une membrane intacte peuvent être reconnus par la fluorescence bleue de l’ADN coloré avec Hoechst 33342. Les ovocytes avec des membranes endommagées montrent une fluorescence rouge due à la coloration de l’ADN avec PI.
8. Évaluation de l’activité mitochondriale et des niveaux intracellulaires de ROS par microscopie confocale à balayage laser
- Préparez la sonde MitoTracker Red CM-H2XRos (MT-Red).
- Diluer la teneur en 1 flacon (50 μg) avec 1 mL de DMSO pour obtenir une solution de 1 mM. Conservez le flacon dilué dans de l’azote liquide.
- Diluer la solution de 1 mM avec du DMSO pour obtenir la solution mère de 100 μM et la stocker à -80 °C dans l’obscurité.
- Préparer la sonde de diacétate de 2′,7′-dichlorodihydrofluorescéine(H2DCF-DA).
- Diluer leH2DCF-DA dans 0,1 % de polyvinyl pyrrolidone (PVA)/PBS pour obtenir la première solution de 100 mM. Gardez la solution à -80 °C dans l’obscurité.
- Diluer la première solution dans 0,1 % de PVA/PBS pour obtenir la solution mère de 100 μM. Conservez-le à -20 °C dans l’obscurité.
- Préparer le milieu de montage (MM) : pour 10 mL de MM, ajouter 5 mL de glycérol, 5 mL de PBS et 250 mg d’azide de sodium. Conservez-le à -20 °C jusqu’à son utilisation.
- Incuber les ovocytes pendant 30 min à 38,5 °C dans bm avec 500 nM MT-Rouge (solution mère : 100 μM dans le DMSO).
- Après incubation avec sonde MT-Red, laver les ovocytes trois fois dans BM et incuber pendant 20 min dans le même milieu contenant 5 μMH2DCF-DA (solution mère : 100 μM dans BM).
- Après exposition aux sondes, laver les ovocytes dans BM et fixer dans 2,5% glutaraldéhyde/PBS pendant au moins 15 min.
- Après fixation, laver les ovocytes trois fois dans BM et les monter sur des lames de verre dans une goutte de MM de 4 μL avec 1 mg/mL hoechst 33342 à l’aide de coussins de cire pour éviter la compression des échantillons.
- Entreposer les diapositives à 4 °C dans l’obscurité jusqu’à évaluation.
- Effectuez l’analyse des sections immunomarquées à l’l’l’utilisation d’un microscope confocal à balayage laser. Le microscope est équipé de lasers Ar/He/Ne, utilisant un objectif d’huile 40/60x. Analyser les sections par excitation séquentielle.
- Pour l’évaluation mitochondriale, observez les échantillons avec un laser multiphotonique pour détecter MT-Red (exposition: 579 nm; émission: 599 nm).
- Utilisez un rayon laser d’ions argon à 488 nm et le filtre B-2 A (exposition de 495 nm et émission de 519 nm) pour signaler la dichlorofluorescéine (DCF)18.
- Dans chaque ovocyte individuel, mesurer les intensités de fluorescence MT-Red et DCF au plan équatorial19.
- Maintenir les paramètres liés à l’intensité de fluorescence à des valeurs constantes lors de toutes les acquisitions d’images (énergie laser 26%, Paramètres séquentiels 1: Gain PMT1 649-PMT2 gain 482; Réglage séquentiel 2: gain PMT1 625-PMT2 gain 589; décalage 0; taille du trou d’épingle: 68).
- Effectuer une analyse quantitative de l’intensité de fluorescence à l’aide du logiciel d’analyse d’image Leica LAS AF Lite, en suivant les procédures normalisées par20.
- Capturez les images une fois, en vous déplaçant sur l’axe Z, jusqu’à atteindre le plan équatorial.
- Pour chaque photo, la transformation en échelle de gris et la mise hors service du canal 1 (lié au bleu hoechst) ont été désactivées. Ensuite, dessinez manuellement une région d’intérêt (ROI) sur une zone circonscrite, c’est-à-dire autour du fuseau méiotique.
Remarque : le logiciel peut lire automatiquement la valeur moyenne des pixels sur le canal 2 (FITC), en soustrayant la valeur de l’arrière-plan à partir de celui-ci. - Enregistrez les valeurs moyennes des pixels et soumettez-les pour analyse statistique.
