Summary
ويهدف البروتوكول إلى توفير طريقة قياسية لتزجيج البويضات الأغنام البالغة والحدث. وهو يشمل جميع الخطوات من إعداد وسائل الإعلام النضج في المختبر لثقافة ما بعد الاحترار. يتم تزجيج البويضات في مرحلة MII باستخدام Cryotop لضمان الحد الأدنى من الحجم الأساسي.
Abstract
في الماشية، يمكن تطوير نظم إنتاج الأجنة في المختبر ومواصلة ذلك بفضل العدد الكبير من المبيضين والبويضات التي يمكن الحصول عليها بسهولة من المسلخ. يحمل المبيضان البالغان دائما العديد من بصيلات النمل ، بينما في المتبرعين قبل البلوغ ، تتوفر الأعداد القصوى من البويضات في عمر 4 أسابيع ، عندما يحمل المبيضان أعدادا كبيرة من بصيلات النمل. وهكذا، تعتبر الحملان 4 أسابيع من العمر المتبرعين جيدة، حتى لو كان الكفاءة التنموية للبويضات prepubertal أقل بالمقارنة مع نظيرتها الكبار.
وستعزز البحوث الأساسية والتطبيقات التجارية بإمكانية نجاح حفظ البويضات الزفيرة التي تم الحصول عليها من المتبرعين البالغين والمتبرعين قبل الاختزال. كما أن تزجيج البويضات التي يتم جمعها من المتبرعين قبل التكاثر سيسمح بتقصير فترة التوليد وبالتالي زيادة المكاسب الوراثية في برامج التربية. ومع ذلك ، فإن فقدان إمكانات النمو بعد التبريد يجعل البويضات الثديية على الأرجح واحدة من أصعب أنواع الخلايا للحفاظ على التبريد. من بين تقنيات التبريد المتاحة ، يتم تطبيق التزجيج على نطاق واسع على البويضات الحيوانية والبشرية. على الرغم من التطورات الأخيرة في هذه التقنية ، فإن التعرض لتركيزات عالية من العوامل الصفية المبردة وكذلك الإصابة المخيفة والإجهاد التناضحي لا يزال يحفز العديد من التعديلات الهيكلية والجزيئية ويقلل من الإمكانات التنموية للبويضات الثديية. هنا، نقوم بوصف بروتوكول لتزجيج البويضات الخرافية التي تم جمعها من المتبرعين الأحداث والبالغين ونضجت في المختبر قبل التبريد. ويشمل البروتوكول جميع الإجراءات من البويضات في النضج في المختبر إلى التزجيج والاحترار وفترة الحضانة بعد الاحترار. يمكن بالفعل تخصيب البويضات المهزوسة في مرحلة MII بعد الاحترار ، ولكنها تحتاج إلى وقت إضافي قبل الإخصاب لاستعادة الضرر بسبب إجراءات التبريد وزيادة إمكاناتها التنموية. وبالتالي، فإن ظروف الثقافة والتوقيت بعد الاحترار هي خطوات حاسمة لاستعادة إمكانات نمو البويضات، خاصة عندما يتم جمع البويضات من المتبرعين الأحداث.
Introduction
يمكن أن يوفر التخزين طويل الأجل للجامات الأنثوية مجموعة واسعة من التطبيقات ، مثل تحسين تربية الحيوانات المنزلية من خلال برامج الاختيار الجيني ، والمساهمة في الحفاظ على التنوع البيولوجي من خلال برنامج الحفاظ على أنواع الحياة البرية في الموقع السابق ، وتعزيز أبحاث وتطبيقات التكنولوجيا الحيوية في المختبر بفضل توافر البويضات المخزنة التي سيتم دمجها في إنتاج الأجنة المختبرية أو برامج زرع الأعضاء النووية1و2و3. كما أن تزجيج البويضات الأحداث سيزيد من الكسب الوراثي عن طريق تقصير فترة التوليد في برامج التربية4. ويعتبر حاليا التزجيج عن طريق التبريد السريع للغاية والاحترار من البويضات نهجا قياسيا للبويضات الماشية cryopreservation5. في المجترات ، قبل التزجيج ، عادة ما تنضج البويضات في المختبر ، بعد استرجاعها من الجريبات التي تم الحصول عليها من المبيضين المشتقة من المسلخ2. الكبار، وخاصة المبيضين prepubertal4،6، يمكن أن توفر في الواقع عدد غير محدود تقريبا من البويضات لتكون cryopreserved.
في الماشية، بعد التزجيج البويضات والاحترار، وقد تم الإبلاغ عن غلة الكيسة الأريمية في >10٪ عادة من قبل العديد من المختبرات خلال العقد الماضي3. ومع ذلك ، في التزجيج البويضات المجترات الصغيرة لا يزال يعتبر جديدا نسبيا لكل من البويضات الأحداث والكبار ، ولا يزال يتعين إنشاء طريقة قياسية لتزجيج البويضاتالخرافية 2،5. على الرغم من التطورات الأخيرة ، فإن البويضات الزخيفة والدافئ تقدم بالفعل العديد من التعديلات الوظيفية والهيكلية التي تحد من إمكاناتها التنموية7و8و9. وهكذا، ذكرت مقالات قليلة تطوير الكيسة الأريمية في 10٪ أو أكثر في البويضات الأغنام vitrified / الدافئة2. وقد تم بحث عدة نهج للحد من التعديلات المذكورة أعلاه: تحسين تكوين حلول التزجيج والذوبان10،11؛ تجريب استخدام أجهزة التبريد المختلفة8،12،13؛ وتطبيق علاجات محددة أثناء نضوج المختبر (IVM)4و14و15 و / أو خلال فترة النقاهة بعد ارتفاع درجة الحرارة6.
هنا نحن نصف بروتوكولا لتزجيج البويضات الأغنام التي تم جمعها من المتبرعين الأحداث والبالغين ونضجت في المختبر قبل cryopreservation. يتضمن البروتوكول جميع الإجراءات من نضوج البويضات في المختبر إلى التزجيج والاحترار وفترة ثقافة ما بعد الاحترار.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
10- يتفق البروتوكول المتعلق بالحيوانات والإجراءات المنفذة المبينة أدناه مع المبادئ التوجيهية الأخلاقية السارية في جامعة ساساري، امتثالا لتوجيه الاتحاد الأوروبي 86/609/EC وتوصية لجنة الجماعات الأوروبية 2007/526/EC.
1. إعداد وسائل الإعلام للتلاعب البويضات
- إعداد المتوسطة لنقل المبيضين التي تم جمعها عن طريق استكمال الفوسفات Dulbecco المخزنة المالحة مع 0.1 غرام / لتر البنسلين و 0.1 غرام / لتر streptomycin (PBS).
- إعداد المتوسطة لجمع البويضات والنضج عن طريق تخفيف 9.5 غرام من الأنسجة المتوسطة (TCM) 199 في مسحوق مع 1 لتر من الماء ميلي كيو تكملها البنسلين (0.1٪) والستريبتوميسين (0.1٪).
- بعد التخفيف، فلتر 100 مل من المتوسط وتخزينه في 4 درجة مئوية كما الأسهم Maturation المتوسطة (SMM) لاستخدامها لمدة أسبوع واحد.
- إعداد وسيطة التجميع (CM) عن طريق استكمال المتبقية 900 مل مع 25 mM HEPES, 0.36 غرام / لتر بيكربونات و 0.1٪ (ث / v) الكحول البوليفينيل (PVA) (درجة الحموضة 7.3, osmolality 290 mOsm/kg).
- إعداد المتوسطة النضج مع SMM تستكمل مع 0.021 غرام / لتر بيكربونات، 10٪ مصل الأغنام estrus المعالجة بالحرارة، 1 وحدة IU/mL FSH، 1 وحدة IU/mL LH، 100 ميكرولتر من السيسيتامين و 8 ملغم / مل من البيروفاتي.
ملاحظة: يجب احتضان وسيط النضج بحجم 10 مل في ظروف قياسية (في جو رطب بحد أقصى عند 39 درجة مئوية في 5٪من ثاني أكسيد الكربون في الهواء) لمدة 4 ساعة على الأقل قبل الاستخدام. - إعداد الوسط الأساسي (BM) للتلاعب بالبويضات بعد النضج في المختبر ، ويتكون في PBS بدون Ca++ و Mg++، مكملا بمصل عجل الجنين 20٪ (FCS).
2. جمع البويضات والنضج
- استعادة البويضات من الأحداث (30-40 يوما من العمر، وزن الجسم 6-10 كجم) والمبايض الكبار.
