Summary
Протокол направлен на обеспечение стандартного метода витрификации ооцитов взрослых и молодых овец. Она включает в себя все этапы от подготовки среды созревания in vitro до постигреющей культуры. Ооциты отрифицируются на стадии MII с использованием криотопа для обеспечения минимально необходимого объема.
Abstract
В животноводстве системы производства эмбрионов in vitro могут быть разработаны и поддержаны благодаря большому количеству яичников и ооцитов, которые можно легко получить на бойне. Взрослые яичники всегда несут несколько антральных фолликулов, в то время как у препубертатных доноров максимальное количество ооцитов доступно в возрасте 4 недель, когда яичники несут пиковое количество антральных фолликулов. Таким образом, 4-недельные ягнята считаются хорошими донорами, даже если развивательная компетенция препубертатных ооцитов ниже по сравнению с их взрослым собратом.
Фундаментальные исследования и коммерческое применение будут усилены возможностью успешного криоконсервирования витрифицированных ооцитов, полученных как от взрослых, так и от препубертатных доноров. Витрификация ооцитов, собранных у препубертатных доноров, также позволит сократить интервал генерации и, таким образом, увеличить генетический прирост в селекционных программах. Однако потеря потенциала развития после криоконсервации делает ооциты млекопитающих, вероятно, одним из самых сложных типов клеток для криоконсервации. Среди доступных методов криоконсервации витрификация широко применяется к ооцитам животных и человека. Несмотря на недавние достижения в этой технике, воздействие высоких концентраций криопротекторов, а также охлаждающая травма и осмотический стресс по-прежнему вызывают несколько структурных и молекулярных изменений и снижают потенциал развития ооцитов млекопитающих. Здесь мы описываем протокол витрификации ооцитов овец, собранных у ювенильных и взрослых доноров и созревающих in vitro до криоконсервации. Протокол включает в себя все процедуры от созревания яйцеклеток in vitro до витрификации, согревающего и постгретого инкубационного периода. Ооциты, отрифицированные на стадии MII, действительно могут быть оплодотворены после согревания, но им требуется дополнительное время до оплодотворения, чтобы восстановить повреждения из-за процедур криоконсервации и увеличить их потенциал развития. Таким образом, условия и сроки культивирования после потепления являются решающими шагами для восстановления потенциала развития ооцитов, особенно когда ооциты собираются у ювенильных доноров.
Introduction
Долгосрочное хранение женских гамет может предложить широкий спектр применений, таких как улучшение разведения домашних животных с помощью программ генетического отбора, содействие сохранению биоразнообразия в рамках программы сохранения видов дикой природы ex-situ и стимулирование биотехнологических исследований и приложений in vitro благодаря наличию хранимых ооцитов для включения в программы производства эмбрионов in vitro или ядерной трансплантации1,2,3. Витрификация ювенильных ооцитов также увеличит генетический прирост за счет сокращения интервала генерации в селекционных программах4. Витрификация путем сверхбыстрого охлаждения и согревания ооцитов в настоящее время считается стандартным подходом для криоконсервации ооцитовскота 5. У жвачных животных до витрификации ооциты обычно созревают in vitro, после извлечения из фолликулов, полученных из яичниковскотобойни 2. Взрослые, и особенно препубертатные яичники4,6,действительно могут поставлять практически неограниченное количество ооцитов для криоконсервции.
У крупного рогатого скота после витрификации и потепления ооцитов урожайность бластоцисты на уровне >10% обычно сообщалась несколькими лабораториями в течение последнего десятилетия3. Однако у мелких жвачных животных витрификация ооцитов по-прежнему считается относительно новой как для ювенильных, так и для взрослых ооцитов, и стандартный метод витрификации ооцитов овец еще предстоит установить2,5. Несмотря на последние достижения, остеклованные и нагретые яйцеклетки действительно представляют собой несколько функциональных и структурных изменений, которые ограничивают их потенциал развития7,8,9. Таким образом, в немногих статьях сообщалось о развитии бластоцисты на уровне 10% или более в отрифицированных/подогретых ооцитаховец 2. Исследовано несколько подходов к уменьшению вышеупомянутых изменений: оптимизация состава растворов витрификации и оттаивания10,11; эксперименты с использованием различныхкриоустройств 8,12,13; и применение специфических методов лечения во время созревания in vitro (IVM)4,14,15 и/или во время восстановления после потепления6.
Здесь мы описываем протокол витрификации ооцитов овец, собранных у молодых и взрослых доноров и созревающих in vitro до криоконсервации. Протокол включает в себя все процедуры от созревания яйцеклеток in vitro до витрификации, согревания и послесогревающего периода культивирования.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Протокол о животных и применяемые процедуры, описанные ниже, соответствуют этическим руководящим принципам, действующим в Университете Сассари, в соответствии с Директивой Европейского союза 86/609/EC и рекомендацией Комиссии Европейских сообществ 2007/526/EC.
1. Подготовка среды для манипуляций с ооцитами
- Подготовьте среду для транспортировки собранных яичников, дополнив фосфатный буферный физиологический раствор Dulbecco 0,1 г / л пенициллина и 0,1 г / л стрептомицина (PBS).
- Подготовьте среду для сбора и созревания ооцитов, разведев 9,5 г тканевой культурального носителя (ТКМ) 199 в порошке с 1 л воды Milli-Q, дополненной пенициллином (0,1%) и стрептомицин (0,1%).
- После разбавления отфильтруйте 100 мл среды и храните ее при 4 °C в качестве среды созревания запаса (SMM) для использования в течение одной недели.
- Готовят сборную среду (СМ), дополняя оставшиеся 900 мл 25 мМ HEPES, 0,36 г/л бикарбоната и 0,1% (мас./об.) поливиниловый спирт (ПВА) (рН 7,3, осмоляльность 290 мОсм/кг).
- Подготовьте среду созревания с SMM, дополненной 0,021 г/л бикарбоната, 10% термически обработанной овечьей сывороткой течки, 1 МЕ/мл ФСГ, 1 МЕ/мл ЛГ, 100 мкл цистеамина и 8 мг/мл пирувата.
ПРИМЕЧАНИЕ: Среда созревания в объеме 10 мл должна инкубирована в стандартных условиях (в максимальной увлажненной атмосфере при 39°С в 5% CO2 на воздухе) в течение не менее 4 ч перед использованием. - Готовят базовую среду (БМ) для манипуляций с яйцеклетками после созревания in vitro, состоящую из PBS безCa++ иMg++,дополненную 20% сывороткой для икр плода (FCS).
2. Сбор и созревание ооцитов
- Восстанавливают ооциты из ювенильных (30-40-дневный возраст, масса тела 6-10 кг) и взрослых яичников.
- Транспортировать собранные завязи с коммерческой бойни в лабораторию в течение 1-2 ч в PBS при 27 °C.
- После промывки в свежей среде PBS нарежьте яичники в CM с помощью микролопасти, чтобы освободить содержимое фолликула.
- При стереомикроскопическом исследовании с 60-кратным увеличением отбирают кучевые-ооцитарные комплексы (КОК) для созревания in vitro путем выбора комплексов с 4-10 слоями клеток гранулезы, ооцитов с однородной цитоплазмой, однородным распределением липидных капель в цитоплазме и с наружным диаметром около 90 мкм (среднее).