9. Analyses statistiques
- Analyser les différences suivantes : taux de survie dans les ovocytes juvéniles par rapport aux ovocytes adultes, taux de survie et compétence développementale dans les ovocytes juvéniles témoins et traités au tréhalose, taux de survie et d’activation parthénogénétique et compétence développementale des ovocytes adultes vitrifiés avec différents milieux de concentration de calcium, taux de fécondation et production d’embryons dans les ovocytes juvéniles vitrifiés avec une concentration de calcium faible ou élevée, phénotypes de mitochondries actives dans les ovocytes vitrifiés juvéniles au cours de différents points temporels de culture post-réchauffement et de taux d’activation parthénogénétique entre les ovocytes vitrifiés adultes et juvéniles à l’aide du test du Khi deux.
- Analyser le taux de clivage et la production d’embryons dans les ovocytes adultes vitrifiés au cours de différents points temporels de la culture post-réchauffement, l’intensité de fluorescence de l’activité mitochondriale et les niveaux intracellulaires de ROS dans les ovocytes vitrifiés juvéniles pendant différents points temporels de la culture post-réchauffement par ANOVA après analyse de l’homogénéité de la variance par le test de Levene. Utilisez un test post-hoc Test de Tukey pour mettre en évidence les différences entre les groupes.
- Effectuer une analyse statistique à l’aide du logiciel statistique et considérer une probabilité de P < 0,05 comme le niveau minimal de signification. Tous les résultats sont exprimés en moyenne ± S.E.M.
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Representative Results
La cryo-tolérance des ovocytes provenant de donneurs juvéniles est plus faible que chez les adultes. Le premier effet observé est un taux de survie post-réchauffement plus faible par rapport aux ovocytes adultes(figure 1A; χ2 test P<0,001). Les ovocytes juvéniles ont montré une intégrité membranaire inférieure après réchauffement (Figure 1B). L’utilisation du tréhalose dans le milieu de maturation visait à vérifier si ce sucre pouvait réduire les cryo-blessures dans les ovocytes juvéniles. Les données ont démontré23 que les ovocytes ont mûri pendant 24 h avec la supplémentation en tréhalose ont montré des taux de survie plus élevés après vitrification / réchauffement par rapport au groupe non traité(Tableau 1:85,7% vs 75,3% respectivement; χ2 test P<0,05). La supplémentation en tréhalose a en effet été associée à une plus grande intégrité de la membrane après réchauffement(figure 2A). Ainsi, l’utilisation de tréhalose lors de la maturation in vitro des ovocytes juvéniles a augmenté les taux de survie après vitrification (85,7%) à des valeurs comparables à celles des adultes (90,3 %). Cependant, le clivage, la fécondation et les taux de développement des ovocytes juvéniles n’ont pas été augmentés par la supplémentation en tréhalose (tableau 1).
Pour améliorer la compétence des ovocytes après vitrification, nous avons testé dans les ovocytes ovins adultes différents milieux de vitrification avec des concentrations de calcium allant de 9,9 à 0,4 mg / dL10. Les résultats obtenus ont montré que l’utilisation de milieux dont la concentration en calcium est égale à 2,2 mg/dl augmentait les taux de survie post-réchauffement, améliorait les compétences développementales et réduisait l’activation parthénogénétique de l’ovocyte adulte10 (tableau 2). Nous avons ainsi testé les milieux de vitrification à faible teneur en calcium pour la vitrification des ovocytes juvéniles. Comme le montre le tableau 3,les ovocytes juvéniles vitrifiés avec une faible concentration de calcium ont démontré des taux de fécondation plus élevés que les ovocytes vitrifiés avec une concentration élevée de calcium (44,35 % vs 32,29 % respectivement; P<0,05), mais aucune différence n’a été trouvée dans la production d’embryons.
