Summary
이 프로토콜은 성인 및 청소년 양 난모세포의 유리화를 위한 표준 방법을 제공하는 것을 목표로 합니다. 여기에는 시험관 내 성숙 미디어 준비부터 온난화 후 문화에 이르기까지 모든 단계가 포함됩니다. 난동체는 최소한의 필수 볼륨을 보장하기 위해 Cryotop을 사용하여 MII 단계에서 진동됩니다.
Abstract
가축에서는 도살장에서 쉽게 얻을 수 있는 많은 수의 난소와 난소 로 인해 체외 배아 생산 시스템을 개발하고 지속할 수 있다. 성인 난소는 항상 여러 개 항성 여포를 부담, 전 사춘기 기증자에서 난소의 최대 수는 4 주에 사용할 수 있습니다, 때 난소는 개소 여포의 피크 번호를 곰. 따라서, 4 주 된 양은 좋은 기증자로 간주됩니다, 프레우버탈 난모세포의 발달 능력이 성인 대응에 비해 낮은 경우에도.
기본 연구 및 상업 응용 프로그램은 성인 및 프레우버탈 기증자 모두에서 얻은 유리화 된 난초를 성공적으로 냉동 보존 할 수있는 가능성에 의해 증폭 될 것입니다. 프레우버탈 기증자로부터 수집된 난소세포의 병리화는 또한 생성 간격을 단축하고 따라서 사육 프로그램에서 유전 이득을 증가시키는 것을 허용할 것입니다. 그러나, 동결 보존 후 발달 잠재력의 손실은 포유류 난모세포를 아마 냉동 보존하는 가장 어려운 세포 유형 중 하나를 만든다. 사용 가능한 냉동 보존 기술 중, 유리화는 동물과 인간의 난모세포에 널리 적용됩니다. 기술의 최근 발전에도 불구하고, 냉동 보호제의 고농도에 노출뿐만 아니라 차가운 부상과 삼투압은 여전히 여러 구조적 및 분자 변화를 유도하고 포유류 난모세포의 발달 잠재력을 감소. 여기에서, 우리는 청소년과 성인 기증자에게서 집합되고 냉동 보존 의 앞에 시험관에서 성숙한 양 난모세포의 병신을 위한 프로토콜을 기술합니다. 이 프로토콜에는 시험외 성숙에서 부터 진동, 온난화 및 후 침습 기간에 이르는 모든 절차가 포함되어 있습니다. MII 단계에서 진동하는 난초는 실제로 온난화 에 따라 수정 될 수 있지만 냉동 보존 절차로 인한 손상을 복원하고 발달 잠재력을 높이기 위해 수정되기 전에 추가 시간이 필요합니다. 따라서, 온난화 후 문화 조건과 타이밍은 난모세포 발달 잠재력의 회복을위한 중요한 단계입니다, 특히 난모세포는 청소년 기증자로부터 수집 될 때.
Introduction
여성 게임테의 장기 저장은 유전적 선정 프로그램에 의한 국내 동물 사육 개선, 전시 야생동물 종 보존 프로그램을 통한 생물다양성 보존 에 기여하고, 생체외 배아 생산 또는 핵이식 프로그램1,2,3에통합될 저장된 난모세포의 가용성에 힘입어 체외 생명공학 연구 및 응용 프로그램을 강화하는 등 광범위한 응용 프로그램을 제공할 수 있다. 청소년 난소 성 유리화는 또한 사육 프로그램4에서생성 간격을 단축하여 유전 적 이득을 증가시킬 것이다. 난모세포의 초고속 냉각 및 온난화에 의한 진동은 현재 가축 난모세포 냉동 보존5에대한 표준 접근법으로 간주됩니다. 반추제에서는, 진동하기 전에, 난소는 일반적으로 아바토이르 유래 난소2로부터얻은 여포로부터 회수 한 후 시험관 내에서 성숙된다. 성인, 특히 프레우버탈 난소4,6은실제로 냉동 보존될 난귀의 거의 무제한 수를 공급할 수 있다.
가축에서, 오낭 성 진동 및 온난화 후, 배반물 수확량>10% 일반적으로 지난 10 년 동안 여러 실험실에 의해 보고 되었습니다3. 그러나, 작은 반추제 난미제에서 난막염 은 여전히 청소년과 성인 난소 모두에 대해 상대적으로 새로운 것으로 간주되며, 양 난미화물 진동에 대한 표준 방법은2,5로확립되어야 한다. 최근의 발전에도 불구하고, 유리화되고 따뜻해진 난소세포는 실제로 발달 잠재력을 제한하는 몇 가지 기능적 및 구조적 변화를 제시합니다7,8,9. 따라서, 생체화/온수 양 난모세포 2에서 10% 이상에서 발아세포 개발을 보고한 기사는 거의없다. 전술한 변경 사항을 줄이기 위해 여러 가지 접근법을 조사했습니다: 바이트로화 및 해동 용액의 조성을최적화(10·11); 다른 저온 장치의 사용을 실험8,12,13; 및 시험관 내 성숙(IVM)4,14, 15 및/또는온난화후 회복 시간 동안 6.
여기에서 우리는 청소년과 성인 기증자에게서 집합되고 냉동 보존 의 앞에 시험관에서 성숙한 양 난모세포의 병용 을 위한 프로토콜을 기술합니다. 이 프로토콜에는 시험외 성숙에서 부터 진동, 온난화 및 온난화 후 문화 기간에 이르는 모든 절차가 포함되어 있습니다.
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Protocol
동물 프로토콜 및 아래에 설명된 구현된 절차는 유럽 연합 지침 86/609/EC및 유럽 공동체 위원회 2007/526/EC의 권고에 따라 사사리 대학의 발효 윤리 지침에 따라 결정됩니다.
1. 오낭 조작을 위한 미디어 준비
- 덜벡코의 인산완충식식염을 0.1g/L 페니실린과 0.1g/L 연쇄상구균(PBS)으로 보충하여 수집된 난소의 수송을 위한 매체를 준비한다.
- 페니실린으로 보충된 밀리큐 물 1L1L로 파우더로 9.5g의 조직 배양 배지(TCM) 199를 희석하여 난피테 수집 및 성숙을 위한 배지를 준비합니다(0.1%) 연쇄상 구균(0.1%).
- 희석 후, 100mL의 매체를 필터링하고 1주일 동안 사용할 스톡 성숙 매체(SMM)로 4°C로 저장한다.
- 나머지 900mL를 25m HEPES, 0.36g/L 중탄산염, 0.1% (w/v) 폴리비닐 알코올(PVA) (pH 7.3, osmolality 290 mOsm/kg)로 보충하여 수집 매체(CM)를 준비한다.
- 0.021 g/L 중탄산염, 10% 열 처리에 필요한 에스트루스 양 세럼, 1 IU/mL FSH, IU/mL LH 1개, 시스증기인 100μL 및 피루바테 8 mg/mL로 보충된 SMM으로 성숙 배지를 준비한다.
참고: 10mL의 부피의 성숙 배지는 사용하기 전에 최소 4시간 동안 표준 조건(공기 중에서 39°C에서 최대 가습대기)에서 배양되어야 합니다. - Ca++ 및 Mg++없이 PBS로 구성된 체외 성숙 후 난미성 조작을 위한 기본 매체(BM)를 준비하여 20%의 태아 종아리 혈청(FCS)으로 보충한다.
2. 오키테 컬렉션 및 성숙
- 청소년 (30-40 일, 체중 6-10kg)과 성인 난소에서 난모를 복구하십시오.
