Summary
Het protocol is gericht op het bieden van een standaardmethode voor de vitrificatie van volwassen en juveniele schapenoöcyten. Het omvat alle stappen van de bereiding van de in vitro rijpingsmedia tot de post-opwarmingscultuur. Oöcyten worden in het MII-stadium ge verglaasd met behulp van Cryotop om het minimale essentiële volume te garanderen.
Abstract
Bij vee kunnen in vitro embryoproductiesystemen worden ontwikkeld en onderhouden dankzij het grote aantal eierstokken en oöcyten dat gemakkelijk uit een slachthuis kan worden verkregen. Volwassen eierstokken dragen altijd verschillende antrale follikels, terwijl bij pre-puberale donoren de maximale aantallen oöcyten beschikbaar zijn op de leeftijd van 4 weken, wanneer eierstokken piekaantallen antrale follikels dragen. 4 weken oude lammeren worden dus beschouwd als goede donoren, zelfs als de ontwikkelingscompetentie van prepubertale oöcyten lager is in vergelijking met hun volwassen tegenhanger.
Fundamenteel onderzoek en commerciële toepassingen zouden worden versterkt door de mogelijkheid om met succes gepreserveerde oöcyten te cryopreserveren die zijn verkregen van zowel volwassen als prepuberale donoren. De vitrificatie van oöcyt verzameld van prepuberale donoren zou ook het mogelijk maken om het generatie-interval te verkorten en zo de genetische winst in fokprogramma's te vergroten. Het verlies van ontwikkelingspotentieel na cryopreservatie maakt zoogdieroöcyten echter waarschijnlijk een van de moeilijkste celtypen om te cryopreserveren. Onder de beschikbare cryopreservatietechnieken wordt vitrificatie op grote schaal toegepast op dierlijke en menselijke oöcyten. Ondanks recente vooruitgang in de techniek veroorzaken blootstellingen aan hoge concentraties cryoprotectieve middelen, evenals koelschade en osmotische stress nog steeds verschillende structurele en moleculaire veranderingen en verminderen ze het ontwikkelingspotentieel van zoogdieroocyten. Hier beschrijven we een protocol voor de vitrificatie van schapenoöcyten verzameld bij jonge en volwassen donoren en gerijpt in vitro voorafgaand aan cryopreservatie. Het protocol omvat alle procedures, van oöcyt in vitro rijping tot vitrificatie, opwarming en incubatieperiode na opwarming. Oöcyten die in het MII-stadium worden geprefereerd, kunnen inderdaad worden bevrucht na opwarming, maar ze hebben extra tijd nodig voorafgaand aan de bevruchting om schade als gevolg van cryopreservatieprocedures te herstellen en hun ontwikkelingspotentieel te vergroten. Zo zijn de omstandigheden en timing van de cultuur na de opwarming cruciale stappen voor het herstel van het ontwikkelingsmogelijkheden van oöcyt, vooral wanneer oöcyt wordt verzameld bij jonge donoren.
Introduction
Langdurige opslag van de vrouwelijke gameten kan een breed scala aan toepassingen bieden, zoals het verbeteren van de fokkerij van huisdieren door genetische selectieprogramma's, het bijdragen aan het behoud van de biodiversiteit door middel van het ex-situ programma voor het behoud van diersoorten in de natuur, en het stimuleren van in vitro biotechnologisch onderzoek en toepassingen dankzij de beschikbaarheid van opgeslagen oöcyten die moeten worden opgenomen in in vitro embryoproductie of nucleaire transplantatieprogramma 's1,2,3. Juveniele oöcyt vitrificatie zou ook de genetische winst verhogen door het generatie-interval in fokprogramma's te verkorten4. Vitrificatie door ultrasnelle koeling en opwarming van oöcyten wordt momenteel beschouwd als een standaardbenadering voor cryopreservatie van dierlijke oöcyten5. Bij herkauwers worden oöcyten vóór vitrificatie meestal in vitro gerijpt, na het ophalen van follikels verkregen uit eierstokken van slachthuizen2. Volwassen, en vooral prepubertal eierstokken4,6, kunnen inderdaad een vrijwel onbeperkt aantal te cryopredienen oöcyten leveren.
Bij runderen, na oöcyt vitrificatie en opwarming, blastocyst opbrengsten op >10% zijn vaak gemeld door verschillende laboratoria in het afgelopen decennium3. Bij kleine herkauwers wordt oöcyt vitrificatie echter nog steeds als relatief nieuw beschouwd voor zowel juveniele als volwassen oöcyt, en een standaardmethode voor de vitrificatie van schapenöcyt moet nog worden vastgesteld2,5. Ondanks recente vooruitgang vertoont de verglaasde en opgewarmde oöcyt inderdaad verschillende functionele en structurele veranderingen die hun ontwikkelingspotentieel beperken7,8,9. Zo hebben weinig artikelen gemeld blastocyst ontwikkeling bij 10% of meer in verglaasde / opgewarmde schapenoöcyten2. Er zijn verschillende benaderingen onderzocht om de bovengenoemde wijzigingen te verminderen: optimalisering van de samenstelling van de vitrificatie- en ontdooioplossingen10,11; experimenteren met het gebruik van verschillende cryo-apparaten8,12,13; en het toepassen van specifieke behandelingen tijdens in vitro rijping (IVM)4,14,15 en/of tijdens de hersteltijd na opwarming6.
Hier beschrijven we een protocol voor de vitrificatie van schapenoöcyten verzameld bij jonge en volwassen donoren en gerijpt in vitro voorafgaand aan cryopreservatie. Het protocol omvat alle procedures, van oöcyt in vitro rijping tot vitrificatie, opwarming en post-warming cultuurperiode.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Het dierprotocol en de hieronder beschreven geïmplementeerde procedures zijn in overeenstemming met de ethische richtsnoeren die van kracht zijn aan de Universiteit van Sassari, in overeenstemming met Richtlijn 86/609/EG van de Europese Unie en de aanbeveling van de Commissie van de Europese Gemeenschappen 2007/526/EG.
1. Voorbereiding van media op oöcytmanipulatie
- Bereid het medium voor op het transport van verzamelde eierstokken door dulbecco's fosfaat gebufferde zoutoplossing aan te vullen met 0,1 g/L penicilline en 0,1 g/L streptomycine (PBS).
- Bereid het medium voor op het verzamelen en rijpen van oöcyten door 9,5 g weefselkweekmedium (TCM) 199 in poeder te verdunnen met 1 L Milli-Q-water aangevuld met penicilline (0,1%) en streptomycine (0,1%).
- Filter na verdunning 100 ml medium en bewaar het bij 4 °C als stockrijpingsmedium (SMM) voor een week.
- Bereid het verzamelmedium (CM) voor door de resterende 900 ml aan te vullen met 25 mM HEPES, 0,36 g/L bicarbonaat en 0,1% (m/v) polyvinylalcohol (PVA) (pH 7,3, osmolaliteit 290 mOsm/kg).
- Bereid het rijpingsmedium voor met SMM aangevuld met 0,021 g/L bicarbonaat, 10% warmtebehandeld oestrusschapenserum, 1 IE/ml FSH, 1 IE/ml LH, 100 μL cysteamine en 8 mg/ml pyruvaat.
OPMERKING: Het rijpingsmedium in een volume van 10 ml moet onder standaardomstandigheden (in een maximaal bevochtigde atmosfeer bij 39 °C in 5% CO2 in de lucht) gedurende ten minste 4 uur vóór gebruik worden geïncubeerd. - Bereid het basismedium (BM) voor op manipulatie van oöcyt na in vitro rijping, bestaande uit PBS zonder Ca++ en Mg++, aangevuld met 20% foetale kalfsserum (FCS).
