Summary
このプロトコルは、成体および若年性羊卵子のガラス化のための標準的な方法を提供することを目的としている。これは、体外成熟培地の調製から温暖化後の培養までのすべてのステップを含む。卵母細胞は最小必須容積を保障するためにクライオトップを使用してMII段階でガラス化される。
Abstract
家畜では、食肉処理場から容易に得ることができる多数の卵巣および卵母細胞のおかげで、インビトロ胚生産システムを開発し、持続させることができる。成人卵巣は常にいくつかの骨根卵胞を負担し、思春期前ドナーでは卵巣が四大葉包のピーク数を負担する4週齢で卵母細胞の最大数が利用可能である。したがって、4週齢の子羊は、成人の卵母細胞の発達能力が成人に比べて低い場合でも、良好なドナーとみなされる。
基礎研究と商業用途は、成人および前頭体ドナーの両方から得られたガラス状卵母細胞を正常に凍結保存する可能性によって後押しされるであろう。前立体ドナーから採取された卵母細胞のガラス化はまた、生成間隔を短くし、繁殖プログラムにおける遺伝的利益を増加させることも可能にする。しかし、凍結保存後の発達力の喪失は、哺乳類の卵母細胞をおそらく凍結保存するのが最も困難な細胞型の1つとなる。利用可能な凍結保存技術の中で、ガラス化は動物およびヒト卵母細胞に広く適用される。この技術の最近の進歩にもかかわらず、高濃度の凍結保護剤への暴露、ならびに冷たい傷害および浸透ストレスは依然としていくつかの構造的および分子的変化を誘発し、哺乳類卵母細胞の発達可能性を低下させる。ここでは、若年および成人ドナーから採取され、凍結保存の前に体外で成熟した羊の卵母細胞のガラス化のためのプロトコルについて述べている。このプロトコルには、卵母細胞の体外成熟からガラス化、温暖化および温暖化後のインキュベーション期間まで、すべての手順が含まれています。MII段階でガラス化された卵母細胞は、実際に温暖化後に受精することができるが、凍結保存手順による損傷を回復し、その発達可能性を高めるために受精前に余分な時間が必要である。したがって、温暖化後の培養条件およびタイミングは、特に卵母細胞が若年性ドナーから採取される場合、卵母細胞の発達可能性を回復するための重要なステップである。
Introduction
雌の配偶子の長期保存は、遺伝的選択プログラムによる家畜飼育の改善、元その場の野生動物種保護プログラムを通じた生物多様性の保全に寄与すること、および貯蔵された卵母細胞が体外胚生産または核移植プログラム1、2、3に組み込まれる可能性のおかげで、生体内バイオテクノロジーの研究と応用を促進するなど、幅広い用途を提供することができる。若年卵母細胞ガラス化はまた、繁殖プログラム4の生成間隔を短くすることによって遺伝的利益を増加させるだろう。卵母細胞の超急速冷却および温暖化によるガラス化は、現在、家畜卵母細胞凍結保存のための標準的なアプローチと考えられている5.反芻動物では、ガラス化の前に、卵母細胞は、通常、インビトロで成熟し、アバトワール由来卵巣から得られた卵胞から取り出した後2。成人、特に思春期前卵巣4,6は、凍結保存される卵母細胞の事実上無制限の数を実際に供給することができる。
牛では、卵子のガラス化および温暖化後、>10%の胚盤胞収量は、過去10年間にいくつかの実験室によって一般的に報告されている3。しかし、小さな反虫卵子では、卵形の卵形は、まだ若年卵母細胞と成人卵母細胞の両方について比較的新しいと考えられており、羊の卵母細胞のガラス化のための標準的な方法は、2,5に確立され続ける。最近の進歩にもかかわらず、ガラス化され、温めた卵母細胞は確かに彼らの発達の可能性7、8、9を制限するいくつかの機能的および構造的な変化を提示する。したがって、ガラス化/温めた羊の卵母細胞2では10%以上の胚盤胞発生を報告した記事はほとんどありません。上記の変更を減らすためにいくつかのアプローチが検討されている:ガラス化および解凍ソリューション10、11の組成を最適化する。異なるクライオデバイス8、12、13の使用を試してみる。そして、体外成熟(IVM)4、14、15および/または温暖化後の回復時間中に特定の治療を適用する6.
ここでは、若年性および成人ドナーから採取され、凍結保存の前に体外で成熟した羊の卵母細胞のガラス化のためのプロトコルについて説明する。このプロトコルには、卵母細胞の体外成熟からガラス化、温暖化および温暖化後の培養期間まで、すべての手順が含まれています。
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Protocol
動物の議定書および実施された手順は、欧州連合指令86/609/ECおよび欧州共同体委員会の勧告2007/526/ECに従って、サッサリ大学で施行されている倫理指針に従っています。
1. 卵母細胞操作用メディアの準備
- 0.1 g/L ペニシリンおよび 0.1 g/L ストレプトマイシン (PBS) で Dulbecco のリン酸緩衝生理食塩を補って、採取した卵巣の輸送のための培地を準備します。
- ペニシリンを添加したミリQ水1 Lで粉末に9.5 gの組織培養培地(TCM)199を希釈して卵母細胞の採取と成熟のための培地を準備する(0.1%)とストレプトマイシン (0.1%).