- 27°C에서 PBS에서 1-2 h 이내에 있는 실험실로 상업용 도축장에서 수집된 난소를 수송한다.
- PBS 신선한 배지에서 세척한 후, 마이크로 블레이드를 사용하여 CM의 난소를 슬라이스하여 여포 함량을 방출합니다.
- 60배율의 입체현미경 검사에서, 과립세포의 4-10층, 분모세포, 세포질내 지질방울의 균일분포, 외경 90μm(평균)를 가진 분비제를 선택하여 체외 성숙을 위한 적수-oocyte 복합체(COC)를 선택한다.
- 선택한 COC를 CM에서 세 번 세척하고 마침내 성숙 배지로 옮겨드시다.
참고 : 청소년 난모세포의 경우, 진동 후 생존을 개선하기 위해, 100 μM trehalose와 성숙 배지를 보완합니다. - 체외 성숙의 경우, 30-35 COC를 4웰 페트리 접시에 성숙 배지 600 μL로 옮기고, 300 μL의 미네랄 오일로 덮여 있으며, 39°C에서 공기 중 5% CO2에서 22(성인 난미세포)/24(청소년 난우세포)를 배양한다.
- 체외 성숙 후, 부드럽게 파이펫팅하여 적혈구의 누드 COC. 60배율의 입체현미경하에서 검사를 받은 후, 첫 극지 체에서 압출을 보이는 사람만 선택하여, 따라서 지하 II(MII) 단계에서 유리화를 선택한다.
3. 정액 수집, 동결 및 해동 절차
- 램 익스텐더 (200 mM Tris; 70 mM 구연산; 55 mM 과당; pH 7.2, osmolality 300 mOsm/kg)로 구성된 정액 냉동 보존을위한 기본 매체를 준비 20 % (v / v)로 보충.
- 양 사육 시즌(10월~11월)에만 정액을 모으게 한다.
- 성인 램 (2-5 세)에서 인공 질에 의해 사정을 얻고, 야외 환경에서 유지 및 라이브 웨이트 유지 보수 배급을 공급. 램을 별도의 펜에 분리하지만 서로 시각적으로 접촉하십시오.
- 전체 번식 기 동안 일주일에 한 번 정액 수집을 반복하여 각 남성으로부터 적어도 8 개의 사정을 얻습니다.
- 정액 샘플을 수집 후 5분 이내에 환경 온도로 실험실로 운반하고 즉시 처리합니다. 2-3 램의 사정을 풀과 정자 농도 분광측정을 평가.
- 풀링 후, 400 x 106 spermatozoa/mL까지 사정을 희석시키는 정액 냉동 보존을 위한 기본 배지로 4% 글리세롤을 보충하였다. 그런 다음 희석된 정액을 2h의 기간 동안 4°C로 식히고 동결하기 전에 20분 동안 상량화합니다.
- 정액 샘플을 마른 얼음에 펠릿 형태(0.25 mL)로 동결한 다음 액체 질소로 떨어지게 합니다.
- 해동을 위해 펠릿을 멸균 유리 매에 넣고 39°C에서 20s의 수조에 넣습니다.
4. 체외 수정 및 배아 배양
- 합성 난관유체(SOF)의 체질에 대한 재고를 준비한다.
- 재고 A 준비: 밀리크 워터 99.4 mL; NaCl 6.29 g; KCl0.534 g; 0.161 g 의 KH2PO4; 0.182 g 의 MgSO4 ·7H2O; 및 나트륨 락테이트의 0.6 mL. 최대 3개월 동안 4°C로 보관하십시오.
- 재고 B 준비: 밀리크 워터 의 10 mL; 0.210 g 의 NaHCO3; 페놀 레드 2-3 g. 1 개월 동안 4 °C에서 보관하십시오.
- 재고 C 준비: 밀리크 워터 의 10 mL; 및 피루바테 나트륨 0.051 g. 1 개월 동안 4 °C에서 보관하십시오.
- 재고 D 준비: 밀리크 워터 10 mL; 및 CaCl2 2H 2O.의 0.262 g는 1 개월 동안 4 °C에서 보관하십시오.
- 밀리큐 물 7.630mL, 주식 A 1mL, 주식 B 1mL, 주식 C 0.07mL, 주식 D 0.7mL로 구성된 SOF 10mL을 준비하십시오.
- 체외 수정 (IVF) 매체 준비: SOF는 2 % 열 처리 에스트라스트 양 혈청, 10 μg / mL 헤파린 및 1 μg / mL hypoutarine (osmolality 280-290 mOsm / kg)로 보충합니다.
참고: 10mL의 부피의 IVF 배지는 표준 조건(5% CO 2, 5% O2 및 90%N2에서39°C에서 최대 가습된 대기)에서 적어도 4시간 이상 배양되어야 합니다.
- 온난한 IVF 배지의 1.5mL 이하의 멸균 유리 원추형 튜브에 냉동/해동 된 정액 알리쿼트를 전송하고 공기 중 5 % CO2에서 가습 된 분위기에서 39 °C에서 15 분 동안 배양하십시오.
- 잠복 후, 운동성 정자는 액체 기둥의 정액 부분을 향해 수영한다. 상단 층을 수집하고 정자 운동성 평가를 관찰합니다.
참고: 정자 운동성 매개 변수는 다음과 같은 설정과 컴퓨터 보조 정자 분석 (CASA) 시스템을 사용하여 평가되어야한다 : 25 프레임은 정자 트랙 중복을 피하기 위해 획득, 최소 대비 10, 평균 경로의 최소 속도 30 μm / s, 진보적 인 운동성은 80 % 직선 >. 이 시스템은 램 정자 평가를위한 특정 설정이 있습니다. 각 샘플에 대해, 정자 현탁액의 5 μL 하위 샘플은 10 μm의 깊이를 가진 미리 따뜻진 분석 챔버에 로드됩니다. 정자 운동성은 상 대비 현미경을 사용하여 40x에서 37°C에서 평가되며 서브샘플당 최소 500개의 정자를 적어도 4개의 상이다른 현미경 분야에서 분석해야 한다. 총 운동및 진보적인 운동성 정자의 백분율이 평가되었습니다. IVF의 경우, 진보적 인 운동성 정자의 비율은 30 %≥. - 1 x 106 spermatozoa/mL 최종 농도에서 수영 유래 모틸성 정자를 희석하고 4웰 페트리 접시에 미네랄 오일로 덮인 IVF 매체의 300 μL에서 MII 난소세포로 공동 배양합니다.
- 22h 후 SOF를 함유한 4웰 페트리 요리로 추정 된 zygotes를 0.4 % 소 세럼 알부민과16 산산에서 보고한 바와 같이 oviductal 농도에서 필수적이고 불필요한 필수 아미노산을 함유하고 있으며, 발아세포 단계까지 표준 조건하에서 배양합니다.
- 22-, 26- 및 32-h 에서, 60 배율와 스테레오 현미경의 밑에 검사에 의해, 두 개의 뚜렷한 blastomeres를 보여주는, 갈라진 난투의 수를 기록합니다.
- 배아를 매일 관찰하는 배아는 문화의 다섯 번째에서 9 일째까지 이고 새로 형성된 분폭제는 60배율을 가진 스테레오현미경의 밑에 검사에 의해 기록되어야 합니다.
5. 오키테 바이트로피화 및 온난화
참고: 장치극저온(17)을사용하여 최소 필수 볼륨(MEV) 방법에 따라 진동화를 수행합니다.