Les ovocytes vitrifiés/réchauffés ont besoin de plus de temps avant la fécondation pour restaurer les dommages dus aux procédures de cryoconservation et pour augmenter leur potentiel de développement. Une étude antérieure a en effet démontré que la concentration intracellulaire d’ATP, l’activité mitochondriale et la compétence développementale in vitro sont réduites dans les ovocytes vitrifiés/décongelés, qui montrent également des concentrations intracellulaires élevées de ROS6. Ces altérations sont particulièrement marquées immédiatement après le réchauffement. Au cours de la culture post-réchauffement, les ovocytes adultes et juvéniles sont capables de se remettre partiellement des dommages subis lors des procédures de vitrification6,24. En comparant la culture post-réchauffement de différentes durées (0, 2, 4, et 6 h), nous avons montré qu’après 4 h de culture, les ovocytes prélevés sur les brebis adultes sont capables de récupérer l’équilibre énergétique6 et la configuration microtubulaire24 et de restaurer la compétence développementale avec un clivage plus élevé (50,7 ± 3,9% ; P< 0,01 ANOVA) et taux de blastocystes (14,40 ± 1,3%; ANOVA P< 0,01) par rapport aux autres points de temps (0, 2 et 6 h; Tableau 4). Ainsi, 4 h de culture post-réchauffement représentent la fenêtre de temps idéale pour la fécondation des ovocytes adultes vitrifiés/réchauffés6.
Lorsque la même expérience a été répétée avec des ovocytes prélevés auprès de donneurs juvéniles, ces résultats ont été partiellement confirmés. L’activité mitochondriale était plus élevée dans les ovocytes juvéniles vitrifiés/réchauffés après 4 h de culture poteau-réchauffante comparée à d’autres points de temps (0, 2, 6 ; Figure 3: ANOVA P<0.01). Plusieurs modèles de distribution mitochondriale sont observés et classés dans les trois groupes suivants (comme rapporté par21): Modèle A: HOMOGÈNE FINE avec de petites granulations réparties dans tout le cytoplasme; Modèle B: GRANULAIRE homogène avec de grandes granulations réparties dans tout le cytoplasme; Modèle C : clustered hétérogène lorsque des granulations particulièrement grandes étaient présentes, réparties sur tout le cytoplasme ou situées dans des domaines cytoplasmiques spécifiques. Les différents phénotypes dans la distribution cytoplasmique du mitochondrique actif dans MII peuvent être liés à la compétence développementale d’oocyte. Une distribution homogène FINE est un indicateur de faible compétence développementale tandis qu’une distribution GRANULAIRE et CLUSTERED sont liées à une activité mitochondriale accrue et, par conséquent, à une compétence développementale plus élevée22. Les modèles de distribution mitochondriques ont changé pendant 6 h de culture poteau-chaude. La figure 4 montre des exemples d’ovocytes juvéniles ayant différents modèles de distribution mitochondriale et leurs fluctuations au cours de la culture post-réchauffement. Le motif A augmente de manière significative au cours de l’incubation prolongée et atteint la valeur la plus élevée à 6 h après le réchauffement(figure 4Aa:χ2 P<0,05), le motif B n’a pas montré de changements significatifs au cours de la culture post-réchauffement(figure 4Bb),le motif C n’a été trouvé dans aucun ovocytes vitrifié/réchauffé juvénile lors de l’incubation prolongée(figure 4Cc:χ2 P<0,05).
De plus, les taux intracellulaires de ROS étaient significativement plus faibles dans les ovocytes juvéniles à 2 h de culture post-réchauffement par rapport à 0, 4 et 6 h(Figure 5: ANOVA P<0,001). Cependant, et contrairement à ce qui a été trouvé dans les ovocytes adultes, le taux d’activation parthénogénétique spontanée a augmenté au cours de la culture post-réchauffement dans les ovocytes juvéniles (Figure 6). Pour cette raison, le point de temps recommandé pour la fécondation dans les ovocytes juvéniles serait de 2 h après la culture post-réchauffement.
Figure 1. Taux de survie des ovocytes ovins vitrifiés/réchauffés prélevés auprès de donneurs juvéniles et adultes. (A) Des ovocytes ont été vitrifiés après maturation in vitro. Les taux de survie ont été déterminés après vitrification et réchauffement par coloration fluorescente avec de l’iodure de propidium (10 μg/mL) et du Hoechst 33342 (10 μg/mL). N = 165 ovocytes adultes et 170 ovocytes juvéniles. Différentes lettres indiquent des différences significatives entre les ovocytes adultes et juvéniles: χ2 test P<0,001. (B-C) Exemples d’ovocytes juvéniles vitrifiés/chauffés avec une membrane plasmique intacte (B) et une membrane plasmique endommagée (C) lors de l’évaluation morphologique (microscope inversé avec grossissement 100x). Barre d’échelle = 10 μm. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.