- نقل المبيضين التي تم جمعها من المسلخ التجاري إلى المختبر في غضون 1-2 ساعة في برنامج تلفزيوني في 27 درجة مئوية.
- بعد الغسيل في PBS المتوسطة الطازجة، شريحة المبيضين في CM باستخدام شفرة صغيرة للافراج عن محتوى الجريب.
- تحت فحص مجسم مع التكبير 60x، حدد مجمعات الركاميات البويضات (COCs) للنضوج في المختبر عن طريق اختيار تلك مع 4-10 طبقات من خلايا الحبيبية، البويضات مع السيتوبلازم موحدة، والتوزيع المتجانس لقطرات الدهون في السيتوبلازم ومع القطر الخارجي من حوالي 90 ميكرومتر (متوسط).
- غسل COCs مختارة ثلاث مرات في CM ونقلها في النهاية في المتوسط النضج.
ملاحظة: بالنسبة للبويضات الأحداث، لتحسين البقاء على قيد الحياة بعد التزجيج، تكملة المتوسطة النضج مع تريهالوز 100 ميكرومتر. - للنضوج في المختبر، نقل 30-35 COCs في 600 ميكروغرام من متوسط النضج في أطباق بيتري أربعة آبار، مغطاة 300 ميكروغرام من الزيت المعدني واحتضانها لمدة 22 (البويضات الكبار)/24 (البويضات الأحداث) ح في 5٪ ثاني أكسيد الكربون2 في الهواء في 39 درجة مئوية.
- بعد النضج في المختبر، وتكسير COCs من خلايا الركاز عن طريق الأنابيب بلطف. بعد الفحص تحت مجسم مع 60x التكبير، حدد فقط تلك التي تظهر البثق على الجسم القطبي الأول، وبالتالي في مرحلة ميتافاز الثاني (MII)، للتزجيج.
3. إجراءات جمع السائل المنوي وتجميده وذوبانه
- إعداد الوسط الأساسي لحفظ التبريد السائل المنوي تتكون من موسع رام (200 mM تريس; 70 mM حمض الستريك; 55 mM الفركتوز; درجة الحموضة 7.2, osmolality 300 mOsm/kg) تكملها صفار البيض 20٪ (v/v).
- جمع السائل المنوي فقط خلال موسم تربية الأغنام (أكتوبر-نوفمبر).
- الحصول على القذف عن طريق المهبل الاصطناعي من الكباش الكبار (الذين تتراوح أعمارهم بين 2-5 سنوات)، والحفاظ عليها في بيئة في الهواء الطلق وتغذية حصة صيانة الوزن الحي. إبقاء الكباش معزولة في أقلام منفصلة، ولكن مع الاتصال البصري بين بعضها البعض.
- كرر جمع السائل المنوي واحد في الأسبوع خلال موسم التكاثر بأكمله للحصول على ما لا يقل عن 8 القذف من كل ذكر.
- نقل عينات السائل المنوي إلى المختبر في درجة حرارة بيئية في غضون 5 دقائق بعد جمعها ومعالجتها على الفور. تجمع القذف من اثنين إلى ثلاثة كباش وتقييم الطيف تركيز الحيوانات المنوية.
- بعد تجميع, تمييع القذف تصل إلى 400 × 106 spermatozoa/mL مع وسيط قاعدة للحفاظ على التبريد السائل المنوي تكملها 4٪ الجلسرين. ثم يبرد السائل المنوي المخفف إلى 4 درجات مئوية على مدى 2 ساعة ويتوازن لمدة 20 دقيقة قبل التجميد.
- تجميد عينات السائل المنوي في شكل بيليه (0.25 مل) على الجليد الجاف ومن ثم يغرق لهم في النيتروجين السائل.
- للذوبان، وضع بيليه في الصقر الزجاجي المعقم ويغرق في حمام مائي لمدة 20 s في 39 درجة مئوية.
4. الإخصاب في المختبر وزراعة الأجنة
- إعداد المخزونات لدستور السائل الأوفيدكتال الاصطناعي (SOF).
- إعداد المخزون A: 99.4 مل من مياه ميليكيو؛ 6.29 غرام من NaCl؛ 0.534 غرام من KCl؛ 0.161 غرام من KH2PO4; 0.182 غرام من MgSO4 · 7H2O; و 0.6 مل من لاكتات الصوديوم. ابق عند 4 درجات مئوية لمدة تصل إلى 3 أشهر.
- إعداد المخزون B: 10 مل من مياه ميليكيو؛ 0.210 غرام من NaHCO3؛ و 2-3 غرام من فينول الأحمر. ابق عند 4 درجة مئوية لمدة شهر واحد.
- إعداد المخزون C: 10 مل من مياه ميليكيو؛ و 0.051 غرام من بيروفات الصوديوم. ابق عند 4 درجة مئوية لمدة شهر واحد.
- إعداد المخزون D: 10 مل من المياه ميلي كيو; و 0.262 غرام من CaCl2 2H2O. الاحتفاظ في 4 درجة مئوية لمدة 1 شهر.
- إعداد 10 مل من SOF تتكون من 7.630 مل من مياه ميليكيو، 1 مل من المخزون A، 1 مل من المخزون B، 0.07 مل من الأسهم C و 0.7 مل من المخزون D.
- إعداد الإخصاب في المختبر (IVF) المتوسطة: SOF تكملها مع 2٪ مصل الأغنام استروس المعالجة بالحرارة، 10 ميكروغرام / مل الهيبارين و 1 ميكروغرام / مل hypoutarine (osmolality 280-290 mOsm/kg).
ملاحظة: يجب احتضان وسيط التلقيح الصناعي بحجم 10 مل في ظروف قياسية (في جو رطب بحد أقصى عند 39 درجة مئوية في 5٪ CO2و 5٪ O2 و 90٪ N2) على الأقل 4 ساعة قبل الاستخدام.
- نقل السائل المنوي المجمدة / المذابة aliquots في أنبوب مخروطي الزجاج المعقم أقل من 1.5 مل من المتوسط التلقيح الاصطناعي الدافئ واحتضانها لمدة 15 دقيقة في 39 درجة مئوية في جو رطب في 5٪ CO2 في الهواء.
- بعد الحضانة ، تسبح الحيوانات المنوية المتحركة نحو الجزء apical من العمود السائل. جمع الطبقة العليا ومراقبة لتقييم حركة الحيوانات المنوية.
ملاحظة: يجب تقييم معلمات حركة الحيوانات المنوية باستخدام نظام تحليل الحيوانات المنوية بمساعدة الكمبيوتر (CASA) مع الإعدادات التالية: 25 إطارا تم الحصول عليها لتجنب تداخل تتبع الحيوانات المنوية ، والحد الأدنى للتباين 10 ، والحد الأدنى لسرعة المسار المتوسط 30 ميكرومتر / ثانية ، والحركة التدريجية > 80٪ استقامة. هذا النظام لديه إعداد محدد لتقييم الحيوانات المنوية رام. لكل عينة، يتم تحميل 5 ميكرولتر من نوع فرعي من تعليق الحيوانات المنوية في غرفة تحليل مسبقة الدفء بعمق 10 ميكرومتر. يتم تقييم حركة الحيوانات المنوية عند 37 درجة مئوية عند 40x باستخدام مجهر تباين المرحلة ويجب تحليل ما لا يقل عن 500 منوي لكل نوع فرعي في أربعة مجالات مجهرية مختلفة على الأقل. تم تقييم النسبة المئوية للحيوانات المنوية المتحركة والتقدمية الكلية. بالنسبة للتلقيح الاصطناعي، يجب أن تكون النسبة المئوية للحيوانات المنوية المتحركة التقدمية ≥ 30٪. - تمييع السباحة المتابعة المستمدة spermatozoa المتحركة في 1 ×10 6 spermatozoa / مل التركيز النهائي والمشاركة في احتضانها مع البويضات MII في 300 ميكرولتر من المتوسط التلقيح الاصطناعي مغطاة بالزيوت المعدنية في أربعة أطباق بيتري جيدا.
- بعد 22 ح نقل الزيغوت المفترضة في أربعة أطباق بيتري جيدا تحتوي على SOF تكملها 0.4٪ الألبومين مصل البقر والأحماض الأمينية الأساسية وغير الأساسية في تركيز oviductal كما ذكرت من قبل16 تحت النفط المعدني وزراعة لهم في ظل ظروف قياسية تصل إلى مرحلة الكيسة الأريمية.
- في 22-, 26-و 32-h ما بعد التلقيح, تسجيل عدد البويضات المشقوقة, تظهر اثنين من blastomeres متميزة, من خلال الفحص تحت مجسمة مع التكبير 60x.