2. Oöcyt collectie en rijping
- Herstel de oöcyten van juveniele (30-40 dagen oud, lichaamsgewicht 6-10 kg) en volwassen eierstokken.
- Vervoer de verzamelde eierstokken van het commerciële slachthuis naar het laboratorium binnen 1-2 uur in PBS bij 27 °C.
- Snijd na het wassen in PBS vers medium de eierstokken in CM met behulp van een microblad om het follikelgehalte vrij te geven.
- Selecteer bij een stereomicroscooponderzoek met 60x vergroting cumulus-oöcytcomplexen (COCs) voor in vitro rijping door die met 4-10 lagen granulosacellen te kiezen, oöcyt met een uniform cytoplasma, homogene verdeling van lipidedruppels in het cytoplasma en met een buitendiameter van ongeveer 90 μm (gemiddeld).
- Was de geselecteerde COC's drie keer in CM en breng ze uiteindelijk over in rijpingsmedium.
OPMERKING: Voor juveniele oöcyten, om de overleving na vitrificatie te verbeteren, vult u het rijpingsmedium aan met 100 μM trehalose. - Breng voor in vitro rijping 30-35 COC's in 600 μL rijpingsmedium over in vier-well petrischalen, bedekt met 300 μL minerale olie en incubeer ze gedurende 22 (volwassen oöcyten)/24 (juveniele oöcyten) h in 5% CO2 in de lucht bij 39 °C.
- Na in vitro rijping, denude COCs van cumulus cellen door zachtjes pipetting. Selecteer na het onderzoek onder een stereomicroscoop met 60x vergroting alleen die met de extrusie op het eerste polaire lichaam, en dus in metafase II (MII) stadium, voor vitrificatie.
3. Spermawinning, invriezen en ontdooien
- Bereid het basismedium voor sperma cryopreservatie bestaande uit ram extender (200 mM Tris; 70 mM citroenzuur; 55 mM fructose; pH 7,2, osmolaliteit 300 mOsm/kg) aangevuld met eigeel 20% (v/v).
- Verzamel het sperma alleen tijdens het schapenkweekseizoen (oktober-november).
- Verkrijg ejaculaten door kunstmatige vagina van volwassen rammen (2-5 jaar oud), onderhouden in een buitenomgeving en gevoed met een levend gewicht onderhoudsrantsoen. Houd rammen geïsoleerd in aparte pennen, maar met visueel contact tussen elkaar.
- Herhaal spermaverzameling één per week gedurende het hele broedseizoen om ten minste 8 ejaculaten van elk mannetje te verkrijgen.
- Transporteer de spermamonsters binnen 5 minuten na het verzamelen naar het laboratorium bij omgevingstemperatuur en verwerk ze onmiddellijk. Pool de ejaculaten van twee-drie rammen en evalueer spermaconcentratiespectrofotometrie.
- Verdun na het poolen de ejaculaten tot 400 x 106 spermatozoa/ml met basismedium voor sperma cryopreservatie aangevuld met 4% glycerol. Koel vervolgens het verdunde sperma af tot 4 °C gedurende een periode van 2 uur en equilibreer het gedurende 20 minuten voordat het invriest.
- Vries de spermamonsters in pelletvorm (0,25 ml) in op droog ijs en dompel ze vervolgens in vloeibare stikstof.
- Voor het ontdooien, doe de pellet in een gesteriliseerde glazen valk en dompel deze 20 s in een waterbad bij 39 °C.
4. In-vitrofertilisatie en embryocultuur
- Bereid de voorraden voor op de samenstelling van de synthetische oviductale vloeistof (SOF).
- Bereid voorraad A voor: 99,4 ml MilliQ-water; 6,29 g NaCl; 0,534 g KCl; 0,161 g KH2PO4; 0,182 g MgSO4 ·7H2O; en 0,6 ml natriumlactaat. Maximaal 3 maanden bij 4 °C bewaren.
- Bereid voorraad B voor: 10 ml MilliQ-water; 0,210 g NaHCO3; en 2-3 g Fenol Rood. 1 maand bij 4 °C bewaren.
- Bereid voorraad C voor: 10 ml MilliQ-water; en 0,051 g natriumpyrilaat. 1 maand bij 4 °C bewaren.
- Bereid voorraad D voor: 10 ml MilliQ-water; en 0,262 g CaCl2 2H2O. Gedurende 1 maand bij 4 °C bewaren.
- Bereid 10 ml SOF voor, bestaande uit 7,630 ml MilliQ-water, 1 ml voorraad A, 1 ml voorraad B, 0,07 ml voorraad C en 0,7 ml voorraad D.
- Bereid in vitro fertilisatie (IVF) medium: SOF aangevuld met 2% warmtebehandeld estrous schapenserum, 10 μg/ml heparine en 1 μg/ml hypoutarine (osmolaliteit 280-290 mOsm/kg).
OPMERKING: Het IVF-medium in een volume van 10 ml moet onder standaardomstandigheden worden geïncubeerd (in een maximaal bevochtigde atmosfeer bij 39 °C in 5% CO2,5% O2 en 90% N2)ten minste 4 uur voor gebruik.
- Breng bevroren/ontdooide sperma aliquots over in een gesteriliseerde glazen conische buis van minder dan 1,5 ml opgewarmd IVF-medium en incubeer ze gedurende 15 minuten bij 39 °C in een bevochtigde atmosfeer bij 5% CO2 in de lucht.
- Na incubatie zwemt de beweeglijke spermatozoa naar het apicale gedeelte van de vloeibare kolom. Verzamel de bovenste laag en observeer voor de evaluatie van de beweeglijkheid van het sperma.
OPMERKING: De parameters voor de beweeglijkheid van het sperma moeten worden beoordeeld met behulp van een computerondersteund spermaanalysesysteem (CASA) met de volgende instellingen: 25 frames die zijn verkregen om overlapping van spermasporen te voorkomen, minimaal contrast 10, minimale snelheid van het gemiddelde pad 30 μm/s en progressieve beweeglijkheid > 80% rechtheid. Dit systeem heeft een specifieke opstelling voor ram sperma evaluatie. Voor elk monster wordt 5 μL subsample spermasuspensie geladen in een voorverwarmde analysekamer met een diepte van 10 μm. De beweeglijkheid van sperma wordt beoordeeld bij 37 °C bij 40x met behulp van een fasecontrastmicroscoop en minimaal 500 sperma per subsample moet worden geanalyseerd in ten minste vier verschillende microscopische velden. Het percentage van het totale beweeglijke en progressieve beweeglijke sperma werd geëvalueerd. Voor de IVF moet het percentage progressieve beweeglijke spermatozoa worden ≥ 30%. - Verdun swim-up afgeleide beweeglijke spermatozoa bij 1 x 106 spermatozoa/ml eindconcentratie en incubeer ze met MII-oöcyten in 300 μL IVF-medium bedekt met minerale olie in vier-well Petrischalen.
- Breng na 22 uur de vermoedelijke zygotes over in vier-well Petrischaaltjes die SOF bevatten, aangevuld met 0,4% runderserumalbumine en essentiële en niet-essentiële aminozuren bij oviductale concentratie zoals gerapporteerd door16 onder minerale olie en kweek ze onder standaardomstandigheden tot de blastocystfase.
- Registreer bij 22-, 26- en 32-h post-inseminatie het aantal gespleten oöcyten, dat twee verschillende blastomeren laat zien, door het onderzoek onder een stereomicroscoop met 60x vergroting.
- Observeer de embryo's dagelijks vanaf de vijfde tot de negende dag van de kweek en nieuw gevormde blastocysten moeten worden geregistreerd door het onderzoek onder een stereomicroscoop met 60x vergroting.
5. Oöcyt vitrificatie en opwarming
OPMERKING: Voer vitrificatie uit volgens de methode van minimaal essentieel volume (MEV) met behulp van cryotopen van het apparaat17.