Figure 2. Taux de survie des ovocytes ovins juvéniles et compétence développementale in vitro après maturation avec (TRH) et sans tréhalose (CTR) (100 mM dans le milieu de maturation). (A-B) Exemples d’ovocytes juvéniles vitrifiés après maturation in vitro dans des milieux complétés(A)par ou(B)sans tréhalose lors de l’évaluation morphologique (microscope inversé à grossissement 100x). Barre d’échelle = 30 μm. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.
Figure 3. Quantification de l’intensité active de la fluorescence mitochondriale dans les ovocytes juvéniles vitrifiés/réchauffés à différents points temporels (0, 2, 4, 6) au cours de la culture in vitro post-réchauffement. Des ovocytes d’IVM ont été utilisés comme contrôle (CTR N = 77). Au total 163 (0 h N = 45 ; 2 h N = 39 ; 4 h N = 40 ; 6 h N = 39) ovocytes juvéniles ont été vitrifiés et réchauffés dans trois expériences indépendantes. Différentes lettres indiquent des différences statistiquement significatives (ANOVA P = 0,0000). Veuillez cliquer ici pour voir une version plus grande de cette figure.
Figure 4. Distribution du modèle mitochondrial dans les ovocytes juvéniles vitrifiés/réchauffés pendant 6 heures de culture in vitro post-réchauffement. Images représentatives de la distribution mitochondriale fine (A),granulaire (B) et groupée (C) dans les ovocytes juvéniles vitrifiés/réchauffés. D) Pourcentage d’ovocytes vitrifiés/réchauffés juvéniles présentant une distribution mitochondriale fine; E) Pourcentage d’ovocytes vitrifiés/réchauffés juvéniles présentant une distribution mitochondriale granulaire; (F) Pourcentage d’ovocytes vitrifiés/réchauffés juvéniles présentant une distribution mitochondriale groupée. Des ovocytes juvéniles d’IVM ont été utilisés comme contrôle (CTR ; N = 77). Au total 163 (0 h N = 45 ; 2 h N = 39 ; 4 h N = 40 ; 6 h N = 39) ovocytes juvéniles vitrifiés et réchauffés dans trois expériences indépendantes ont été utilisés. Différentes lettres indiquent des différences statistiquement significatives (Aa: χ2 P = 0,026; Bb: χ2 P = 0,097; Cc : χ2 P = 0,014). Barre d’échelle = 30 μm. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.
Figure 5. Quantification de l’intensité intracellulaire de fluorescence de ROS dans les ovocytes juvéniles vitrifiés pendant de 6 heures de culture in vitro poteau-réchauffante. (A-B) Images représentatives de l’intensité de fluorescence ros in vitro mûri (A) et vitrifié (B) ovocytes juvéniles. (C) Les niveaux intracellulaires de ROS déterminés par quantification de l’intensité de fluorescence dans les ovocytes juvéniles vitrifiés à différents points de temps (0 h N = 45; 2 h N = 39; 4 h N = 40; 6 h N = 39) au cours de la culture in vitro post-réchauffement. Des ovocytes juvéniles mûris in vitro ont été utilisés comme témoin (CTR N = 77). Différentes lettres indiquent des différences statistiquement significatives (ANOVA P = 0,0000). Barre d’échelle = 50 μm. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.
Figure 6. Activation parthénogénétique dans les ovocytes juvéniles et adultes vitrifiés pendant 6 heures de culture in vitro poteau-réchauffante. (A-B) Images représentatives de l’activation parthénogénétique des ovocytes : (A) ovocyte dans la transition métaphase II-télophase II et (B) formation du pronoyau. (C) Pourcentages d’ovocytes adultes et juvéniles activés parthénogénétiques à différents moments (0, 2, 4, 6 h) au cours de la culture in vitro post-réchauffement. Les astérisques indiquent des différences statistiques entre les ovocytes juvéniles et adultes à chaque point d’incubation (ANOVA P = 0,000). Ce chiffre a été modifié à partir de Serra et al.24 Scale bar = 50 μm. Veuillez cliquer ici pour voir une version plus grande de ce chiffre.