- مراقبة الأجنة يوميا بدءا من اليوم الخامس إلى التاسع من الثقافة وينبغي تسجيل الكيسات الأريمية التي تشكلت حديثا عن طريق الفحص تحت منظار مجسم مع التكبير 60x.
5. التزجيج البويضات والاحترار
ملاحظة: تنفيذ التزجيج باتباع طريقة الحد الأدنى من حجم الأساسية (MEV) باستخدام cryotops الجهاز17.
- توازن مجموعة من خمس بويضات في 38.5 درجة مئوية لمدة 2 دقيقة في BM. استخدام BM يضمن تركيز الكالسيوم منخفضة ([Ca2++] 2.2 ملغم / ديسيلت)10.
- تجفيف البويضات مع التعرض 3 دقائق لمحلول التوازن التي تحتوي على 7.5٪ (v/v) ثنائي ميثيل سلفوإكسيد (DMSO) و 7.5٪ (v/v) غليكول الإيثيلين (EG) في BM.
- نقل البويضات إلى حل التزجيج التي تحتوي على 16.5٪ (v/v) DMSO، 16.5٪ (v/v) EG و 0.5 M trehalose في BM قبل تحميلها في جهاز التبريد وإغراقها مباشرة في النيتروجين السائل في غضون 30 ثانية.
- للتدفئة إلى درجة حرارة بيولوجية، نقل محتوى كل جهاز التزجيج من النيتروجين السائل إلى 200 μL قطرات من 1.25 M تريهالوز في BM لمدة 1 دقيقة في 38.5 درجة مئوية، ويحرك بلطف لتسهيل الاختلاط.
- لتعزيز إزالة المبردات داخل الخلايا، نقل البويضات تدريجيا إلى 200 قطرات ميكرولتر من محلول تريهالوز المتناقص (0.5 م، 0.25 م، 0.125 م تريهالوز في BM) لمدة 30 ثانية عند 38.5 درجة مئوية قبل أن يتم تسويتها لمدة 10 دقائق عند 38.5 درجة مئوية في BM.
6. تقييم جودة البويضات بعد الاحترار
- بعد الاحترار، واحتضان البويضات لمدة 6 ساعة في برنامج تلفزيوني دون Ca++ وMg++ بالإضافة إلى 20٪ FCS (BM) في 5٪ CO2 في الهواء عند 38.5 درجة مئوية.
ملاحظة: القدرة على استعادة البويضات البيولوجية والهيكلية بعد التزجيج هي فيما يتعلق بأنواع وفئات البويضات المستخدمة. - منذ قدرة البويضات لاسترداد الأضرار cryopreservation يعتمد على الوقت، وتقييم جودة البويضات في نقاط زمنية مختلفة من الثقافة في المختبر (0 ساعة، 2 ح، 4 ح، 6 ح) بعد الاحترار، لتحديد الإطار الزمني الأمثل للإخصاب البويضات.
ملاحظة: في البويضات الأغنام الكبار, الوقت الأمثل هو 4 ح بعد الاحترار; لخلايا البويضات prepubertal، والوقت الأمثل هو 2 ساعة بعد الاحترار.
7. تقييم بقاء البويضات
- مباشرة بعد الاحترار ولكل نقطة زمنية من ثقافة ما بعد الاحترار، تقييم البويضات بشكل شكلي باستخدام المجهر المقلوب مع التكبير 100x.
ملاحظة: يجب تصنيف البويضات ذات التعديلات الهيكلية، مثل السيتوبلازم الخافت و/أو الضرر الذي يلحق بزونا بيلوسيدا و/أو الغشاء على أنها منحلة. - التحقق من صحة تقييم سلامة الغشاء باستخدام تلطيخ فلوري تفاضلي مزدوج.
- احتضان البويضات في 2 مل من BM التي تحتوي على يوديد البروبيديوم (PI؛ 10 ميكروغرام / مل) وهويشست 33342 (10 ميكروغرام / مل) لمدة 5 دقائق في 5٪ ثاني أكسيد الكربون2 في الهواء عند 38.5 درجة مئوية.
- بعد غسل ثلاث مرات في BM الطازجة، ومراقبة البويضات تحت المجهر الفلورسنت باستخدام مرشح الإثارة من 350 نانومتر وانبعاث 460 نانومتر لHoechst 33342 ومرشح الإثارة من 535 نانومتر وانبعاث 617 نانومتر لPI.
ملاحظة: يمكن التعرف على البويضات ذات الغشاء السليم من خلال الفلورسينس الأزرق للحمض النووي الملون مع Hoechst 33342. تظهر البويضات ذات الأغشية التالفة مضان أحمر بسبب تلطيخ الحمض النووي مع PI.
8. تقييم نشاط الميتوكوندريا ومستويات ROS داخل الخلايا عن طريق الفحص المجهري بالليزر confocal
- إعداد MitoTracker الأحمر CM-H2XRos (MT-الأحمر) التحقيق.
- تمييع محتوى قارورة واحدة (50 ميكروغرام) مع 1 مل من DMSO للحصول على محلول 1 مللي متر. الحفاظ على قارورة مخففة في النيتروجين السائل.
- تمييع الحل 1 mM مع DMSO للحصول على حل المخزون 100 ميكرومتر وتخزينه في -80 درجة مئوية في الظلام.
- إعداد 2′,7′-ثنائي كلوروهيدروفلوروسيين diacetate (H2DCF-DA) التحقيق.
- تمييع H2DCF-DA في 0.1٪ بولي فينيل بيروليدون (PVA)/برنامج تلفزيوني للحصول على أول حل 100 mM. الحفاظ على الحل في -80 درجة مئوية في الظلام .
- تمييع الحل الأول في 0.1٪ PVA / PBS للحصول على حل الأسهم 100 ميكرومتر. تخزينه في -20 درجة مئوية في الظلام.
- إعداد المتوسطة المتصاعدة (MM): ل 10 مل من MM، أضف 5 مل من الجلسرين، 5 مل من برنامج تلفزيوني و 250 ملغ من أزيد الصوديوم. تخزينه في -20 درجة مئوية حتى الاستخدام.
- احتضان البويضات لمدة 30 دقيقة عند 38.5 درجة مئوية في BM مع 500 nM MT-Red (محلول المخزون: 100 ميكرومتر في DMSO).
- بعد الحضانة مع مسبار MT-Red، اغسل البويضات ثلاث مرات في BM واحتضن لمدة 20 دقيقة في نفس الوسائط التي تحتوي على 5 ميكرومتر H2DCF-DA (محلول المخزون: 100 ميكرومتر في BM).
- بعد التعرض للمسابير، وغسل البويضات في BM وإصلاح في 2.5٪ glutaraldehyde/ PBS لمدة 15 دقيقة على الأقل.
- بعد التثبيت، اغسل البويضات ثلاث مرات في BM واثبت على الشرائح الزجاجية في قطرة 4 ميكرولتر من MM مع 1 ملغم / مل Hoechst 33342 باستخدام وسائد الشمع لتجنب ضغط العينات.
- تخزين الشرائح عند 4 درجة مئوية في الظلام حتى التقييم.
- إجراء تحليل المقاطع التي تم تصنيفها بالمناعة باستخدام مجهر مسح ليزر كونفوج. تم تجهيز المجهر بأشعة الليزر Ar/He/Ne، باستخدام هدف زيتي 40/60x. تحليل المقاطع حسب الإثارة المتتابعة.
- لتقييم الميتوكوندريا، لاحظ العينات باستخدام ليزر متعدد الفوتون للكشف عن MT-Red (التعرض: 579 نانومتر؛ الانبعاثات: 599 نانومتر).
- استخدام أشعة الليزر أيونات الأرجون في 488 نانومتر ومرشح B-2 A (495 نانومتر التعرض و 519 نانومتر انبعاث) للإشارة إلى ثنائي كلوروفلوريسين (DCF)18.
- في كل البويضات الفردية، وقياس MT-الأحمر وDCF شدة الفلورسينس في الطائرة الاستوائية19.
- الحفاظ على المعلمات المتعلقة كثافة الفلورية في القيم الثابتة خلال جميع عمليات الاستحواذ على الصور (طاقة الليزر 26٪، إعدادات تسلسلية 1: PMT1 كسب 649-PMT2 كسب 482؛ الإعداد التسلسلي 2: كسب PMT1 625-PMT2 كسب 589; الإزاحة 0; حجم الثقب: 68).
- إجراء تحليل كمي لكثافة الفلورسينس باستخدام حزمة برامج تحليل الصور Leica LAS AF Lite ، باتباع الإجراءات الموحدة من قبل20.