- Промыть выбранные КОК три раза в СМ и окончательно перенести их в среду созревания.
ПРИМЕЧАНИЕ: Для ювенильных ооцитов для улучшения выживаемости после витрификации дополните среду созревания трегалозой 100 мкМ. - Для созревания in vitro переносят 30-35 КОК в 600 мкл среды созревания в четырехлунные чашки Петри, покрытые 300 мкл минерального масла и инкубируют их по 22 (взрослые ооциты)/24 (ювенильные ооциты)ч в 5%СО2 на воздухе при 39 °С.
- После созревания in vitro денут КОК кучевых клеток путем осторожного пипетирования. После обследования под стереомикроскопом с 60-кратным увеличением отбирайте для витрификации только те, которые показывают экструзию на первом полярном теле и, таким образом, на стадии метафазы II (MII).
3. Процедуры сбора, замораживания и размораживания спермы
- Подготовьте базовую среду для криоконсервации спермы, состоящую из удлинителя барана (200 мМ Трис; 70 мМ лимонной кислоты; 55 мМ фруктозы; рН 7,2, осмоляльность 300 мОсм/кг), дополненного яичным желтком 20% (v/v).
- Собирать сперму можно только в период размножения овец (октябрь-ноябрь).
- Получают эякуляты искусственным влагалищем от взрослых баранов (в возрасте 2-5 лет), выдерживают в наружной среде и кормят рационом поддержания живой массы. Держите баранов изолированными в отдельных ручках, но с визуальным контактом между собой.
- Повторяйте сбор спермы один раз в неделю в течение всего сезона размножения, чтобы получить не менее 8 эякулятов от каждого самца.
- Транспортировать образцы спермы в лабораторию при температуре окружающей среды в течение 5 мин после сбора и сразу же обрабатывать. Объедините эякуляты двух-трех баранов и оцените концентрацию сперматозоидов спектрофотометрией.
- После объединения разбавляют эякуляции до 400 х 106 сперматозоидов/мл базовой средой для криоконсервации спермы, дополненной 4% глицерином. Затем охладите разбавленная сперма до 4 °C в течение 2 ч и уравновешивайте ее в течение 20 мин перед замораживанием.
- Заморозьте образцы спермы в форме гранул (0,25 мл) на сухом льду, а затем погрузите их в жидкий азот.
- Для оттаивания поместите гранулу в стерилизованное стекло сокола и погрузите ее на водяную баню на 20 с при 39 °C.
4. Экстракорпоральное оплодотворение и культивирование эмбрионов
- Подготовьте запасы для создания синтетической яйцеводной жидкости (ХОФ).
- Подготовьте запас A: 99,4 мл MilliQ-воды; 6,29 г NaCl; 0,534 г KCl; 0,161 г KH2PO4; 0,182 г МгСО4 ·7Н2О; и 0,6 мл лактата натрия. Хранить при 4 °C до 3 месяцев.
- Подготовьте запас B: 10 мл MilliQ-воды; 0,210 г NaHCO3; и 2-3 г фенола красного. Хранить при 4 °C в течение 1 месяца.
- Подготовьте запас C: 10 мл MilliQ-воды; и 0,051 г пирувата натрия. Хранить при 4 °C в течение 1 месяца.
- Подготовьте запас D: 10 мл MilliQ-воды; и 0,262 г CaCl2H 2O. Хранить при 4 °C в течение 1 месяца.
- Подготовьте 10 мл SOF, состоящих из 7,630 мл воды MilliQ, 1 мл stock A, 1 мл Stock B, 0,07 мл Stock C и 0,7 мл stock D.
- Подготовьте среду экстракорпорального оплодотворения (ЭКО): SOF дополнен 2% термически обработанной овечьей сывороткой, 10 мкг/мл гепарина и 1 мкг/мл гипоутарина (осмоляльность 280-290 мОсм/кг).
ПРИМЕЧАНИЕ: Среду ЭКО в объеме 10 мл необходимо инкубировали в стандартных условиях (в максимально увлажненной атмосфере при 39 °C в 5% CO2,5% O2 и 90%N2)не менее чем за 4 ч до использования.
- Переложите замороженные/размороженные аликвоты спермы в стерилизованную стеклянную коническую трубку ниже 1,5 мл нагретой среды ЭКО и инкубируйте их в течение 15 мин при 39 °C в увлажненной атмосфере при 5% CO2 на воздухе.
- После инкубации подвижные сперматозоиды плывут к апикальной части жидкого столба. Соберите верхний слой и наблюдайте за оценкой подвижности сперматозоидов.
ПРИМЕЧАНИЕ: Параметры подвижности сперматозоидов должны оцениваться с использованием компьютерной системы анализа спермы (CASA) со следующими настройками: 25 кадров, полученных во избежание перекрытия следов сперматозоидов, минимальный контраст 10, минимальная скорость среднего пути 30 мкм / с и прогрессирующая подвижность > 80% прямолинейности. Эта система имеет специальную настройку для оценки сперматозоидов барана. Для каждого образца 5 мкл субвыборки суспензии сперматозоидов загружают в предварительно нагретую аналитический камеру глубиной 10 мкм. Подвижность сперматозоидов оценивается при 37 °C при 40x с использованием фазово-контрастного микроскопа, и минимум 500 сперматозоидов на подвыборку должны быть проанализированы по крайней мере в четырех различных микроскопических полях. Оценивался процент общих подвижных и прогрессирующих подвижных сперматозоидов. Для ЭКО процент прогрессирующих подвижных сперматозоидов должен составлять ≥ 30%. - Развести подвижные сперматозоиды при конечной концентрации 1 х10 6 сперматозоидов/мл и совместно инкубировать их с ооцитами МИИ в 300 мкл среды ЭКО, покрытой минеральным маслом, в четырехлуночных чашках Петри.
- Через 22 ч перенос предполагаемых зигот в четырехязычную чашку Петри, содержащую SOF, дополненную 0,4% бычим сывороточным альбумином и незаменимыми и заменимыми аминокислотами в яйцевидной концентрации, как указанов 16 под минеральным маслом, и культивировать их в стандартных условиях до стадии бластоцисты.
- Через 22, 26 и 32 часа после оплодотворения регистрируют количество расщепленных ооцитов, показывающих два отчетливых бластомера, путем обследования под стереомикроскопом с 60-кратным увеличением.
- Наблюдать за эмбрионами ежедневно, начиная с пятого по девятый день посева, а вновь образованные бластоцисты должны регистрироваться обследованием под стереомикроскопом с 60-кратным увеличением.
5. Витрификация и согревание ооцитов
ПРИМЕЧАНИЕ: Выполняют витрификацию по методу минимального необходимого объема (МЭВ) с помощью прибора криотопы17.
- Уравновешивают группу из пяти ооцитов при 38,5 °C в течение 2 мин в БМ. Применение БМ гарантирует низкую концентрацию кальция ([Ca2++]2,2мг/дл) 10.