| Ovocytes (n) | Taux de survie (%) | FIV (n) | Fertiliséa (%) | Clivéb (%) | Blastocystesc (%) | |
| Ctr | 73 | 75.3* | 452 | 91.1 | 96.1 | 14.3 |
| Trh | 77 | 85.7 | 470 | 92.5 | 95.4 | 13 |
| * Test du Khi deux p<0,5 | ||||||
| a Les pourcentages sont calculés sur les ovocytes de FIV | ||||||
| b Les pourcentages sont calculés sur les ovocytes fécondés | ||||||
| c Les pourcentages sont calculés sur les ovocytes clivés | ||||||
Tableau 1. Taux de survie des ovocytes ovins juvéniles et compétence développementale in vitro après maturation avec et sans tréhalose et vitrification. TRH = ovocytes juvéniles mûris avec la supplémentation en tréhalose (100 mM dans le milieu de maturation). CTR = ovocytes juvéniles de contrôle mûris sans supplémentation en tréhalose. Les taux de survie ont été déterminés après coloration fluorescente avec de l’iodure de propidium (10 μg/mL) et hoechst 33342 (10 μg/mL) d’ovocytes vitrifiés/réchauffés. La compétence développementale d’oocyte a été déterminée après incorporation dans un système de production in vitro. a Les pourcentages sont calculés sur les ovocytes de FIV. b Les pourcentages sont calculés sur les ovocytes fécondés. c Les pourcentages sont calculés sur les ovocytes clivés. * χ2 essai P<0,5. Ce tableau a été modifié à partir de Berlinguer et al.23
| groupe | [Ca++] mg/dL | N ovocyte | Activation parthénogénétique spontanée (%) | Ovocytes vitrifiés | Ovocytes survivants et FIV (%) | Clivage (%) | Sortie des blastocystes (%) |
| MTC/FCS | 9.9 | 80 | 33 (41.2)a | 150 | 124 (82,7)a | 40 (32,5)a | 2 (1,6)a |
| PBS/FCS | 4.4 | 82 | 29 (35.3)acre | 115 | 88 (76,5)a | 33 (37,5)ae | 1 (1.1)a |
| PBSCaMg gratuit/FCS | 2.2 | 86 | 11 (12.7)b | 126 | 115 (91.3)b | 74 (64,3)b | 12 (10.4)b |
| PBS/BSA | 3.2 | 83 | 21 (25.3)c | 110 | 90 (81,8)a | 18 (20)c) | 0 (0)a |
| PBSCaMg gratuit/BSA | 0.4 | 87 | 10 (11,5)b | 149 | 123 (82,5)a | 57 (46.3)de | 3 (2.4)b |
Tableau 2. Compétence développementale des ovocytes adultes mûris in vitro vitrifiés dans des milieux de vitrification (16,5% d’éthylène glycol + 16,5% de diméthylsulfoxyde) contenant différentes concentrations de calcium. Les taux de survie et de fécondation sont calculés sur des ovocytes vitrifiés; les taux de clivage total et de blastocyste sont calculés sur les ovocytes survivants. Les valeurs avec un indice différent dans la même colonne sont significativement différentes : χ2 test P<0,05. Ce tableau a été modifié à partir de Succu et al.10
| [Ca 2++] dans les milieux de vitrification | Non. Ovocytes | Taux de survie après la vitrification (%) | Taux de fécondation (%) | Clivage (%) | Sortie de blastocystes (%) |
| Élevé [9,9 mg/dl] | 190 | 161 (84.73) | 52/161 (32.29)a | 43/161 (26.7) | 0 |
| Faible [2,2 mg/dl] | 150 | 124 (82.66) | 55/124 (44,35)b | 41/124 (33.1) | 0 |
Tableau 3. Taux de fécondation et de développement après fécondation in vitro et culture d’ovocytes juvéniles vitrifiés/chauffés en utilisant une concentration élevée ([Ca 2++] = 9,9 mg/dl) et faible ([Ca 2++] = 2,2 mg/dl) dans les milieux de vitrification. Différentes lettres indiquent une différence statistique (un ≠ b P<0,05 χ2 test).
| Heures d’incubation post-réchauffement | Taux de clivage (n) | Production d’embryons (n) |
| 0 | 19,2 ± 3%a (82) | 0%a (17) |
| 2 | 41,8 ± 3%b (100) | 6,5 ± 1,3%b (42) |
| 4 | 50,7 ± 3%b (92) | 14,4 ± 1,3%c (48) |
| 6 | 26 ± 3%a (92) | 0%a (23) |
Tableau 4. Taux de clivage et production d’embryons dans les ovocytes adultes vitrifiés/réchauffés fécondés à différents moments de la culture post-réchauffement. Différentes lettres indiquent une différence statistique dans la même colonne : ANOVA P<0,01.