- التقاط الصور مرة واحدة، تتحرك على محور Z، حتى تصل إلى الطائرة الاستوائية.
- لكل صورة، تم إيقاف التحويل إلى مقياس رمادي وإيقاف تشغيل القناة 1 (المتعلقة ب Hoechst blue). ثم رسم يدويا منطقة الاهتمام (ROI) على منطقة محدودة، وهذا هو حول المغزل meiotic.
ملاحظة: البرنامج تلقائيا قراءة متوسط قيمة بكسل على القناة 2 (FITC) طرح قيمة الخلفية منه. - سجل متوسط قيم وحدات البكسل وإرسالها للتحليل الإحصائي.
9. التحليلات الإحصائية
- تحليل الاختلافات التالية: معدلات البقاء على قيد الحياة في البويضات الأحداث مقابل الكبار، ومعدلات البقاء على قيد الحياة والكفاءة التنموية في السيطرة والبويضات الأحداث المعالجة trehalose، ومعدلات البقاء على قيد الحياة والتنشيط البارثينوجيني والكفاءة التنموية للبويضات الكبار تهتز مع وسائل الإعلام تركيز الكالسيوم المختلفة، ومعدلات الإخصاب وإنتاج الأجنة في البويضات الأحداث تهتز مع تركيز الكالسيوم منخفضة أو عالية، والأنماط الظاهرية الميتوكوندريا النشطة في البويضات الوترية الأحداث خلال نقاط زمنية مختلفة من ثقافة ما بعد الاحترار ومعدلات التنشيط البارثينوجينية بين البويضات الزهية الكبار والأحداث باستخدام اختبار تشي مربع.
- تحليل معدل الانقسام وانتاج الأجنة في البويضات الكبار الزهية خلال نقاط زمنية مختلفة من ثقافة ما بعد الاحترار، وكثافة الفلورية من نشاط الميتوكوندريا ومستويات ROS داخل الخلايا في البويضات الزحمة الأحداث خلال نقاط زمنية مختلفة من ثقافة ما بعد الاحترار من قبل ANOVA بعد تحليل لتجانس التباين من قبل اختبار ليفين. استخدم اختبار توكي اللاحق لتسليط الضوء على الاختلافات بين المجموعات وفيما بينها.
- إجراء تحليل إحصائي باستخدام برنامج إحصائي والنظر في احتمال P < 0.05 ليكون الحد الأدنى من الأهمية. يتم التعبير عن جميع النتائج على أنها متوسطة ± S.E.M.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
والتبريد من البويضات من المتبرعين الأحداث أقل بالمقارنة مع الكبار. التأثير الأول الملاحظ هو انخفاض معدل البقاء على قيد الحياة بعد الاحترار مقارنة بالبويضات البالغة(الشكل 1A؛ خي2 اختبار P<0.001). وأظهرت البويضات الأحداث سلامة الغشاء أقل بعد الاحترار (الشكل 1B). كان الغرض من استخدام التريهالوز في وسط النضج هو التحقق مما إذا كان هذا السكر يمكن أن يقلل من إصابات التبريد في البويضات الصغيرة. وقد أظهرت البيانات23 أن البويضات نضجت لمدة 24 ساعة مع مكملات تريهالوز أظهرت ارتفاع معدلات البقاء على قيد الحياة بعد التزجيج / الاحترار مقارنة مع المجموعة غير المعالجة(الجدول 1: 85.7٪ مقابل 75.3٪ على التوالي؛ خي2 اختبار P<0.05). ارتبط مكملات تريهالوز بالفعل مع أعلى سلامة الغشاء بعد الاحترار (الشكل 2A). وهكذا، فإن استخدام التريهالوز أثناء نضوج البويضات الأحداث في المختبر زاد من معدلات البقاء على قيد الحياة بعد التزجيج (85.7٪) إلى قيم مماثلة لقيم البالغين (90.3٪). ومع ذلك، لم يتم زيادة الانقسام والإخصاب ومعدلات النمو من البويضات الأحداث عن طريق مكملات تريهالوز(الجدول 1).
لتحسين كفاءة البويضات بعد التزجيج اختبرنا في البويضات البويضية الكبار وسائل الإعلام المختلفة التزجيج مع تركيزات الكالسيوم تتراوح بين 9.9 إلى 0.4 ملغ / ديسيلتر10. وأظهرت النتائج التي تم الحصول عليها أن استخدام وسائل الإعلام مع تركيز الكالسيوم يساوي 2.2 ملغ / ديسيلتر زيادة معدلات البقاء على قيد الحياة بعد الاحترار, تحسين الكفاءة التنموية وانخفاض تنشيط البارثينوجينيتي من البويضات الكبار10 (الجدول 2). وهكذا اختبرنا وسائل الإعلام منخفضة الكالسيوم التزجيج لتزجيج البويضات الأحداث. وكما هو مبين في الجدول 3،أظهرت البويضات اليافعة المهزوسة بتركيز منخفض للكالسيوم ارتفاع معدلات الإخصاب مقارنة بالبويضات المهزوسة بتركيز الكالسيوم العالي (44.35 في المائة مقابل 32.29 في المائة على التوالي؛ P<0.05)، ولكن لم يتم العثور على اختلافات في إنتاج الأجنة.
تحتاج البويضات الزفيرة/الدافئة إلى وقت إضافي قبل الإخصاب لاستعادة الضرر الناجم عن إجراءات التبريد وزيادة إمكاناتها التنموية. وقد أظهرت دراسة سابقة في الواقع أن تركيز ATP داخل الخلايا, يتم تقليل نشاط الميتوكوندريا والكفاءة التنموية في المختبر في البويضات المهزوتة / المذابة, التي تظهر أيضا تركيزات ROS داخل الخلايا عالية6. يتم وضع علامة خاصة على هذه التعديلات مباشرة بعد الاحترار. خلال ثقافة ما بعد الاحترار ، يمكن لكل من البويضات البالغة والحدثية التعافي جزئيا من الأضرار التي لحقت بها أثناء إجراءات التزجيج6و24. من خلال مقارنة ثقافة ما بعد الاحترار من فترات مختلفة (0 و 2 و 4 و 6 ساعة) ، أظهرنا أنه بعد 4 ساعة من البويضات الثقافية التي تم جمعها من النعاج البالغة قادرة على استعادة التوازن النشط6 والإعداد الجزئي24 واستعادة الكفاءة التنموية مع انشقاق أعلى (50.7 ± 3.9 ٪؛ P< 0.01 ANOVA) ومعدلات الكيسة الأريمية (14.40 ± 1.3٪؛ ANOVA P< 0.01) مقارنة بالنقاط الزمنية الأخرى (0 و 2 و 6 ساعة؛ الجدول 4). وهكذا، 4 ح من ثقافة ما بعد الاحترار يمثل نافذة الوقت المثالي لتسميد البويضات الكبار vitrified / الحارة6.
وعندما تكررت التجربة نفسها مع البويضات التي تم جمعها من المتبرعين الأحداث، تأكدت هذه النتائج جزئيا. وكان نشاط الميتوكوندريا أعلى في البويضات اليافعة/الدافئة بعد 4 ح من ثقافة ما بعد الاحترار مقارنة بالنقاط الزمنية الأخرى (0، 2، 6؛ 2، 2، 2؛ 2، 2، 6؛ 2، 2، 2، 6؛ 2، 2، 6؛ 2، 2، 6؛ 2، 2، 6؛ 2، 2، 6؛ 2، 2، 6؛ 2، 2 الشكل 3:ANOVA P<0.01). لوحظت عدة أنماط لتوزيع الميتوكوندريا وتصنف في المجموعات الثلاث التالية (كما ذكرت من قبل21): النمط A: FINE متجانسة مع حبيبات صغيرة تنتشر في جميع أنحاء السيتوبلازم; النمط B: متجانسة GRANULAR مع حبيبات كبيرة تنتشر في جميع أنحاء السيتوبلازم; النمط C: متفاوت التجانس CLUSTERED عندما كانت الحبيبات الكبيرة بشكل خاص موجودة ، منتشرة في جميع أنحاء السيتوبلازم أو تقع في مجالات سيتوبلازمية محددة. يمكن أن ترتبط الأنماط الظاهرية المختلفة في توزيع السيتوبلازم للميتوكوندريا النشطة في MII بالكفاءة التنموية للبويضات. توزيع FINE المتجانس هو مؤشر على ضعف الكفاءة التنموية في حين يرتبط التوزيع الحبيبي والمتجمع بزيادة نشاط الميتوكوندريا وبالتالي كفاءة تنموية أعلى22. تغيرت أنماط توزيع الميتوكوندريا خلال 6 ساعة من ثقافة ما بعد الاحترار. ويبين الشكل 4 أمثلة على البويضات الأحداث التي لها أنماط مختلفة من توزيع الميتوكوندريا وتقلباتها خلال ثقافة ما بعد الاحترار. النمط A زيادة كبيرة خلال الحضانة لفترات طويلة وتصل إلى قيمة أعلى في 6 ساعة بعد الاحترار (الشكل 4Aa: خي2 P<0.05), النمط B لم تظهر تغييرات كبيرة خلال ثقافة ما بعد الاحترار (الشكل 4Bb), لم يتم العثور على نمط C في أي البويضات الأحداث vitrified / دافئة خلال الحضانة لفترات طويلة (الشكل 4Cc: الشرع2 P<0.05).