- BM에서 2 분 동안 38.5 °C에서 5 개의 난초의 그룹을 상형화합니다. BM의 사용은 낮은 칼슘 농도 보장 ([Ca2++]2.2 mg/dL)10.
- BM에서 7.5%(v/v) 디메틸 설산화물(DMSO) 및 7.5%(v/v) 에틸렌 글리콜(EG)을 함유한 평형 용액에 3분 노출을 통해 난미를 탈수한다.
- 난소는 16.5%(v/v) DMSO, 16.5%(v/v) EG 및 BM의 0.5M 트레할로스를 함유한 바이트화 용액으로 전송한 후 극저온 장치에 적재하고 30대 이내에 액체 질소로 직접 급락한다.
- 생물학적 온도로 따뜻해지기 위해 각 유리화 장치의 함량을 38.5°C에서 1분 동안 BM에서 1.25M 트레할로오스의 200 μL 방울로 옮기고 부드럽게 저어 혼합을 용이하게 합니다.
- 세포 내 냉동 보호제의 제거를 촉진하기 위해, 피낭을 단계별로 200 μL 방울로 옮기기 위해 감소하는 트레할로오스 용액(BM의 0.5M, 0.25 M, 0.125 M trehalose)으로 30s에서 38.5°C로 38.5°C로 평형화됩니다.
6. 온난화 후 난모세포 품질 평가
- 온난화 후, Ca++와 Mg++ 플러스 20% FCS (BM) 없이 PBS에서 6 h에 대 한 난모 를 배양 5% CO2 공기에서 38.5°C.
참고: 유리화 후 생물학적 및 구조적 특징을 복원하는 난모세포 능력은 사용된 난모세포의 종 과 클래스와 관련이 있습니다. - 냉동 보존 손상을 복구하는 난모세포 능력은 시간에 따라 달라지므로 온난화 후 체외 배양(0h, 2h, 4h, 6h)의 다른 시점에서 난낭의 품질을 평가하여 난소 비료를 위한 최적의 시간 창을 정의합니다.
참고 : 성인 양 oocyte에서 최적의 시간은 4 시간 후 온난화입니다. 프레우버탈 오피테의 경우, 최적의 시간은 2시간 후 온난화입니다.
7. 오사이클 생존 평가
- 온난화 직후와 온난화 후 문화의 각 시간 지점에 대해 100배 배율로 반전된 현미경을 사용하여 난미세포를 형태학적으로 평가합니다.
참고: 희미한 세포질, 손상 조나 펠루시다 및/또는 멤브레인과 같은 구조적 변경 기능이 있는 오사이클은 퇴화로 분류되어야 합니다. - 이중 차동 형광 염색을 사용하여 멤브레인 무결성 평가를 검증합니다.
- 38.5°C에서 5%의CO2에서 5분 동안 프로피듐 요오드(PI; 10 μg/mL) 및 Hoechst 33342(10 μg/mL)를 함유하는 BM의 2mL에 난모사이클을 배양한다.
- 신선한 BM에서 세 번 세척한 후, 350nm의 흥분 필터와 Hoechst 33342의 460 nm 의 방출을 사용하여 형광 현미경으로 난토를 관찰하고 535 nm의 발광 필터와 PI용 617 nm의 방출을 관찰하십시오.
참고: 그대로 막이 있는 난동은 Hoechst 33342를 가진 색깔DNA의 푸른 형광에 의해 인식될 수 있습니다. 손상된 막을 가진 Oocyte는 PI를 가진 DNA 염색 때문에 빨간 형광을 보여줍니다.
8. 공초점 레이저 스캐닝 현미경 검사에 의한 미토콘드리아 활성 및 ROS 세포내 수치 평가
- 미토트래커 레드 CM-H2XRos(MT-Red) 프로브를 준비합니다.
- 1mM 용액을 얻기 위해 1심(50 μg)의 함량을 DMSO 1mL로 희석한다. 희석된 유리알을 액체 질소에 보관하십시오.
- 100 μM 스톡 용액을 얻기 위해 DMSO로 용액 1m를 희석하고 어둠 속에서 -80 °C에 저장합니다.
- 준비 2′,7′-디클로로디하이드로플루오레세신 (H2DCF-DA) 프로브.
- H2DCF-DA를 0.1% 폴리비닐 피롤리돈(PVA)/PBS로 희석하여 최초 100mM 솔루션을 얻습니다. 용액을 -80 °C에서 어둠 속에서 유지하십시오.
- 첫 번째 용액을 0.1% PVA/PBS로 희석하여 100 μM 스톡 솔루션을 얻습니다. 어둠 속에서 -20 °C에 보관하십시오.
- 마운팅 매체(MM):10mLMM의 경우 글리세롤 5mL, PBS 5mL, 아지드 나트륨 250mg을 추가합니다. 사용할 때까지 -20 °C에 보관하십시오.
- 500 nM MT-레드 (스톡 용액 : DMSO에서 100 μM)와 BM에서 38.5 °C에서 30 분 동안 난모세포를 배양합니다.
- MT-Red 프로브를 사용하여 배양 한 후, BM에서 난모세포를 세 번 세척하고 5 μM H2DCF-DA (스톡 용액 : BM에서 100 μM)를 포함하는 동일한 매체에서 20 분 동안 배양하십시오.
- 프로브에 노출 된 후 BM에서 난모구를 씻고 2.5 % 글루타랄데히드 / PBS에서 적어도 15 분 동안 수정하십시오.
- 고정 후, BM에서 난모세포를 세 번 세척하고 샘플의 압축을 방지하기 위해 왁스 쿠션을 사용하여 1 mg / mL Hoechst 33342MM의 4 μL 드롭에 유리 슬라이드에 마운트.
- 평가될 때까지 어둠 속에서 4°C로 슬라이드를 저장합니다.
- 공초점 레이저 스캐닝 현미경으로 면역 라벨섹션의 분석을 수행합니다. 현미경은 40/60x 오일 목표를 사용하여 Ar/He/Ne 레이저를 장착하고 있습니다. 순차적으로 섹션을 분석합니다.
- 미토콘드리아 평가를 위해, MT-Red를 검출하기 위해 다광 레이저로 샘플을 관찰한다(노출: 579 nm; 방출: 599 nm).
- 488nm에서 아르곤 이온 레이저 광선과 B-2 A 필터(495nm 노출 및 519 nm 방출)를 사용하여 디클로로플루오레세신(DCF)18을지적한다.
- 각 개별 난수체에서 적도평면(19)에서MT-Red 및 DCF 형광 강도를 측정한다.
- 모든 이미지 수집 중 일정한 값에서 형광 강도와 관련된 매개변수를 유지(레이저 에너지 26%, 순차 설정 1: PMT1 이득 649-PMT2 gain 482; 순차설정 2: PMT1 이득 625-PMT2 이득 589; 오프셋 0; 핀홀 크기: 68).
- 라이카 LAS AF 라이트 이미지 분석 소프트웨어 패키지를 사용하여 형광 강도의 정량적 분석을 수행하며,20까지표준화된 절차에 따라.
- 적도 평면에 도달 할 때까지, Z 축에 이동, 한 번 사진을 캡처합니다.
- 각 사진에 대해 회색 스케일로 변환하고 채널 1(Hoechst blue과 관련된)을 끕니다. 그런 다음 수동으로 외딴 지역에 관심 영역(ROI)을 그립니다.
참고: 소프트웨어는 채널 2(FITC)의 픽셀 평균 값을 자동으로 읽을 수 있으며 배경 값을 빼는 것입니다. - 픽셀의 평균 값을 기록하고 통계 분석을 위해 제출합니다.