- Equilibreren van een groep van vijf oöcyten bij 38,5 °C gedurende 2 minuten in BM. Het gebruik van BM garandeert een lage calciumconcentratie ([Ca2++] 2,2 mg/dl)10.
- Dehydrateer de oöcyten met een blootstelling van 3 minuten aan equilibratieoplossing die 7,5% (v/v) dimethylsulfoxide (DMSO) en 7,5% (v/v) ethyleenglycol (EG) in BM bevat.
- Breng de oöcyten over naar de vitrificatieoplossing die 16,5% (v/v) DMSO, 16,5% (v/v) EG en 0,5 M trehalose in BM bevat voordat u ze in een cryotopapparaat laadt en ze binnen 30 s direct in vloeibare stikstof stort.
- Om op te warmen tot een biologische temperatuur, brengt u het gehalte van elk vitrificatieapparaat over van vloeibare stikstof in 200 μL druppels van 1,25 M trehalose in BM gedurende 1 min bij 38,5 °C en roert u voorzichtig om het mengen te vergemakkelijken.
- Om de verwijdering van intracellulaire cryoprotectiva te bevorderen, moet oöcyten stapsgewijs worden overgedragen in 200 μL druppels afnemende trehaloseoplossingen (0,5 M, 0,25 M, 0,125 M trehalose in BM) gedurende 30 s bij 38,5 °C voordat ze gedurende 10 minuten bij 38,5 °C in BM worden geëquilibreerd.
6. Beoordeling van de oöcytkwaliteit na de opwarming
- Na opwarming incubeer je de oöcyten gedurende 6 uur in PBS zonder Ca++ en Mg++ plus 20% FCS (BM) in 5% CO2 in de lucht bij 38,5 °C.
OPMERKING: Het oöcytvermogen om biologische en structurele kenmerken na vitrificatie te herstellen is in relatie tot de soorten en klassen van gebruikte oöcyten. - Aangezien het oöcytvermogen om cryopreservatieschade te herstellen tijdsafhankelijk is, beoordeelt u de oöcytkwaliteit op verschillende tijdstippen van in vitro cultuur (0 h, 2 h, 4 h, 6 h) na opwarming, om het optimale tijdvenster voor oöcytbemesting te definiëren.
OPMERKING: Bij volwassen schapenocyt is de optimale tijd 4 uur na het opwarmen; voor prepubertal oöcyt, is de optimale tijd 2 h na het verwarmen.
7. Oöcyt overlevingsbeoordeling
- Onmiddellijk na het opwarmen en voor elk tijdstip van post-opwarmingscultuur, morfologisch evalueren oöcyten met behulp van een omgekeerde microscoop met 100x vergroting.
OPMERKING: Oöcyten met structurele veranderingen, zoals zwak cytoplasma, beschadiging van zona pellucida en/of membraan, moeten als ontaard worden geclassificeerd. - Valideer de membraanintegriteitsevaluatie met behulp van een dubbele differentiële fluorescerende kleuring.
- Incubeer de oöcyten in 2 ml BM met propidiumjodide (PI; 10 μg/ml) en Hoechst 33342 (10 μg/ml) gedurende 5 min in 5% CO2 in de lucht bij 38,5 °C.
- Na driemaal wassen in verse BM, observeer de oöcyten onder een fluorescerende microscoop met behulp van een excitatiefilter van 350 nm en een emissie van 460 nm voor Hoechst 33342 en een excitatiefilter van 535 nm en een emissie van 617 nm voor PI.
OPMERKING: Oöcyten met een intact membraan zijn te herkennen aan de blauwe fluorescentie van gekleurd DNA met Hoechst 33342. Oöcyt met beschadigde membranen vertoont een rode fluorescentie als gevolg van DNA-kleuring met PI.
8. Evaluatie van mitochondriale activiteit en ROS intracellulaire niveaus door confocale laserscanmicroscopie
- Bereid de MitoTracker Red CM-H2XRos (MT-Red) sonde voor.
- Verdun het gehalte van 1 flacon (50 μg) met 1 ml DMSO om een oplossing van 1 ml te verkrijgen. Bewaar de verdunde flacon in vloeibare stikstof.
- Verdun de oplossing 1 mM met DMSO om de 100 μM voorraadoplossing te verkrijgen en bewaar deze bij -80 °C in het donker.
- Bereid 2′,7′-dichloorodiehydrofluoresceïnediacetaat (H2DCF-DA) sonde voor.
- Verdun de H2DCF-DA in 0,1% polyvinyl pyrrolidone (PVA)/PBS om de eerste 100 mM oplossing te verkrijgen. Houd de oplossing bij -80 °C in het donker .
- Verdun de eerste oplossing in 0,1% PVA/PBS om de 100 μM voorraadoplossing te verkrijgen. Bewaar het bij -20 °C in het donker.
- Bereid het montagemedium (MM) voor: voeg voor 10 ml MM 5 ml glycerol, 5 ml PBS en 250 mg natriumaziide toe. Bewaar het bij -20 °C tot gebruik.
- Incubeer de oöcyten gedurende 30 minuten bij 38,5 °C in BM met 500 nM MT-Red (stamoplossing: 100 μM in DMSO).
- Was na incubatie met mt-rode sonde de oöcyten driemaal in BM en incubeer gedurende 20 minuten in hetzelfde medium met 5 μM H2DCF-DA (stamoplossing: 100 μM in BM).
- Na blootstelling aan de sondes, was de oöcyten in BM en fixeer in 2,5% glutaraldehyde / PBS gedurende ten minste 15 minuten.
- Was na fixatie de oöcyten driemaal in BM en monteer ze op glazen dia's in een druppel van 4 μL MM met 1 mg/ml Hoechst 33342 met waskussens om compressie van monsters te voorkomen.
- Bewaar dia's bij 4 °C in het donker tot de evaluatie.
- Voer de analyse uit van immunoactief gelabelde secties met een confocale laserscanmicroscoop. De microscoop is uitgerust met Ar/He/Ne lasers, met behulp van een 40/60x olie objectief. Analyseer de secties door opeenvolgende excitatie.
- Voor mitochondriale evaluatie, observeer de monsters met een multifoton laser om MT-Red te detecteren (blootstelling: 579 nm; emissie: 599 nm).
- Gebruik een argonionenlaserstraal bij 488 nm en het B-2 A-filter (495 nm blootstelling en 519 nm emissie) om het dichloorfluoresceïne (DCF) aan te wijzen18.
- Meet in elke afzonderlijke oöcyt mt-rode en DCF-fluorescentieintensiteiten op het equatoriale vlak19.
- Behoud parameters met betrekking tot fluorescentie-intensiteit bij constante waarden tijdens alle beeldaanwinsten (laserenergie 26%, Sequentiële instellingen 1: PMT1-versterking 649-PMT2-gain 482; Sequentiële instelling 2: PMT1-versterking 625-PMT2-versterking 589; offset 0; pinhole grootte: 68).
- Voer kwantitatieve analyse van fluorescentie-intensiteit uit met behulp van het Leica LAS AF Lite beeldanalysesoftwarepakket, volgens de procedures gestandaardiseerd door20.
- Leg de foto's één keer vast, bewegend op de Z-as, totdat het equatoriale vlak is bereikt.
- Voor elke foto werd transformeren naar grijstinten en kanaal 1 (gerelateerd aan Hoechst blauw) uitgeschakeld. Teken vervolgens handmatig een regio van belang (ROI) op een omschreven gebied, dat zich rond de meiotische spindel bevindt.
OPMERKING: De software kan automatisch de pixelgemiddelde waarde op kanaal 2 (FITC) lezen, waarbij de waarde van de achtergrond ervan wordt afgetrokken. - Noteer de gemiddelde waarden van pixels en dien in voor statistische analyse.
