Summary
El protocolo tiene como objetivo proporcionar un método estándar para la vitrificación de ovocitos de ovejas adultas y juveniles. Incluye todos los pasos desde la preparación de los medios de maduración in vitro hasta el cultivo post-calentamiento. Los ovocitos se vitrifican en la etapa de MII utilizando Cryotop para asegurar el volumen mínimo esencial.
Abstract
En el ganado, los sistemas de producción de embriones in vitro se pueden desarrollar y mantener gracias a la gran cantidad de ovarios y ovocitos que se pueden obtener fácilmente de un matadero. Los ovarios adultos siempre llevan varios folículos antrales, mientras que en los donantes prepúerales los números máximos de ovocitos están disponibles a las 4 semanas de edad, cuando los ovarios tienen un número máximo de folículos antrales. Así, los corderos de 4 semanas de edad se consideran buenos donantes, incluso si la competencia de desarrollo de los ovocitos prepúrromos es menor en comparación con su contraparte adulta.
La investigación básica y las aplicaciones comerciales se verían impulsadas por la posibilidad de criopreservar con éxito ovocitos vitrificados obtenidos de donantes adultos y prepúterrales. La vitrificación de los ovocitos recogidos de donantes prepúrromos también permitiría acortar el intervalo de generación y, por lo tanto, aumentar la ganancia genética en los programas de cría. Sin embargo, la pérdida de potencial de desarrollo después de la criopreservación hace que los ovocitos de mamíferos sean probablemente uno de los tipos celulares más difíciles de criopreservar. Entre las técnicas de criopreservación disponibles, la vitrificación se aplica ampliamente a los ovocitos animales y humanos. A pesar de los avances recientes en la técnica, las exposiciones a altas concentraciones de agentes crioprotectores, así como lesiones escalofriantes y estrés osmótico todavía inducen varias alteraciones estructurales y moleculares y reducen el potencial de desarrollo de los ovocitos de mamíferos. Aquí, se describe un protocolo para la vitrificación de ovocitos de oveja recogidos de donantes juveniles y adultos y madurados in vitro antes de la criopreservación. El protocolo incluye todos los procedimientos desde la maduración in vitro de ovocitos hasta la vitrificación, el calentamiento y el período de incubación post-calentamiento. Los ovocitos vitrificados en la etapa de MII de hecho pueden ser fertilizados después del calentamiento, pero necesitan tiempo extra antes de la fertilización para restaurar el daño debido a los procedimientos de criopreservación y para aumentar su potencial de desarrollo. Por lo tanto, las condiciones de cultivo posteriores al calentamiento y el momento son pasos cruciales para la restauración del potencial de desarrollo de ovocitos, especialmente cuando los ovocitos se recolectan de donantes juveniles.
Introduction
El almacenamiento a largo plazo de los gametos femeninos puede ofrecer una amplia gama de aplicaciones, como la mejora de la cría de animales domésticos mediante programas de selección genética, la contribución a la preservación de la biodiversidad a través del programa de conservación de especies silvestres ex situ, y el impulso de la investigación y las aplicaciones biotecnológicas in vitro gracias a la disponibilidad de ovocitos almacenados para ser incorporados en la producción de embriones in vitro o en los programas de trasplante nuclear1,2,3. La vitrificación de ovocitos juveniles también aumentaría la ganancia genética al acortar el intervalo de generación en los programas de cría4. La vitrificación por enfriamiento y calentamiento ultrarrápido de ovocitos se considera actualmente un enfoque estándar para la criopreservación de ovocitos de ganado5. En los rumiantes, antes de la vitrificación, los ovocitos suelen madurar in vitro, después de la recuperación de folículos obtenidos de ovarios derivados demataderos 2. Los ovarios adultos, y especialmente los ovarios prepúrromos4,6,pueden suministrar un número prácticamente ilimitado de ovocitos que se criopreservan.
En el ganado vacuno, después de la vitrificación y calentamiento de los ovocitos, los rendimientos de blastocistos en >10% han sido comúnmente reportados por varios laboratorios durante la última década3. Sin embargo, en los pequeños rumiantes la vitrificación de ovocitos todavía se considera relativamente nueva tanto para ovocitos juveniles como para adultos, y queda por establecer un método estándar para la vitrificación de ovocitos ovinos2,5. A pesar de los avances recientes, el ovocito vitrificado y calentado presenta de hecho varias alteraciones funcionales y estructurales que limitan su potencial de desarrollo7,8,9. Por lo tanto, pocos artículos han reportado el desarrollo de blastocistos al 10% o más en ovocitos de oveja vitrificados /calentados2. Se han investigado varios enfoques para reducir las alteraciones antes mencionadas: optimización de la composición de las soluciones de vitrificación y descongelación10,11; experimentar con el uso de diferentes crio-dispositivos8,12,13; y la aplicación de tratamientos específicos durante la maduración in vitro (GIV)4,14,15 y/o durante el tiempo de recuperación después del calentamiento6.
Aquí describimos un protocolo para la vitrificación de ovocitos de oveja recogidos de donantes juveniles y adultos y madurados in vitro antes de la criopreservación. El protocolo incluye todos los procedimientos desde la maduración in vitro de ovocitos hasta la vitrificación, el calentamiento y el período de cultivo post-calentamiento.
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Protocol
El protocolo animal y los procedimientos implementados que se describen a continuación están de acuerdo con las directrices éticas vigentes en la Universidad de Sassari, en cumplimiento de la Directiva 86/609/CE de la Unión Europea y la recomendación de la Comisión de las Comunidades Europeas 2007/526/CE.
1. Preparación de medios para la manipulación de ovocitos
- Prepare el medio para el transporte de los ovarios recolectados complementando la solución salina tamponada con fosfato de Dulbecco con 0,1 g/L de penicilina y 0,1 g/L de estreptomicina (PBS).