وعلاوة على ذلك، كانت مستويات ROS داخل الخلايا أقل بكثير في البويضات الأحداث في 2 ساعة من ثقافة ما بعد الاحترار مقارنة مع 0 و 4 و 6 ح (الشكل 5: ANOVA P<0.001). ومع ذلك ، وعلى النقيض مما تم العثور عليه في البويضات البالغة ، زاد معدل التنشيط الذاتي الذاتي خلال ثقافة ما بعد الاحترار في البويضات الأحداث(الشكل 6). لهذا السبب، فإن النقطة الزمنية الموصى بها للإخصاب في البويضات الأحداث تكون 2 ساعة بعد ثقافة ما بعد الاحترار.
الشكل 1. معدلات البقاء على قيد الحياة من البويضات البويضة النهمة / الدافئة التي تم جمعها من المتبرعين الأحداث والبالغين. (أ) تم تزجيج البويضات بعد النضج في المختبر. تم تحديد معدلات البقاء على قيد الحياة بعد التزجيج والاحترار عن طريق تلطيخ الفلورسنت مع يوديد البروبيديوم (10 ميكروغرام / مل) وهويشست 33342 (10 ميكروغرام / مل). N = 165 بويضات للبالغين و 170 بويضة صغيرة. تشير الحروف المختلفة إلى اختلافات كبيرة بين البويضات البالغة والحدث: خي2 اختبار P<0.001. (B-C) أمثلة على البويضات الأحداث vitrified / الحارة مع سليمة (ب) وغشاء البلازما التالفة (C) في التقييم المورفولوجي (المجهر المقلوب مع التكبير 100x). شريط المقياس = 10 ميكرومتر. الرجاء الضغط هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
الشكل 2. معدلات بقاء البويضات النعوتة الأحداث والكفاءة التنموية في المختبر بعد النضج مع (TRH) وبدون تريهالوز (100 mM في متوسط النضج). (أ-ب) أمثلة على البويضات الأحداث تهتز بعد النضج في المختبر في وسائل الإعلام تكمل(أ)مع أو (ب) دون trehalose في التقييم المورفولوجي (المجهر المقلوب مع التكبير 100x). مقياس الشريط = 30 ميكرومتر. الرجاء الضغط هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
الشكل 3. القياس الكمي لكثافة الفلورسينس الميتوكوندريا النشطة في البويضات اليافعة /الدافئة في نقاط زمنية مختلفة (0، 2، 4، 6) أثناء فترة ما بعد الاحترار في الثقافة المختبرية. استخدمت البويضات IVM كعنصر تحكم (CTR N = 77). في المجموع 163 (0 ساعة N = 45؛ 2 ساعة N = 39؛ 4 ساعة N = 40؛ 6 ساعة N = 39) تم هز البويضات الأحداث وتسخينها في ثلاث تجارب مستقلة. تشير الأحرف المختلفة إلى اختلافات ذات دلالة إحصائية (ANOVA P = 0.0000). يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
الشكل 4. توزيع نمط الميتوكوندريا في البويضات الأحداث vitrified / الحارة خلال 6 ساعات من ما بعد الاحترار في الثقافة المختبرية. صور تمثيلية لتوزيع الميتوكوندريا الدقيقة (A) والحبيبية (B) والمتجمعة (C) في البويضات الأحداث الزهية / الدافئة. (د) النسبة المئوية للخلايا الزخيفة/الدافئة التي تظهر توزيعا دقيقا للميتوكوندريا؛ (ه) النسبة المئوية للخلايا الزهنية/الدافئة التي تظهر توزيعا الحبيبية الميتوكوندريا؛ (و) النسبة المئوية للخلايا البويضات الصغيرة المهترئة/الدافئة التي تظهر توزيعا متجمعا للميتوكوندريا. استخدمت البويضات الأحداث IVM كسيطرة (CTR; N = 77). في المجموع 163 (0 ساعة N = 45؛ 2 ساعة N = 39؛ 4 ساعة N = 40؛ 6 ساعة N = 39) استخدمت البويضات الأحداث المهزوسة والمدفئة في ثلاث تجارب مستقلة. وتشير الرسائل المختلفة إلى اختلافات ذات دلالة إحصائية (Aa: خي2 P = 0.026؛ Aa: 2 P = 0.026؛ Aa: 2 P = 0.026؛ Aa: 2 P = 0.026؛ Aa: 2 P = 0 Bb: خي2 P = 0.097; نسخة: خي2 P = 0.014). مقياس الشريط = 30 ميكرومتر. الرجاء الضغط هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
الشكل 5. القياس الكمي لكثافة الفلورسينس ROS داخل الخلايا في البويضات الأحداث المهزوم خلال 6 ساعات بعد الاحترار في الثقافة المختبرية. (أ-ب) صور تمثيلية من شدة الفلورسينس ROS في المختبر نضجت(A)وvitrified (B) البويضات الأحداث. (ج) مستويات ROS داخل الخلايا كما يحددها القياس الكمي لشدة الفلورسينس في البويضات الأحداث المهزوسة في نقاط زمنية مختلفة (0 ساعة N = 45؛ 2 ح ن = 39؛ 4 ح ن = 40؛ 6 ساعة N = 39) خلال ثقافة المختبر بعد الاحترار. في المختبر نضجت البويضات الأحداث استخدمت كعنصر تحكم (CTR N = 77). تشير الأحرف المختلفة إلى اختلافات ذات دلالة إحصائية (ANOVA P = 0.0000). مقياس الشريط = 50 ميكرومتر. الرجاء الضغط هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
الشكل 6. تنشيط البارثينوجينيتي في البويضات الزكية الأحداث والبالغين خلال 6 ساعات من الاحترار في الثقافة المختبرية. (A-B) صور تمثيلية لتنشيط الخلايا البويضات البارثينوجينية: (A) البويضات في مرحلة انتقال ميتافايز II-telophase II و (B) تشكيل البرونوكلور. (ج)نسب من البويضات المنشطة من البالغين والأحداث في نقاط زمنية مختلفة (0، 2، 4، 6 ح) أثناء فترة ما بعد الاحترار في الثقافة المختبرية. تشير النجمة إلى الاختلافات الإحصائية بين البويضات الصغيرة والبالغة في كل نقطة حضانة زمنية (ANOVA P = 0.000). تم تعديل هذا الرقم من Serra et al.24 Scale bar = 50 ميكرومتر. الرجاء الضغط هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
| البويضات (n) | معدل البقاء على قيد الحياة (٪) | التلقيح الاصطناعي (ن) | المخصبة أ (٪) | مشقوقب (٪) | الكيسات الأريميةج (٪) | |
| الخطر | 73 | 75.3* | 452 | 91.1 | 96.1 | 14.3 |
| TRH | 77 | 85.7 | 470 | 92.5 | 95.4 | 13 |
| * تشي مربع اختبار p<0.5 | ||||||
| (أ) تحسب النسب المئوية على البويضات التلقيح الاصطناعي | ||||||
| ب يتم حساب النسب المئوية على البويضات المخصبة | ||||||
| ج يتم حساب النسب المئوية على البويضات المشقوقة | ||||||
الجدول 1 - الجداول الأحداث ovine oocytes معدلات البقاء على قيد الحياة والكفاءة في المختبر النمو بعد النضج مع وبدون تريهالوز والتزجيج. TRH = نضجت البويضات الأحداث مع مكملات تريهالوز (100 مليون متر في متوسط النضج). CTR = مراقبة البويضات الأحداث نضجت دون مكملات تريهالوز. تم تحديد معدلات البقاء على قيد الحياة بعد تلطيخ الفلورسنت مع يوديد البروبيديوم (10 ميكروغرام / مل) وهويشست 33342 (10 ميكروغرام / مل) من البويضات الزنجية / الدافئة. تم تحديد الكفاءة التنموية البويضات بعد دمجها في نظام إنتاج المختبر. أ يتم حساب النسب المئوية على البويضات التلقيح الاصطناعي. (ب) تحسب النسب المئوية على البويضات المخصبة. ج تحسب النسب المئوية على البويضات المشقوقة. * خي2 اختبار P<0.5. تم تعديل هذا الجدول من Berlinguerوآخرون.