- 希釈後、100mLの培地を濾過し、1週間使用するストック成熟培地(SMM)として4°Cで保管します。
- 残りの900 mLを25 mM HEPES、0.36 g/L重炭酸塩、0.1%(w/v)ポリビニルアルコール(PVA)(pH 7.3、オスモラリティ290 mOsm/kg)で補って回収培地(CM)を調製します。
- 成熟培地に0.021 g/L重炭酸塩、10%熱処理されたエラスヒツジ血清、1 IU/mL FSH、1 IU/mL LH、100 μLのシステアミン、8 mg/mLのピルビン酸を加えて調製します。
注:10 mLの体積の成熟培地は、使用前に少なくとも4時間(空気中の5%CO2で39°Cで最大加湿雰囲気で)標準的な条件でインキュベートする必要があります。 - インビトロ成熟後の卵母細胞の操作のために塩基培地(BM)を準備し、CA++およびMg++を含まないPBSで成り、20%の胎児子牛血清(FCS)を補う。
2. 卵母細胞のコレクションと成熟
- 若年期(30-40日、体重6〜10kg)および成人卵巣から卵母細胞を回復する。
- 採取した卵巣を商業食肉処理場から27°CのPBSで1〜2時間以内に実験室に輸送する。
- PBS新鮮な培地で洗浄した後、マイクロブレードを使用してCMで卵巣をスライスし、卵胞含有量を放出する。
- 60倍の倍率で実体顕微鏡検査の下で、4-10層の顆粒球細胞、均一な細胞質を有する卵子、細胞質中の脂質滴の均質な分布、および外径約90μm(平均)を有するものを選択して、インビトロ成熟のためのcumulus-oocyte複合体(COC)を選択する。
- 選択したCOCsをCMで3回洗浄し、最後に成熟培地で移送します。
注意:若年卵子の場合、ガラス化後の生存率を向上させるために、100 μM トレハロースで成熟培地を補います。 - インビトロ成熟のために、300 μLのミネラルオイルで覆われた4ウェルペトリ皿で600 μLの成熟培地で30-35 COCを移し、39°Cで空気中5%CO2で22(成卵母細胞)/24(若い卵子)hでインキュベートします。
- インビトロ成熟後、穏やかにピペット処理することにより、cumulus細胞の脱ヌードCOC。60倍の倍率で実体顕微鏡で検査した後、第1極体の押出を示すものだけを選択し、したがって、形相II(MII)段階でガラス化を行う。
3. 精液の収集、凍結および解凍の手順
- ラムエクステンダー(200 mM Tris;70 mMクエン酸;55 mMフルクトース;pH 7.2、オスモラリティ300 mOsm/kg)で構成される精液凍結保存用の塩基培地を卵黄20%(v/v)で補う準備を行います。
- 羊の繁殖期(10月~11月)のみ、精液を回収してください。
- 人工膣による射精を成人のラム(2〜5歳)から取得し、屋外環境で維持し、ライブ体重維持配給を与える。ラムは別々のペンで隔離されますが、互いに視覚的に接触します。
- 各雄から少なくとも8つの射精を得るために、繁殖期中に週に1回精液採取を繰り返す。
- 採取後5分以内に環境温度で実験室に精液サンプルを輸送し、すぐに処理します。2~3個のラムの射精をプールし、精子濃度分光度測定を評価する。
- プール後、4%グリセロールを添加した精液凍結保存用のベース培地で最大400 x 106 精子/mLの射精を希釈する。その後、希釈した精液を2時間にわたって4°Cに冷却し、凍結する前に20分間平衡化します。
- 乾燥氷の上にペレット状(0.25 mL)の精液サンプルを凍結し、液体窒素に突っ込みます。
- 解凍の場合は、ペレットを殺菌ガラスハヤブサに入れ、39°Cで20sの水浴に突き刺します。
4. 体外受精と胚培養
- 合成排卵液(SOF)の体質のための在庫を準備します。
- ストックAを準備:ミリQ水の99.4 mL。NaClの6.29 g;0.534 g の KCl;0.161 g の KH2PO4;0.182 MgSO4 ·7H2Oのg;そして0.6mLの乳酸ナトリウム。4°Cで最大3ヶ月間保管してください。
- ストックBを準備:ミリク水の10 mL。0.210 グラムの NaHCO3;フェノールレッドの2-3グラム。4°Cで1ヶ月保存してください。
- ストックCを準備:ミリク水の10 mL。そして0.051gのピルビン酸ナトリウム。4°Cで1ヶ月保存してください。
- ストックDを準備:ミリク水の10 mL。CaCl2 2H 2 O. 1 ヶ月間 4 °C で保管する 0.262 g.
- 7.630 mLのミリQ水、1 mLのストックA、1 mLのストックB、0.07mLのストックC、0.7 mLのストックDからなるSOFの10 mLを準備します。
- 体外受精(IVF)培地を準備する:SOFは2%熱処理されたエストロスヒツジ血清、10 μg/mLヘパリンおよび1 μg/mL低酸素(浸透圧280-290 mOsm/kg)を補充した。
注:10 mLの体積のIVF培地は、使用前に少なくとも4時間前に(5%CO2、5%O2および90%N2の39°Cで最大加湿雰囲気で)標準的な条件でインキュベートする必要があります。
- 凍結/解凍した精液アリコートを、1.5mL以下の加温IVF培地の殺菌ガラス円錐管に移し、空気中5%CO2 の加湿雰囲気で39°Cで15分間インキュベートします。
- インキュベーション後、運動精子は液体カラムの素端部に向かって泳ぐ。最上層を収集し、精子の運動性評価のために観察します。
注:精子の運動性パラメータは、精子トラックの重複を避けるために取得した25フレーム、最小コントラスト10、平均パス30μm/秒の最小速度、および80%の直流性>進行運動性の設定を用いて、コンピュータ支援精子分析(CASA)システムを使用して評価する必要があります。このシステムはラム精子の評価のための特定のセットアップを有する。各サンプルに対して、精子懸濁液の5μLサブサンプルは、10 μmの深さの予め温めた分析チャンバにロードされます。精子の運動量は、位相コントラスト顕微鏡を用いて40倍で37°Cで評価され、サブサンプル当たり最低500個の精子を少なくとも4つの異なる顕微鏡分野で分析する必要があります。総運動量および進行性の運動性精子の割合を評価した。IVFの場合、進行性の運動精子の割合は30%≥すべきである。 - 希釈スイムアップ由来のモチル精子を1 x 106 精子/mL最終濃度で、4ウェルペトリ皿でミネラルオイルで覆われたIVF培地の300 μLのMII卵母細胞と共インキュベートする。
- 22時間後、ミネラルオイルの下で報告 された排卵濃度で0.4%のウシ血清アルブミンと必須および非必須アミノ酸を補充したSOFを含む4ウェルペトリ皿の推定ザイゴットを移し、胚盤胞期までの標準的な条件下でそれらを培養する。
- 22-、26-および32-hポスト授精で、60倍の拡大率を有する実体顕微鏡下での検査によって、2つの異なるブラストメアを示す切断卵母細胞の数を記録する。
- 培養の5日目から9日目まで毎日胚を観察し、新たに形成された胚盤胞は60倍の倍率で実体顕微鏡で検査によって記録されるべきである。
5. 卵母細胞のガラス化と温暖化
注:デバイスクライオトップ17を使用して最小必須ボリューム(MEV)の方法に従ってガラス化を行います。
- BMで2分間38.5°Cで5つの卵母細胞のグループを平衡化する。BMの使用は低カルシウム濃度を保証する([Ca2++]2.2 mg/dL)10.