- Обезвоживают ооциты 3 мин воздействием уравновешивающего раствора, содержащего 7,5% (v/v) диметилсульфоксида (DMSO) и 7,5% (v/v) этиленгликоля (EG) в BM.
- Перенесите ооциты в витрификационные растворы, содержащие 16,5% (v/v) DMSO, 16,5% (v/v) EG и 0,5 M трегалозы в BM перед загрузкой их в криотопное устройство и непосредственным погружением в жидкий азот в течение 30 с.
- Для нагревания до биологической температуры перенесите содержание каждого устройства витрификации из жидкого азота в 200 мкл капель 1,25 М трегалозы в БМ в течение 1 мин при 38,5 °С и осторожно перемешайте для облегчения перемешивания.
- Для содействия выведению внутриклеточных криопротекторов переносят ооциты поэтапно в 200 мкл капель уменьшающихся трехгалозных растворов (0,5 М, 0,25 М, 0,125 М трегалозы в БМ) в течение 30 с при 38,5 °С до уравновешивания в течение 10 мин при 38,5 °С в БМ.
6. Оценка качества ооцитов после потепления
- После нагревания инкубируют ооциты в течение 6 ч в PBS безCa++ иMg++ плюс 20% FCS (BM) в 5% CO2 на воздухе при 38,5 °C.
ПРИМЕЧАНИЕ: Способность ооцитов восстанавливать биологические и структурные особенности после витрификации относится к видам и классам используемых ооцитов. - Поскольку способность ооцитов восстанавливать повреждения криоконсерваций зависит от времени, оцените качество ооцитов в разные моменты времени посева in vitro (0 ч, 2 ч, 4 ч, 6 ч) после согревания, чтобы определить оптимальное временное окно для оплодотворения яйцеклеток.
ПРИМЕЧАНИЕ: У взрослых овец оптимальным временем является 4 ч после потепления; для препубертатного ооцита оптимальное время – 2 ч после потепления.
7. Оценка выживаемости ооцитов
- Сразу после потепления и для каждой временной точки послегретной культуры морфологически оценивают ооциты с помощью инвертированного микроскопа со 100-кратным увеличением.
ПРИМЕЧАНИЕ: Ооциты со структурными изменениями, такими как слабая цитоплазма, повреждение пеллюцидной зоны и/или мембраны, следует классифицировать как дегенерированные. - Проверьте оценку целостности мембраны с помощью двойного дифференциального флуоресцентного окрашивания.
- Инкубируют ооциты в 2 мл БМ, содержащих йодид пропидия (PI; 10 мкг/мл) и Hoechst 33342 (10 мкг/мл) в течение 5 мин в 5% CO2 на воздухе при 38,5 °C.
- После трехкратной промывки в свежем БМ наблюдают за ооцитами под флуоресцентным микроскопом с помощью фильтра возбуждения 350 нм и излучения 460 нм для Hoechst 33342 и фильтра возбуждения 535 нм и излучения 617 нм для PI.
ПРИМЕЧАНИЕ: Ооциты с интактной мембраной могут быть распознано по синей флуоресценции цветной ДНК с Hoechst 33342. Ооциты с поврежденными мембранами показывают красную флуоресценцию из-за окрашивания ДНК ПИ.
8. Оценка митохондриальной активности и внутриклеточных уровней АФК с помощью конфокальной лазерной сканирующей микроскопии
- Подготовьте датчик MitoTracker Red CM-H2XRos (MT-Red).
- Разбавляют содержание 1 флакона (50 мкг) 1 мл ДМСО для получения раствора 1 мМ. Разбавленный флакон хранить в жидком азоте.
- Разбавляют раствор 1 мМ ДМСО до получения 100 мкМ запасного раствора и хранят при -80 °C в темноте.
- Приготовьте 2',7'-дихлордигидрофлуоресцеин диацетат (H2DCF-DA) зонд.
- РазбавляютH2DCF-DA в 0,1% поливинилпирролидоне (ПВА)/ПБС для получения первого раствора 100 мМ. Держите раствор при -80 °C в темноте.
- Разбавляют первый раствор в 0,1% ПВА/ПБС для получения 100 мкМ раствора. Хранить при -20 °C в темноте.
- Подготовьте монтажную среду (ММ): на 10 мл ММ добавьте 5 мл глицерина, 5 мл PBS и 250 мг азида натрия. Храните при -20 °C до использования.
- Инкубировать ооциты в течение 30 мин при 38,5 °C в БМ с 500 нМ MT-Red (стоковый раствор: 100 мкМ в ДМСО).
- После инкубации с помощью зонда MT-Red промыть яйцеклетки три раза в БМ и инкубировать в течение 20 мин в той же среде, содержащей 5 мкМH2DCF-DA (стоковый раствор: 100 мкМ в БМ).
- После воздействия зондов промыть ооциты в БМ и зафиксировать в 2,5% глутаральдегиде/PBS в течение не менее 15 мин.
- После фиксации промыть ооциты три раза в БМ и установить на стеклянные слайды в каплю ММ 4 мкл с 1 мг/мл Hoechst 33342 с использованием восковых подушек, чтобы избежать сжатия образцов.
- Храните слайды при 4 °C в темноте до оценки.
- Выполните анализ иммуномаркированных участков с помощью конфокального лазерного сканирующего микроскопа. Микроскоп оснащен лазерами Ar/He/Ne с использованием масляного объектива 40/60x. Анализируйте участки последовательным возбуждением.
- Для митохондриальной оценки наблюдайте за образцами с помощью многофотонного лазера для обнаружения MT-Red (экспозиция: 579 нм; излучение: 599 нм).
- Используйте лазерный луч ионов аргона при 488 нм и фильтр B-2 A (экспозиция 495 нм и излучение 519 нм), чтобы указать на дихлорфлуоресцеин (DCF)18.
- В каждой отдельной яйцеклетке измерьте интенсивность флуоресценции MT-Red и DCF в экваториальной плоскости19.
- Поддерживать параметры, связанные с интенсивностью флуоресценции при постоянных значениях во время всех сборов изображения (энергия лазера 26%, последовательные настройки 1: PMT1 коэффициент усиления 649-PMT2 482; Последовательная настройка 2: PMT1 усиление 625-PMT2 усиление 589; смещение 0; размер отверстия: 68).
- Выполните количественный анализ интенсивности флуоресценции с помощью программного пакета для анализа изображений Leica LAS AF Lite, следуя процедурам, стандартизированным20.
- Делайте снимки один раз, двигаясь по оси Z, пока не достигнет экваториальной плоскости.
- Для каждой фотографии было отключено преобразование в шкалу серого и отключение канала 1 (связанного с синим цветом Hoechst). Затем вручную нарисуйте интересуемую область (ROI) на ограниченной области, то есть вокруг мейотического шпинделя.
ПРИМЕЧАНИЕ: Программное обеспечение может автоматически считывать среднее значение пикселя на канале 2 (FITC), вычитая из него значение фона. - Запишите средние значения пикселей и отправьте на статистический анализ.