- Preparar el medio para la recolección y maduración de ovocitos diluyendo 9,5 g de Tissue Culture Medium (TCM) 199 en polvo con 1 L de agua Milli-Q suplementada con penicilina (0,1%) y estreptomicina (0,1%).
- Después de la dilución, filtre 100 mL de medio y guárdelo a 4 °C como Medio de Maduración (SMM) para ser utilizado durante una semana.
- Preparar el medio de recolección (CM) complementando los 900 mL restantes con 25 mM HEPES, 0,36 g/L de bicarbonato y 0,1% (p/v) de alcohol polivinílico (PVA) (pH 7,3, osmolalidad 290 mOsm/kg).
- Preparar el medio de maduración con SMM suplementado con 0,021 g/L de bicarbonato, 10% de suero de ovejas de celo tratado térmicamente, 1 UI/mL de FSH, 1 UI/mL de LH, 100 μL de cisteamina y 8 mg/mL de piruvato.
NOTA: El medio de maduración en un volumen de 10 mL debe incubarse en condiciones estándar (en una atmósfera humidificada máxima a 39 °C en un 5% de CO2 en el aire) durante al menos 4 h antes de su uso. - Preparar el medio base (BM) para la manipulación de ovocitos después de la maduración in vitro, consistente en PBS sinCa++ yMg++,complementado con suero fetal de terneros (FCS) al 20%.
2. Recolección y maduración de ovocitos
- Recuperar los ovocitos de ovarios juveniles (30-40 días de edad, peso corporal 6-10 kg) y adultos.
- Transporte los ovarios recogidos desde el matadero comercial hasta el laboratorio dentro de 1-2 h en PBS a 27 °C.
- Después del lavado en pbs medio fresco, cortar los ovarios en CM utilizando una micro-cuchilla para liberar el contenido del folículo.
- Bajo un examen estereomicroscopio con aumento de 60x, seleccione complejos cúmulo-ovocito (AOC) para la maduración in vitro eligiendo aquellos con 4-10 capas de células granulosa, ovocitos con un citoplasma uniforme, distribución homogénea de gotitas lipídicas en el citoplasma y con el diámetro externo de aproximadamente 90 μm (media).
- Lavar los AOC seleccionados tres veces en CM y finalmente transferirlos en medio de maduración.
NOTA: Para los ovocitos juveniles, para mejorar la supervivencia después de la vitrificación, complementar el medio de maduración con 100 μM de trehalosa. - Para la maduración in vitro, transferir 30-35 COCs en 600 μL de medio de maduración en placas de Petri de cuatro pocillos, recubiertas con 300 μL de aceite mineral e incubarlos durante 22 (ovocitos adultos)/24 (ovocitos juveniles) h en 5% de CO2 en el aire a 39 °C.
- Después de la maduración in vitro, denude los AOC de las células cumulus pipeteando suavemente. Después del examen bajo un estereomicroscopio con aumento de 60x, seleccione solo aquellos que muestren la extrusión en el primer cuerpo polar, y por lo tanto en la etapa de metafase II (MII), para la vitrificación.
3. Procedimientos de recogida, congelación y descongelación del semen
- Preparar el medio base para la criopreservación de semen consistente en extensor de ram (200 mM Tris; 70 mM de ácido cítrico; 55 mM de fructosa; pH 7,2, osmolalidad 300 mOsm/kg) suplementado con yema de huevo al 20% (v/v).
- Recoger el semen sólo durante la temporada de cría de ovejas (octubre-noviembre).
- Obtener eyaculados por vagina artificial a partir de carneros adultos (de 2 a 5 años), mantenidos en un ambiente al aire libre y alimentados con una ración de mantenimiento de peso vivo. Mantenga los carneros aislados en corrales separados, pero con contacto visual entre sí.
- Repetir la recolección de semen una a la semana durante toda la temporada de reproducción para obtener al menos 8 eyaculados de cada macho.
- Transporte las muestras de semen al laboratorio a temperatura ambiental dentro de los 5 minutos posteriores a la recolección y procese inmediatamente. Agrupar los eyaculados de dos-tres carneros y evaluar la espectrofotometría de concentración de espermatozoides.
- Después de la agrupación, diluir los eyaculados hasta 400 x 106 espermatozoides/mL con medio base para la criopreservación de semen complementado con glicerol al 4%. Luego enfríe el semen diluido a 4 °C durante un período de 2 h y equilibre durante 20 min antes de congelarlo.
- Congele las muestras de semen en forma de pellets (0,25 mL) sobre hielo seco y luego sumerjalas en nitrógeno líquido.
- Para descongelar, ponga el pellet en un halcón de vidrio esterilizado y sumérjalo en un baño de agua durante 20 s a 39 °C.
4. Fertilización in vitro y cultivo de embriones
- Preparar las existencias para la constitución del fluido oviductal sintético (SOF).
- Preparar Stock A: 99.4 mL de MilliQ-agua; 6,29 g de NaCl; 0,534 g de KCl; 0,161 g de KH2PO4; 0,182 g de MgSO4 ·7H2O; y 0,6 mL de Lactato sódico. Conservar a 4 °C durante un hasta 3 meses.
- Preparar Stock B: 10 mL de MilliQ-agua; 0,210 g de NaHCO3; y 2-3 g de Fenol Rojo. Conservar a 4 °C durante 1 mes.
- Preparar Stock C: 10 mL de MilliQ-agua; y 0,051 g de piruvato de sodio. Conservar a 4 °C durante 1 mes.
- Preparar Stock D: 10 mL de MilliQ-agua; y 0,262 g de CaCl2 2H2O. Mantener a 4 °C durante 1 mes.
- Preparar 10 mL de SOF consistentes en 7.630 mL de agua MilliQ, 1 mL de Stock A, 1 mL de Stock B, 0.07 mL de Stock C y 0.7 mL de stock D.
- Preparar medio de fecundación in vitro (FIV): SOF suplementado con 2% de suero estrooso de oveja tratado térmicamente, 10 μg/mL de heparina y 1 μg/mL de hipoutarina (osmolalidad 280-290 mOsm/kg).