- 7.5%(v/v)ジメチルスルホキシド(DMSO)と7.5%(v/v)エチレングリコール(EG)を含む平衡溶液への3分の露出で卵母細胞を脱水します。
- 卵母細胞を16.5%(v/v)DMSO、16.5%(v/v)EG、0.5 Mトレハロース(BM)を含むガラス化溶液に移し、クライオトップ装置にロードし、30s以内の液体窒素に直接突っ込みます。
- 生物学的温度に温めるには、液体窒素から38.5°Cで1分間BMの1.25Mトレハロースの200μL滴に各ガラス化装置の含有量を移し、穏やかに攪拌して混合を容易にします。
- 細胞内凍結保護剤の除去を促進するために、卵母細胞を減少するトレハロース溶液(0.5 M、0.25 M、0.125 Mトレハロース(BM中0.5M、0.125 Mトレハロース)を30秒に30秒に段階的に移し、BMで38.5°Cで10分間平衡化する。
6. 卵母細胞の品質の評価後温暖化
- 加温後、38.5°Cで空気中5%CO2でCa++およびMg++プラス20%FCS(BM)を使用せずにPBSで6時間の卵母細胞をインキュベートする。
注:ガラス化後に生物学的および構造的特徴を回復させる卵母細胞能力は、使用済み卵母細胞の種およびクラスに関連しています。 - 凍結保存損傷を回復する卵母細胞能力は時間依存性であるため、体外培養の異なる時点(0時間、2時間、4時間、6時間)で卵母細胞の品質を評価し、卵母細胞受精に最適なタイムウィンドウを定義する。
注:大人の羊の卵母細胞では、最適な時間は4時間の温暖化後です。思春期前の卵母細胞にとって、最適な時間は2時間の温暖化後である。
7. 卵母細胞生存率評価
- 温暖化直後および温暖化後培養の各時点について、100倍の倍率で反転した顕微鏡を用いて、形態学的に卵母細胞を評価する。
注:かすかな細胞質、損傷の透明帯および/または膜のような構造的変化を有する卵母細胞は退化として分類されるべきである。 - 二重微分蛍光染色を使用して膜完全性評価を検証します。
- ヨウ化プロピジウム(PI;10 μg/mL)とヘヒスト33342(10μg/mL)を含むBMの2mLで卵母細胞を38.5°Cで空気中5%CO2 で5分間インキュベートします。
- フレッシュBMで3回洗浄した後、350nmの励起フィルターと460nmのエミッションを用いて蛍光顕微鏡下で卵母細胞を観察し、535nmの励起フィルターとPI用617nmの放出を観察します。
注:無傷の膜を有する卵母細胞は、Hoechst 33342で着色されたDNAの青色蛍光によって認識することができる。損傷した膜を有する卵母細胞は、PIによるDNA染色による赤色蛍光を示す。
8. 共焦点レーザー走査顕微鏡によるミトコンドリア活性とROS細胞内レベルの評価
- ミトトラッカーレッドCM-H2XRos(MT-レッド)プローブを準備します。
- 1バイアル(50μg)の含有量を1 mLのDMSOで希釈し、1mM溶液を得る。希釈したバイアルを液体窒素に入れておいてください。
- 溶液をDMSOで1mM希釈して100μMのストック溶液を得て、暗闇の中で-80°Cに保存します。
- 2′,7'ジクロロジヒドロフルオレスセインジアセインジアセテート(H2DCF-DA)プローブを準備します。
- H2DCF-DAを0.1%ポリビニルピロリドン(PVA)/PBSで希釈し、最初の100 mM溶液を得る。溶液を暗闇の中で-80°Cに保つ。
- 1番目の溶液を0.1%PVA/PBSで希釈し、100 μMのストック溶液を得ます。暗闇の中で-20°Cに保管してください。
- 取り付け培地(MM)を準備する:10 mLのMMに対して、5mLのグリセロール、5 mLのPBS、250mgのアジドナトリウムを加えます。使用するまで-20°Cで保管してください。
- 卵母細胞をBMで38.5 °Cで30分間インキュベートし、500 nM MT-Red(ストック溶液:DMSOで100 μM)
- MT-Redプローブでインキュベーションした後、卵母細胞をBMで3回洗浄し、5μM H2DCF-DA(ストック溶液:BMで100μM)を含む同じ培地で20分間インキュベートします。
- プローブに曝した後、BMで卵母細胞を洗浄し、2.5%グルタルアルデヒド/PBSで少なくとも15分間固定します。
- 固定後、卵母細胞をBMで3回洗浄し、サンプルの圧縮を避けるためにワックスクッションを使用して1 mg /mL Hoechst 33342で4μLのMMドロップでガラススライドに取り付けます。
- スライドは、評価まで暗闇の中で4°Cで保存します。
- 共焦点レーザー走査顕微鏡で免疫標識切片の分析を行います。顕微鏡は40/60xのオイルの目的を使用して、Ar/He/Neレーザーが装備されている。連続的な励起によってセクションを分析する。
- ミトコンドリア評価では、MT-Red(露光:579 nm;放出:599nm)を検出するために、多光子レーザーでサンプルを観察してください。
- 488 nmのアルゴンイオンレーザー線とB-2 Aフィルタ(495nm露光および519nm放射)を用いてジクロロフルオレセイン(DCF)18を指摘する。
- 個々の卵母細胞において、赤道面19でMT-赤およびDCF蛍光強度を測定する。