9. Статистический анализ
- Проанализируйте следующие различия: показатели выживаемости среди ювенильных и взрослых ооцитов, выживаемость и компетентность развития в контрольных и трегалозных ювенильных ооцитах, выживаемость и партеногенетическая активация и компетентность развития взрослых ооцитов, остекленных различными средами концентрации кальция, показатели оплодотворения и производства эмбрионов в ювенильных ооцитах, остеклованных с низкой или высокой концентрацией кальция, активные фенотипы митохондрий в ювенильных витрифицированных ооцитах в течение различные временные точки культуры после потепления и партеногенетическая активация между взрослыми и ювенильными витрифицированными ооцитами с использованием теста хи квадрата.
- Проанализировать скорость расщепления и выход эмбриона в витрифицированных взрослых ооцитах в разные временные точки культуры после потепления, интенсивность флуоресценции митохондриальной активности и внутриклеточные уровни АФК в ювенильных витрифицированных ооцитах в разные временные точки послегретной культуры ANOVA после анализа однородности дисперсии тестом Левена. Используйте тест Tukey после специального тестирования, чтобы выделить различия между группами.
- Выполните статистический анализ с помощью статистического программного обеспечения и рассмотрите вероятность P < 0,05 как минимальный уровень значимости. Все результаты выражаются как среднее ± S.E.M.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Криотолерантность ооцитов у ювенильных доноров ниже по сравнению со взрослыми. Первым наблюдаемым эффектом является более низкая выживаемость после потепления по сравнению со взрослыми ооцитами(рисунок 1A;χ 2 тест P<0,001). Ювенильные ооциты показали более низкую целостность мембраны после нагрева(рисунок 1B). Использование трегалозы в среде созревания было предназначено для проверки того, может ли этот сахар уменьшить криоинжества в ювенильных ооцитах. Данные показали23, что ооциты созрели в течение 24 ч с добавками трегалозы показали более высокие показатели выживаемости после витрификации / потепления по сравнению с группой, не получавших лечения(Таблица 1:85,7% против 75,3% соответственно;χ 2 тест P<0,05). Добавки трегалозы действительно были связаны с более высокой целостностью мембраны после нагревания(рисунок 2A). Так, применение трегалозы при созревании in vitro ювенильных ооцитов повышало показатели выживаемости после витрификации (85,7%) к значениям, сопоставимым со взрослыми (90,3%). Однако расщепление, оплодотворение и темпы развития ювенильных ооцитов не были увеличены добавками трегалозы(таблица 1).
Для повышения компетентности ооцитов после витрификации мы протестировали во взрослых яйцеклетках различные среды витрификации с концентрацией кальция от 9,9 до 0,4мг/дл 10. Полученные результаты показали, что применение сред с концентрацией кальция, равной 2,2 мг/дл, повышало выживаемость после потепления, улучшало компетенцию развития и снижало партеногенетическую активацию взрослого ооцита10 (таблица 2). Таким образом, мы протестировали жимы витрификации с низким содержанием кальция для витрификации ювенильных ооцитов. Как показано в таблице 3,ювенильные ооциты, отрифованные с низкой концентрацией кальция, свидетельствовали о более высоких показателях оплодотворения по сравнению с ооцитами, витрифицированными с высокой концентрацией кальция (44,35% против 32,29 % соответственно; P<0,05), но никаких различий в производстве эмбрионов обнаружено не было.
Остеклованным/подогретым ооцитам требуется дополнительное время до оплодотворения, чтобы восстановить повреждения из-за процедур криоконсервации и повысить их потенциал развития. Предыдущее исследование действительно продемонстрировало, что внутриклеточная концентрация АТФ, митохондриальная активность и компетентность в развитии in vitro снижаются в витрифицированных/размороженных ооцитах, которые также показывают высокие внутриклеточные концентрации АФК6. Эти изменения особенно заметны сразу после потепления. Во время послесогревающей культуры как взрослые, так и ювенильные ооциты способны частично оправиться от повреждений, полученных во время процедур витрификации6,24. Сравнивая послегретную культуру разной длительности (0, 2, 4 и 6 ч), мы показали, что через 4 ч культуры ооциты, собранные у взрослых овец, способны восстановить энергетический баланс6 и микротрубчатую установку24 и восстановить способность к развитию с более высоким расщеплением (50,7 ± 3,9%; P< 0,01 ANOVA) и показатели бластоцисты (14,40 ± 1,3%; ANOVA P< 0,01) по сравнению с другими временными точками (0, 2 и 6 ч; Таблица 4). Таким образом, 4 ч послесогревающей культуры представляет собой идеальное временное окно для оплодотворения оплодотворенных/согретых взрослых ооцитов6.
Когда тот же эксперимент повторялся с ооцитами, собранными у ювенильных доноров, эти результаты были частично подтверждены. Митохондриальная активность была выше в витрифицированных/подогретых ювенильных ооцитах после 4 ч после нагревания культуры по сравнению с другими временными точками (0, 2, 6; Рисунок 3:ANOVA P<0.01). Несколько моделей распределения митохондрий наблюдаются и классифицируются на следующие три группы (как сообщается в21): Паттерн А: однородный FINE с небольшими грануляциями, распространенными по всей цитоплазме; Рисунок В: однородный гранулированный с крупными грануляциями, распространенными по всей цитоплазме; Паттерн C: гетерогенный CLUSTERED, когда присутствовали особенно крупные грануляции, распространявшиеся по всей цитоплазме или расположенные в специфических цитоплазматических доменах. Различные фенотипы в цитоплазматическом распределении активного митохондриала в MII могут быть связаны с компетенцией развития ооцитов. Однородное распределение FINE является показателем плохой компетентности в развитии, в то время как гранулярное и кластерное распределение связаны с повышенной активностью митохондрий и, следовательно, более высокой компетенцией развития22. Модели распределения митохондрий изменились в течение 6 ч после потепления культуры. На рисунке 4 показаны примеры ювенильных ооцитов, имеющих различные паттерны митохондриального распределения и их флуктуации во время культуры после потепления. Рисунок А значительно увеличивается во время длительной инкубации и достигает более высокого значения через 6 ч после потепления(Рисунок 4А: χ2 P<0,05), рисунок В не показал значительных изменений во время послегретной культуры(Рисунок 4Bb),рисунок С не был обнаружен ни в одном ювенильном отрифицированном/нагретом ооците во время длительной инкубации(Рисунок 4Cc:χ2 P<0,05).
Кроме того, внутриклеточные уровни АФК были значительно ниже в ювенильных ооцитах через 2 ч после нагревательной культуры по сравнению с 0, 4 и 6 ч(Рисунок 5:ANOVA P<0,001). Однако, в отличие от того, что было обнаружено во взрослых ооцитах, скорость спонтанной партеногенетической активации увеличивалась во время послегреющей культуры в ювенильных ооцитах(рисунок 6). По этой причине рекомендуемая точка времени для оплодотворения в ювенильных ооцитах будет составлять 2 ч после культивации после потепления.