9. Statistische analyses
- Analyseer de volgende verschillen: overlevingspercentages in juveniele versus volwassen oöcyten, overlevingspercentages en ontwikkelingscompetentie in controle- en trehalosebehandelde juveniele oöcyten, overlevings- en parthenogenetische activeringspercentages en ontwikkelingscompetentie van volwassen oöcyten gesaldeerd met verschillende calciumconcentratiemedia, bevruchtingspercentages en embryoproductie in juveniele oöcyten verglaasd met lage of hoge calciumconcentratie, actieve mitochondriën fenotypes in juveniele geglazuurde oöcyten tijdens verschillende tijdspunten van post-opwarmingscultuur en parthenogenetische activeringssnelheden tussen volwassen en juveniele verglaasde oöcyten met behulp van de chi-vierkante test.
- Analyseer de decolletésnelheid en embryo-output in geglazuurde volwassen oöcyten tijdens verschillende tijdspunten van post-opwarmingscultuur, fluorescentie-intensiteit van mitochondriale activiteit en ROS intracellulaire niveaus in juveniele verglaasde oöcyten tijdens verschillende tijdspunten van post-opwarmingscultuur door ANOVA na analyse op homogeniteit van variantie door levene's test. Gebruik een post-hoc test Tukey's test om verschillen tussen en tussen groepen te markeren.
- Voer statistische analyses uit met behulp van het statistische softwareprogramma en beschouw een waarschijnlijkheid van P < 0,05 als het minimale significantieniveau. Alle resultaten worden uitgedrukt als gemiddelde ± S.E.M.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
De cryotolerantie van oöcyt van jonge donoren is lager in vergelijking met volwassen donoren. Het eerste waargenomen effect is een lagere overlevingskans na opwarming in vergelijking met volwassen oöcyten (figuur 1A; χ2 test P<0,001). Juveniele oöcyten vertoonden een lagere membraanintegriteit na opwarming (figuur 1B). Het gebruik van trehalose in het rijpingsmedium was bedoeld om te controleren of deze suiker cryo-verwondingen in juveniele oöcyten kon verminderen. De gegevens hebbenaangetoond 23 dat oöcyten gerijpt voor 24 uur met trehalose suppletie toonden hogere overlevingskansen na vitrificatie / opwarming in vergelijking met de niet-behandelde groep (Tabel 1: 85,7% vs 75,3% respectievelijk; χ2 test P<0.05). Trehalose suppletie werd inderdaad geassocieerd met een hogere membraan integriteit na opwarming (Figuur 2A). Zo verhoogde het gebruik van trehalose tijdens de in vitro rijping van juveniele oöcyten de overlevingskansen na vitrificatie (85,7%) waarden die vergelijkbaar zijn met die van volwassenen (90,3%). Decolleté, bevruchting en ontwikkelingssnelheden van juveniele oöcyten werden echter niet verhoogd door trehalosesuppletie (Tabel 1).
Om de oöcytcompetentie na vitrificatie te verbeteren, testten we in volwassen eicellen verschillende vitrificatiemedia met calciumconcentraties variërend van 9,9 tot 0,4 mg/dl10. Verkregen resultaten toonden aan dat het gebruik van media met een calciumconcentratie gelijk aan 2,2 mg/dl verhoogde overlevingskansen na opwarming, verbeterde ontwikkelingscompetentie en verminderde parthenogenetische activering van volwassen oöcyt10 (Tabel 2). Zo hebben we de lage calcium vitrificatie media getest op de vitrificatie van juveniele oöcyten. Zoals blijkt uit tabel 3,vertoonden juveniele oöcyten met een lage calciumconcentratie hogere bemestingspercentages in vergelijking met oöcyten met een hoge calciumconcentratie (respectievelijk 44,35% versus 32,29 %; P<0,05), maar er werden geen verschillen gevonden in de embryoproductie.
Verglaasde/opgewarmde oöcyten hebben extra tijd nodig voorafgaand aan de bevruchting om schade als gevolg van cryopreservatieprocedures te herstellen en hun ontwikkelingspotentieel te vergroten. Een eerdere studie heeft inderdaad aangetoond dat atp intracellulaire concentratie, mitochondriale activiteit en in vitro ontwikkelingscompetentie worden verminderd in verglaasde/ontdooide oöcyten, die ook hoge intracellulaire ROS-concentraties vertonen6. Deze veranderingen worden bijzonder onmiddellijk na het opwarmen gemarkeerd. Tijdens de post-opwarmingscultuur kunnen zowel volwassen als juveniele oöcyten gedeeltelijk herstellen van de schade die is opgelopen tijdens de vitrificatieprocedures6,24. Door de post-opwarmingscultuur van verschillende duur (0, 2, 4 en 6 uur) te vergelijken, toonden we aan dat na 4 uur kweekoöcyten verzameld van volwassen ooien in staat zijn om de energetische balans6 en microtubulaire opstelling24 te herstellen en de ontwikkelingscompetentie te herstellen met een hoger decolleté (50,7 ± 3,9%; P< 0,01 ANOVA) en blastocyst-tarieven (14,40 ± 1,3%; ANOVA P< 0,01) in vergelijking met andere tijdspunten (0, 2 en 6 uur; Tabel 4). 4 uur post-opwarmingscultuur vertegenwoordigt dus het ideale tijdvenster voor bevruchting van verglaasde / opgewarmde volwassen oöcyten6.
Toen hetzelfde experiment werd herhaald met oöcyten verzameld bij juveniele donoren, werden deze resultaten gedeeltelijk bevestigd. Mitochondriale activiteit was hoger in verglaasde/opgewarmde juveniele oöcyten na 4 uur post-opwarmingscultuur in vergelijking met andere tijdspunten (0, 2, 6; Figuur 3: ANOVA P<0,01). Verschillende patronen van mitochondriale distributie worden waargenomen en ingedeeld in de volgende drie groepen (zoals gerapporteerd door21 ): Patroon A: homogene FINE met kleine granulaties verspreid over het cytoplasma; Patroon B: homogeen GRANULATIES met grote granulaties verspreid over het cytoplasma; Patroon C: heterogeen GECLUSTERD wanneer bijzonder grote granulaties aanwezig waren, verspreid over het cytoplasma of gelegen in specifieke cytoplasmatische domeinen. De verschillende fenotypes in de cytoplasmaverdeling van actieve mitochondriale in MII kunnen worden gerelateerd aan oöcytontwikkelingscompetentie. Een FINE homogene verdeling is een indicator van een slechte ontwikkelingscompetentie , terwijl een GRANULAR - en CLUSTERED-verdeling verband houden met een verhoogde mitochondriënactiviteit en bijgevolg een hogere ontwikkelingscompetentie22. Mitochondriale distributiepatronen veranderden tijdens 6 uur post-opwarming cultuur. Figuur 4 toont voorbeelden van juveniele oöcyten met verschillende patronen van mitochondriale distributie en hun fluctuaties tijdens de post-opwarmingscultuur. Het patroon A neemt aanzienlijk toe tijdens de langdurige incubatie en bereikt de hogere waarde bij 6 uur na opwarming (Figuur 4Aa: χ2 P<0,05), het patroon B vertoonde geen significante veranderingen tijdens de post-opwarmingscultuur (Figuur 4Bb), het patroon C werd niet gevonden in een juveniele verglaasde/opgewarmde oöcyt tijdens de langdurige incubatie (Figuur 4Cc: χ2 P<0.05).
Bovendien waren de ros-intracellulaire spiegels significant lager in juveniele oöcyten na 2 uur na de opwarming van de cultuur in vergelijking met 0, 4 en 6 uur(figuur 5: ANOVA P<0.001). In tegenstelling tot wat werd aangetroffen in volwassen oöcyten, nam de snelheid van spontane parthenogenetische activering echter toe tijdens de post-opwarmingscultuur in juveniele oöcyten (figuur 6). Om deze reden zou het aanbevolen tijdstip voor bevruchting in juveniele oöcyten 2 uur na de post-opwarmingscultuur zijn.