- すべての画像取得中に一定の値で蛍光強度に関連するパラメータを維持します (レーザーエネルギー 26%, シーケンシャル設定 1: PMT1 ゲイン 649-PMT2 ゲイン 482;シーケンシャルセッティング2:PMT1ゲイン625-PMT2ゲイン589;オフセット 0;ピンホールサイズ:68)。
- Leica LAS AF Lite画像解析ソフトウェアパッケージを用いて蛍光強度の定量的分析を行い、20によって標準化された手順に従う。
- 赤道平面に到達するまで、Z軸上を移動して、一度画像をキャプチャします。
- 各写真について、グレースケールに変換し、チャンネル1(Hoechst青に関連)をオフにします。次に、meiotic スピンドルの周囲にある外接領域に、関心領域 (ROI) を手動で描画します。
注:ソフトウェアは、自動的にチャンネル2(FITC)のピクセル平均値を読み取り、そこから背景の値を差し引くことができます。 - ピクセルの平均値を記録し、統計分析のために送信します。
9. 統計分析
- 次の違いを分析する:若年対成卵母細胞の生存率、対照およびトレハロース処理の若年卵母細胞における生存率および発達能力、生存率およびパルテノ遺伝学的活性化率および異なるカルシウム濃度培地で生き生きとした成卵細胞の発生能力、受精率および胚産生は低カルシウム濃度または高カルシウム濃度で生分解される カイ二乗試験を用いた成人と若年のガラス化卵母細胞間の温暖化後培養とパルテノジェネティック活性化率の異なる時点。
- リヴェンの試験による均質分散の分析後、ANOVAによる温暖化後培養の異なる時点におけるミトコンドリア活性およびROS細胞内卵母細胞における異なる時点におけるガラス化成卵母細胞における切断率および胚出力を分析する。グループ間とグループ間の違いを強調するために、ポストホックテストTukeyの検定を使用します。
- 統計ソフトウェアプログラムを使用して統計分析を実行し、P < 0.05 の確率を最小の有意水準と考えます。すべての結果は、S.E.M±平均で表されます。
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Representative Results
若年性ドナーからの卵母細胞の凍結耐性は、成人の卵子に比べて低い。最初に観察された効果は、成体卵母細胞と比較して温暖化後生存率が低い(図1A;χ2試験P<0.001)。若年卵母細胞は、温暖化後の膜完全性の低下を示した(図1B)。成熟培地におけるトレハロースの使用は、この糖が若年卵母細胞の凍結傷害を減少させるかどうかを検証することを意図していた。データは、卵母細胞がトレハロース補充で24時間熟成したことを示している23は、非治療群と比較してガラス化/温暖化後の生存率が高いことを示した(表1:85.7%対75.3%それぞれ;χ2試験P<0.05)。トレハロース補充は、確かに温暖化後のより高い膜完全性と関連していた (図 2A).したがって、若年卵母細胞のインビトロ成熟時にトレハロースを使用すると、ガラス化後の生存率が増加した(85.7%)大人のものと同等の値に(90.3%)。しかしながら、若年卵母細胞の切断、受精および発達率は、トレハロース補充によって増加しなかった(表1)。
ガラス化後の卵母細胞能力を向上させるために、9.9〜0.4mg/dL10の範囲のカルシウム濃度を有する成人卵母細胞の異なるガラス化培地で試験した。得られた結果は、カルシウム濃度2.2mg/dLに等しい培地を使用すると、温暖化後の生存率が上昇し、成人卵母細胞10 の発生能力およびパラテノ遺伝学的活性化の低下を示した(表2)。そこで、若年卵子のガラス化について低カルシウムガラス化培地を試験した。 表3に示すように、低カルシウム濃度でガラス化された若年卵母細胞は、高カルシウム濃度でガラス化された卵母細胞と比較して高い受精率を証明した(それぞれ44.35%対32.29%)。P<0.05)が、胚の生産に違いは見つからなかった。
ガラス化/温め卵母細胞は、凍結保存手順による損傷を回復し、その発達の可能性を高めるために受精前に余分な時間を必要とします。以前の研究では、ATP細胞内濃度、ミトコンドリア活性およびインビトロ発育能力が、高い細胞内ROS濃度6を示すガラス化/解凍卵母細胞において減少することが確かに実証されている。これらの変化は、特に温暖化直後にマークされます。温暖化後の培養中、成人卵母細胞と若年卵母細胞の両方が、ガラス化手順6,24の間に被った損害から部分的に回復することができる。異なる期間(0、2、4、および6時間)の温暖化後培養を比較することにより、成人のewesから採取された培養卵母細胞の4時間後に、エネルギッシュバランス6と微小管セットアップ24を回復し、より高い切断(50.7±3.9%)で発達能力を回復できることを示しました。P<0.01 ANOVA)および胚盤胞率(14.40±1.3%;他の時点(0、2、6 h)と比較したANOVA P<0.01;表 4.したがって、温暖化後培養の4時間は、ガラス化/温めた成卵母細胞6の受精のための理想的な時間枠を表す。