9. 통계 분석
- 다음과 같은 차이점을 분석합니다: 청소년 대 성인 난우낭의 생존율, 생존율 및 트레할로오스 처리된 청소년 난십세포의 생존율, 생존 및 파르테노유전학 활성화율 및 다른 칼슘 농도 미디어로 진동하는 성인 난소세포의 발달 능력, 저칼슘 농도 또는 높은 칼슘 농도로 진동된 청소년 난소 세포에서의 배아 생산, 활성 미토콘세포 피트리아제 치아 정사각형 검사를 사용하여 성인과 청소년 유리화 난수세포 사이의 온난화 후 문화와 파르테노 유전 활성화 비율의 다른 시간 지점.
- 레븐의 시험에 의한 분산의 균질성을 분석한 후 ANOVA에 의한 온난화 후 문화의 다른 시간 지점에서 미토콘드리아 활성 및 ROS 내 세포 내 수의 다른 시간 지점에서 진동성 성인 난소세포에서 골짜기 속도와 배아 출력을 분석한다. 투키 후 테스트를 사용하여 그룹 간의 차이점을 강조표시합니다.
- 통계 소프트웨어 프로그램을 사용하여 통계 분석을 수행하고 P < 0.05의 확률을 최소 유의 수준으로 간주합니다. 모든 결과는 s.E.M ± 의미로 표현됩니다.
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Representative Results
청소년 기증자의 난소 세포의 극온성은 성인 기증자에 비해 낮습니다. 관찰된 첫 번째 효과는 성인 난모세포에 비해 온난화 후 생존율이 낮습니다(도1A;θ 2 시험 P<0.001). 청소년 난모세포는 온난화 후 멤브레인 무결성이 낮은 것으로나타났다(그림 1B). 성숙 배지에서 트레할로오스를 사용하는 것은 이 설탕이 청소년 난모세포에서 저온 부상을 줄일 수 있는지 여부를 확인하기 위한 것이었습니다. 이 데이터는23년 동안 트레할로오스 보충을 통해 24시간 동안 숙성된 난모세포가 비처리군에 비해 진동/온난화 후 생존율이 더 높은 것으로나타났다(표 1: 85.7% vs 75.3%, θ2 시험 P<0.05). Trehalose 보충 실제로 온난화 후 높은 막 무결성과 관련 된(그림 2A). 따라서, 청소년 난모세포의 체외 성숙 시 트레할로오스의 사용은 시험신후 생존율을 증가(85.7%) 성인값(90.3%)에 필적할 만한 값입니다. 그러나, 골짜기, 수정 및 청소년 난모세포의 발달 속도는 트레할로오스 보충에 의해 증가되지 않았다(표 1).
병기 후 난소 능력을 향상시키기 위해 우리는 9.9에서 0.4 mg / dL10에이르는 칼슘 농도와 다른 유리화 매체성인 오비소 난모세포에서 테스트. 얻어진 결과는 2.2 mg/dL에 해당하는 칼슘 농도를 가진 매체의 사용이 온난화 후 생존율 증가, 발달 능력 향상 및 성인 oocyte10 (표 2)의감소된 파르테노유전적 활성화를 보여주었다. 따라서 우리는 청소년 난모세포의 유리화에 대한 낮은 칼슘 유리화 매체를 테스트했습니다. 표 3에나타난 바와 같이, 칼슘 농도가 낮은 발상화된 청소년 난우낭은 높은 칼슘 농도로 진동하는 난우세포에 비해 더 높은 수정률을 보였다(각각 44.35% 대 32.29%). P<0.05), 그러나 태아 생산에서 아무 다름도 발견되지 않았습니다.
유리화/ 온난소는 냉동 보존 절차로 인한 손상을 복원하고 발달 잠재력을 높이기 위해 수정되기 전에 추가 시간이 필요합니다. 이전 연구는 실제로 ATP 세포 내 농도, 미토콘드리아 활성 및 체외 발달 능력이 생체화 / 해동 된 난초에서 감소되어 높은 세포 내 ROS 농도6을보여줍니다. 이러한 변경 사항은 특히 온난화 직후에 표시됩니다. 온난화 후 문화 동안 성인과 청소년 난모세포는 진동 절차6,24동안 입은 손해로부터 부분적으로 회복 할 수 있습니다. 서로 다른 지속시간(0, 2, 4, 6h)의 온난화 후 문화를 비교하여, 성인 의에너지 로부터 수집된 배양 난모세포의 4시간 후에 는 정력적 균형6과 미세관설정(24)을 회복하고 더 높은 분열(50.7 ± 3.9%)으로 발달 능력을 회복할 수 있음을 보여주었습니다. P< 0.01 ANOVA) 및 배반성 비율 (14.40 ± 1.3 %; ANOVA P< 0.01) 다른 시간 포인트에 비해 (0, 2 및 6 시간; 표 4). 따라서, 온난화 후 문화의 4h는 유리화/온난한 성인 난모세포의 수정을 위한 이상적인 시간 창을 나타낸다6.
청소년 기증자로부터 수집 된 난모 세포와 동일한 실험이 반복되었을 때, 이러한 결과는 부분적으로 확인되었다. 미토콘드리아 활성은 다른 시간 점에 비해 온난화 후 문화의 4 시간 후 유리화/ 온난연한 청소년 난모세포에서 더 높았다(0, 2, 6; 그림 3: ANOVA P<0.01). 미토콘드리아 분포의 여러 패턴은 관찰되고 다음 세 그룹으로 분류됩니다(21에 의해보고됨): 패턴 A : 세포질 전체에 퍼지는 작은 과립과 균질한 FINE; 패턴 B: 세포질 전체에 퍼지는 큰 과립을 가진 균일한 과립; 패턴 C: 특히 큰 과립이 존재했을 때 이질적인 클러스터ED가 존재하거나 세포질 전체에 퍼져 있거나 특정 세포질 도메인에 위치합니다. MII에서 활성 미토콘드리아의 세포질 분포내의 상이한 표현형은 난소세포 발달 능력과 관련이 있을 수 있다. 미세균성 분포는 발달 능력이 떨어지는 지표이며, 세분화및 클러스터ED 분포는 미토콘드리아 활성증가와 관련이 있으며, 결과적으로 발달 능력이높다(22). 미토콘드리아 분포 패턴은 온난화 후 문화의 6 시간 동안 변경되었습니다. 도 4는 미토콘드리아 분포의 다른 패턴과 온난화 후 문화 동안의 변동을 갖는 청소년 난모세포의 예를 보여줍니다. 패턴 A는 장기간 인큐베이션 동안 크게 증가하고 6h 후 온난화(도 4Aa: 2 P<0.05)에서 더 높은 값에 도달, 패턴 B는 온난화 후 문화 동안 큰 변화를 보여주지 않았다(도 4Bb),패턴 C는 장기간 인큐베이션 동안 어떤 청소년 유리화 / 온온 oocyte에서 발견되지 않았다(그림 4cc:Pθ :< Pθ.05).
더욱이, 로스 내 세포 수준은 0, 4 및 6 h에 비해 온난화 후 문화의 2 h에서 청소년 난모세포에서 현저하게 낮았다(그림 5: ANOVA P<0.001). 그러나, 성인 난모세포에서 발견된 것과는 대조적으로, 자발적인 파르테노유전학 활성화의 비율은 청소년 난모세포에서 온난화 후 문화 동안 증가하였다(도6). 이러한 이유로, 청소년 난모세포에서 수정에 대 한 권장된 시간 포인트 될 것 이다 2 시간 후 온난화 문화.