| المجموعات | [Ca++] ملغم/ديسيلت | ن البويضات | التنشيط الذاتي الذاتي (٪) | البويضات المهزوم | نجا والبويضات التلقيح الاصطناعي (٪) | الانقسام (٪) | مخرجات الكيسات الأريمية (٪) |
| TCM/ FCS | 9.9 | 80 | 33 (41.2)أ | 150 | 124 (82.7)أ | 40 (32.5)أ | 2 (1.6)أ |
| برنامج تلفزيوني / FCS | 4.4 | 82 | 29 (35.3)ac | 115 | 88 (76.5)أ | 33 (37.5)ae | 1 (1.1)أ |
| PBSCaMg مجانا/ FCS | 2.2 | 86 | 11 (12.7)ب | 126 | 115 (91.3)ب | 74 (64.3)ب | 12 (10.4)ب |
| برنامج تلفزيوني / بكالوريوس | 3.2 | 83 | 21 (25.3)ج | 110 | 90 (81.8)أ | 18 (20)ج | 0 (0)أ |
| PBSCaMg مجانا/ BSA | 0.4 | 87 | 10 (11.5)ب | 149 | 123 (82.5)أ | 57 (46.3)دي | 3 (2.4)ب |
الجدول 2 - الأرباح الكفاءة التنموية للبويضات البالغة الناضجة في المختبر المهزوغة في وسائط التزجيج (16.5٪ جلايكول الإيثيلين + 16.5٪ ثنائي ميثيل سلفوإكسيد) تحتوي على تركيزات الكالسيوم المختلفة. وتحسب معدلات البقاء على قيد الحياة والإخصاب على البويضات الزهية؛ يتم حساب إجمالي معدلات الانقسام و الأريمية على البويضات الناجية. تختلف القيم ذات الخانة الفرعية المختلفة داخل نفس العمود اختلافا كبيرا: خي2 اختبار P<0.05. تم تعديل هذا الجدول من Succu etal.
| [Ca 2++] في وسائط التزجيج | لا. البويضات | معدل البقاء على قيد الحياة بعد التزجيج (٪) | معدل الإخصاب (٪) | الانقسام (٪) | مخرجات الكيسة الأريمية (٪) |
| عالية [9.9 ملغم/ديسيلت] | 190 | 161 (84.73) | 52/161 (32.29)أ | 43/161 (26.7) | 0 |
| منخفض [2.2 ملغم/ديسيلت] | 150 | 124 (82.66) | 55/124 (44.35)ب | 41/124 (33.1) | 0 |
الجدول 3 - الأرباح معدلات الإخصاب والنمو بعد الإخصاب في المختبر وثقافة البويضات الأحداث الزهد / الدافئة باستخدام عالية ([Ca 2++] = 9.9 ملغ / ديسيلتر) ومنخفضة ([Ca 2++] = 2.2 ملغم / ديسيلتر) تركيز الكالسيوم في وسائط التزجيج. تشير الحروف المختلفة إلى الفرق الإحصائي (اختبار ≠ b P<0.05 خي2).
| ساعات من الحضانة بعد الاحترار | معدل الانقسام (n) | إخراج الجنين (n) |
| 0 | 19.2 ± 3٪أ (82) | 0٪أ (17) |
| 2 | 41.8 ± 3٪ب (100) | 6.5 ± 1.3٪ب (42) |
| 4 | 50.7 ± 3٪ب (92) | 14.4 ± 1.3٪ج (48) |
| 6 | 26 ± 3٪أ (92) | 0٪أ (23) |
الجدول 4 - الأرباح معدل الانقسام وانتاج الأجنة في البويضات البالغة المهزوغة / الدافئة المخصبة في نقاط زمنية مختلفة من ثقافة ما بعد الاحترار. تشير الأحرف المختلفة إلى اختلاف إحصائي داخل نفس العمود: ANOVA P<0.01.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
يمكن أن يسمح الحفاظ على البويضات في الحيوانات المنزلية ليس فقط بالحفاظ على الموارد الوراثية الأنثوية على المدى الطويل ، ولكن أيضا تطوير التكنولوجيات الحيوية الجنينية. وبالتالي، فإن وضع طريقة قياسية لتزجيج البويضات من شأنه أن يستفيد منه كل من الثروة الحيوانية وقطاع البحوث. في هذا البروتوكول، يتم تقديم طريقة كاملة لهزيج البويضات الأغنام الكبار ويمكن أن تمثل نقطة انطلاق صلبة لتطوير نظام كفاءة التزجيج للخلايا ال oocyte الأحداث.
واحدة من المزايا الرئيسية للطريقة المقترحة هي أنها تشمل جميع الخطوات من جمع البويضات ، والنضج في المختبر ، والتزجيج ، والاحترار. وعلاوة على ذلك، فإنه يتضمن فترة ثقافة ما بعد الاحترار للسماح للبويضات بالتعافي من الأضرار التي لحقت بها أثناء إجراء التزجيج قبل تخصيبها. وينبغي أن يكون الوقت الأمثل للإخصاب مصممة وفقا لطريقة cryopreservation، ونوعية البويضات الأولية، وعمر المريض، والأنواع، ويجري ضروري للنظر في كلا الجانبين من الانتعاش الوقت والشيخوخة البويضات25،26. وبالتالي ، فإن اختيار مدة فترة الحضانة بعد الاحترار أمر صعب وقد يؤثر على نتائج برامج تخزج البويضات. واستنادا إلى النتائج التي تم الحصول عليها من حيث معدلات الانقسام وانتاج الأجنة، وفي ظل الظروف المبينة في البروتوكول المقدم، فإن الوقت الأمثل لتسميد البويضات الأغنام البالغة الزخرفية هو بعد 4 ساعات من حضانة ما بعد الاحترار (الجدول 4)6. هذه المعلومات أمر بالغ الأهمية عند تصميم برنامج التزجيج البويضات.
ومع ذلك، فإن هذا البروتوكول، في حين يعطي نتائج مقبولة من حيث إنتاج الأجنة من البويضات البالغة المهزوغة/الدافئة، لا يزال يؤدي إلى أجنة منخفضة إلى صفر إذا تم تطبيقها على البويضات الأحداث. العديد من القيود الهيكلية والوظيفية تضعف الكفاءة التنموية للبويضات قبل الخلايا ، مثل صغر الحجم ، الاقتران المعيب بين خلايا الركاميات والبويضات ، وانخفاض امتصاص الأحماض الأمينية ، وانخفاض تخليق البروتين واستقلاب الطاقة 27،28،29. في دراسة سابقة أبلغنا أن البويضات prepubertal تظهر حساسية عالية لإجراء التزجيج30. الكفاءة التنموية المنخفضة التي تظهر بعد التزجيج والاحترار هو على الارجح نتيجة لأضرار العوامل السيتوبلازمية المشاركة في إعادة تنظيم الهيكل الخلوي و (أو) في تفعيل النضج تعزيز عامل30. كما هو مبين في الجدول 1، كان مكملات وسيط النضج مع تريهالوز ، وهو بروتين التبريد غير نفاذية ، قادرة على زيادة معدلات البقاء على قيد الحياة بعد التزجيج والاحترار لقيم مماثلة لتلك التي من البويضات الكبار4. وبنفس الطريقة، فإن استخدام محلول التزجيج بتركيزات منخفضة من الكالسيوم يزيد من معدلات تخصيب البويضات الأحداث بعد التزجيج والاحترار، كما هو مبين في الجدول 3. وهكذا، فإن التحسين على الظروف الثقافية أثناء النضج في المختبر وتكوين الوسائط التزجيج قد يساعد في زيادة نوعية البويضات الأحداث بعد التزجيج والاحترار. تظهر البويضات الأحداث بعض القدرة على التعافي من الأضرار الناجمة عن إجراء التزجيج ، كما هو موضح في الشكل 3و 4 و 5.