Рисунок 1. Показатели выживаемости витрифицированных/подогретых яйцеклеток овец, собранных у ювенильных и взрослых доноров. (А) Ооциты были витрифицированы после созревания in vitro. Выживаемость определяли после витрификации и потепления флуоресцентным окрашиванием йодидом пропидия (10 мкг/мл) и Hoechst 33342 (10 мкг/мл). N = 165 взрослых ооцитов и 170 ювенильных ооцитов. Разные буквы указывают на значительные различия между взрослыми и ювенильными ооцитами:χ 2 тест P<0,001. (Б-С) Примеры витрифицированных/нагретых ювенильных ооцитов с интактными (В) и поврежденными плазматическими мембранами (С) при морфологической оценке (инвертированный микроскоп со 100-кратным увеличением). Шкала = 10 мкм. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.
Рисунок 2. Выживаемость ювенильных яйцеклеток и компетентность развития in vitro после созревания с (TRH) и без (CTR) трегалозой (100 мМ в среде созревания). (А-Б) Примеры ювенильных ооцитов, остекленных после созревания in vitro в средах, дополненных(A)с или(B)без трегалозы при морфологической оценке (инвертированный микроскоп со 100-кратным увеличением). Шкала = 30 мкм. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.
Рисунок 3. Количественная оценка интенсивности активной митохондриальной флуоресценции в отрифицированных/нагретых ювенильных ооцитах в разные моменты времени (0, 2, 4, 6) во время культуры in vitro после потепления. В качестве контроля использовали ооциты IVM (CTR N =77). Всего 163 (0 ч N = 45; 2 ч N = 39; 4 ч N = 40; 6 ч N = 39) ювенильных ооцитов были витрифицированы и нагреты в трех независимых экспериментах. Разные буквы указывают на статистически значимые различия (ANOVA P = 0,0000). Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.
Рисунок 4. Распределение митохондриального рисунка в витрифицированных/нагретых ювенильных ооцитах в течение 6 часов после нагревания культуры in vitro. Репрезентативные изображения тонкого (A),гранулированного (B) и кластерного (C) митохондриального распределения в отрифицированных/подогретых ювенильных ооцитах. D) процентная доля ювенильных витрифицированных/подогретых ооцитов, демонстрирующих тонкое митохондриальное распределение; E) процентная доля ювенильных витрифицированных/подогретых ооцитов, демонстрирующих гранулированное митохондриальное распределение; (F) Процентная доля ювенильных витризованных/нагретых ооцитов, демонстрирующих кластерное митохондриальное распределение. В качестве контроля использовались ювенильные ооциты IVM (CTR; N = 77). Всего было использовано 163 (0 ч N = 45; 2 ч N = 39; 4 ч N = 40; 6 ч N = 39) ювенильных ооцитов, отрихнутых и нагретых в трех независимых экспериментах. Различные буквы указывают на статистически значимые различия (Aa: χ2 P = 0,026; Bb: χ2 P = 0,097; Cc: χ2 P = 0,014). Шкала = 30 мкм. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.
Рисунок 5. Количественная оценка интенсивности флуоресценции внутриклеточного АФК в витридных ювенильных ооцитах в течение 6 часов после нагрева культуры in vitro. (А-Б) Репрезентативные изображения интенсивности флуоресценции АФК в зрелых(А)и витрифицированных(В)ювенильных ооцитах. (C)Внутриклеточные уровни АФК, определяемые количественной оценкой интенсивности флуоресценции в витрифицированных ювенильных ооцитах в разные моменты времени (0 ч N=45; 2 ч N=39; 4 ч N=40; 6 ч N=39) во время культивации in vitro после потепления. В качестве контроля использовались зрелые ювенильные ооциты in vitro (CTR N = 77). Разные буквы указывают на статистически значимые различия (ANOVA P = 0,0000). Шкала = 50 мкм. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.
Рисунок 6. Партеногенетическая активация в витрифицированных ювенильных и взрослых ооцитах в течение 6 часов после нагрева культуры in vitro. (A-B) Репрезентативные изображения партеногенетической активации ооцитов:(А)ооцит в метафазе II-телофазного II перехода и(В)образования пронуклеуса. (C)Процентное содержание партеногенетически активированных взрослых и ювенильных ооцитов в разные моменты времени (0, 2, 4, 6 ч) во время культивирования in vitro после потепления. Звездочки указывают на статистические различия между ювенильными и взрослыми ооцитами в каждой точке инкубации (ANOVA P = 0,000). Этот рисунок был изменен из Serra et al.24 Scale bar = 50 μm. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.
| Ооциты (n) | Выживаемость (%) | ЭКО (н) | Удобренныйа (%) | Расщепленныйb (%) | Бластоцистыc (%) | |
| CTR | 73 | 75.3* | 452 | 91.1 | 96.1 | 14.3 |
| ТРХ | 77 | 85.7 | 470 | 92.5 | 95.4 | 13 |
| * Критерий квадрата Ци p<0,5 | ||||||
| a Проценты рассчитываются по эколоцитам | ||||||
| b Проценты рассчитываются на оплодотворенных ооцитах | ||||||
| c Проценты рассчитываются на расщепленных ооцитах | ||||||
Таблица 1. Выживаемость ювенильных яйцеклеток овец и компетентность развития in vitro после созревания с трегалозой и витрификацией и без нее. TRH = ювенильные ооциты, созревшие с добавками трегалозы (100 мМ в среде созревания). CTR = контрольные ювенильные ооциты, созревшие без добавок трегалозы. Показатели выживаемости определяли после флуоресцентного окрашивания йодидом пропидия (10 мкг/мл) и Hoechst 33342 (10 мкг/мл) витрифицированных/подогретых ооцитов. Компетентность развития ооцитов определялась после включения в производственную систему in vitro. а Проценты рассчитываются на эко-ооцитах. b Проценты рассчитываются на оплодотворенных ооцитах. c Проценты рассчитываются на расщепленных ооцитах. * χ2 тест P<0,5. Эта таблица была изменена по сравнению с Berlinguer et al.23
| Группы | [Ca++] мг/дл | N-яйцеклетка | Спонтанная партеногенетическая активация (%) | Отрифицированные ооциты | Выжившие и ЭКО ооциты (%) | Декольте (%) | Выход бластоцист (%) |
| ТКМ/ФТС | 9.9 | 80 | 33 (41,2)а | 150 | 124 (82,7)а | 40 (32,5)а | 2 (1.6)а |
| ПБС/ФКС | 4.4 | 82 | 29 (35.3)переменного тока | 115 | 88 (76,5)а | 33 (37,5)э | 1 (1.1)а |
| PBSCaMg бесплатно/FCS | 2.2 | 86 | 11 (12.7)б | 126 | 115 (91.3)б | 74 (64.3)б | 12 (10.4)б |
| ПБС/БСА | 3.2 | 83 | 21 (25,3)с | 110 | 90 (81,8)а | 18 (20)с | 0 (0)а |
| PBSCaMg бесплатно/BSA | 0.4 | 87 | 10 (11.5)б | 149 | 123 (82,5)а | 57 (46.3)де | 3 (2.4)б |
Таблица 2. Компетенция развития зрелых взрослых ооцитов in vitro, отрифицированных в средах витрификации (16,5% этиленгликоля + 16,5% диметилсульфоксида), содержащих различные концентрации кальция. Выживаемость и показатели оплодотворения рассчитываются по витрифицированным ооцитам; общее расщепление и скорость бластоцисты рассчитываются на выживших ооцитах. Значения с разным подстрочным индексом в одном столбце существенно отличаются: χ2 test P<0.05. Эта таблица была изменена по сравнению с Succu et al.10
| [Ca 2++] в средах витрификации | Нет. Яйцеклеток | Выживаемость после витрификации (%) | Коэффициент оплодотворения (%) | Декольте (%) | Выход бластоцисты (%) |
| Высокий [9,9 мг/дл] | 190 | 161 (84.73) | 52/161 (32.29)а | 43/161 (26.7) | 0 |
| Низкий [2,2 мг/дл] | 150 | 124 (82.66) | 55/124 (44.35)б | 41/124 (33.1) | 0 |
Таблица 3. Оплодотворение и темпы развития после экстракорпорального оплодотворения и культивирования отрифицированного/подогретого ювенильного ооцита с использованием высокой ([Ca 2++] = 9,9 мг/дл) и низкой ([Ca 2++] = 2,2 мг/дл) концентрации кальция в средах витрификации. Различные буквы указывают на статистическую разницу (тест ≠ b P<0,05χ 2).