NOTA: El medio de FIV en un volumen de 10 mL debe incubarse en condiciones estándar (en una atmósfera humidificada máxima a 39 °C en 5% deCO2,5% deO2 y 90% deN2)al menos 4 h antes de su uso.
- Transfiera las alícuotas de semen congeladas/descongeladas en un tubo cónico de vidrio esterilizado por debajo de 1,5 mL de medio de FIV calentado y las incube durante 15 min a 39 °C en una atmósfera humidificada al 5% de CO2 en el aire.
- Después de la incubación, los espermatozoides móviles nadan hacia la porción apical de la columna líquida. Recoger la capa superior y observar para la evaluación de la motilidad de los espermatozoides.
NOTA: Los parámetros de motilidad de los espermatozoides deben evaluarse utilizando un sistema de análisis de espermatozoides asistido por computadora (CASA) con los siguientes ajustes: 25 marcos adquiridos para evitar la superposición de la pista de espermatozoides, contraste mínimo 10, velocidad mínima de la trayectoria media 30 μm / s, y motilidad progresiva > 80% de recualidad. Este sistema tiene una configuración específica para la evaluación de espermatozoides ram. Para cada muestra, se cargan 5 μL de submuestra de suspensión de espermatozoides en una cámara de análisis precalentada con una profundidad de 10 μm. La motilidad de los espermatozoides se evalúa a 37 °C a 40x utilizando un microscopio de contraste de fase y se debe analizar un mínimo de 500 espermatozoides por submuestra en al menos cuatro campos microscópicos diferentes. Se evaluó el porcentaje de espermatozoides móviles totales y móviles progresivos. Para la FIV, el porcentaje de espermatozoides móviles progresivos debe ser ≥ del 30%. - Diluir espermatozoides móviles derivados de swim-up a 1 x 106 espermatozoides/mL de concentración final y co-incubarlos con ovocitos MII en 300 μL de medio de FIV cubiertos con aceite mineral en placas de Petri de cuatro pozos.
- Después de 22 h transfiera los cigotos presuntos en las placas de Petri de cuatro pozos que contienen SOF complementado con la albúmina de suero bovino 0,4% y los aminoácidos esenciales y no esenciales en la concentración oviductal según lo divulgado por16 bajo aceite mineral y cultivarlos bajo condiciones estándar hasta la etapa del blastocyst.
- En 22-, 26- y 32- h post-inseminación, registre el número de ovocitos escindidos, mostrando dos blastómeros distintos, por la examinación bajo estereomicroscopio con la ampliación de 60x.
- Observe los embriones diariamente a partir del quinto al noveno día de cultivo y los blastocistos recién formados deben ser registrados por el examen bajo un estereomicroscopio con aumento de 60x.
5. Vitrificación y calentamiento de ovocitos
NOTA: Realizar la vitrificación siguiendo el método de volumen mínimo esencial (MEV) utilizando criotopos dispositivo17.
- Equilibrar un grupo de cinco ovocitos a 38,5 °C durante 2 min en BM. El uso de BM garantiza una baja concentración de calcio ([Ca2++] 2,2 mg/dL)10.
- Deshidratar los ovocitos con una exposición de 3 min a la solución de equilibrio que contiene 7,5% (v/v) sulfóxido de dimetilo (DMSO) y 7,5% (v/v) de etilenglicol (EG) en BM.
- Transferir los ovocitos a la solución de vitrificación que contiene 16,5% (v/v) DMSO, 16,5% (v/v) EG y 0,5 M de trehalosa en BM antes de cargarlos en un dispositivo de criotopo y sumergirlos directamente en nitrógeno líquido dentro de 30 s.
- Para calentar a una temperatura biológica, transfiera el contenido de cada dispositivo de vitrificación de nitrógeno líquido a gotas de 200 μL de trehalosa de 1,25 M en BM durante 1 min a 38,5 °C, y revuelva suavemente para facilitar la mezcla.
- Para promover la eliminación de los crioprotectores intracelulares, transfiera los ovocitos de forma gradual a 200 μL de gotas de disminución de soluciones de trehalosa (0,5 M, 0,25 M, 0,125 M de trehalosa en BM) durante 30 s a 38,5 °C antes de equilibrarse durante 10 min a 38,5 °C en BM.
6. Evaluación de la calidad de los ovocitos después del calentamiento
- Después del calentamiento, incubar los ovocitos durante 6 h en PBS sinCa++ yMg++ más 20% fcs (BM) en 5%CO2 en aire a 38,5 °C.
NOTA: La capacidad de los ovocitos para restaurar las características biológicas y estructurales después de la vitrificación está en relación con las especies y clases de ovocitos utilizados. - Dado que la capacidad de los ovocitos para recuperar los daños de criopreservación depende del tiempo, evaluar la calidad de los ovocitos en diferentes puntos de tiempo de cultivo in vitro (0 h, 2 h, 4 h, 6 h) después del calentamiento, para definir la ventana de tiempo óptima para la fertilización de ovocitos.
NOTA: En el ovocito de oveja adulto, el tiempo óptimo es 4 h después del calentamiento; para el ovocitos prepúrromos, el tiempo óptimo es de 2 h después del calentamiento.
7. Evaluación de la supervivencia de los ovocitos
- Inmediatamente después del calentamiento y para cada punto de tiempo de cultivo post-calentamiento, evaluar morfológicamente los ovocitos utilizando un microscopio invertido con aumento de 100x.
NOTA: Los ovocitos con alteraciones estructurales, como citoplasma débil, zona de daño pelúcida y/o membrana deben clasificarse como degenerados. - Valide la evaluación de la integridad de la membrana usando una coloración fluorescente diferencial doble.
- Incubar los ovocitos en 2 mL de BM que contengan yoduro de propidio (PI; 10 μg/mL) y Hoechst 33342 (10 μg/mL) durante 5 min enCO2 al 5% en aire a 38,5 °C.