Figuur 1. Overlevingspercentages van verglaasde/opgewarmde eicelocyt verzameld bij jonge en volwassen donoren. (A) Oöcyt werd verglaasd na in vitro rijping. Overlevingskansen werden bepaald na vitrificatie en opwarming door fluorescerende kleuring met propidiumjodide (10 μg/ml) en Hoechst 33342 (10 μg/ml). N = 165 volwassen oöcyten en 170 juveniele oöcyten. Verschillende letters wijzen op significante verschillen tussen volwassen en juveniele oöcyten: χ2 test P<0,001. (B-C) Voorbeelden van verglaasde/opgewarmde juveniele oöcyten met intact (B) en beschadigd plasmamembraan (C) bij de morfologische evaluatie (omgekeerde microscoop met 100x vergroting). Schaalbalk = 10 μm. Klik hier om een grotere versie van deze afbeelding te bekijken.
Figuur 2. Overlevingspercentages van juveniele eicelöcyt en in vitro ontwikkelingscompetentie na rijping met (TRH) en zonder (CTR) trehalose (100 mM in rijpingsmedium). (A-B) Voorbeelden van juveniele oöcyten verglaasd na in vitro rijping in media aangevuld (A) met of (B) zonder trehalose bij de morfologische evaluatie (omgekeerde microscoop met 100x vergroting). Schaalbalk = 30 μm. Klik hier om een grotere versie van deze afbeelding te bekijken.
Figuur 3. Kwantificering van actieve mitochondriale fluorescentie-intensiteit in verglaasde/opgewarmde juveniele oöcyten op verschillende tijdstippen (0, 2, 4, 6) tijdens post-warming in vitro kweek. IVM-oöcyten werden gebruikt als controle (CTR N = 77). In totaal werden 163 (0 h N = 45; 2 h N = 39; 4 h N = 40; 6 h N = 39) juveniele oöcyten ge verglaasd en opgewarmd in drie onafhankelijke experimenten. Verschillende letters duiden op statistisch significante verschillen (ANOVA P = 0,0000). Klik hier om een grotere versie van deze afbeelding te bekijken.
Figuur 4. Verdeling van het mitochondriale patroon in verglaasde/opgewarmde juveniele oöcyten gedurende 6 uur post-warming in vitro kweek. Representatieve beelden van fijne (A), korrelige (B) en geclusterde (C) mitochondriale verdeling in verglaasde/opgewarmde juveniele oöcyten. D) percentage juveniele verglaasde/opgewarmde oöcyten met een fijne mitochondriale verdeling; E) percentage juveniele verglaasde/opgewarmde oöcyten met een korrelige mitochondriale verdeling; (F) Percentage juveniele verglaasde/opgewarmde oöcyten met een geclusterde mitochondriale verdeling. IVM juveniele oöcyten werden gebruikt als controle (CTR; N = 77). In totaal werden 163 (0 h N = 45; 2 h N = 39; 4 h N = 40; 6 h N = 39) juveniele oöcyten gesmeerd en opgewarmd in drie onafhankelijke experimenten. Verschillende letters geven statistisch significante verschillen aan (Aa: χ2 P = 0,026; Bb: χ2 P = 0,097; Cc: χ2 P = 0,014). Schaalbalk = 30 μm. Klik hier om een grotere versie van deze afbeelding te bekijken.
Figuur 5. Kwantificering van intracellulaire ROS fluorescentie-intensiteit in verglaasde juveniele oöcyten gedurende 6 uur na opwarming in vitro kweek. (A-B) Representatieve beelden van ros fluorescentie intensiteit in in vitro gerijpte (A) en verglaasde (B) juveniele oöcyten. (C) Intracellulaire ros-niveaus zoals bepaald door kwantificering van fluorescentie-intensiteit in geglazuurde juveniele oöcyten op verschillende tijdstippen (0 h N=45; 2 h N=39; 4 h N=40; 6 h N=39) tijdens post-warming in vitro cultuur. In vitro gerijpte juveniele oöcyten werden gebruikt als controle (CTR N = 77). Verschillende letters duiden op statistisch significante verschillen (ANOVA P = 0,0000). Schaalbalk = 50 μm. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Figuur 6. Parthenogenetische activering in verglaasde juveniele en volwassen oöcyten gedurende 6 uur post-warming in vitro kweek. (A-B) Representatieve beelden van oöcyt parthenogenetische activering: (A) oöcyt in metafase II-telophase II overgang en (B) pronucleus vorming. (C) Percentages parthenogenetische geactiveerde volwassen en juveniele oöcyten op verschillende tijdstippen (0, 2, 4, 6 uur) tijdens post-warming in vitro kweek. Sterretjes duiden op statistische verschillen tussen juveniele en volwassen oöcyten op elk moment van incubatie (ANOVA P = 0,000). Dit cijfer is gewijzigd van Serra et al.24 Schaalbalk = 50 μm. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
| Oöcyten (n) | Overlevingskans (%) | IVF (n) | Bevruchteen (%) | Gespletenb (%) | Blastocystenc (%) | |
| Ctr | 73 | 75.3* | 452 | 91.1 | 96.1 | 14.3 |
| Trh | 77 | 85.7 | 470 | 92.5 | 95.4 | 13 |
| * Chi vierkante test p<0.5 | ||||||
| a Percentages worden berekend op IVF-oöcyten | ||||||
| b Percentages worden berekend op bevruchte oöcyten | ||||||
| c Percentages worden berekend op gespleten oöcyten | ||||||
Tabel 1. Overlevingspercentages van juveniele eicellenoocyten en in vitro ontwikkelingscompetentie na rijping met en zonder trehalose en vitrificatie. TRH = juveniele oöcyten gerijpt met trehalose suppletie (100 mM in rijpingsmedium). CTR = controle juveniele oöcyten gerijpt zonder trehalose suppletie. Overlevingskansen werden bepaald na fluorescerende kleuring met propidiumjodide (10 μg/ml) en Hoechst 33342 (10 μg/ml) van verglaasde/verwarmde oöcyten. De ontwikkelingscompetentie van oöcyt werd bepaald na opname in een in vitro productiesysteem. een Percentages worden berekend op IVF-oöcyten. b Percentages worden berekend op bevruchte oöcyten. c Percentages worden berekend op gespleten oöcyten. * χ2 test P<0,5. Deze tabel is gewijzigd van Berlinguer et al.23
| groepen | [Ca++] mg/dl | N oöcyt | Spontane parthenogenetische activering (%) | Geglazuurde oöcyten | Overleefde en IVF-oöcyten (%) | Decolleté (%) | Blastocysten output (%) |
| TCM/FCS | 9.9 | 80 | 33 (41,2)a | 150 | 124 (82,7)a | 40 (32,5)a | 2 (1.6)a |
| PBS/FCS | 4.4 | 82 | 29 (35,3)ac | 115 | 88 (76,5)a | 33 (37,5)ae | 1 (1.1)a |
| PBSCaMg gratis/FCS | 2.2 | 86 | 11 (12,7)b) b | 126 | 115 (91,3)b | 74 (64,3)b | 12 (10,4)b |
| PBS/BSA | 3.2 | 83 | 21 (25,3)c | 110 | 90 (81,8)a | 18 (20)c | 0 (0)a |
| PBSCaMg gratis/BSA | 0.4 | 87 | 10 (11,5)b | 149 | 123 (82,5)a | 57 (46,3)de | 3 ( 2.4)b |
Tabel 2. Ontwikkelingscompetentie van in vitro gerijpte volwassen oöcyten verglaasd in vitrificatiemedia (16,5% ethyleenglycol + 16,5% dimethylsulfoxide) die verschillende calciumconcentraties bevatten. Overlevings- en bevruchtingspercentages worden berekend op verglaasde oöcyten; totale decolleté- en blastocystsnelheden worden berekend op overleefde oöcyten. Waarden met verschillende subscripts binnen dezelfde kolom zijn significant verschillend: χ2 test P<0,05. Deze tabel is gewijzigd van Succu et al.10
| [Ca 2++] in vitrificatiemedia | Nee. Oöcyten | Overlevingskans na vitrificatie (%) | Bemestingspercentage (%) | Decolleté (%) | Blastocyst-uitgang (%) |
| Hoog [9,9 mg/dl] | 190 | 161 (84.73) | 52/161 (32,29)a | 43/161 (26.7) | 0 |
| Laag [2,2 mg/dl] | 150 | 124 (82.66) | 55/124 (44.35)b | 41/124 (33.1) | 0 |
Tabel 3. Bevruchtings- en ontwikkelingssnelheden na in-vitrofertilisatie en kweek van verglaasde/opgewarmde juveniele oöcyt met behulp van hoge ([Ca 2++] = 9,9 mg/dl) en lage ([Ca 2++] = 2,2 mg/dl) calciumconcentratie in vitrificatiemedia. Verschillende letters geven statistisch verschil aan (a ≠ b P<0,05 χ2-test).