同じ実験を、若年ドナーから採取した卵母細胞で繰り返した場合、これらの結果は部分的に確認された。ミトコンドリア活性は、他の時点(0、2、6;6;6;)と比較して、温暖化後培養の4時間後にガラス化/温めた若年卵子で高かった。図3:ANOVA P<0.01)。ミトコンドリア分布のいくつかのパターンが観察され、次の3つのグループに分類されます (報告されたように 21 ): パターン A: 小さな造粒を持つ均質な FINE 細胞質全体に広がりました;パターンB:大きな造粒を持つ均質な粒状分は、細胞質全体に広がる。パターンC:特に大きな造粒が存在する場合の異種CLUSTEREDは、細胞質全体に広がったり、特定の細胞質ドメインに位置していたりする。MIIにおける活性ミトコンドリアの細胞質分布における異なる型は、卵母細胞の発達能力に関連し得る。FINE均質分布は発達能力が乏しい指標であり、粒状分布およびCLUSTERED分布はミトコンドリア活性の増加に関連しており、結果的に高い発達能力22.ミトコンドリア分布パターンは、温暖化後培養の6時間の間に変化した。図4は、ミトコンドリア分布のパターンが異なる若年卵母細胞の例を示し、温暖化後培養中のそれらの変動を示す。パターンAは、長期のインキュベーション中に有意に増加し、6時間の温暖化後に高い値に達する(図4Aa:χ2P<0.05)、パターンBは温暖化後培養中に有意な変化を示さなかった(図4Bb)、パターンCは、延長培養中に任意の若年性ガラス化/温め卵母細胞に見つからなかった(図4Cc:χ2<P0.05)。
さらに、ROS細胞内レベルは、0、4、および6hと比較して、温暖化後培養の2時間で若年卵子において有意に低かった(図5:ANOVAP<0.001)。しかし、成体卵母細胞に見られたものとは対照的に、若年卵母細胞における温暖化後培養中に自発的なパルテノジェネティック活性化の割合が増加した(図6)。このため、若年卵母細胞における受精の推奨時間は、温暖化後培養後2時間となる。
図 1.若年性および成人ドナーから採取されたガラス化/温めたオビン卵母細胞の生存率。(A) 卵母細胞は、体外成熟後にガラス化した。生存率は、ヨウ化プロピジウム(10μg/mL)およびHoechst 33342(10μg/mL)による蛍光染色により、ガラス化および温暖化後に決定した。N = 165個の成人卵母細胞および170の若年卵子。異なる文字は、成人と若年卵母細胞の間に有意な違いを示します: χ2 テスト P<0.001. (B-C) 形態学的評価における(B)および損傷した原形質膜(C)を有するガラス化/温められた若年卵子の例(100倍倍率の反転顕微鏡)。スケールバー= 10 μm. この図の大きなバージョンを表示するには、ここをクリックしてください。
図 2.若年性オビン卵母細胞生存率および(TRH)と(CTR)トレハロース(成熟培地中の100mM)を伴う成熟後の体外発生能力。(A-B) 形態学的評価においてトレハロースを伴う(A)または(B)を補ったメディアにおけるインビトロ成熟後にガラス化された若年卵母細胞の例(100倍倍率の逆顕微鏡)。スケールバー= 30 μm. この図の大きなバージョンを表示するには、ここをクリックしてください。
図 3.体外培養中の異なる時点(0、2、4、6)におけるガラス化/温め若い卵母細胞における活性ミトコンドリア蛍光強度の定量化。 IVM卵母細胞をコントロールとして用いた(CTR N=77)。合計で163(0 h N= 45;2h N=39;4 h N=40;6h N=39)若年卵母細胞は、3つの独立した実験でガラス化および温めた。異なる文字は統計的に有意差を示します(ANOVA P = 0.0000)。 この図の大きなバージョンを表示するには、ここをクリックしてください。
図 4.体外培養における温暖化後6時間の間に、ガラス化/温めた若年卵母細胞におけるミトコンドリアパターンの分布。 微粒子 (A)、顆粒 (B) およびクラスター化 (C) ミトコンドリア分布の代表的な画像。 (D) 微細なミトコンドリア分布を示す若年のガラス化/温め卵母細胞の割合; (E) 顆粒性ミトコンドリア分布を示す若年性ガラス化/温卵母細胞の割合; (F) クラスター化されたミトコンドリア分布を示す若年性ガラス化/温卵母細胞の割合。IVM若年卵母細胞は、コントロールとして使用されました (CTR;N = 77)。合計で163(0 h N=45;2h N=39;4h N=40;6h N=39)で、3つの独立した実験でガラス化および温めた若年卵母細胞が使用された。異なる文字は統計的に有意差を示します(Aa:χ2 P = 0.026;Bb: χ2 P = 0.097;Cc: χ2 P = 0.014)。スケールバー= 30 μm. この図の大きなバージョンを表示するには、ここをクリックしてください。
図 5.体外培養後6時間の間にガラス化した若年卵母細胞における細胞内ROS蛍光強度の定量化。(A-B) IN vitro でのROS蛍光強度の代表的な画像は、成熟した(A)およびガラス化された(B)若年卵母細胞である。(C)異なる時点でのガラス化若卵細胞の蛍光強度の定量(0 h N=45;2 h N=39;4 h N=40;6 h N=39)の細胞内レベルのインビトロ培養中。 インビトロ 成熟した若年卵母細胞を対照として用いた(CTR N=77)。異なる文字は統計的に有意差を示します(ANOVA P = 0.0000)。スケールバー= 50 μm. この図の大きなバージョンを表示するには、ここをクリックしてください。