- Después de lavar tres veces en BM fresco, observe los ovocitos bajo un microscopio fluorescente utilizando un filtro de excitación de 350 nm y emisión de 460 nm para Hoechst 33342 y un filtro de excitación de 535 nm y emisión de 617 nm para PI.
NOTA: Los ovocitos con una membrana intacta pueden ser reconocidos por la fluorescencia azul del ADN coloreado con Hoechst 33342. Los ovocitos con membranas dañadas muestran una fluorescencia roja debido a la tinción del ADN con IP.
8. Evaluación de la actividad mitocondrial y de los niveles intracelulares del ROS por microscopia confocal de la exploración del laser
- Prepare la sonda MitoTracker Red CM-H2XRos (MT-Red).
- Diluir el contenido de 1 vial (50 μg) con 1 mL de DMSO para obtener una solución de 1 mM. Mantenga el vial diluido en nitrógeno líquido.
- Diluya la solución 1 mM con DMSO para obtener la solución común de 100 μM y almacenarla a -80 °C en la oscuridad.
- Prepare la sonda de diacetato de 2′,7′-diclorodihidrofluoresceína (H2DCF-DA).
- Diluir elH2DCF-DA en polivinil pirrolina al 0,1% (PVA)/PBS para obtener la primera solución de 100 mM. Mantenga la solución a -80 °C en la oscuridad.
- Diluir la primera solución en PVA/PBS al 0,1% para obtener la solución común de 100 μM. Guárdelo a -20 °C en la oscuridad.
- Preparar el medio de montaje (MM): para 10 mL de MM, añadir 5 mL de glicerol, 5 mL de PBS y 250 mg de azida de sodio. Guárdelo a -20 °C hasta su uso.
- Incubar los ovocitos durante 30 min a 38,5 °C en BM con 500 nM MT-Red (solución madre: 100 μM en DMSO).
- Después de la incubación con sonda MT-Red, lavar los ovocitos tres veces en BM e incubar durante 20 min en el mismo medio que contiene 5 μM H2DCF-DA (solución madre: 100 μM en BM).
- Después de la exposición a las sondas, lave los ovocitos en BM y fije en glutaraldehído/PBS al 2,5% durante al menos 15 min.
- Después de la fijación, lave los ovocitos tres veces en BM y monte en diapositivas de vidrio en una gota de 4 μL de MM con 1 mg/mL Hoechst 33342 usando cojines de cera para evitar la compresión de muestras.
- Guarde las diapositivas a 4 °C en la oscuridad hasta la evaluación.
- Realizar el análisis de secciones inmunomarcadas con un microscopio de barrido láser confocal. El microscopio está equipado con láseres Ar/He/Ne, utilizando un objetivo de aceite 40/60x. Analizar las secciones por excitación secuencial.
- Para la evaluación mitocondrial, observe las muestras con un láser multifotón para detectar MT-Red (exposición: 579 nm; emisión: 599 nm).
- Utilice un rayo láser de iones de argón a 488 nm y el filtro B-2 A (exposición de 495 nm y emisión de 519 nm) para señalar la diclorofluoresceína (DCF)18.
- En cada ovocito individual, mida las intensidades de fluorescencia MT-Red y DCF en el plano ecuatorial19.
- Mantener los parámetros relacionados con la intensidad de fluorescencia en valores constantes durante todas las adquisiciones de imágenes (energía láser 26%, Ajustes secuenciales 1: Ganancia PMT1 649-PMT2 ganancia 482; Ajuste secuencial 2: Ganancia PMT1 625-PMT2 ganancia 589; desplazamiento 0; tamaño del agujero de alfiler: 68).
- Realizar análisis cuantitativos de la intensidad de fluorescencia utilizando el paquete de software de análisis de imágenes Leica LAS AF Lite, siguiendo los procedimientos estandarizados por20.
- Captura las imágenes una vez, moviéndose sobre el eje Z, hasta llegar al plano ecuatorial.
- Para cada foto, transformar a escala de grises y desactivar el canal 1 (relacionado con el azul hoechst) se apagó. A continuación, dibuje manualmente una región de interés (ROI) en un área circunscrita, es decir, alrededor del huso meiótico.
NOTA: El software puede leer automáticamente el valor promedio de píxeles en el canal 2 (FITC), restando el valor del fondo de él. - Registre los valores medios de los píxeles y envíelos para su análisis estadístico.
9. Análisis estadísticos
- Analizar las siguientes diferencias: tasas de supervivencia en ovocitos juveniles vs adultos, tasas de supervivencia y competencia de desarrollo en ovocitos juveniles tratados con trehalosa y ovocitos tratados con trehalosa, supervivencia y tasas de activación partenogenética y competencia de desarrollo de ovocitos adultos vitrificados con diferentes medios de concentración de calcio, tasas de fertilización y producción de embriones en ovocitos juveniles vitrificados con baja o alta concentración de calcio, fenotipos mitocondriales activos en ovocitos vitrificados juveniles durante diferentes puntos de tiempo del cultivo post-calentamiento y las tasas de activación partenogenética entre ovocitos vitrificados adultos y juveniles utilizando la prueba de chi cuadrado.
- Analizar la tasa de escisión y la producción de embriones en ovocitos adultos vitrificados durante diferentes puntos de tiempo de cultivo post-calentamiento, intensidad de fluorescencia de la actividad mitocondrial y niveles intracelulares ros en ovocitos vitrificados juveniles durante diferentes puntos de tiempo de cultivo post-calentamiento por ANOVA después del análisis de homogeneidad de varianza por la prueba de Levene. Utilice una prueba post-hoc de la prueba de Tukey para resaltar las diferencias entre los grupos.
- Realice el análisis estadístico usando el programa de software estadístico y considere una probabilidad de P < 0.05 para ser el nivel mínimo de significación. Todos los resultados se expresan como ± media de S.E.M.