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Discussion
La cryoconservation des ovocytes chez les animaux domestiques peut non seulement permettre la conservation à long terme des ressources génétiques féminines, mais aussi faire progresser le développement des biotechnologies embryonnaires. Ainsi, le développement d’une méthode standard pour la vitrification des ovocytes profiterait à la fois au bétail et au secteur de la recherche. Dans ce protocole, une méthode complète pour la vitrification adulte d’oocyte de mouton est présentée et pourrait représenter un point de départ solide pour le développement d’un système efficace de vitrification pour l’ovocyte juvénile.
L’un des principaux avantages de la méthode proposée est qu’elle comprend toutes les étapes de la collecte des ovocytes, de la maturation in vitro, de la vitrification et du réchauffement. De plus, il comprend une période de culture post-réchauffement pour permettre aux ovocytes de se remettre des dommages subis lors de la procédure de vitrification avant d’être fécondés. Le moment optimal pour la fécondation doit être adapté en fonction de la méthode de cryoconservation, de la qualité initiale des ovocytes, de l’âge du patient et de l’espèce, étant essentiel pour prendre en compte à la fois les aspects de la récupération temporelle et du vieillissement des ovocytes25,26. Ainsi, le choix de la durée de la période d’incubation post-réchauffement est difficile et peut avoir un impact sur le résultat des programmes de vitrification des ovocytes. Sur la base des résultats obtenus en termes de taux de clivage et de production d’embryons, et dans les conditions décrites dans le protocole présenté, le moment optimal pour la fécondation des ovocytes adultes vitrifiés de moutons est après 4 heures d’incubation post-réchauffement (Tableau 4)6. Ces informations sont cruciales lors de la conception d’un programme de vitrification des ovocytes.
Ce protocole, cependant, tout en donnant des résultats acceptables en termes de production d’embryons à partir d’ovocytes adultes vitrifiés/réchauffés, conduit toujours à des embryons faibles à nuls s’il est appliqué aux ovocytes juvéniles. Plusieurs limitations structurelles et fonctionnelles nuisent à la compétence développementale prépubère des ovocytes, telles que la petite taille, le couplage défectueux entre les cellules cumulus et les ovocytes, la diminution de l’absorption des acides aminés, la réduction de la synthèse des protéines et du métabolisme énergétique 27,28,29. Dans une étude précédente, nous avons signalé que les ovocytes prépubéraux montrent une sensibilité élevée à la procédure de vitrification30. La faible compétence développementale démontrée après vitrification et réchauffement est probablement le résultat de dommages aux facteurs cytoplasmiques impliqués dans la réorganisation du cytosquelette et (ou) dans l’activation du facteur favorisant la maturation30. Comme le montre le tableau 1,la supplémentation du milieu de maturation en tréhalose, un cryoprotecteur non perméable, a pu augmenter les taux de survie après vitrification et réchauffement à des valeurs comparables à celles des ovocytes adultes4. De la même manière, l’utilisation d’une solution de vitrification à faible concentration de calcium augmente les taux de fécondation des ovocytes juvéniles après vitrification et réchauffement, comme le montre le tableau 3. Ainsi, tant l’optimisation sur les conditions de culture lors de la maturation in vitro que de la composition du milieu de vitrification peut aider à augmenter la qualité de l’ovocyte juvénile après vitrification et réchauffement. Les ovocytes juvéniles montrent une certaine capacité à récupérer des dommages induits par la procédure de vitrification, comme le montrent les figures 3,4 et 5.
Cependant, les taux élevés d’activation parthénogénétique spontanée au cours de la culture post-réchauffement limitent toujours leur potentiel de développement. L’éthylène glycol et le DMSO, qui sont des agents cryoprotecteurs couramment utilisés, peuvent activer artificiellement l’ovocyte avant la fécondation réelle, limitant ainsi le succès de la fécondation et le développement de l’embryon. Ils peuvent en effet provoquer une augmentation transitoire de la concentration intracellulaire deCa2+ 31,déclenchant ainsi une exocytose granulaire corticale, la formation de pronuclei, et la reprise méiotique32. En fait, la vitrification peut activer artificiellement l’ovocyte avant la fécondation réelle, limitant ainsi le succès de la fécondation et le développement de l’embryon. Le chélateur de calcium peut ainsi être employé pour limiter davantage la disponibilité de calcium pendant le processus de vitrification dans le but de limiter le taux d’activation spontanée dans les ovocytes juvéniles.