| Uren van post-opwarming incubatie | Decolletésnelheid (n) | Embryo-output (n) |
| 0 | 19,2 ± 3%a (82) | 0%a (17) |
| 2 | 41,8 ± 3%b (100) | 6,5 ± 1,3%b (42) |
| 4 | 50,7 ± 3%b (92) | 14,4 ± 1,3%c (48) |
| 6 | 26 ± 3%a (92) | 0%a (23) |
Tabel 4. Decolletésnelheid en embryoproductie in verglaasde/opgewarmde volwassen eicellen bevrucht op verschillende tijdstippen van post-opwarmingscultuur. Verschillende letters geven statistisch verschil aan binnen dezelfde kolom: ANOVA P<0.01.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Oöcyt cryopreservatie bij huisdieren kan niet alleen de instandhouding van vrouwelijke genetische hulpbronnen op lange termijn mogelijk maken, maar ook de ontwikkeling van embryonale biotechnologie bevorderen. De ontwikkeling van een standaardmethode voor oöcyt vitrificatie zou dus zowel de veehouderij als de onderzoekssector ten goed komen. In dit protocol wordt een volledige methode voor volwassen schapenocyt vitrificatie gepresenteerd en zou een solide uitgangspunt kunnen zijn voor de ontwikkeling van een efficiënt vitrificatiesysteem voor juveniele oöcyt.
Een van de belangrijkste voordelen van de voorgestelde methode is dat deze alle stappen omvat van oöcytverzameling, in vitro rijping, vitrificatie en opwarming. Bovendien omvat het een cultuurperiode na de opwarming om oöcyten in staat te stellen zich te herstellen van de schade die tijdens de vitrificatieprocedure is opgelopen voordat ze worden bevrucht. De optimale tijd voor bevruchting moet worden afgestemd op de methode van cryopreservatie, initiële oöcytkwaliteit, leeftijd van de patiënt en soorten, omdat het essentieel is om beide aspecten van tijdherstel en oöcytveroudering25,26te overwegen . Het kiezen van de duur van de incubatieperiode na de opwarming is dus een uitdaging en het kan de uitkomst van oöcyt vitrificatieprogramma's beïnvloeden. Op basis van de verkregen resultaten in termen van decolletésnelheden en embryoproductie, en onder de in het gepresenteerde protocol beschreven omstandigheden, is de optimale tijd voor bevruchting van ge verglaasde volwassen schapenoöcyten na 4 uur post-opwarming incubatie (Tabel 4)6. Deze informatie is cruciaal bij het ontwerpen van een oöcyt vitrificatie programma.
Dit protocol geeft echter aanvaardbare resultaten in termen van embryoproductie uit verglaasde/opgewarmde volwassen oöcyten, maar leidt nog steeds tot embryo's van lage tot nul als ze op juveniele oöcyten worden toegepast. Verschillende structurele en functionele beperkingen tasten prepubertale oöcytontwikkelingscompetentie aan, zoals kleine omvang, gebrekkige koppeling tussen cumuluscellen en oöcyten, afname van aminozuuropname, verminderde eiwitsynthese en energiemetabolisme 27,28,29. In een eerdere studie meldden we dat prepubertale oöcyten een hoge gevoeligheid vertonen voor de vitrificatieprocedure30. De lage ontwikkelingscompetentie die wordt aangetoond na vitrificatie en opwarming is waarschijnlijk het gevolg van schade aan cytoplasmatische factoren die betrokken zijn bij de reorganisatie van het cytoskelet en (of) bij de activering van rijpingsbevorderende factor30. Zoals blijkt uit tabel 1, was de suppletie van het rijpingsmedium met trehalose, een niet-doorlatend cryoprotectant, in staat de overlevingskansen na vitrificatie en opwarming te verhogen tot waarden die vergelijkbaar zijn met die van volwassen oöcyten4. Op dezelfde manier verhoogt het gebruik van vitrificatieoplossing met lage calciumconcentraties de bevruchtingspercentages van juveniele oöcyten na vitrificatie en opwarming, zoals weergegeven in tabel 3. Zo kan zowel de optimalisatie van de kweekomstandigheden tijdens in vitro rijping als van de samenstelling van de vitrificatiemedia helpen bij het verhogen van de kwaliteit van de juveniele oöcyt na vitrificatie en opwarming. Juveniele oöcyten vertonen enig vermogen om te herstellen van de schade veroorzaakt door de vitrificatieprocedure, zoals weergegeven in figuur 3, 4 en 5.
De hoge percentages spontane parthenogenetische activering tijdens de post-opwarmingscultuur beperken echter nog steeds hun ontwikkelingspotentieel. Ethyleenglycol en DMSO, die veelgebruikte cryoprotectieve middelen zijn, kunnen de oöcyt kunstmatig activeren vóór de daadwerkelijke bevruchting, waardoor het bevruchtingssucces en de embryoontwikkeling worden beperkt. Ze kunnen inderdaad een voorbijgaande toename van intracellulaire Ca2+ concentratie31veroorzaken , waardoor corticale granulaat exocytose, pronucleivorming en meiotische hervatting32worden geactiveerd . In feite kan vitrificatie de oöcyt kunstmatig activeren vóór de daadwerkelijke bevruchting, waardoor het bevruchtingssucces en de embryoontwikkeling worden beperkt. Calcium chelator kan dus worden gebruikt om de beschikbaarheid van calcium tijdens het vitrificatieproces verder te beperken met als doel de snelheid van spontane activering in juveniele oöcyten te beperken.
Er moet ook rekening mee worden gehouden dat, in tegenstelling tot langzaam invriezen, vitrificatie een uitsluitend handmatige techniek is en dus afhankelijk is van de gebruiker33,34. De beschikbaarheid van opgeleid personeel is dus een belangrijke factor voor het succes van deze methode. Allereerst moet de operator de te verglaasen oöcyten goed selecteren. Na IVM worden oöcyten voorzichtig ontnauwd van cumuluscellen en geëvalueerd onder een stereomicroscoop om alleen die met een uniform cytoplasma, homogene verdeling van lipidedruppels in het cytoplasma en met een buitendiameter van ongeveer 90 μm voor cryopreservatie te selecteren. Bovendien moeten alleen oöcyten worden geselecteerd die de extrusie op het eerste polaire lichaam, en dus in het MII-stadium, vertonen.