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Representative Results
La criotolerance de los ovocitos de donantes juveniles es menor en comparación con los adultos. El primer efecto observado es una menor tasa de supervivencia post-calentamiento en comparación con los ovocitos adultos(Figura 1A;χ2 prueba P<0,001). Los ovocitos juveniles mostraron una menor integridad de la membrana después del calentamiento (Figura 1B). El uso de trehalosa en el medio de maduración tenía como objetivo verificar si este azúcar podría reducir las crioinjurias en ovocitos juveniles. Los datos han demostrado23 que los ovocitos maduraron durante 24 h con la suplementación con trehalosa mostraron mayores tasas de supervivencia después de la vitrificación/calentamiento en comparación con el grupo no tratado(Tabla 1:85,7% vs 75,3% respectivamente; χ2 prueba P<0,05). La suplementación con trehalosa se asoció de hecho con una mayor integridad de la membrana después del calentamiento(Figura 2A). Así, el uso de trehalosa durante la maduración in vitro de ovocitos juveniles aumentó las tasas de supervivencia tras la vitrificación (85,7%) a valores comparables a los adultos (90,3%). Sin embargo, la escisión, la fertilización y las tasas de desarrollo de los ovocitos juveniles no aumentaron con la suplementación con trehalosa(Tabla 1).
Para mejorar la competencia de los ovocitos después de la vitrificación, probamos en ovocitos ovinos adultos diferentes medios de vitrificación con concentraciones de calcio que oscilan entre 9,9 y 0,4 mg/dL10. Los resultados obtenidos mostraron que el uso de medios con concentración de calcio igual a 2,2 mg/dL aumentó las tasas de supervivencia post-calentamiento, mejoró la competencia en el desarrollo y redujo la activación partenogenética del ovocito adulto10 (Tabla 2). Probamos así los medios bajos de la vitrificación del calcio para la vitrificación de ovocitos juveniles. Como se muestra en la Tabla 3,los ovocitos juveniles vitrificados con baja concentración de calcio evidenciaron mayores tasas de fertilización en comparación con los ovocitos vitrificados con alta concentración de calcio (44,35% vs 32,29% respectivamente; P<0,05), pero no se encontraron diferencias en la producción embrionaria.
Los ovocitos vitrificados/calentados necesitan tiempo extra antes de la fertilización para restaurar el daño debido a los procedimientos de criopreservación y para aumentar su potencial de desarrollo. De hecho, un estudio previo ha demostrado que la concentración intracelular de ATP, la actividad mitocondrial y la competencia en el desarrollo in vitro se reducen en ovocitos vitrificados /descongelados, que también muestran altas concentraciones intracelulares de ROS6. Estas alteraciones son particularmente marcadas inmediatamente después del calentamiento. Durante el cultivo post-calentamiento, tanto los ovocitos adultos como los juveniles son capaces de recuperarse parcialmente de los daños sufridos durante los procedimientos de vitrificación6,24. Comparando la cultura del poste-calentamiento de diversas duraciones (0, 2, 4, y 6 h), mostramos que después de 4 h de la cultura los ovocitos recogidos de ovejas adultas pueden recuperar el equilibrio energético6 y la configuración microtubular24 y restaurar la capacidad de desarrollo con una escisión más alta (50,7 ± 3,9%; P< 0,01 ANOVA) y tasas de blastocistos (14,40 ± 1,3%; ANOVA P< 0,01) comparado con otros puntos de tiempo (0, 2 y 6 h; Cuadro 4). Así, 4 h de cultivo post-calentamiento representa la ventana de tiempo ideal para la fertilización de ovocitos adultos vitrificados/calentados6.
Cuando el mismo experimento fue repetido con los ovocitos recogidos de donantes juveniles, estos resultados fueron confirmados parcialmente. La actividad mitocondrial era más alta en ovocitos juveniles vitrified/calentados después de 4 h de cultura del poste-calentamiento comparada a otros puntos del tiempo (0, 2, 6; Figura 3: ANOVA P<0.01). Se observan varios patrones de distribución mitocondrial y se clasifican en los tres grupos siguientes (según lo informado por21): Patrón A: FINE homogéneo con pequeñas granulaciones diseminadas por todo el citoplasma; Patrón B: GRANULAR homogéneo con grandes granulaciones diseminadas por todo el citoplasma; Patrón C: agrupados heterogéneos cuando estaban presentes granulaciones particularmente grandes, repartidas por todo el citoplasma o localizadas en dominios citoplasmáticos específicos. Los diferentes fenotipos en la distribución citoplasmática de mitocondrial activo en MII pueden estar relacionados con la competencia de desarrollo de ovocitos. Una distribución homogénea FINE es un indicador de mala competencia en el desarrollo, mientras que una distribución GRANULAR y CLUSTERED están relacionadas con un aumento de la actividad mitocondrial y, en consecuencia, una mayor competencia en el desarrollo22. Los patrones mitocondriales de la distribución cambiaron durante 6 h de cultura de poste-que calentaba. La Figura 4 muestra ejemplos de ovocitos juveniles que tienen diferentes patrones de distribución mitocondrial y sus fluctuaciones durante el cultivo post-calentamiento. El patrón A aumentó significativamente durante la incubación prolongada y alcanza el valor más alto a las 6 h post-calentamiento (Figura 4Aa: χ2 P<0.05), el patrón B no mostró cambios significativos durante el cultivo post-calentamiento (Figura 4Bb), el patrón C no se encontró en ningún ovocito vitrificado/calentado juvenil durante la incubación prolongada (Figura 4Cc: χ2 P<0.05).
Por otra parte, los niveles intracelulares de ROS fueron significativamente menores en los ovocitos juveniles a las 2 h del cultivo post-calentamiento en comparación con 0, 4 y 6 h(Figura 5:ANOVA P<0,001). Sin embargo, y en contraste con lo encontrado en ovocitos adultos, la tasa de activación partenogenética espontánea aumentó durante el cultivo post-calentamiento en ovocitos juveniles(Figura 6). Por esta razón, el punto de tiempo recomendado para la fertilización en ovocitos juveniles sería de 2 h después del cultivo post calentamiento.