Il faut aussi considérer que, contrairement à la congélation lente, la vitrification est une technique exclusivement manuelle et qu’elle dépend donc de l’opérateur33,34. Ainsi, la disponibilité de personnel qualifié est un facteur clé du succès de cette méthode. Tout d’abord, l’opérateur doit sélectionner correctement les ovocytes à vitrifier. Après ivm, les ovocytes sont doucement dénudés des cellules cumulus et évalués sous un stéréomicroscope pour sélectionner pour la cryoconservation seulement ceux avec un cytoplasme uniforme, distribution homogène des gouttelettes lipidiques dans le cytoplasme et avec le diamètre externe d’environ 90 μm. De plus, seuls les ovocytes montrant l’extrusion sur le premier corps polaire, et donc au stade MII, doivent être sélectionnés.
L’évaluation morphologique des ovocytes doit être achevée en quelques minutes et étant dépendante de l’opérateur, elle est très sensible aux variations dans sa bonne mise en œuvre. Pour aider à normaliser la procédure de sélection, la méthode suggère de limiter le temps de culture pour la maturation in vitro à 22 h pour les ovocytes adultes. À ce stade, les ovocytes de moutons de haute qualité ont déjà terminé la première division méiotique22 et peuvent être sélectionnés pour la cryoconservation. De cette façon, l’élimination des ovocytes de mauvaise qualité, qui sont les plus lents dans l’achèvement de la première division méiotique, devrait être plus simple.
L’opérateur doit également respecter strictement le calendrier fixé pour la procédure de vitrification, de la première exposition au cryoprotecteur à l’immersion dans l’azote liquide. Une autre étape critique est la charge de l’ovocyte dans le dispositif de vitrification utilisé. La procédure doit utiliser des volumes d’échantillon minimaux pour augmenter la vitesse de refroidissement et aider les cellules à traverser rapidement la température de transition de phase, diminuant ainsi les cryo-blessures35. Cryotop utilise une bande de polypropylène fixée à un support. Dans cette méthode, les ovocytes de la solution de vitrification (<0,1 μL) sont rapidement chargés d’un capillaire en verre sur le dessus de la bande de film. Ensuite, la solution doit être retirée, laissant derrière elle une fine couche suffisante pour recouvrir les cellules à cryoconserver. Encore une fois, cette étape doit être complétée le plus rapidement possible pour limiter l’exposition des ovocytes aux concentrations élevées de cryoprotecteurs de la solution de vitrification, qui peuvent provoquer un choc osmotique et sont toxiques pour les cellules.
Pour ces raisons, un défi majeur associé à cette méthode est le besoin de manutention manuelle et de technicien qualifié. D’autres auteurs ont rapporté que le résultat de la vitrification des ovocytes semble influencé par un effet de « courbe d’apprentissage », car l’acquisition de compétences manuelles peut réduire de manière significative les dommages biologiques induits par la procédure de vitrification34. Les chercheurs devraient donc prendre en considération « l’effet opérateur » dans l’évaluation des résultats de la procédure de vitrification.
D’autres études se concentreront à la fois sur la normalisation de la procédure de sélection des ovocytes et sur une meilleure adaptation de la composition des milieux et des conditions de culture aux besoins des ovocytes juvéniles. À cet égard, l’utilisation du chélateur de calcium et des antioxydants peut offrir des occasions prometteuses. De même, l’optimisation du protocole permettra d’augmenter la compétence développementale des ovocytes adultes vitrifiés/réchauffés.
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Disclosures
Les auteurs déclarent qu’ils n’ont pas d’intérêts financiers concurrents.