De morfologische evaluatie van de oöcyten moet binnen enkele minuten worden voltooid en is afhankelijk van de operator, het is zeer gevoelig voor variaties in de juiste uitvoering ervan. Om de selectieprocedure te helpen standaardiseren, stelt de methode voor om de kweektijd voor in vitro rijping te beperken tot 22 uur voor volwassen oöcyten. Op dit moment hebben schapenoöcyten van hoge kwaliteit de eerste meiotische divisie22 al voltooid en kunnen ze worden geselecteerd voor cryopreservatie. Op deze manier zou de eliminatie van lage kwaliteit oöcyten, die de langzaamste zijn in de voltooiing van de eerste meiotische deling, eenvoudiger moeten zijn.
De bediener moet ook de timing voor de vitrificatieprocedure strikt respecteren, van de eerste blootstelling aan het cryoprotectant tot de onderdompeling in vloeibare stikstof. Een andere kritieke stap is het laden van de oöcyt in het gebruikte vitrificatieapparaat. De procedure moet minimale monstervolumes gebruiken om de koelsnelheid te verhogen en cellen te helpen de faseovergangstemperatuur snel door te komen, waardoor cryo-verwondingenafnemen 35. Cryotop maakt gebruik van een polypropyleen strip bevestigd aan een houder. Bij deze methode worden de oöcyten in de vitrificatieoplossing (<0,1 μL) snel geladen met een glazen capillair bovenop de filmstrip. Vervolgens moet de oplossing worden verwijderd, waarbij een dunne laag achterblijft die voldoende is om de cellen te bedekken die cryopreserved moeten worden. Nogmaals, deze stap moet zo snel mogelijk worden voltooid om de blootstelling van de oöcyten aan de hoge cryoprotectantconcentraties van de vitrificatieoplossing te beperken, die osmotische schokken kunnen veroorzaken en giftig zijn voor de cellen.
Om deze redenen is een grote uitdaging in verband met deze methode de behoefte aan handmatige bediening en bekwame technicus. Andere auteurs meldden dat het resultaat van de oöcytsglazuur lijkt te worden beïnvloed door een "leercurve"-effect, omdat het verwerven van handmatige vaardigheden de biologische schade die door de vitrificatieprocedure wordt veroorzaakt, aanzienlijk kan verminderen34. Onderzoekers moeten dus rekening houden met het "operatoreffect" bij de evaluatie van de uitkomst van de vitrificatieprocedure.
Verdere studies zullen zich zowel richten op het standaardiseren van de oöcytselectieprocedure als op een betere aanpassing van de mediasamenstelling en cultuuromstandigheden aan de behoeften van de juveniele oöcyten. In dit opzicht kan zowel het gebruik van calcium chelator als antioxidanten veelbelovende kansen bieden. Evenzo zal de optimalisatie van het protocol het mogelijk maken de ontwikkelingscompetentie van geglazuurde / opgewarmde volwassen oöcyten te vergroten.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
De auteurs verklaren geen concurrerende financiële belangen te hebben.
Acknowledgments
De auteurs kregen geen specifieke financiering voor dit werk. Professor Maria Grazia Cappai en Dr. Valeria Pasciu worden dankbaar erkend voor de video voice-over en voor het opzetten van het lab tijdens het maken van de video.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 2′,7′-Dichlorofluorescin diacetate | Sigma-Aldrich | D-6883 | |
| Albumin bovine fraction V, protease free | Sigma-Aldrich | A3059 | |
| Bisbenzimide H 33342 trihydrochloride (Hoechst 33342) | Sigma-Aldrich | 14533 | |
| Calcium chloride (CaCl2 2H20) | Sigma-Aldrich | C8106 | |
| Citric acid | Sigma-Aldrich | C2404 | |
| Confocal laser scanning microscope | Leica Microsystems GmbH,Wetzlar | TCS SP5 DMI 6000CS | |
| Cryotop Kitazato | Medical Biological Technologies | ||
| Cysteamine | Sigma-Aldrich | M9768 | |
| D- (-) Fructose | Sigma-Aldrich | F0127 | |
| D(+)Trehalose dehydrate | Sigma-Aldrich | T0167 | |
| Dimethyl sulfoxide (DMSO) | Sigma-Aldrich | D2438 | |
| Dulbecco Phosphate Buffered Saline | Sigma-Aldrich | D8537 | |
| Egg yolk | Sigma-Aldrich | P3556 | |
| Ethylene glycol (EG) | Sigma-Aldrich | 324558 | |
| FSH | Sigma-Aldrich | F4021 | |
| Glutamic Acid | Sigma-Aldrich | G5638 | |
| Glutaraldehyde | Sigma-Aldrich | G5882 | |
| Glycerol | Sigma-Aldrich | G5516 | |
| Glycine | Sigma-Aldrich | G8790 | |
| Heparin | Sigma-Aldrich | H4149 | |
| HEPES | Sigma-Aldrich | H4034 | |
| Hypoutarine | Sigma-Aldrich | H1384 | |
| Inverted microscope | Diaphot, Nikon | ||
| L-Alanine | Sigma-Aldrich | A3534 | |
| L-Arginine | Sigma-Aldrich | A3784 | |
| L-Asparagine | Sigma-Aldrich | A4284 | |
| L-Aspartic Acid | Sigma-Aldrich | A4534 | |
| L-Cysteine | Sigma-Aldrich | C7352 | |
| L-Cystine | Sigma-Aldrich | C8786 | |
| L-Glutamine | Sigma-Aldrich | G3126 | |
| LH | Sigma-Aldrich | L6420 | |
| L-Histidine | Sigma-Aldrich | H9511 | |
| L-Isoleucine | Sigma-Aldrich | I7383 | |
| L-Leucine | Sigma-Aldrich | L1512 | |
| L-Lysine | Sigma-Aldrich | L1137 | |
| L-Methionine | Sigma-Aldrich | M2893 | |
| L-Ornithine | Sigma-Aldrich | O6503 | |
| L-Phenylalanine | Sigma-Aldrich | P5030 | |
| L-Proline | Sigma-Aldrich | P4655 | |
| L-Serine | Sigma-Aldrich | S5511 | |
| L-Tyrosine | Sigma-Aldrich | T1020 | |
| L-Valine | Sigma-Aldrich | V6504 | |
| Magnesium chloride heptahydrate (MgSO4.7H2O) | Sigma-Aldrich | M2393 | |
| Makler Counting Chamber | Sefi-Medical Instruments ltd.Biosigma S.r.l. | ||
| Medium 199 | Sigma-Aldrich | M5017 | |
| Mineral oil | Sigma-Aldrich | M8410 | |
| MitoTracker Red CM-H2XRos | ThermoFisher | M7512 | |
| New born calf serum heat inactivated (FCS) | Sigma-Aldrich | N4762 | |
| Penicillin G sodium salt | Sigma-Aldrich | P3032 | |
| Phenol Red | Sigma-Aldrich | P3532 | |
| Polyvinyl alcohol (87-90% hydrolyzed, average mol wt 30,000-70,000) | Sigma-Aldrich | P8136 | |
| Potassium Chloride (KCl) | Sigma-Aldrich | P5405 | |
| Potassium phosphate monobasic (KH2PO4) | Sigma-Aldrich | P5655 | |
| Propidium iodide | Sigma-Aldrich | P4170 | |
| Sheep serum | Sigma-Aldrich | S2263 | |
| Sodium azide | Sigma-Aldrich | S2202 | |
| Sodium bicarbonate (NaHCO3) | Sigma-Aldrich | S5761 | |
| Sodium chloride (NaCl) | Sigma-Aldrich | S9888 | |
| Sodium dl-lactate solution syrup | Sigma-Aldrich | L4263 | |
| Sodium pyruvate | Sigma-Aldrich | P2256 | |
| Sperm Class Analyzer | Microptic S.L. | S.C.A. v 3.2.0 | |
| Statistical software Minitab 18.1 | 2017 Minitab | ||
| Stereo microscope | Olimpus | SZ61 | |
| Streptomycin sulfate | Sigma-Aldrich | S9137 | |
| Taurine | Sigma-Aldrich | T7146 | |
| TRIS | Sigma-Aldrich | 15,456-3 |
References
- Arav, A.