Figura 1. Tasas de supervivencia de ovocitos ovinos vitrificados/calentados recogidos de donantes juveniles y adultos. (A) Los ovocitos fueron vitrificados después de la maduración in vitro. Las tasas de supervivencia se determinaron después de la vitrificación y el calentamiento por tinción fluorescente con yoduro de propidio (10 μg/mL) y Hoechst 33342 (10 μg/mL). N = 165 ovocitos adultos y 170 ovocitos juveniles. Diferentes letras indican diferencias significativas entre los ovocitos adultos y juveniles: χ2 prueba P<0.001. (B-C) Ejemplos de ovocitos juveniles vitrificados/calentados con membrana plasmática intacta (B) y dañada (C) en la evaluación morfológica (microscopio invertido con aumento de 100x). Barra de escala = 10 μm. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 2. Tasas de supervivencia de ovocitos ovinos juveniles y competencia de desarrollo in vitro después de la maduración con (TRH) y sin (CTR) trehalosa (100 mM en medio de maduración). (A-B) Ejemplos de ovocitos juveniles vitrificados tras la maduración in vitro en medios complementados(A)con o(B)sin trehalosa en la evaluación morfológica (microscopio invertido con aumento de 100x). Barra de escala = 30 μm. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 3. Cuantificación de la intensidad de fluorescencia mitocondrial activa en ovocitos juveniles vitrificados/calentados en diferentes momentos (0, 2, 4, 6) durante el cultivo in vitro post-calentamiento. Los ovocitos de IVM fueron utilizados como control (CTR N = 77). En total 163 (0 h N = 45; 2 h N = 39; 4 h N = 40; 6 h N = 39) ovocitos juveniles vitrificados y calentados en tres experimentos independientes. Diferentes letras indican diferencias estadísticamente significativas (ANOVA P = 0,0000). Haga clic aquí para ver una versión más amplia de esta figura.
Figura 4. Distribución del patrón mitocondrial en ovocitos juveniles vitrificados/calentados durante 6 horas de cultivo in vitro poste-calentamiento. Imágenes representativas de la distribución mitocondrial fina (A),granular (B) y agrupada (C) en ovocitos juveniles vitrificados / calentados. (D) Porcentaje de ovocitos vitrificados/calentados juveniles que muestran una fina distribución mitocondrial; (E) Porcentaje de ovocitos vitrificados/calentados juveniles que muestran una distribución mitocondrial granular; (F) Porcentaje de ovocitos vitrificados/calentados juveniles que muestran una distribución mitocondrial agrupada. Los ovocitos juveniles de IVM fueron utilizados como control (CTR; N = 77). En total 163 (0 h N = 45; 2 h N = 39; 4 h N = 40; 6 h N = 39) los ovocitos juveniles vitrificados y calentados en tres experimentos independientes fueron utilizados. Diversas letras indican diferencias estadístico significativas (Aa: χ2 P = 0,026; Bb: χ2 P = 0,097; Cc: χ2 P = 0,014). Barra de escala = 30 μm. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 5. Cuantificación de la intensidad intracelular de la fluorescencia del ROS en ovocitos juveniles vitrificados durante de 6 horas de cultivo in vitro post-calentamiento. (A-B) Imágenes representativas de la intensidad de fluorescencia ros en in vitro madurado(A)y vitrificado(B)ovocitos juveniles. (C)Los niveles intracelulares de ROS determinados por la cuantificación de la intensidad de fluorescencia en ovocitos juveniles vitrificados en diferentes puntos de tiempo (0 h N = 45; 2 h N = 39; 4 h N = 40; 6 h N = 39) durante el cultivo in vitro post-calentamiento. Los ovocitos juveniles madurados ines vitro fueron utilizados como control (CTR N = 77). Diferentes letras indican diferencias estadísticamente significativas (ANOVA P = 0,0000). Barra de escala = 50 μm. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 6. Activación partenogenética en ovocitos juveniles y adultos vitrificados durante 6 horas de cultivo in vitro post-calentamiento. (A-B)Imágenes representativas de la activación partenogenética de ovocitos:(A)ovocitos en transición metafase II-telofase II y(B)formación de pronúcleos. (C)Porcentajes de ovocitos adultos y juveniles activados por partenogenéticos en diferentes momentos (0, 2, 4, 6 h) durante el cultivo in vitro post-calentamiento. Los asteriscos indican diferencias estadísticas entre ovocitos juveniles y adultos en cada punto de incubación (ANOVA P = 0,000). Esta cifra ha sido modificada de Serra et al.24 Barra de escala = 50 μm. Por favor, haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
| Ovocitos (n) | Tasa de supervivencia (%) | FIV (n) | Fertilizadoa (%) | Bescindida (%) | Blastocistosc (%) | |
| Ctr | 73 | 75.3* | 452 | 91.1 | 96.1 | 14.3 |
| Trh | 77 | 85.7 | 470 | 92.5 | 95.4 | 13 |
| * Prueba de Chi cuadrado p<0.5 | ||||||
| a Los porcentajes se calculan en ovocitos de FIV | ||||||
| b Los porcentajes se calculan en ovocitos fertilizados | ||||||
| c Los porcentajes se calculan en ovocitos escindidos | ||||||