図 6.体育後6時間の体外培養中に、ガラス化若年卵母細胞および成体卵母細胞におけるパルテノジェネティック活性化。(A-B)卵母細胞パルテノジェネティック活性化の代表的な画像:(A)形相II-テロフェイズII転移および(B)前核形成における卵母細胞。(C)体育後の体育培養中の異なる時点(0,2,4,6時間)におけるパルテノ遺伝学的活性化成体および若年卵母細胞の割合。アスタリスクは、インキュベーションの各時点における若年卵母細胞と成人卵母細胞の間の統計的な違いを示します(ANOVA P = 0.000)。この図はSerraらから変更されました24スケールバー = 50 μm.この図の大きなバージョンを表示するには、ここをクリックしてください。
| 卵母細胞 (n) | 生存率 (%) | IVF (n) | 受精a (%) | 切断b (%) | 胚盤胞c (%) | |
| CTR | 73 | 75.3* | 452 | 91.1 | 96.1 | 14.3 |
| TRH | 77 | 85.7 | 470 | 92.5 | 95.4 | 13 |
| * カイスクエアテスト p<0.5 | ||||||
| A パーセントはIVF卵子で計算される | ||||||
| b 受精卵母細胞でパーセントが計算される | ||||||
| c 分母は切断卵母細胞で計算される | ||||||
表 1.若年性卵子生存率およびトレハロースおよびガラス化の有無を伴う成熟後の体外発生能力。TRH=若葉卵細胞は、トレハロース補充(成熟培地中で100mM)で成熟した。CTR =トレハロース補充なしで成熟した若年卵母細胞をコントロールする。生存率は、ヨウ化プロピジウム(10 μg/mL)およびヘヒスト33342(10 μg/mL)のガラス化/温められた卵母細胞による蛍光染色後に決定された。卵母細胞の発達能力は、インビトロ生産システムに組み込まれた後に決定した。a割合はIVF卵母細胞で計算されます。b受精卵母細胞でパーセント値を計算します。c分母は切断卵母細胞で計算される。* χ2テスト P<0.5.このテーブルはベルリンゲールら23から変更されました
| グループ | [Ca++]mg/dL | N卵母細胞 | 自然パルテノジェネティック活性化(%) | ビトリファイス卵母細胞 | 生き残った卵母細胞 (%) | 切断 (%) | 胚盤胞の出力(%) |
| TCM/FCS | 9.9 | 80 | 33 (41.2)a | 150 | 124 (82.7)a | 40 (32.5)a | 2 (1.6)a |
| PBS/FCS | 4.4 | 82 | 29 (35.3)ac | 115 | 88 (76.5)a | 33 (37.5)ae | 1 (1.1) |
| PBSCaMg フリー/FCS | 2.2 | 86 | 11 (12.7)b | 126 | 115 (91.3)b | 74 (64.3)b | 12 (10.4)b |
| PBS/BSA | 3.2 | 83 | 21 (25.3)c | 110 | 90 (81.8)a | 18 (20)c | 0 (0)a |
| PBSCaMgフリー/BSA | 0.4 | 87 | 10 (11.5)b | 149 | 123 (82.5)a | 57 (46.3) | 3 (2.4)b |
表 2.異なるカルシウム濃度を含むビトロ成熟した成人卵母細胞の発生能力は、ガラス化培地(16.5%エチレングリコール+16.5%ジメチルスルホキシド)でガラス化した。生存率と受精率は、ガラス化卵母細胞上で計算されます。全切断および胚盤胞の速度は生き残った卵母細胞で計算される。同じ列内の異なる添字を持つ値は大きく異なります: χ2検定 P<0.05.このテーブルはSuccuら10から変更されました
| [Ca 2++] ガラス化媒体 | いいえ。卵子 | ポストガラス化生存率 (%) | 受精率(%) | 切断 (%) | 胚盤胞の出力(%) |
| 高い [9.9 mg/dL] | 190 | 161 (84.73) | 52/161 (32.29)a | 43/161 (26.7) | 0 |
| 低い [2.2 mg/dL] | 150 | 124 (82.66) | 55/124 (44.35)b | 41/124 (33.1) | 0 |
表 3.体外受精後の受精および培養後の培養([Ca 2++]=9.9mg/dL)および低([Ca 2++]=2.2mg/dL)のカルシウム濃度をガラス化培地に用いた 異なる文字は、統計的な違いを示します(b P<0.05χ2 検定≠)。
| 温暖化後のインキュベーションの時間 | 切断率 (n) | 胚出力 (n) |
| 0 | 19.2 ± 3%a (82) | 0%a (17) |
| 2 | 41.8 ± 3%b (100) | 6.5 ± 1.3%b (42) |
| 4 | 50.7 ± 3%b (92) | 14.4 ± 1.3%c (48) |
| 6 | 26 ± 3%a (92) | 0%a (23) |
表 4.温暖化後培養の異なる時点で受精したガラス化/温化成卵母細胞における切断率および胚出力。 異なる文字は、同じ列内の統計的な違いを示します: ANOVA P<0.01.