- Mullen, S. F., Fahy, G. M. A chronologic review of mature oocyte vitrification research in cattle, pigs, and sheep. Theriogenology. 78 (8), 1709-1719 (2012).
- Hwang, I. S., Hochi, S. Recent progress in cryopreservation of bovine oocytes. BioMed Research International. 2014, (2014).
- Berlinguer, F., et al. Effects of trehalose co-incubation on in vitro matured prepubertal ovine oocyte vitrification. Cryobiology. 55 (1), (2007).
- Quan, G., Wu, G., Hong, Q. Oocyte Cryopreservation Based in Sheep: The Current Status and Future Perspective. Biopreservation and Biobanking. 15 (6), 535-547 (2017).
- Succu, S., et al. A recovery time after warming restores mitochondrial function and improves developmental competence of vitrified ovine oocytes. Theriogenology. 110, (2018).
- Succu, S., et al. Vitrification of in vitro matured ovine oocytes affects in vitro pre-implantation development and mRNA abundance. Molecular Reproduction and Development. 75 (3), (2008).
- Succu, S., et al. Vitrification Devices Affect Structural and Molecular Status of In Vitro Matured Ovine Oocytes. Molecular Reproduction and Development. 74, 1337-1344 (2007).
- Hosseini, S. M., Asgari, V., Hajian, M., Nasr-Esfahani, M. H. Cytoplasmic, rather than nuclear-DNA, insufficiencies as the major cause of poor competence of vitrified oocytes. Reproductive BioMedicine Online. , (2015).
- Succu, S., et al. Calcium concentration in vitrification medium affects the developmental competence of in vitro matured ovine oocytes. Theriogenology. 75 (4), (2011).
- Sanaei, B., et al. An improved method for vitrification of in vitro matured ovine oocytes; beneficial effects of Ethylene Glycol Tetraacetic acid, an intracellular calcium chelator. Cryobiology. 84, 82-90 (2018).
- Quan, G. B., Wu, G. Q., Wang, Y. J., Ma, Y., Lv, C. R., Hong, Q. H. Meiotic maturation and developmental capability of ovine oocytes at germinal vesicle stage following vitrification using different cryodevices. Cryobiology. 72 (1), 33-40 (2016).
- Fernández-Reyez, F., et al. maturation and embryo development in vitro of immature porcine and ovine oocytes vitrified in different devices. Cryobiology. 64 (3), 261-266 (2012).
- Ahmadi, E., Shirazi, A., Shams-Esfandabadi, N., Nazari, H. Antioxidants and glycine can improve the developmental competence of vitrified/warmed ovine immature oocytes. Reproduction in Domestic Animals. 54 (3), 595-603 (2019).
- Barrera, N., et al. Impact of delipidated estrous sheep serum supplementation on in vitro maturation, cryotolerance and endoplasmic reticulum stress gene expression of sheep oocytes. PLoS ONE. 13 (6), (2018).
- Walker, S. K., Hill, J. L., Kleemann, D. O., Nancarrow, C. D. Development of Ovine Embryos in Synthetic Oviductal Fluid Containing Amino Acids at Oviductal Fluid Concentrations. Biology of Reproduction. 55 (3), 703-708 (1996).
- Kuwayama, M., Vajta, G., Kato, O., Leibo, S. P. Highly efficient vitrification method for cryopreservation of human oocytes. Reproductive BioMedicine Online. 11 (3), 300-308 (2005).
- Wu, X., Jin, X., Wang, Y., Mei, Q., Li, J., Shi, Z. Synthesis and spectral properties of novel chlorinated pH fluorescent probes. Journal of Luminescence. 131 (4), 776-780 (2011).
- Dell'Aquila, M. E., et al. Prooxidant effects of verbascoside, a bioactive compound from olive oil mill wastewater, on in vitro developmental potential of ovine prepubertal oocytes and bioenergetic/oxidative stress parameters of fresh and vitrified oocytes. BioMed Research International. 2014, (2014).
- Gadau, S. D. Morphological and quantitative analysis on α-tubulin modifications in glioblastoma cells. Neuroscience Letters. 687, 111-118 (2018).
- los Reyes, M. D., Palomino, J., Parraguez, V. H., Hidalgo, M., Saffie, P. Mitochondrial distribution and meiotic progression in canine oocytes during in vivo and in vitro maturation. Theriogenology. , (2011).
- Leoni, G. G., et al. Differences in the kinetic of the first meiotic division and in active mitochondrial distribution between prepubertal and adult oocytes mirror differences in their developmental competence in a sheep model. PLoS ONE. 10 (4), (2015).
- Berlinguer, F., et al. Effects of trehalose co-incubation on in vitro matured prepubertal ovine oocyte vitrification. Cryobiology. 55 (1), 27-34 (2007).
- Serra, E., Gadau, S. D., Berlinguer, F., Naitana, S., Succu, S. Morphological features and microtubular changes in vitrified ovine oocytes. Theriogenology. 148, 216-224 (2020).
- Asgari, V., Hosseini, S. M., Ostadhosseini, S., Hajian, M., Nasr-Esfahani, M. H. Time dependent effect of post warming interval on microtubule organization, meiotic status, and parthenogenetic activation of vitrified in vitro matured sheep oocytes. Theriogenology. 75 (5), 904-910 (2011).
- Ciotti, P. M., et al. Meiotic spindle recovery is faster in vitrification of human oocytes compared to slow freezing. Fertility and Sterility. 91 (6), 2399-2407 (2009).
- Ledda, S., Bogliolo, L., Leoni, G., Naitana, S. Cell Coupling and Maturation-Promoting Factor Activity in In Vitro-Matured Prepubertal and Adult Sheep Oocytes1. Biology of Reproduction. 65 (1), 247-252 (2001).
- Palmerini, M. G., et al. In vitro maturation is slowed in prepubertal lamb oocytes: ultrastructural evidences. Reproductive Biology and Endocrinology. 12, (2014).
- Leoni, G. G., et al. Relations between relative mRNA abundance and developmental competence of ovine oocytes. Molecular Reproduction and Development. 74 (2), 249-257 (2007).
- Succu, S., et al. Effect of vitrification solutions and cooling upon in vitro matured prepubertal ovine oocytes. Theriogenology. 68 (1), 107-114 (2007).
- Larman, M. G., Sheehan, C. B., Gardner, D. K. Calcium-free vitrification reduces cryoprotectant-induced zona pellucida hardening and increases fertilization rates in mouse oocytes. Reproduction. 131 (1), 53-61 (2006).
- Yeste, M., Jones, C., Amdani, S. N., Patel, S., Coward, K. Oocyte activation deficiency: a role for an oocyte contribution. Human Reproduction Update. 22 (1), 23-47 (2016).
- Rienzi, L., et al. Oocyte, embryo and blastocyst cryopreservation in ART: systematic review and meta-analysis comparing slow-freezing versus vitrification to produce evidence for the development of global guidance. Human Reproduction Update. 23 (2), 139-155 (2017).
- De Santis, L., et al. Oocyte vitrification: influence of operator and learning time on survival and development parameters. Placenta. 32, 280-281 (2011).
- Zhang, X., Catalano, P. N., Gurkan, U. A., Khimji, I., Demirci, U. Emerging technologies in medical applications of minimum volume vitrification. Nanomedicine. 6 (6), London, England. 1115-1129 (2011).