그림 1. 청소년 및 성인 기증자로부터 수집 된 유리화 / 온난 오비오비알 난모세포의 생존율. (A) 오시테는 체외 성숙 후 진동하였다. 생존율은 공형요요오드(10μg/mL)와 Hoechst 33342(10 μg/mL)로 형광 염색에 의해 진동 및 온난화 후에 결정되었다. N = 165 성인 난모세포와 170 청소년 난모세포. 다른 문자는 성인과 청소년 난모세포 사이의 상당한 차이를 나타냅니다 :θ 2 테스트 P<0.001. (B-C) 형태학적 평가에서 손상 (B) 및 손상된 플라즈마 멤브레인 (C)을 가진 유리화 / 온난수 의 예 (100 배율의 반전 현미경). 스케일 바 = 10 μm. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
그림 2. 청소년 오비소 난모세포 생존율및 체외 발달 능력 (TRH)와 (CTR) 트레할로오스 (성숙 배지에서 100 mMM)를 성숙 후. (A-B) 형태학적 평가(100x 배율의 반전 현미경)에서 트레할로오스없이 또는 (B)를 가진 또는 (B)를 가진 또는(B)에서체외 성숙 후 생체화한 청소년 난모세포의 예. 스케일 바 = 30 μm. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
그림 3. 시험관 내 후 배양 시 다른 시점(0, 2, 4, 6)에서 생체내분동 강도의 정량화. IVM 난모세포는 대조군(CTR N = 77)으로 사용되었다. 총 163 (0 h N = 45; 2 h N = 39; 4 h N = 40; 6 h N = 39) 청소년 oocytes는 3 개의 독립적 인 실험에서 유리화되고 따뜻했다. 문자가 다른 문자는 통계적으로 유의한 차이점을 나타냅니다(ANOVA P = 0.0000). 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
그림 4. 시험관 내 후 6시간 동안 생체/온난미 의 미토콘드리아 패턴 분포. 정밀(A), 세분화(B) 및 클러스터(C) 미토콘드리아 분포의 대표적인 이미지로, 유리화/온난한 청소년 난모세포에서. (D) 미세미토콘드리아 분포를 나타내는 청소년 유리화/온난모세포의 백분율; (E) 과립 미토콘드리아 분포를 나타내는 청소년 유리화/온난모세포의 백분율; (F) 클러스터된 미토콘드리아 분포를 보여주는 청소년 바이트로/온난소의 백분율. IVM 청소년 난모세포는 제어로 사용되었다 (CTR; N = 77). 총 163 (0 h N = 45; 2 h N = 39; 4 h N = 40; 6 h N = 39) 청소년 oocytes는 3 개의 독립적 인 실험에서 진동및 따뜻하게 사용되었다. 다른 문자는 통계적으로 유의한 차이를 나타냅니다 (Aa:2 P = 0.026; Bb:θ 2 P = 0.097; Cc: θ2 P = 0.014). 스케일 바 = 30 μm. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
그림 5. 체외 문화에서 6 시간 동안 생체 내 의 생체 내 온수 성 온수량 에서 세포 내 ROS 형광 강도의 정량화. (A-B) 시험관 내 로트형광 강도의 대표적인 이미지(A) 및 생체내(B) 청소년 난모세포. (C)다른 시점에서 진동된 청소년 oocytes에서 형광 강도의 정량화에 의해 결정된 바와 같이 ROS의 세포내 수준(0 h N=45; 2h N=39; 4h N=40; 6 h N=39) 온난화 후 체외 배양 시. 시험관 내 숙성 된 청소년 난모세포는 대조군으로 사용되었다 (CTR N = 77). 문자가 다른 문자는 통계적으로 유의한 차이점을 나타냅니다(ANOVA P = 0.0000). 스케일 바 = 50 μm. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
그림 6. 시험관 내 후 6 시간 동안 유리화 된 청소년 및 성인 난모세포에서 parthenogenetic 활성화. (A-B)난소세포 파르테노유전학 활성화의 대표적인 이미지:(A)메타상 II-텔로위상 II 전이 및(B)프로핵 형성에서 오사이클. (C)체외 배양 시 상이한 시점(0, 2, 4, 6h)에서 파르테노유전학 활성화 성인 및 청소년 난모세포의 백분율. 별표는 인큐베이션의 각 시점 (ANOVA P = 0.000)의 각 시점에서 청소년과 성인 난모세포 사이의 통계적 차이를 나타냅니다. 이 그림은 세라 등에서 수정되었습니다.24 스케일 바 = 50 μm. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
| 난피 (n) | 생존율(%) | IVF (n) | 수정된a(%) | 클리브b (%) | 보폭성c (%) | |
| 클릭률 | 73 | 75.3* | 452 | 91.1 | 96.1 | 14.3 |
| TRH | 77 | 85.7 | 470 | 92.5 | 95.4 | 13 |
| * 치 스퀘어 테스트 p<0.5 | ||||||
| 백분율은 IVF 난모세포에 계산됩니다. | ||||||
| b 백분율은 수정된 난모세포에 계산됩니다 | ||||||
| c 백분율은 갈라진 난모세포에서 계산됩니다. | ||||||
표 1. 어린 오바인은 트레할로오스와 진동과 함께 성숙 한 후 생존율과 체외 발달 능력을 수분합니다. TRH = 트레할로스 보충 (성숙 배지에서 100 mMM)으로 성숙 된 청소년 난모세포. CTR = 트레할로스 보충 없이 숙성된 조절 청소년 난모세포. 생존율은 유리화/온난한 난우세포의 프로피듐 요오드(10 μg/mL)와 Hoechst 33342(10 μg/mL)로 형광 염색 후 결정되었다. 오키테 발달 능력은 체외 생산 시스템에 통합 된 후 결정되었다. a 백분율은 IVF 난모세포에 계산됩니다. b 백분율은 수정된 난모세포에 계산됩니다. c 백분율은 갈라진 난모세포에서 계산됩니다. *2 테스트 P<0.5. 이 표는 베를린게르등에서 수정되었습니다. 23
| 그룹 | [Ca++]mg/dL | N 오사이클 | 자발적인 파르테노유전학 활성화(%) | 유리화된 오신구 | 생존 및 IVF 난모세포 (%) | 분열 (%) | 배반성 구균 출력 (%) |
| TCM/FCS | 9.9 | 80 | 33 (41.2) | 150 | 124 (82.7) | 40 (32.5) | 2 (1.6) |
| PBS/FCS | 4.4 | 82 | 29 (35.3)ac | 115 | 88 (76.5) | 33 (37.5)ae | 1 (1.1) |
| PBSCaMg 무료/FCS | 2.2 | 86 | 11 (12.7)b | 126 | 115 (91.3)b | 74 (64.3)b | 12 (10.4)b |
| PBS/BSA | 3.2 | 83 | 21 (25.3)c | 110 | 90 (81.8) | 18 (20)c | 0 (0)a |
| PBSCaMg 무료/BSA | 0.4 | 87 | 10 (11.5)b | 149 | 123 (82.5) | 57 (46.3)드 | 3 (2.4)b |
표 2. 다른 칼슘 농도를 함유한 생체외 성숙성 성난미의 발달 능력은 상생화 매체(16.5% 에틸렌 글리콜 + 16.5% 디메틸 설프리산화물)에서 진동한다. 생존 및 수정 속도는 유리화 된 난모세포에 계산됩니다. 총 분열 및 배반성 비율은 살아남은 난모세포에 계산됩니다. 동일한 열 내에 서로 다른 하위 스크립트가 있는 값은 크게 다릅니다:θ 2 테스트 P<0.05. 이 표는 수쿠 등에서수정되었습니다. 10
| [Ca 2++]유리화 매체 | 아니요. 오사이클 | 진동 후 생존율(%) | 수정율(%) | 분열 (%) | 배반성 출력(%) |
| 높은 [9.9 mg/dL] | 190 | 161 (84.73) | 52/161 (32.29) | 43/161 (26.7) | 0 |
| 낮음 [2.2 mg/dL] | 150 | 124 (82.66) | 55/124 (44.35)b | 41/124 (33.1) | 0 |
표 3. 체외 수정 및 생체 내 고생/온난한 청소년 난미세포의 배양 후 의 풍부화 및 개발 속도 높은 ([Ca 2+] = 9.9 mg/dL) 및 낮은 ([Ca 2+] = 2.2 mg/dL) 진동 매체에서 칼슘 농도. 다른 문자는 통계적 차이를 나타냅니다 (≠ b p<0.05 θ2 테스트).