Tabla 1. Tasas de supervivencia juveniles de los oocytes ovinos y capacidad de desarrollo in vitro después de la maduración con y sin trehalosa y vitrificación. TRH = los ovocitos juveniles maduraron con la suplementación de la trehalosa (100 milímetros en medio de la maduración). CTR = los ovocitos juveniles del control maduraron sin la suplementación de la trehalosa. Las tasas de supervivencia se determinaron después de la tinción fluorescente con yoduro de propidio (10 μg/mL) y Hoechst 33342 (10 μg/mL) de ovocitos vitrificados/calentados. La capacidad de desarrollo del oocyte fue determinada después de la incorporación en un sistema de producción in vitro. a Los porcentajes se calculan en ovocitos de FIV. b Los porcentajes se calculan en ovocitos fertilizados. c Los porcentajes se calculan en ovocitos escindidos. * χ2 prueba P<0.5. Esta tabla ha sido modificada de Berlinguer et al.23
| grupos | [Ca++] mg/dL | N ovocito | Activación partenogenética espontánea (%) | Ovocitos vitrificados | Ovocitos sobrevividos y de FIV (%) | Escisión (%) | Salida de blastocistos (%) |
| MTC/FCS | 9.9 | 80 | 33 (41.2)a | 150 | 124 (82,7)a | 40 (32.5)a | 2 (1.6)a |
| PBS/FCS | 4.4 | 82 | 29 (35,3)ac | 115 | 88 (76,5)a | 33 (37.5)ae | 1 (1.1)a |
| PBSCaMg libre/FCS | 2.2 | 86 | 11 (12,7)b | 126 | 115 (91,3)b | 74 (64,3)b | 12 (10,4)b |
| PBS/BSA | 3.2 | 83 | 21 (25,3)c | 110 | 90 (81,8)a | 18 (20)c | 0 (0)a |
| PBSCaMg libre/BSA | 0.4 | 87 | 10 (11,5)b | 149 | 123 (82,5)a | 57 (46.3)de | 3 (2.4)b |
Tabla 2. Competencia de desarrollo de ovocitos adultos madurados in vitro vitrificados en medios de vitrificación (16,5% de etilenglicol + 16,5% de dimetil sulfóxido) que contienen diferentes concentraciones de calcio. Las tasas de supervivencia y fertilización se calculan en ovocitos vitrificados; las tarifas totales de la hendidura y del blastocyst se calculan en ovocitos sobrevividos. Los valores con diferentes subíndices dentro de la misma columna son significativamente diferentes: χ2 prueba P<0.05. Esta tabla ha sido modificada de Succu et al.10
| [Ca 2++] en medios de vitrificación | No. Ovocitos | Tasa de supervivencia posterior a la vitrificación (%) | Tasa de fertilización (%) | Escisión (%) | Salida de blastocisto (%) |
| Alto [9,9 mg/dL] | 190 | 161 (84.73) | 52/161 (32.29)a | 43/161 (26.7) | 0 |
| Bajo [2,2 mg/dL] | 150 | 124 (82.66) | 55/124 (44,35)b | 41/124 (33.1) | 0 |
Tabla 3. Fertilización y tasas de desarrollo después de la fertilización in vitro y el cultivo de ovocitos juveniles vitrificados / calentados utilizando alta ([Ca 2 ++] = 9,9 mg / dL) y baja ([Ca 2 ++] = 2,2 mg / dL) concentración de calcio en medios de vitrificación. Diferentes letras indican diferencia estadística (a ≠ b P<0,05 χ2 prueba).
| Horas de incubación post-calentamiento | Tasa de escisión (n) | Producción embrionaria (n) |
| 0 | 19,2 ± 3%a (82) | 0%a (17) |
| 2 | 41,8 ± 3%b (100) | 6,5 ± 1,3%b (42) |
| 4 | 50,7 ± 3%b (92) | 14,4 ± 1,3%c (48) |
| 6 | 26 ± 3%a (92) | 0%a (23) |
Tabla 4. Tasa de escisión y producción de embriones en ovocitos adultos vitrificados /calentados fertilizados en diferentes puntos de tiempo de cultivo post-calentamiento. Diferentes letras indican diferencia estadística dentro de la misma columna: ANOVA P<0.01.
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Discussion
La criopreservación de ovocitos en animales domésticos puede permitir no sólo la conservación a largo plazo de los recursos genéticos femeninos, sino también avanzar en el desarrollo de biotecnologías embrionarias. Por lo tanto, el desarrollo de un método estándar para la vitrificación de ovocitos beneficiaría tanto al ganado como al sector de la investigación. En este protocolo, un método completo para la vitrificación adulta del oocyte de las ovejas se presenta y podría representar un punto de partida sólido para el desarrollo de un sistema eficiente de la vitrificación para el oocyte juvenil.
Una de las principales ventajas del método propuesto es que incluye todos los pasos de la recolección de ovocitos, la maduración in vitro, la vitrificación y el calentamiento. Además, incluye un período de cultivo posterior al calentamiento para permitir que los ovocitos se recuperen de los daños incurridos durante el procedimiento de vitrificación antes de ser fertilizados. El tiempo óptimo para la fecundación debe ser adaptado según el método de criopreservación, la calidad inicial de los ovocitos, la edad del paciente y la especie, siendo fundamental considerar ambos aspectos de la recuperación del tiempo y el envejecimiento delos ovocitos 25,26. Por lo tanto, elegir la duración del período de incubación posterior al calentamiento es un desafío y puede afectar el resultado de los programas de vitrificación de ovocitos. En base a los resultados obtenidos en términos de tasas de escisión y producción embrionaria, y en las condiciones descritas en el presente protocolo, el momento óptimo para la fertilización de ovocitos vitrificados de ovejas adultas es después de 4 horas de incubación post-calentamiento(Tabla 4)6. Esta información es crucial a la hora de diseñar un programa de vitrificación de ovocitos.