| Часы инкубации после потепления | Скорость расщепления (n) | Вывод эмбриона (n) |
| 0 | 19.2 ± 3%a (82) | 0%а (17) |
| 2 | 41.8 ± 3%b (100) | 6.5 ± 1.3%b (42) |
| 4 | 50.7 ± 3%b (92) | 14.4 ± 1.3%c (48) |
| 6 | 26 ± 3%год ( 92) | 0%а (23) |
Таблица 4. Скорость расщепления и выход эмбриона в витрифицированных/нагретых взрослых ооцитах, оплодотворенных в разные моменты времени после потепления культуры. Разные буквы указывают на статистическую разницу в пределах одного столбца: ANOVA P<0,01.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Криоконсервация ооцитов у домашних животных может позволить не только долгосрочное сохранение женских генетических ресурсов, но и продвинуть развитие эмбриональных биотехнологий. Таким образом, разработка стандартного метода витрификации ооцитов принесет пользу как животноводству, так и исследовательским сектору. В этом протоколе представлен полный метод витрификации ооцитов взрослых овец, который может представлять собой прочную отправную точку для разработки эффективной системы витрификации ювенильных ооцитов.
Одним из главных преимуществ предлагаемого метода является то, что он включает в себя все этапы от сбора ооцитов, созревания in vitro, витрификации и согревания. Кроме того, он включает в себя период после нагревания культуры, чтобы позволить оооцитам восстановиться после повреждений, понесенных во время процедуры витрификации, перед оплодотворением. Оптимальное время для оплодотворения должно быть адаптировано в соответствии с методом криоконсервации, начальным качеством ооцитов, возрастом пациента и видами, что необходимо учитывать как аспекты восстановления времени, так и старение ооцитов25,26. Таким образом, выбор продолжительности инкубационного периода после потепления является сложной задачей, и это может повлиять на результат программ витрификации ооцитов. Исходя из результатов, полученных с точки зрения скорости расщепления и выхода эмбриона, а также в условиях, описанных в представленном протоколе, оптимальным временем оплодотворения ооцитов взрослых овец является после 4 часов послеогревательной инкубации(табл. 4)6. Эта информация имеет решающее значение при разработке программы витрификации ооцитов.
Этот протокол, однако, хотя и дает приемлемые результаты с точки зрения выхода эмбриона из отрифицированных / подогретых взрослых ооцитов, все же приводит к низким или нулевым эмбрионам при применении к ювенильным оооцитам. Некоторые структурные и функциональные ограничения ухудшают препубертатную компетенцию развития ооцитов, такие как малый размер, дефектная связь между кучевые клетки и ооцитами, снижение поглощения аминокислот, снижение синтеза белка и энергетического обмена 27,28,29. В предыдущем исследовании мы сообщали, что препубертатные ооциты проявляют высокую чувствительность к процедуре витрификации30. Низкая компетенция развития, проявляющаяся после витрификации и потепления, вероятно, является результатом повреждения цитоплазматических факторов, участвующих в реорганизации цитоскелета и (или) в активации фактора, способствующего созреванию30. Как показано в таблице 1,добавление среды созревания трегалозой, непроницаемым криопротектором, смогло увеличить выживаемость после витрификации и нагревания до значений, сопоставимых со значениями взрослых ооцитов4. Таким же образом применение витрификационного раствора с низкими концентрациями кальция повышает показатели оплодотворения ювенильных ооцитов после витрификации и согревания, как показано в таблице 3. Таким образом, как оптимизация условий культивирования при созревании in vitro, так и состава среды витрификации могут способствовать повышению качества ювенильного ооцита после витрификации и потепления. Ювенильные ооциты демонстрируют некоторую способность к восстановлению после повреждений, вызванных процедурой витрификации, как показано на рисунках 3,4 и 5.
Однако высокие показатели спонтанной партеногенетической активации во время послеогревательной культуры все еще ограничивают их потенциал развития. Этиленгликоль и ДМСО, которые обычно используются криопротекторами, могут искусственно активировать ооцит до фактического оплодотворения, тем самым ограничивая успех оплодотворения и развитие эмбриона. Они действительно могут вызывать преходящее увеличение внутриклеточной концентрации Ca2+ 31,тем самым вызывая экзоцитоз корковых гранул, образование пронуклей и мейотическое возобновление32. Фактически, витрификация может искусственно активировать яйцеклетку до фактического оплодотворения, тем самым ограничивая успех оплодотворения и развитие эмбриона. Таким образом, хелатор кальция может быть использован для дальнейшего ограничения доступности кальция во время процесса витрификации с целью ограничения скорости спонтанной активации в ювенильных ооцитах.
Следует также учитывать, что, в отличие от медленного замораживания, витрификация является исключительно ручной техникой и, таким образом, зависит от оператора33,34. Таким образом, наличие обученного персонала является ключевым фактором успеха данного метода. Прежде всего, оператор должен правильно выбрать ооциты для витрифицированности. После IVM ооциты осторожно оголяют кучевые клетки и оценивают под стереомикроскопом для отбора для криоконсервации только тех, которые имеют однородную цитоплазму, однородное распределение липидных капель в цитоплазме и с наружным диаметром около 90 мкм. Более того, должны быть отобраны только ооциты, показывающие экструзию на первом полярном теле, а значит, и на стадии МИИ.
Морфологическая оценка ооцитов должна быть завершена за несколько минут и, будучи операторозависимой, очень чувствительна к изменениям в ее правильном осуществлении. Чтобы помочь стандартизировать процедуру отбора, метод предлагает ограничить время культивирования для созревания in vitro до 22 ч для взрослых ооцитов. На данный момент овечьи ооциты высокого качества уже завершили первое мейотическое деление22 и могут быть отобраны для криоконсервации. Таким образом, устранение некачественных ооцитов, которые являются самыми медленными при завершении первого мейотического деления, должно быть проще.