| 온난화 후 인큐베이션 시간 | 골짜기 속도(n) | 배아 출력(n) |
| 0 | 19.2 ± 3%a (82) | 0%a (17) |
| 2 | 41.8 ± 3%b (100) | 6.5 ± 1.3%b (42) |
| 4 | 50.7 ± 3%b (92) | 14.4 ± 1.3%c (48) |
| 6 | 26 ± 3%a (92) | 0%a (23) |
표 4. 진동/온난성 성수기의 골짜기 속도와 배아 출력은 온난화 후 문화의 다른 시점에서 수정됩니다. 다른 문자는 동일한 열 내에서 통계적 차이를 나타냅니다: ANOVA P<0.01.
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Discussion
가축의 오키테 냉동 보존은 여성 유전 자원의 장기적인 보존뿐만 아니라 배아 생명 공학의 개발을 진전시킬 수 있습니다. 따라서, 난소 진동을 위한 표준 방법의 개발은 가축과 연구 분야 모두에 유리할 것이다. 이 프로토콜에서는 성인 양 난소 진동을 위한 완전한 방법이 제시되고 청소년 oocyte에 대한 효율적인 유리화 시스템의 개발을 위한 견고한 출발점을 나타낼 수 있습니다.
제안 된 방법의 주요 장점 중 하나는 난모세포 수집, 시험관 성숙, 진동 및 온난화의 모든 단계를 포함한다는 것입니다. 또한, 난모세포가 수정되기 전에 진동 절차 중에 발생한 손해로부터 회수할 수 있도록 온난화 후 문화 기간을 포함한다. 수정을 위한 최적의 시간은 저온 보존, 초기 난소세포 질, 환자 연령 및 종의 방법에 따라 조정되어야 하며, 시간 회복과 난소 세포 노화의 양상을 고려하는 데 필수적이다25,26. 따라서, 온난화 후 잠복기의 기간을 선택하는 것은 도전적이며 난모세포 진동 프로그램의 결과에 영향을 미칠 수 있습니다. 골짜기 비율 및 배아 출력의 관점에서 얻은 결과에 기초하여, 제시된 프로토콜에 기재된 조건하에서, 유리화된 성인 양 난모세포의 수정을 위한 최적의 시간은 4시간 후인큐베이션(표4)6이다. 이 정보는 oocyte 바이트로피화 프로그램을 설계할 때 매우 중요합니다.
그러나 이 프로토콜은 유리화/온난성 성상 난모세포에서 배아 출력 측면에서 허용 가능한 결과를 제공하면서, 여전히 청소년 난모세포에 적용하는 경우 0배아로 낮게 이어집니다. 몇몇 구조적 및 기능적 한계는 작은 크기, 적혈구 와 난미세포 사이의 불량 커플링, 아미노산 섭취 감소, 단백질 합성 감소 및 에너지 대사 27,28,29와같은 prepubertal oocyte 발달 능력을 손상시니다. 이전 연구에서 우리는 예비 난모세포가 유리화 절차(30)에높은 감도를 보여 보고 . 진동 및 온난화 후 나타난 낮은 발달 능력은 아마도 세포 골격의 재구성과 (또는) 성숙 촉진 요인의 활성화에 관여하는 세포질 요인에 대한 손상의결과입니다.30. 표 1에도시된 바와 같이, 비투과성 극저온보호제인 트레할로오스를 가진 성숙 배지의 보충제는, 성인 난모세포의 것과 비교할 수 있는 값에 대한 진동및 온난화 후 생존율을 증가시킬 수 있었다4. 같은 방법으로, 칼슘 농도가 낮은 유리화 용액의 사용은 표 3에도시된 바와 같이 진동및 온난화 후 청소년 난모세포의 수정속도를 증가시킨다. 따라서, 시험내 성숙 과 생체화 미디어 조성 시 문화 조건에 대한 최적화는 모두 시험화 및 온난화 후 청소년 난종의 질을 높이는 데 도움이 될 수 있다. 청소년 난모세포는 도 3,4 및 5에도시된 바와 같이 진동 절차에 의해 유도된 손해로부터 회복할 수 있는 능력을 보여준다.
그러나, 온난화 후 문화 동안 자발적인 parthenogenetic 활성화의 높은 비율은 아직도 그들의 발달 잠재력을 제한합니다. 일반적으로 사용되는 냉동 보호제인 에틸렌 글리콜 및 DMSO는 실제 수정 전에 난소체를 인위적으로 활성화하여 수정 성공 및 배아 발달을 제한할 수 있습니다. 그(것)들은 실제로 세포내 Ca2+ 농도31에있는 일시적인 증가를 일으키는 원인이 될 수 있고, 따라서 피질 과립 외세포증, pronuclei 형성 및 메이오스틱 재개32를트리거합니다. 실제로, 유리화는 실제 수정 전에 인위적으로 난소세포를 활성화하여 수정 성공 및 배아 발달을 제한할 수 있다. 따라서 칼슘 첼레이터는 청소년 난모세포에서 자발적인 활성화 속도를 제한하기 위해 유리화 과정에서 칼슘 가용성을 더욱 제한하는 데 사용될 수 있습니다.
또한 느린 동결과는 달리, 유리화는 독점적으로 수동 기술이며 따라서 운영자 의존33,34것을고려해야한다. 따라서 숙련된 인력의 가용성은 이 방법의 성공을 위한 핵심 요소입니다. 우선, 연산자는 진동할 난모세포를 올바르게 선택해야 합니다. IVM 후, 난모세포는 부드럽게 적혈구의 탈모하고 균일한 세포질, 세포질에 있는 지질 방울의 균일한 분포및 약 90 μm의 외성 분포를 가진 사람들만 저온 보존을 위해 선택하기 위하여 고정체 현미경으로 평가됩니다. 더욱이, 제1극체의 압출을 보여주는 난모세포만 선택되어야 한다.
난모세포의 형태학적 평가는 몇 분 안에 완료되어야 하며 연산자 의존성일 수 있으므로 적절한 구현의 변형에 매우 민감합니다. 선택 절차를 표준화하는 데 도움이 되는 방법은 체외 성숙을 위한 문화 시간을 성인 난모에 대해 22시간으로 제한하는 것을 제안합니다. 이 시점에서, 높은 품질의 양 난모세포는 이미 첫 번째 메이오틱 부문(22)을 완료하고 냉동 보존을 위해 선택 될 수있다. 이렇게 하면 첫 번째 메이오틱 부문이 완성된 가장 느린 품질의 난모세포 제거가 더 간단해야 합니다.