ومع ذلك ، فإن ارتفاع معدلات التنشيط الذاتي الذاتي أثناء ثقافة ما بعد الاحترار لا يزال يحد من إمكاناتها التنموية. جلايكول الإيثيلين وDMSO، وهما من العوامل ذات الصفة الكريوبروتينية الشائعة الاستخدام، قد ينشطان البويضات بشكل مصطنع قبل الإخصاب الفعلي، مما يحد من نجاح الإخصاب وتطور الجنين. أنها يمكن أن تسبب في الواقع زيادة عابرة في Ca2+ داخل الخلية تركيز31, وبالتالي اثار حبيبات القشرية exocytosis, تشكيل pronuclei, واستئناف meiotic32. في الواقع ، قد ينشط التزجيج البويضات بشكل مصطنع قبل الإخصاب الفعلي ، مما يحد من نجاح الإخصاب وتطور الجنين. وبالتالي يمكن استخدامchelator الكالسيوم لزيادة الحد من توافر الكالسيوم خلال عملية التزجيج بهدف الحد من معدل التنشيط التلقائي في البويضات الأحداث.
وينبغي أيضا أن يعتبر أنه ، على عكس التجميد البطيء ، فإن التزجيج تقنية يدوية حصرا وبالتالي فهي تعتمد على المشغل33و34. وبالتالي، فإن توافر الموظفين المدربين عامل رئيسي لنجاح هذه الطريقة. أولا وقبل كل شيء، المشغل لديه لتحديد بشكل صحيح البويضات لتكون تهتز. بعد IVM ، يتم تنضح البويضات بلطف من خلايا الركاز وتقييمها تحت منظار مجسم لتحديد لالتبريد فقط أولئك الذين لديهم سيتوبلازم موحد ، توزيع متجانس لقطرات الدهون في السيتوبلازم ومع القطر الخارجي لحوالي 90 ميكرومتر. وعلاوة على ذلك، يجب اختيار البويضات فقط التي تظهر البثق على الجسم القطبي الأول، وبالتالي في مرحلة MII.
يجب الانتهاء من التقييم المورفولوجي للبويضات في بضع دقائق وكونها تعتمد على المشغل ، فهي حساسة للغاية للاختلافات في تنفيذها بشكل صحيح. للمساعدة في توحيد إجراءات الاختيار، تقترح الطريقة تحديد وقت الثقافة للنضوج في المختبر إلى 22 ساعة للبويضات البالغة. في هذه المرحلة الزمنية ، أكملت البويضات الأغنام ذات الجودة العالية بالفعل القسم22 الأول ويمكن اختيارها لالتبريد. وبهذه الطريقة يجب أن يكون القضاء على البويضات منخفضة الجودة ، والتي هي أبطأها في إكمال القسم المطيوي الأول ، أبسط.
يجب على المشغل أيضا أن يحترم بدقة التوقيت المحدد لإجراء التزجيج ، من التعرض الأول للبروتين المبرد إلى الغمر في النيتروجين السائل. خطوة أخرى حاسمة هي تحميل البويضات في جهاز التزجيج المستخدم. يجب أن يستخدم الإجراء الحد الأدنى من أحجام العينة لزيادة معدل التبريد ومساعدة الخلايا على المرور عبر درجة حرارة المرحلة الانتقالية بسرعة ، وبالتالي تقليل إصابات التبريد35. يستخدم Cryotop شريط البولي بروبلين المرفق بحامل. في هذه الطريقة ، يتم تحميل البويضات في محلول التزجيج (<0.1 ميكرولتر) بسرعة مع شعرية زجاجية فوق شريط الفيلم. ثم، يجب إزالة الحل، تاركا وراءه طبقة رقيقة كافية لتغطية الخلايا لتكون cryopreserved. مرة أخرى ، يجب إكمال هذه الخطوة في أسرع وقت ممكن للحد من تعرض البويضات لتركيزات التبريد العالية لمحلول التزجيج ، والتي يمكن أن تسبب صدمة تناضحية وسامة للخلايا.
ولهذه الأسباب، يتمثل أحد التحديات الرئيسية المرتبطة بهذه الطريقة في الحاجة إلى المناولة اليدوية والفني الماهر. وأفاد مؤلفون آخرون أن نتيجة تزجيج البويضات تبدو متأثرة بتأثير "منحنى التعلم"، حيث أن اكتساب المهارات اليدوية يمكن أن يقلل بشكل كبير من الضرر البيولوجي الناجم عن إجراء التزجيج34. وينبغي بالتالي أن يأخذ الباحثون في الاعتبار "تأثير المشغل" في تقييم نتائج إجراء التزجيج.
وستركز دراسات أخرى على توحيد إجراءات اختيار البويضات وتحسين تكييف تكوين الوسائط وظروف الثقافة مع احتياجات البويضات الأحداث. وفي هذا الصدد، قد يوفر استخدام مطهر الكالسيوم ومضادات الأكسدة فرصا واعدة. وبالمثل، فإن الاستفادة المثلى من البروتوكول تسمح بزيادة الكفاءة التنموية للبويضات البالغة الزخينة / الدافئة.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
ويعلن صاحبا البلاغ أنه ليس لديهما مصالح مالية متنافسة.
Acknowledgments
ولم يتلق المؤلفان أي تمويل محدد لهذا العمل. البروفسورة ماريا غرازيا كاباي والدكتورة فاليريا باسيو معترف بامتنان لصوت الفيديو ولإعداد المختبر أثناء صنع الفيديو.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 2′,7′-Dichlorofluorescin diacetate | Sigma-Aldrich | D-6883 | |
| Albumin bovine fraction V, protease free | Sigma-Aldrich | A3059 | |
| Bisbenzimide H 33342 trihydrochloride (Hoechst 33342) | Sigma-Aldrich | 14533 | |
| Calcium chloride (CaCl2 2H20) | Sigma-Aldrich | C8106 | |
| Citric acid | Sigma-Aldrich | C2404 | |
| Confocal laser scanning microscope | Leica Microsystems GmbH,Wetzlar | TCS SP5 DMI 6000CS | |
| Cryotop Kitazato | Medical Biological Technologies | ||
| Cysteamine | Sigma-Aldrich | M9768 | |
| D- (-) Fructose | Sigma-Aldrich | F0127 | |
| D(+)Trehalose dehydrate | Sigma-Aldrich | T0167 | |
| Dimethyl sulfoxide (DMSO) | Sigma-Aldrich | D2438 | |
| Dulbecco Phosphate Buffered Saline | Sigma-Aldrich | D8537 | |
| Egg yolk | Sigma-Aldrich | P3556 | |
| Ethylene glycol (EG) | Sigma-Aldrich | 324558 | |
| FSH | Sigma-Aldrich | F4021 | |
| Glutamic Acid | Sigma-Aldrich | G5638 | |
| Glutaraldehyde | Sigma-Aldrich | G5882 | |
| Glycerol | Sigma-Aldrich | G5516 | |
| Glycine | Sigma-Aldrich | G8790 | |
| Heparin | Sigma-Aldrich | H4149 | |
| HEPES | Sigma-Aldrich | H4034 | |
| Hypoutarine | Sigma-Aldrich | H1384 | |
| Inverted microscope | Diaphot, Nikon | ||
| L-Alanine | Sigma-Aldrich | A3534 | |
| L-Arginine | Sigma-Aldrich | A3784 | |
| L-Asparagine | Sigma-Aldrich | A4284 | |
| L-Aspartic Acid | Sigma-Aldrich | A4534 | |
| L-Cysteine | Sigma-Aldrich | C7352 | |
| L-Cystine | Sigma-Aldrich | C8786 | |
| L-Glutamine | Sigma-Aldrich | G3126 | |
| LH | Sigma-Aldrich | L6420 | |
| L-Histidine | Sigma-Aldrich | H9511 | |
| L-Isoleucine | Sigma-Aldrich | I7383 | |
| L-Leucine | Sigma-Aldrich | L1512 | |
| L-Lysine | Sigma-Aldrich | L1137 | |
| L-Methionine | Sigma-Aldrich | M2893 | |
| L-Ornithine | Sigma-Aldrich | O6503 | |
| L-Phenylalanine | Sigma-Aldrich | P5030 | |
| L-Proline | Sigma-Aldrich | P4655 | |
| L-Serine | Sigma-Aldrich | S5511 | |
| L-Tyrosine | Sigma-Aldrich | T1020 | |
| L-Valine | Sigma-Aldrich | V6504 | |
| Magnesium chloride heptahydrate (MgSO4.7H2O) | Sigma-Aldrich | M2393 | |
| Makler Counting Chamber | Sefi-Medical Instruments ltd.Biosigma S.r.l. | ||
| Medium 199 | Sigma-Aldrich | M5017 | |
| Mineral oil | Sigma-Aldrich | M8410 | |
| MitoTracker Red CM-H2XRos | ThermoFisher | M7512 | |
| New born calf serum heat inactivated (FCS) | Sigma-Aldrich | N4762 | |
| Penicillin G sodium salt | Sigma-Aldrich | P3032 | |
| Phenol Red | Sigma-Aldrich | P3532 | |
| Polyvinyl alcohol (87-90% hydrolyzed, average mol wt 30,000-70,000) | Sigma-Aldrich | P8136 | |
| Potassium Chloride (KCl) | Sigma-Aldrich | P5405 | |
| Potassium phosphate monobasic (KH2PO4) | Sigma-Aldrich | P5655 | |
| Propidium iodide | Sigma-Aldrich | P4170 | |
| Sheep serum | Sigma-Aldrich | S2263 | |
| Sodium azide | Sigma-Aldrich | S2202 | |
| Sodium bicarbonate (NaHCO3) | Sigma-Aldrich | S5761 | |
| Sodium chloride (NaCl) | Sigma-Aldrich | S9888 | |
| Sodium dl-lactate solution syrup | Sigma-Aldrich | L4263 | |
| Sodium pyruvate | Sigma-Aldrich | P2256 | |
| Sperm Class Analyzer | Microptic S.L. | S.C.A. v 3.2.0 | |
| Statistical software Minitab 18.1 | 2017 Minitab | ||
| Stereo microscope | Olimpus | SZ61 | |
| Streptomycin sulfate | Sigma-Aldrich | S9137 | |
| Taurine | Sigma-Aldrich | T7146 | |
| TRIS | Sigma-Aldrich | 15,456-3 |
References
- Arav, A.