Оператор также должен строго соблюдать сроки, установленные для процедуры витрификации, от первого воздействия криопротектора до погружения в жидкий азот. Другим критическим этапом является загрузка ооцита в используемом устройстве витрификации. Процедура должна использовать минимальные объемы образцов, чтобы увеличить скорость охлаждения и помочь клеткам быстро пройти через температуру фазового перехода, тем самым уменьшая криоинжурии35. Криотоп использует полипропиленовую полосу, прикрепленную к держателю. При этом способе ооциты в растворе витрификации (<0,1 мкл) быстро нагружают стеклянным капилляром поверх пленочной полосы. Затем раствор необходимо удалить, оставив после себя тонкий слой, достаточный для покрытия клеток, которые должны быть криоконсервированы. Опять же, этот этап должен быть завершен как можно быстрее, чтобы ограничить воздействие на ооциты высоких концентраций криопротекторов раствора витрификации, которые могут вызвать осмотический шок и являются токсичными для клеток.
По этим причинам основной проблемой, связанной с этим методом, является потребность в ручном обращении и квалифицированном технике. Другие авторы сообщили, что на исход витрификации ооцитов, по-видимому, влияет эффект «кривой обучения», поскольку приобретение мануаловых навыков может значительно уменьшить биологический ущерб, вызванный процедурой витрификации34. Таким образом, исследователи должны учитывать «эффект оператора» при оценке результатов процедуры витрификации.
Дальнейшие исследования будут сосредоточены как на стандартизации процедуры отбора ооцитов, так и на лучшей адаптации состава среды и условий культивирования к потребностям ювенильных ооцитов. В связи с этим как применение хелатора кальция, так и антиоксидантов может предложить многообещающие возможности. Аналогичным образом, оптимизация протокола позволит повысить компетенцию развития остеклованных/подогретых взрослых ооцитов.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Авторы заявляют, что у них нет конкурирующих финансовых интересов.
Acknowledgments
Авторы не получили конкретного финансирования для этой работы. Профессор Мария Грация Каппай и доктор Валерия Пасчу благодарны за закадровый голос видео и за создание лаборатории во время создания видео.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 2′,7′-Dichlorofluorescin diacetate | Sigma-Aldrich | D-6883 | |
| Albumin bovine fraction V, protease free | Sigma-Aldrich | A3059 | |
| Bisbenzimide H 33342 trihydrochloride (Hoechst 33342) | Sigma-Aldrich | 14533 | |
| Calcium chloride (CaCl2 2H20) | Sigma-Aldrich | C8106 | |
| Citric acid | Sigma-Aldrich | C2404 | |
| Confocal laser scanning microscope | Leica Microsystems GmbH,Wetzlar | TCS SP5 DMI 6000CS | |
| Cryotop Kitazato | Medical Biological Technologies | ||
| Cysteamine | Sigma-Aldrich | M9768 | |
| D- (-) Fructose | Sigma-Aldrich | F0127 | |
| D(+)Trehalose dehydrate | Sigma-Aldrich | T0167 | |
| Dimethyl sulfoxide (DMSO) | Sigma-Aldrich | D2438 | |
| Dulbecco Phosphate Buffered Saline | Sigma-Aldrich | D8537 | |
| Egg yolk | Sigma-Aldrich | P3556 | |
| Ethylene glycol (EG) | Sigma-Aldrich | 324558 | |
| FSH | Sigma-Aldrich | F4021 | |
| Glutamic Acid | Sigma-Aldrich | G5638 | |
| Glutaraldehyde | Sigma-Aldrich | G5882 | |
| Glycerol | Sigma-Aldrich | G5516 | |
| Glycine | Sigma-Aldrich | G8790 | |
| Heparin | Sigma-Aldrich | H4149 | |
| HEPES | Sigma-Aldrich | H4034 | |
| Hypoutarine | Sigma-Aldrich | H1384 | |
| Inverted microscope | Diaphot, Nikon | ||
| L-Alanine | Sigma-Aldrich | A3534 | |
| L-Arginine | Sigma-Aldrich | A3784 | |
| L-Asparagine | Sigma-Aldrich | A4284 | |
| L-Aspartic Acid | Sigma-Aldrich | A4534 | |
| L-Cysteine | Sigma-Aldrich | C7352 | |
| L-Cystine | Sigma-Aldrich | C8786 | |
| L-Glutamine | Sigma-Aldrich | G3126 | |
| LH | Sigma-Aldrich | L6420 | |
| L-Histidine | Sigma-Aldrich | H9511 | |
| L-Isoleucine | Sigma-Aldrich | I7383 | |
| L-Leucine | Sigma-Aldrich | L1512 | |
| L-Lysine | Sigma-Aldrich | L1137 | |
| L-Methionine | Sigma-Aldrich | M2893 | |
| L-Ornithine | Sigma-Aldrich | O6503 | |
| L-Phenylalanine | Sigma-Aldrich | P5030 | |
| L-Proline | Sigma-Aldrich | P4655 | |
| L-Serine | Sigma-Aldrich | S5511 | |
| L-Tyrosine | Sigma-Aldrich | T1020 | |
| L-Valine | Sigma-Aldrich | V6504 | |
| Magnesium chloride heptahydrate (MgSO4.7H2O) | Sigma-Aldrich | M2393 | |
| Makler Counting Chamber | Sefi-Medical Instruments ltd.Biosigma S.r.l. | ||
| Medium 199 | Sigma-Aldrich | M5017 | |
| Mineral oil | Sigma-Aldrich | M8410 | |
| MitoTracker Red CM-H2XRos | ThermoFisher | M7512 | |
| New born calf serum heat inactivated (FCS) | Sigma-Aldrich | N4762 | |
| Penicillin G sodium salt | Sigma-Aldrich | P3032 | |
| Phenol Red | Sigma-Aldrich | P3532 | |
| Polyvinyl alcohol (87-90% hydrolyzed, average mol wt 30,000-70,000) | Sigma-Aldrich | P8136 | |
| Potassium Chloride (KCl) | Sigma-Aldrich | P5405 | |
| Potassium phosphate monobasic (KH2PO4) | Sigma-Aldrich | P5655 | |
| Propidium iodide | Sigma-Aldrich | P4170 | |
| Sheep serum | Sigma-Aldrich | S2263 | |
| Sodium azide | Sigma-Aldrich | S2202 | |
| Sodium bicarbonate (NaHCO3) | Sigma-Aldrich | S5761 | |
| Sodium chloride (NaCl) | Sigma-Aldrich | S9888 | |
| Sodium dl-lactate solution syrup | Sigma-Aldrich | L4263 | |
| Sodium pyruvate | Sigma-Aldrich | P2256 | |
| Sperm Class Analyzer | Microptic S.L. | S.C.A. v 3.2.0 | |
| Statistical software Minitab 18.1 | 2017 Minitab | ||
| Stereo microscope | Olimpus | SZ61 | |
| Streptomycin sulfate | Sigma-Aldrich | S9137 | |
| Taurine | Sigma-Aldrich | T7146 | |
| TRIS | Sigma-Aldrich | 15,456-3 |
References
- Arav, A.
- Mullen, S. F., Fahy, G. M. A chronologic review of mature oocyte vitrification research in cattle, pigs, and sheep. Theriogenology. 78 (8), 1709-1719 (2012).