작업자는 또한 극저온 보호제에 대한 첫 번째 노출부터 액체 질소침에 이르기까지 진동 절차에 설정된 타이밍을 엄격히 준수해야 합니다. 또 다른 중요한 단계는 사용되는 유리화 장치에 난모세포의 하중입니다. 이 절차는 최소 샘플 부피를 사용하여 냉각 속도를 높이고 세포가 위상 전이 온도를 빠르게 통과할 수 있도록 하여극저온상해(35)를감소시켜야 한다. 극저온은 홀더에 부착된 폴리프로필렌 스트립을 사용합니다. 이 방법에서, 유리화 용액(<0.1 μL)의 난모세포는 필름 스트립 위에 유리 모세관으로 빠르게 적재된다. 그런 다음 용액을 제거해야 하며, 극저온 보존될 세포를 덮을 수 있을 충분한 얇은 층을 남겨두어야 합니다. 다시 한번, 이 단계는 삼투성 충격을 유발하고 세포에 유독한 유리화 용액의 높은 극저온 보호제 농도에 난귀세포의 노출을 제한하기 위해 가능한 한 빨리 완료되어야 합니다.
이러한 이유로 이 방법과 관련된 주요 과제는 수동 취급 및 숙련된 기술자의 필요성입니다. 다른 저자들은 수동 기술의 획득이 유리화절차(34)에의해 유도되는 생물학적 손상을 현저히 감소시킬 수 있기 때문에 오사이클 바이트 진동 결과가 "학습 곡선" 효과에 의해 영향을 받는 것으로 나타났다고 보고했다. 따라서 연구원은 유리화 절차의 결과의 평가에 있는 "연산자 효력"을 고려해야 합니다.
추가 연구는 난모세포 선택 절차의 표준화와 청소년 난모세포의 요구에 미디어 구성 및 문화 조건을 더 잘 조정하는 데 초점을 맞출 것입니다. 이와 관련하여 칼슘 첼라토르와 항산화제의 사용은 모두 유망한 기회를 제공할 수 있습니다. 마찬가지로, 프로토콜의 최적화는 유리화 / 온난성 난모세포의 발달 능력을 증가 시킬 수 있습니다.
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Disclosures
저자는 경쟁적인 재정적 이익이 없다고 선언합니다.
Acknowledgments
저자는이 작품에 대한 구체적인 자금을받지 못했습니다. 마리아 그라치아 카파이 교수와 발레리아 파시우 박사는 비디오 보이스오버와 비디오 제작 중 실험실 을 설립한 것에 대해 감사하게 인정받고 있습니다.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 2′,7′-Dichlorofluorescin diacetate | Sigma-Aldrich | D-6883 | |
| Albumin bovine fraction V, protease free | Sigma-Aldrich | A3059 | |
| Bisbenzimide H 33342 trihydrochloride (Hoechst 33342) | Sigma-Aldrich | 14533 | |
| Calcium chloride (CaCl2 2H20) | Sigma-Aldrich | C8106 | |
| Citric acid | Sigma-Aldrich | C2404 | |
| Confocal laser scanning microscope | Leica Microsystems GmbH,Wetzlar | TCS SP5 DMI 6000CS | |
| Cryotop Kitazato | Medical Biological Technologies | ||
| Cysteamine | Sigma-Aldrich | M9768 | |
| D- (-) Fructose | Sigma-Aldrich | F0127 | |
| D(+)Trehalose dehydrate | Sigma-Aldrich | T0167 | |
| Dimethyl sulfoxide (DMSO) | Sigma-Aldrich | D2438 | |
| Dulbecco Phosphate Buffered Saline | Sigma-Aldrich | D8537 | |
| Egg yolk | Sigma-Aldrich | P3556 | |
| Ethylene glycol (EG) | Sigma-Aldrich | 324558 | |
| FSH | Sigma-Aldrich | F4021 | |
| Glutamic Acid | Sigma-Aldrich | G5638 | |
| Glutaraldehyde | Sigma-Aldrich | G5882 | |
| Glycerol | Sigma-Aldrich | G5516 | |
| Glycine | Sigma-Aldrich | G8790 | |
| Heparin | Sigma-Aldrich | H4149 | |
| HEPES | Sigma-Aldrich | H4034 | |
| Hypoutarine | Sigma-Aldrich | H1384 | |
| Inverted microscope | Diaphot, Nikon | ||
| L-Alanine | Sigma-Aldrich | A3534 | |
| L-Arginine | Sigma-Aldrich | A3784 | |
| L-Asparagine | Sigma-Aldrich | A4284 | |
| L-Aspartic Acid | Sigma-Aldrich | A4534 | |
| L-Cysteine | Sigma-Aldrich | C7352 | |
| L-Cystine | Sigma-Aldrich | C8786 | |
| L-Glutamine | Sigma-Aldrich | G3126 | |
| LH | Sigma-Aldrich | L6420 | |
| L-Histidine | Sigma-Aldrich | H9511 | |
| L-Isoleucine | Sigma-Aldrich | I7383 | |
| L-Leucine | Sigma-Aldrich | L1512 | |
| L-Lysine | Sigma-Aldrich | L1137 | |
| L-Methionine | Sigma-Aldrich | M2893 | |
| L-Ornithine | Sigma-Aldrich | O6503 | |
| L-Phenylalanine | Sigma-Aldrich | P5030 | |
| L-Proline | Sigma-Aldrich | P4655 | |
| L-Serine | Sigma-Aldrich | S5511 | |
| L-Tyrosine | Sigma-Aldrich | T1020 | |
| L-Valine | Sigma-Aldrich | V6504 | |
| Magnesium chloride heptahydrate (MgSO4.7H2O) | Sigma-Aldrich | M2393 | |
| Makler Counting Chamber | Sefi-Medical Instruments ltd.Biosigma S.r.l. | ||
| Medium 199 | Sigma-Aldrich | M5017 | |
| Mineral oil | Sigma-Aldrich | M8410 | |
| MitoTracker Red CM-H2XRos | ThermoFisher | M7512 | |
| New born calf serum heat inactivated (FCS) | Sigma-Aldrich | N4762 | |
| Penicillin G sodium salt | Sigma-Aldrich | P3032 | |
| Phenol Red | Sigma-Aldrich | P3532 | |
| Polyvinyl alcohol (87-90% hydrolyzed, average mol wt 30,000-70,000) | Sigma-Aldrich | P8136 | |
| Potassium Chloride (KCl) | Sigma-Aldrich | P5405 | |
| Potassium phosphate monobasic (KH2PO4) | Sigma-Aldrich | P5655 | |
| Propidium iodide | Sigma-Aldrich | P4170 | |
| Sheep serum | Sigma-Aldrich | S2263 | |
| Sodium azide | Sigma-Aldrich | S2202 | |
| Sodium bicarbonate (NaHCO3) | Sigma-Aldrich | S5761 | |
| Sodium chloride (NaCl) | Sigma-Aldrich | S9888 | |
| Sodium dl-lactate solution syrup | Sigma-Aldrich | L4263 | |
| Sodium pyruvate | Sigma-Aldrich | P2256 | |
| Sperm Class Analyzer | Microptic S.L. | S.C.A. v 3.2.0 | |
| Statistical software Minitab 18.1 | 2017 Minitab | ||
| Stereo microscope | Olimpus | SZ61 | |
| Streptomycin sulfate | Sigma-Aldrich | S9137 | |
| Taurine | Sigma-Aldrich | T7146 | |
| TRIS | Sigma-Aldrich | 15,456-3 |
References
- Arav, A.