Acknowledgments
Les auteurs n’ont reçu aucun financement spécifique pour ce travail. La professeure Maria Grazia Cappai et la Dre Valeria Pasciu sont reconnaissantes pour la voix off vidéo et pour la mise en place du laboratoire pendant la réalisation de la vidéo.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 2′,7′-Dichlorofluorescin diacetate | Sigma-Aldrich | D-6883 | |
| Albumin bovine fraction V, protease free | Sigma-Aldrich | A3059 | |
| Bisbenzimide H 33342 trihydrochloride (Hoechst 33342) | Sigma-Aldrich | 14533 | |
| Calcium chloride (CaCl2 2H20) | Sigma-Aldrich | C8106 | |
| Citric acid | Sigma-Aldrich | C2404 | |
| Confocal laser scanning microscope | Leica Microsystems GmbH,Wetzlar | TCS SP5 DMI 6000CS | |
| Cryotop Kitazato | Medical Biological Technologies | ||
| Cysteamine | Sigma-Aldrich | M9768 | |
| D- (-) Fructose | Sigma-Aldrich | F0127 | |
| D(+)Trehalose dehydrate | Sigma-Aldrich | T0167 | |
| Dimethyl sulfoxide (DMSO) | Sigma-Aldrich | D2438 | |
| Dulbecco Phosphate Buffered Saline | Sigma-Aldrich | D8537 | |
| Egg yolk | Sigma-Aldrich | P3556 | |
| Ethylene glycol (EG) | Sigma-Aldrich | 324558 | |
| FSH | Sigma-Aldrich | F4021 | |
| Glutamic Acid | Sigma-Aldrich | G5638 | |
| Glutaraldehyde | Sigma-Aldrich | G5882 | |
| Glycerol | Sigma-Aldrich | G5516 | |
| Glycine | Sigma-Aldrich | G8790 | |
| Heparin | Sigma-Aldrich | H4149 | |
| HEPES | Sigma-Aldrich | H4034 | |
| Hypoutarine | Sigma-Aldrich | H1384 | |
| Inverted microscope | Diaphot, Nikon | ||
| L-Alanine | Sigma-Aldrich | A3534 | |
| L-Arginine | Sigma-Aldrich | A3784 | |
| L-Asparagine | Sigma-Aldrich | A4284 | |
| L-Aspartic Acid | Sigma-Aldrich | A4534 | |
| L-Cysteine | Sigma-Aldrich | C7352 | |
| L-Cystine | Sigma-Aldrich | C8786 | |
| L-Glutamine | Sigma-Aldrich | G3126 | |
| LH | Sigma-Aldrich | L6420 | |
| L-Histidine | Sigma-Aldrich | H9511 | |
| L-Isoleucine | Sigma-Aldrich | I7383 | |
| L-Leucine | Sigma-Aldrich | L1512 | |
| L-Lysine | Sigma-Aldrich | L1137 | |
| L-Methionine | Sigma-Aldrich | M2893 | |
| L-Ornithine | Sigma-Aldrich | O6503 | |
| L-Phenylalanine | Sigma-Aldrich | P5030 | |
| L-Proline | Sigma-Aldrich | P4655 | |
| L-Serine | Sigma-Aldrich | S5511 | |
| L-Tyrosine | Sigma-Aldrich | T1020 | |
| L-Valine | Sigma-Aldrich | V6504 | |
| Magnesium chloride heptahydrate (MgSO4.7H2O) | Sigma-Aldrich | M2393 | |
| Makler Counting Chamber | Sefi-Medical Instruments ltd.Biosigma S.r.l. | ||
| Medium 199 | Sigma-Aldrich | M5017 | |
| Mineral oil | Sigma-Aldrich | M8410 | |
| MitoTracker Red CM-H2XRos | ThermoFisher | M7512 | |
| New born calf serum heat inactivated (FCS) | Sigma-Aldrich | N4762 | |
| Penicillin G sodium salt | Sigma-Aldrich | P3032 | |
| Phenol Red | Sigma-Aldrich | P3532 | |
| Polyvinyl alcohol (87-90% hydrolyzed, average mol wt 30,000-70,000) | Sigma-Aldrich | P8136 | |
| Potassium Chloride (KCl) | Sigma-Aldrich | P5405 | |
| Potassium phosphate monobasic (KH2PO4) | Sigma-Aldrich | P5655 | |
| Propidium iodide | Sigma-Aldrich | P4170 | |
| Sheep serum | Sigma-Aldrich | S2263 | |
| Sodium azide | Sigma-Aldrich | S2202 | |
| Sodium bicarbonate (NaHCO3) | Sigma-Aldrich | S5761 | |
| Sodium chloride (NaCl) | Sigma-Aldrich | S9888 | |
| Sodium dl-lactate solution syrup | Sigma-Aldrich | L4263 | |
| Sodium pyruvate | Sigma-Aldrich | P2256 | |
| Sperm Class Analyzer | Microptic S.L. | S.C.A. v 3.2.0 | |
| Statistical software Minitab 18.1 | 2017 Minitab | ||
| Stereo microscope | Olimpus | SZ61 | |
| Streptomycin sulfate | Sigma-Aldrich | S9137 | |
| Taurine | Sigma-Aldrich | T7146 | |
| TRIS | Sigma-Aldrich | 15,456-3 |
References
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