- Hwang, I. S., Hochi, S. Recent progress in cryopreservation of bovine oocytes. BioMed Research International. 2014, (2014).
- Berlinguer, F., et al. Effects of trehalose co-incubation on in vitro matured prepubertal ovine oocyte vitrification. Cryobiology. 55 (1), (2007).
- Quan, G., Wu, G., Hong, Q. Oocyte Cryopreservation Based in Sheep: The Current Status and Future Perspective. Biopreservation and Biobanking. 15 (6), 535-547 (2017).
- Succu, S., et al. A recovery time after warming restores mitochondrial function and improves developmental competence of vitrified ovine oocytes. Theriogenology. 110, (2018).
- Succu, S., et al. Vitrification of in vitro matured ovine oocytes affects in vitro pre-implantation development and mRNA abundance. Molecular Reproduction and Development. 75 (3), (2008).
- Succu, S., et al. Vitrification Devices Affect Structural and Molecular Status of In Vitro Matured Ovine Oocytes. Molecular Reproduction and Development. 74, 1337-1344 (2007).
- Hosseini, S. M., Asgari, V., Hajian, M., Nasr-Esfahani, M. H. Cytoplasmic, rather than nuclear-DNA, insufficiencies as the major cause of poor competence of vitrified oocytes. Reproductive BioMedicine Online. , (2015).
- Succu, S., et al. Calcium concentration in vitrification medium affects the developmental competence of in vitro matured ovine oocytes. Theriogenology. 75 (4), (2011).
- Sanaei, B., et al. An improved method for vitrification of in vitro matured ovine oocytes; beneficial effects of Ethylene Glycol Tetraacetic acid, an intracellular calcium chelator. Cryobiology. 84, 82-90 (2018).
- Quan, G. B., Wu, G. Q., Wang, Y. J., Ma, Y., Lv, C. R., Hong, Q. H. Meiotic maturation and developmental capability of ovine oocytes at germinal vesicle stage following vitrification using different cryodevices. Cryobiology. 72 (1), 33-40 (2016).
- Fernández-Reyez, F., et al. maturation and embryo development in vitro of immature porcine and ovine oocytes vitrified in different devices. Cryobiology. 64 (3), 261-266 (2012).
- Ahmadi, E., Shirazi, A., Shams-Esfandabadi, N., Nazari, H. Antioxidants and glycine can improve the developmental competence of vitrified/warmed ovine immature oocytes. Reproduction in Domestic Animals. 54 (3), 595-603 (2019).
- Barrera, N., et al. Impact of delipidated estrous sheep serum supplementation on in vitro maturation, cryotolerance and endoplasmic reticulum stress gene expression of sheep oocytes. PLoS ONE. 13 (6), (2018).
- Walker, S. K., Hill, J. L., Kleemann, D. O., Nancarrow, C. D. Development of Ovine Embryos in Synthetic Oviductal Fluid Containing Amino Acids at Oviductal Fluid Concentrations. Biology of Reproduction. 55 (3), 703-708 (1996).
- Kuwayama, M., Vajta, G., Kato, O., Leibo, S. P. Highly efficient vitrification method for cryopreservation of human oocytes. Reproductive BioMedicine Online. 11 (3), 300-308 (2005).
- Wu, X., Jin, X., Wang, Y., Mei, Q., Li, J., Shi, Z. Synthesis and spectral properties of novel chlorinated pH fluorescent probes. Journal of Luminescence. 131 (4), 776-780 (2011).
- Dell'Aquila, M. E., et al. Prooxidant effects of verbascoside, a bioactive compound from olive oil mill wastewater, on in vitro developmental potential of ovine prepubertal oocytes and bioenergetic/oxidative stress parameters of fresh and vitrified oocytes. BioMed Research International. 2014, (2014).
- Gadau, S. D. Morphological and quantitative analysis on α-tubulin modifications in glioblastoma cells. Neuroscience Letters. 687, 111-118 (2018).
- los Reyes, M. D., Palomino, J., Parraguez, V. H., Hidalgo, M., Saffie, P. Mitochondrial distribution and meiotic progression in canine oocytes during in vivo and in vitro maturation. Theriogenology. , (2011).
- Leoni, G. G., et al. Differences in the kinetic of the first meiotic division and in active mitochondrial distribution between prepubertal and adult oocytes mirror differences in their developmental competence in a sheep model. PLoS ONE. 10 (4), (2015).
- Berlinguer, F., et al. Effects of trehalose co-incubation on in vitro matured prepubertal ovine oocyte vitrification. Cryobiology. 55 (1), 27-34 (2007).
- Serra, E., Gadau, S. D., Berlinguer, F., Naitana, S., Succu, S. Morphological features and microtubular changes in vitrified ovine oocytes. Theriogenology. 148, 216-224 (2020).
- Asgari, V., Hosseini, S. M., Ostadhosseini, S., Hajian, M., Nasr-Esfahani, M. H. Time dependent effect of post warming interval on microtubule organization, meiotic status, and parthenogenetic activation of vitrified in vitro matured sheep oocytes. Theriogenology. 75 (5), 904-910 (2011).
- Ciotti, P. M., et al. Meiotic spindle recovery is faster in vitrification of human oocytes compared to slow freezing. Fertility and Sterility. 91 (6), 2399-2407 (2009).
- Ledda, S., Bogliolo, L., Leoni, G., Naitana, S. Cell Coupling and Maturation-Promoting Factor Activity in In Vitro-Matured Prepubertal and Adult Sheep Oocytes1. Biology of Reproduction. 65 (1), 247-252 (2001).
- Palmerini, M. G., et al. In vitro maturation is slowed in prepubertal lamb oocytes: ultrastructural evidences. Reproductive Biology and Endocrinology. 12, (2014).
- Leoni, G. G., et al. Relations between relative mRNA abundance and developmental competence of ovine oocytes. Molecular Reproduction and Development. 74 (2), 249-257 (2007).
- Succu, S., et al. Effect of vitrification solutions and cooling upon in vitro matured prepubertal ovine oocytes. Theriogenology. 68 (1), 107-114 (2007).
- Larman, M. G., Sheehan, C. B., Gardner, D. K. Calcium-free vitrification reduces cryoprotectant-induced zona pellucida hardening and increases fertilization rates in mouse oocytes. Reproduction. 131 (1), 53-61 (2006).
- Yeste, M., Jones, C., Amdani, S. N., Patel, S., Coward, K. Oocyte activation deficiency: a role for an oocyte contribution. Human Reproduction Update. 22 (1), 23-47 (2016).
- Rienzi, L., et al. Oocyte, embryo and blastocyst cryopreservation in ART: systematic review and meta-analysis comparing slow-freezing versus vitrification to produce evidence for the development of global guidance. Human Reproduction Update. 23 (2), 139-155 (2017).
- De Santis, L., et al. Oocyte vitrification: influence of operator and learning time on survival and development parameters. Placenta. 32, 280-281 (2011).
- Zhang, X., Catalano, P. N., Gurkan, U. A., Khimji, I., Demirci, U. Emerging technologies in medical applications of minimum volume vitrification. Nanomedicine. 6 (6), London, England. 1115-1129 (2011).