- Mullen, S. F., Fahy, G. M. A chronologic review of mature oocyte vitrification research in cattle, pigs, and sheep. Theriogenology. 78 (8), 1709-1719 (2012).
- Hwang, I. S., Hochi, S. Recent progress in cryopreservation of bovine oocytes. BioMed Research International. 2014, (2014).
- Berlinguer, F., et al. Effects of trehalose co-incubation on in vitro matured prepubertal ovine oocyte vitrification. Cryobiology. 55 (1), (2007).
- Quan, G., Wu, G., Hong, Q. Oocyte Cryopreservation Based in Sheep: The Current Status and Future Perspective. Biopreservation and Biobanking. 15 (6), 535-547 (2017).
- Succu, S., et al. A recovery time after warming restores mitochondrial function and improves developmental competence of vitrified ovine oocytes. Theriogenology. 110, (2018).
- Succu, S., et al. Vitrification of in vitro matured ovine oocytes affects in vitro pre-implantation development and mRNA abundance. Molecular Reproduction and Development. 75 (3), (2008).
- Succu, S., et al. Vitrification Devices Affect Structural and Molecular Status of In Vitro Matured Ovine Oocytes. Molecular Reproduction and Development. 74, 1337-1344 (2007).
- Hosseini, S. M., Asgari, V., Hajian, M., Nasr-Esfahani, M. H. Cytoplasmic, rather than nuclear-DNA, insufficiencies as the major cause of poor competence of vitrified oocytes. Reproductive BioMedicine Online. , (2015).
- Succu, S., et al. Calcium concentration in vitrification medium affects the developmental competence of in vitro matured ovine oocytes. Theriogenology. 75 (4), (2011).
- Sanaei, B., et al. An improved method for vitrification of in vitro matured ovine oocytes; beneficial effects of Ethylene Glycol Tetraacetic acid, an intracellular calcium chelator. Cryobiology. 84, 82-90 (2018).
- Quan, G. B., Wu, G. Q., Wang, Y. J., Ma, Y., Lv, C. R., Hong, Q. H. Meiotic maturation and developmental capability of ovine oocytes at germinal vesicle stage following vitrification using different cryodevices. Cryobiology. 72 (1), 33-40 (2016).
- Fernández-Reyez, F., et al. maturation and embryo development in vitro of immature porcine and ovine oocytes vitrified in different devices. Cryobiology. 64 (3), 261-266 (2012).
- Ahmadi, E., Shirazi, A., Shams-Esfandabadi, N., Nazari, H. Antioxidants and glycine can improve the developmental competence of vitrified/warmed ovine immature oocytes. Reproduction in Domestic Animals. 54 (3), 595-603 (2019).
- Barrera, N., et al. Impact of delipidated estrous sheep serum supplementation on in vitro maturation, cryotolerance and endoplasmic reticulum stress gene expression of sheep oocytes. PLoS ONE. 13 (6), (2018).
- Walker, S. K., Hill, J. L., Kleemann, D. O., Nancarrow, C. D. Development of Ovine Embryos in Synthetic Oviductal Fluid Containing Amino Acids at Oviductal Fluid Concentrations. Biology of Reproduction. 55 (3), 703-708 (1996).
- Kuwayama, M., Vajta, G., Kato, O., Leibo, S. P. Highly efficient vitrification method for cryopreservation of human oocytes. Reproductive BioMedicine Online. 11 (3), 300-308 (2005).
- Wu, X., Jin, X., Wang, Y., Mei, Q., Li, J., Shi, Z. Synthesis and spectral properties of novel chlorinated pH fluorescent probes. Journal of Luminescence. 131 (4), 776-780 (2011).
- Dell'Aquila, M. E., et al. Prooxidant effects of verbascoside, a bioactive compound from olive oil mill wastewater, on in vitro developmental potential of ovine prepubertal oocytes and bioenergetic/oxidative stress parameters of fresh and vitrified oocytes. BioMed Research International. 2014, (2014).
- Gadau, S. D. Morphological and quantitative analysis on α-tubulin modifications in glioblastoma cells. Neuroscience Letters. 687, 111-118 (2018).
- los Reyes, M. D., Palomino, J., Parraguez, V. H., Hidalgo, M., Saffie, P. Mitochondrial distribution and meiotic progression in canine oocytes during in vivo and in vitro maturation. Theriogenology. , (2011).
- Leoni, G. G., et al. Differences in the kinetic of the first meiotic division and in active mitochondrial distribution between prepubertal and adult oocytes mirror differences in their developmental competence in a sheep model. PLoS ONE. 10 (4), (2015).
- Berlinguer, F., et al. Effects of trehalose co-incubation on in vitro matured prepubertal ovine oocyte vitrification. Cryobiology. 55 (1), 27-34 (2007).
- Serra, E., Gadau, S. D., Berlinguer, F., Naitana, S., Succu, S. Morphological features and microtubular changes in vitrified ovine oocytes. Theriogenology. 148, 216-224 (2020).
- Asgari, V., Hosseini, S. M., Ostadhosseini, S., Hajian, M., Nasr-Esfahani, M. H. Time dependent effect of post warming interval on microtubule organization, meiotic status, and parthenogenetic activation of vitrified in vitro matured sheep oocytes. Theriogenology. 75 (5), 904-910 (2011).
- Ciotti, P. M., et al. Meiotic spindle recovery is faster in vitrification of human oocytes compared to slow freezing. Fertility and Sterility. 91 (6), 2399-2407 (2009).
- Ledda, S., Bogliolo, L., Leoni, G., Naitana, S. Cell Coupling and Maturation-Promoting Factor Activity in In Vitro-Matured Prepubertal and Adult Sheep Oocytes1. Biology of Reproduction. 65 (1), 247-252 (2001).
- Palmerini, M. G., et al. In vitro maturation is slowed in prepubertal lamb oocytes: ultrastructural evidences. Reproductive Biology and Endocrinology. 12, (2014).
- Leoni, G. G., et al. Relations between relative mRNA abundance and developmental competence of ovine oocytes. Molecular Reproduction and Development. 74 (2), 249-257 (2007).
- Succu, S., et al. Effect of vitrification solutions and cooling upon in vitro matured prepubertal ovine oocytes. Theriogenology. 68 (1), 107-114 (2007).
- Larman, M. G., Sheehan, C. B., Gardner, D. K. Calcium-free vitrification reduces cryoprotectant-induced zona pellucida hardening and increases fertilization rates in mouse oocytes. Reproduction. 131 (1), 53-61 (2006).
- Yeste, M., Jones, C., Amdani, S. N., Patel, S., Coward, K. Oocyte activation deficiency: a role for an oocyte contribution. Human Reproduction Update. 22 (1), 23-47 (2016).
- Rienzi, L., et al. Oocyte, embryo and blastocyst cryopreservation in ART: systematic review and meta-analysis comparing slow-freezing versus vitrification to produce evidence for the development of global guidance. Human Reproduction Update. 23 (2), 139-155 (2017).
- De Santis, L., et al. Oocyte vitrification: influence of operator and learning time on survival and development parameters. Placenta. 32, 280-281 (2011).
- Zhang, X., Catalano, P. N., Gurkan, U. A., Khimji, I., Demirci, U. Emerging technologies in medical applications of minimum volume vitrification. Nanomedicine. 6 (6), London, England. 1115-1129 (2011).