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Discussion
家畜における卵母細胞凍結保存は、女性の遺伝資源の長期的な保存だけでなく、胚性バイオテクノロジーの開発を進めることができる。したがって、卵母細胞ガラス化のための標準的な方法の開発は、家畜と研究部門の両方に有利であろう。このプロトコルでは、成虫の羊卵子ガラス化のための完全な方法が提示され、若年卵母細胞のための効率的なガラス化システムの開発のための固体の出発点を表すことができる。
提案された方法の主な利点の1つは、卵母細胞コレクション、体外成熟、ガラス化、および温暖化からのすべてのステップが含まれていることである。さらに、卵母細胞が受精前のガラス化処置中に被った損害から回復することを可能にする温暖化後培養期間が含まれる。受精のための最適な時間は、凍結保存、初期卵母細胞の品質、患者の年齢、および種の方法に従って調整されるべきであり、時間回復と卵母細胞老化25、26の両方の側面を考慮することが不可欠である。したがって、温暖化後の培養期間の選択は困難であり、卵母細胞ガラス化プログラムの結果に影響を与える可能性があります。切断率および胚出力の観点から得られた結果に基づいて、および提示されたプロトコルに記載された条件の下で、ガラス化成羊卵母細胞の受精に最適な時期は、4時間後の温暖化後の培養後である(表4)6。この情報は、卵母細胞ガラス化プログラムを設計する際に重要です。
しかし、このプロトコルは、ガラス化/温めた成卵母細胞からの胚出力の点で許容可能な結果を与えながら、まだ若い卵母細胞に適用された場合、低〜ゼロ胚につながる。いくつかの構造的および機能的な制限は、小さいサイズ、積雲細胞と卵母細胞との間のカップリング不良、アミノ酸取り込みの減少、タンパク質合成およびエネルギー代謝の減少27、28、29のような、思春期前卵母細胞の発達能力を損なう。以前の研究では、前の研究では、前思春期の卵母細胞がガラス化手順30に対して高感度を示すことを報告しました。ガラス化および温暖化後に示される低い発達能力は、おそらく細胞骨格の再編成に関与する細胞質因子への損傷の結果であり、(または)成熟促進因子30の活性化に関する。表1に示すように、トレハロースを用いた成熟培地の補充は、非透過性凍結保護剤であり、ガラス化および加温後の生存率を成人卵母細胞4に匹敵する値まで増加させることができた。同様に、低カルシウム濃度のガラス化溶液を用い、ガラス化および温暖化後の若年卵母細胞の受精率が高くなる、表3に示す。したがって、体外成熟時の培養条件とガラス化培地組成物の両方の最適化は、ガラス化および温暖化後の若年卵母細胞の品質を高める上で助けとなるかもしれない。若年卵母細胞は、図3、4および5に示すように、ガラス化手順によって引き起こされた損傷から回復する能力を示す。
しかし、温暖化後の培養中の自発的なパルテノジェネティック活性化の高率は、依然としてその発達の可能性を制限している。一般的に使用されるエチレングリコールおよびDMSOは、実際の受精前に人工的に卵母細胞を活性化し、受精の成功および胚の発生を制限する可能性がある。彼らは実際に細胞内Ca2+ 濃度31の一過性増加を引き起こし、したがって皮質顆粒エキサイトーシス、前核形成、および射影再開32を引き起こす。実際、ガラス化は実際の受精前に人工的に卵母細胞を活性化し、それによって受精の成功および胚の発生を制限する。このようにして、カルシウムキレートは、若年卵母細胞における自発的な活性化の速度を制限することを目的として、ガラス化プロセス中のカルシウムの利用可能性をさらに制限するために使用することができる。
また、ゆっくりと冷凍とは異なり、ガラス化は排他的に手動技術であり、したがってオペレータ依存33、34であると考えるべきである。したがって、この方法を成功させるためには、訓練を受けた人材の利用可能性が重要な要素となります。まず、オペレータはガラス化する卵母細胞を適切に選択する必要があります。IVMの後、卵母細胞は、穏やかにcumulus細胞を脱婦し、細胞質を均一にしたものだけを凍結保存するために選択する立体顕微鏡の下で評価され、細胞質中の脂質滴の均質な分布と、外径は約90μmである。また、第1極体上の押出を示す卵母細胞のみ、したがってMII段階で、選択されなければならない。
卵母細胞の形態学的評価は数分で完了する必要があり、オペレータ依存性であること、それはその適切な実装の変動に非常に敏感である。選択手順を標準化するために、この方法は、成人卵母細胞のインビトロ成熟のための培養時間を22時間に制限することを示唆している。この時点で、高品質の羊の卵母細胞はすでに最初のマイオティック部門22 を完了しており、凍結保存のために選択することができます。このように、最初の大動脈分裂の完了で最も遅い卵母細胞の除去は、より簡単であるべきです。
オペレータはまた、最初の曝露から液体窒素への浸漬まで、ガラス化手順のタイミング設定を厳密に尊重する必要があります。もう一つの重要なステップは、使用されるガラス化装置における卵母細胞のローディングである。この手順では、最小サンプル量を使用して冷却速度を上昇させ、細胞が相転移温度を迅速に通過するのを助け、それによって凍結傷害を減少させる35。クライオトップはホルダーに付すポリプロピレンストリップを使用します。この方法では、ガラス化溶液(<0.1 μL)の卵母細胞に、フィルムストリップの上にガラスキャピラリーが急速にロードされます。次いで、溶液を除去し、凍結保存される細胞を覆うのに十分な薄層を残さなければならない。もう一度、このステップは、卵母細胞の暴露をガラス化溶液の高凍結保護剤濃度に制限するためにできるだけ速く完了する必要があり、これは浸透性ショックを引き起こし、細胞に有毒である可能性があります。
これらの理由から、この方法に関連する大きな課題は、手作業の取り扱いと熟練した技術者の必要性です。他の著者は、手動スキルの習得がガラス化手順34によって誘発される生物学的損傷を有意に減少させることができるので、卵母細胞ガラス化の結果が「学習曲線」効果の影響を受けて現れると報告した。研究者は、このようにガラス化手順の結果の評価における「オペレータ効果」を考慮に入れるべきです。
さらなる研究は、卵母細胞選択手順を標準化することと、若年卵母細胞のニーズに合わせて培地組成および培養条件をより適切に調整することに焦点を当てる。この点で, カルシウムキレートと抗酸化物質の両方の使用は有望な機会を提供することができます。.同様に、プロトコルの最適化により、ガラス化/温めた成人卵母細胞の発達能力を高めることが可能になる。
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Disclosures
著者らは、競合する財政的利益はないと宣言している。
Acknowledgments
著者たちはこの作品に対する具体的な資金を受け取っていなかった。マリア・グラツィア・カッパイ教授とヴァレリア・パシウ博士は、ビデオナレーションとビデオ制作中にラボを設置したことで感謝しています。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 2′,7′-Dichlorofluorescin diacetate | Sigma-Aldrich | D-6883 | |
| Albumin bovine fraction V, protease free | Sigma-Aldrich | A3059 | |