- Mullen, S. F., Fahy, G. M. A chronologic review of mature oocyte vitrification research in cattle, pigs, and sheep. Theriogenology. 78 (8), 1709-1719 (2012).
- Hwang, I. S., Hochi, S. Recent progress in cryopreservation of bovine oocytes. BioMed Research International. 2014, (2014).
- Berlinguer, F., et al. Effects of trehalose co-incubation on in vitro matured prepubertal ovine oocyte vitrification. Cryobiology. 55 (1), (2007).
- Quan, G., Wu, G., Hong, Q. Oocyte Cryopreservation Based in Sheep: The Current Status and Future Perspective. Biopreservation and Biobanking. 15 (6), 535-547 (2017).
- Succu, S., et al. A recovery time after warming restores mitochondrial function and improves developmental competence of vitrified ovine oocytes. Theriogenology. 110, (2018).
- Succu, S., et al. Vitrification of in vitro matured ovine oocytes affects in vitro pre-implantation development and mRNA abundance. Molecular Reproduction and Development. 75 (3), (2008).
- Succu, S., et al. Vitrification Devices Affect Structural and Molecular Status of In Vitro Matured Ovine Oocytes. Molecular Reproduction and Development. 74, 1337-1344 (2007).
- Hosseini, S. M., Asgari, V., Hajian, M., Nasr-Esfahani, M. H. Cytoplasmic, rather than nuclear-DNA, insufficiencies as the major cause of poor competence of vitrified oocytes. Reproductive BioMedicine Online. , (2015).
- Succu, S., et al. Calcium concentration in vitrification medium affects the developmental competence of in vitro matured ovine oocytes. Theriogenology. 75 (4), (2011).
- Sanaei, B., et al. An improved method for vitrification of in vitro matured ovine oocytes; beneficial effects of Ethylene Glycol Tetraacetic acid, an intracellular calcium chelator. Cryobiology. 84, 82-90 (2018).
- Quan, G. B., Wu, G. Q., Wang, Y. J., Ma, Y., Lv, C. R., Hong, Q. H. Meiotic maturation and developmental capability of ovine oocytes at germinal vesicle stage following vitrification using different cryodevices. Cryobiology. 72 (1), 33-40 (2016).
- Fernández-Reyez, F., et al. maturation and embryo development in vitro of immature porcine and ovine oocytes vitrified in different devices. Cryobiology. 64 (3), 261-266 (2012).
- Ahmadi, E., Shirazi, A., Shams-Esfandabadi, N., Nazari, H. Antioxidants and glycine can improve the developmental competence of vitrified/warmed ovine immature oocytes. Reproduction in Domestic Animals. 54 (3), 595-603 (2019).
- Barrera, N., et al. Impact of delipidated estrous sheep serum supplementation on in vitro maturation, cryotolerance and endoplasmic reticulum stress gene expression of sheep oocytes. PLoS ONE. 13 (6), (2018).
- Walker, S. K., Hill, J. L., Kleemann, D. O., Nancarrow, C. D. Development of Ovine Embryos in Synthetic Oviductal Fluid Containing Amino Acids at Oviductal Fluid Concentrations. Biology of Reproduction. 55 (3), 703-708 (1996).
- Kuwayama, M., Vajta, G., Kato, O., Leibo, S. P. Highly efficient vitrification method for cryopreservation of human oocytes. Reproductive BioMedicine Online. 11 (3), 300-308 (2005).
- Wu, X., Jin, X., Wang, Y., Mei, Q., Li, J., Shi, Z. Synthesis and spectral properties of novel chlorinated pH fluorescent probes. Journal of Luminescence. 131 (4), 776-780 (2011).
- Dell'Aquila, M. E., et al. Prooxidant effects of verbascoside, a bioactive compound from olive oil mill wastewater, on in vitro developmental potential of ovine prepubertal oocytes and bioenergetic/oxidative stress parameters of fresh and vitrified oocytes. BioMed Research International. 2014, (2014).
- Gadau, S. D. Morphological and quantitative analysis on α-tubulin modifications in glioblastoma cells. Neuroscience Letters. 687, 111-118 (2018).
- los Reyes, M. D., Palomino, J., Parraguez, V. H., Hidalgo, M., Saffie, P. Mitochondrial distribution and meiotic progression in canine oocytes during in vivo and in vitro maturation. Theriogenology. , (2011).
- Leoni, G. G., et al. Differences in the kinetic of the first meiotic division and in active mitochondrial distribution between prepubertal and adult oocytes mirror differences in their developmental competence in a sheep model. PLoS ONE. 10 (4), (2015).
- Berlinguer, F., et al. Effects of trehalose co-incubation on in vitro matured prepubertal ovine oocyte vitrification. Cryobiology. 55 (1), 27-34 (2007).
- Serra, E., Gadau, S. D., Berlinguer, F., Naitana, S., Succu, S. Morphological features and microtubular changes in vitrified ovine oocytes. Theriogenology. 148, 216-224 (2020).
- Asgari, V., Hosseini, S. M., Ostadhosseini, S., Hajian, M., Nasr-Esfahani, M. H. Time dependent effect of post warming interval on microtubule organization, meiotic status, and parthenogenetic activation of vitrified in vitro matured sheep oocytes. Theriogenology. 75 (5), 904-910 (2011).
- Ciotti, P. M., et al. Meiotic spindle recovery is faster in vitrification of human oocytes compared to slow freezing. Fertility and Sterility. 91 (6), 2399-2407 (2009).
- Ledda, S., Bogliolo, L., Leoni, G., Naitana, S. Cell Coupling and Maturation-Promoting Factor Activity in In Vitro-Matured Prepubertal and Adult Sheep Oocytes1. Biology of Reproduction. 65 (1), 247-252 (2001).
- Palmerini, M. G., et al. In vitro maturation is slowed in prepubertal lamb oocytes: ultrastructural evidences. Reproductive Biology and Endocrinology. 12, (2014).
- Leoni, G. G., et al. Relations between relative mRNA abundance and developmental competence of ovine oocytes. Molecular Reproduction and Development. 74 (2), 249-257 (2007).
- Succu, S., et al. Effect of vitrification solutions and cooling upon in vitro matured prepubertal ovine oocytes. Theriogenology. 68 (1), 107-114 (2007).
- Larman, M. G., Sheehan, C. B., Gardner, D. K. Calcium-free vitrification reduces cryoprotectant-induced zona pellucida hardening and increases fertilization rates in mouse oocytes. Reproduction. 131 (1), 53-61 (2006).
- Yeste, M., Jones, C., Amdani, S. N., Patel, S., Coward, K. Oocyte activation deficiency: a role for an oocyte contribution. Human Reproduction Update. 22 (1), 23-47 (2016).
- Rienzi, L., et al. Oocyte, embryo and blastocyst cryopreservation in ART: systematic review and meta-analysis comparing slow-freezing versus vitrification to produce evidence for the development of global guidance. Human Reproduction Update. 23 (2), 139-155 (2017).
- De Santis, L., et al. Oocyte vitrification: influence of operator and learning time on survival and development parameters. Placenta. 32, 280-281 (2011).
- Zhang, X., Catalano, P. N., Gurkan, U. A., Khimji, I., Demirci, U. Emerging technologies in medical applications of minimum volume vitrification. Nanomedicine. 6 (6), London, England. 1115-1129 (2011).