| Bisbenzimide H 33342 trihydrochloride (Hoechst 33342) | Sigma-Aldrich | 14533 | |
| Calcium chloride (CaCl2 2H20) | Sigma-Aldrich | C8106 | |
| Citric acid | Sigma-Aldrich | C2404 | |
| Confocal laser scanning microscope | Leica Microsystems GmbH,Wetzlar | TCS SP5 DMI 6000CS | |
| Cryotop Kitazato | Medical Biological Technologies | ||
| Cysteamine | Sigma-Aldrich | M9768 | |
| D- (-) Fructose | Sigma-Aldrich | F0127 | |
| D(+)Trehalose dehydrate | Sigma-Aldrich | T0167 | |
| Dimethyl sulfoxide (DMSO) | Sigma-Aldrich | D2438 | |
| Dulbecco Phosphate Buffered Saline | Sigma-Aldrich | D8537 | |
| Egg yolk | Sigma-Aldrich | P3556 | |
| Ethylene glycol (EG) | Sigma-Aldrich | 324558 | |
| FSH | Sigma-Aldrich | F4021 | |
| Glutamic Acid | Sigma-Aldrich | G5638 | |
| Glutaraldehyde | Sigma-Aldrich | G5882 | |
| Glycerol | Sigma-Aldrich | G5516 | |
| Glycine | Sigma-Aldrich | G8790 | |
| Heparin | Sigma-Aldrich | H4149 | |
| HEPES | Sigma-Aldrich | H4034 | |
| Hypoutarine | Sigma-Aldrich | H1384 | |
| Inverted microscope | Diaphot, Nikon | ||
| L-Alanine | Sigma-Aldrich | A3534 | |
| L-Arginine | Sigma-Aldrich | A3784 | |
| L-Asparagine | Sigma-Aldrich | A4284 | |
| L-Aspartic Acid | Sigma-Aldrich | A4534 | |
| L-Cysteine | Sigma-Aldrich | C7352 | |
| L-Cystine | Sigma-Aldrich | C8786 | |
| L-Glutamine | Sigma-Aldrich | G3126 | |
| LH | Sigma-Aldrich | L6420 | |
| L-Histidine | Sigma-Aldrich | H9511 | |
| L-Isoleucine | Sigma-Aldrich | I7383 | |
| L-Leucine | Sigma-Aldrich | L1512 | |
| L-Lysine | Sigma-Aldrich | L1137 | |
| L-Methionine | Sigma-Aldrich | M2893 | |
| L-Ornithine | Sigma-Aldrich | O6503 | |
| L-Phenylalanine | Sigma-Aldrich | P5030 | |
| L-Proline | Sigma-Aldrich | P4655 | |
| L-Serine | Sigma-Aldrich | S5511 | |
| L-Tyrosine | Sigma-Aldrich | T1020 | |
| L-Valine | Sigma-Aldrich | V6504 | |
| Magnesium chloride heptahydrate (MgSO4.7H2O) | Sigma-Aldrich | M2393 | |
| Makler Counting Chamber | Sefi-Medical Instruments ltd.Biosigma S.r.l. | ||
| Medium 199 | Sigma-Aldrich | M5017 | |
| Mineral oil | Sigma-Aldrich | M8410 | |
| MitoTracker Red CM-H2XRos | ThermoFisher | M7512 | |
| New born calf serum heat inactivated (FCS) | Sigma-Aldrich | N4762 | |
| Penicillin G sodium salt | Sigma-Aldrich | P3032 | |
| Phenol Red | Sigma-Aldrich | P3532 | |
| Polyvinyl alcohol (87-90% hydrolyzed, average mol wt 30,000-70,000) | Sigma-Aldrich | P8136 | |
| Potassium Chloride (KCl) | Sigma-Aldrich | P5405 | |
| Potassium phosphate monobasic (KH2PO4) | Sigma-Aldrich | P5655 | |
| Propidium iodide | Sigma-Aldrich | P4170 | |
| Sheep serum | Sigma-Aldrich | S2263 | |
| Sodium azide | Sigma-Aldrich | S2202 | |
| Sodium bicarbonate (NaHCO3) | Sigma-Aldrich | S5761 | |
| Sodium chloride (NaCl) | Sigma-Aldrich | S9888 | |
| Sodium dl-lactate solution syrup | Sigma-Aldrich | L4263 | |
| Sodium pyruvate | Sigma-Aldrich | P2256 | |
| Sperm Class Analyzer | Microptic S.L. | S.C.A. v 3.2.0 | |
| Statistical software Minitab 18.1 | 2017 Minitab | ||
| Stereo microscope | Olimpus | SZ61 | |
| Streptomycin sulfate | Sigma-Aldrich | S9137 | |
| Taurine | Sigma-Aldrich | T7146 | |
| TRIS | Sigma-Aldrich | 15,456-3 |
References
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