Este protocolo, sin embargo, mientras que da resultados aceptables en términos de salida del embrión de los ovocitos adultos vitrificados/calentados, todavía lleva a los embriones bajos a cero si está aplicado a los ovocitos juveniles. Varias limitaciones estructurales y funcionales deterioran la competencia prepúber del desarrollo de ovocitos, como el tamaño pequeño, el acoplamiento defectuoso entre las células del cúmulo y los ovocitos, la disminución de la absorción de aminoácidos, la reducción de la síntesis de proteínas y el metabolismo energético 27,28,29. En un estudio anterior relatamos que los ovocitos prepúrromos muestran alta sensibilidad al procedimiento de vitrificación30. La baja competencia en el desarrollo mostrada después de la vitrificación y el calentamiento es probablemente el resultado de daños a los factores citoplasmáticos implicados en la reorganización del citoesqueleto y (o) en la activación de la maduración que promueve el factor30. Como se muestra en la Tabla 1,la suplementación del medio de maduración con trehalosa, un crioprotector no permeable, fue capaz de aumentar las tasas de supervivencia después de la vitrificación y el calentamiento a valores comparables a los de los ovocitos adultos4. Del mismo modo, el uso de solución de vitrificación con bajas concentraciones de calcio aumenta las tasas de fecundación de los ovocitos juveniles tras la vitrificación y el calentamiento, como se muestra en la Tabla 3. Así, tanto la optimización en condiciones de cultivo durante la maduración in vitro como de la composición de los medios de vitrificación pueden ayudar a aumentar la calidad del ovocito juvenil después de la vitrificación y el calentamiento. Los ovocitos juveniles muestran cierta capacidad de recuperación de los daños inducidos por el procedimiento de vitrificación, tal y como se muestra en las Figuras 3,4 y 5.
Sin embargo, las altas tasas de activación partenogenética espontánea durante el cultivo posterior al calentamiento todavía limitan su potencial de desarrollo. El etilenglicol y DMSO, que son agentes crioprotectores de uso común, pueden activar artificialmente el ovocito antes de la fertilización real, de tal modo limitando éxito de la fertilización y el desarrollo del embrión. De hecho, pueden causar un aumento transitorio en la concentración intracelular de Ca2+ 31,desencadenando así la exocitosis de gránulos corticales, la formación de pronúcleos y la reanudación meiótica32. De hecho, la vitrificación puede activar artificialmente el ovocito antes de la fertilización real, limitando así el éxito de la fertilización y el desarrollo del embrión. El quelante del calcio se puede utilizar así para limitar más lejos disponibilidad del calcio durante el proceso de la vitrificación con el objetivo de limitar el índice de activación espontánea en ovocitos juveniles.
También debe considerarse que, a diferencia de la congelación lenta, la vitrificación es una técnica exclusivamente manual y, por lo tanto, depende del operador33,34. Por lo tanto, la disponibilidad de personal capacitado es un factor clave para el éxito de este método. En primer lugar, el operador tiene que seleccionar correctamente los ovocitos a vitrificar. Después de ivm, los ovocitos se denudan suavemente de las células cumulus y se evalúan bajo un estereomicroscopio para seleccionar para la criopreservación sólo aquellos con un citoplasma uniforme, distribución homogénea de gotitas de lípidos en el citoplasma y con el diámetro externo de aproximadamente 90 μm. Por otra parte, sólo los ovocitos que muestran la extrusión en el primer cuerpo polar, y por lo tanto en la etapa de MII, deben ser seleccionados.
La evaluación morfológica de los ovocitos debe completarse en pocos minutos y al ser dependiente del operador, es muy sensible a las variaciones en su correcta implementación. Para ayudar a estandarizar el procedimiento de selección, el método sugiere limitar el tiempo de cultivo para la maduración in vitro a 22 h para los ovocitos adultos. En este momento, los ovocitos ovinos de alta calidad ya han completado la primera división meiótica22 y pueden ser seleccionados para la criopreservación. De esta manera la eliminación de ovocitos de baja calidad, que son los más lentos en la finalización de la primera división meiótica, debería ser más sencilla.
El operador también debe respetar estrictamente el tiempo establecido para el procedimiento de vitrificación, desde la primera exposición al crioprotector hasta la inmersión en nitrógeno líquido. Otro paso crítico es la carga del ovocito en el dispositivo de vitrificación utilizado. El procedimiento debe utilizar volúmenes mínimos de muestra para aumentar la velocidad de enfriamiento y ayudar a las células a pasar rápidamente a través de la temperatura de transición de fase, disminuyendo así las crioinjurias35. Cryotop utiliza una tira de polipropileno unida a un soporte. En este método, los ovocitos en la solución de vitrificación (<0.1 μL) se cargan rápidamente con un capilar de vidrio en la parte superior de la tira de película. A continuación, se debe retirar la solución, dejando atrás una capa delgada suficiente para cubrir las células a criopreservar. Una vez más, este paso debe completarse lo más rápido posible para limitar la exposición de los ovocitos a las altas concentraciones crioprotectoras de la solución de vitrificación, que pueden causar shock osmótico y son tóxicas para las células.
Por estas razones, un desafío importante asociado con este método es la necesidad de manipulación manual y técnico calificado. Otros autores relataron que el resultado de la vitrificación de ovocitos aparece influenciado por un efecto de "curva de aprendizaje", ya que la adquisición de habilidades manuales puede reducir significativamente el daño biológico inducido por el procedimiento de vitrificación34. Por lo tanto, los investigadores deben tener en cuenta el "efecto operador" en la evaluación del resultado del procedimiento de vitrificación.
Otros estudios se centrarán tanto en la estandarización del procedimiento de selección de ovocitos como en una mejor adaptación de la composición de los medios y las condiciones de cultivo a las necesidades de los ovocitos juveniles. En este sentido, tanto el uso de quelante de calcio como los antioxidantes pueden ofrecer oportunidades prometedoras. Del mismo modo, la optimización del protocolo permitirá aumentar la competencia de desarrollo de los ovocitos adultos vitrificados/calentados.
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Disclosures
Los autores declaran que no tienen intereses financieros contrapuestos.
Acknowledgments
Los autores no recibieron financiación específica para este trabajo. La profesora Maria Grazia Cappai y la Dra. Valeria Pasciu son agradecidas por la voz en off en video y por configurar el laboratorio durante la realización del video.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 2′,7′-Dichlorofluorescin diacetate | Sigma-Aldrich | D-6883 | |
| Albumin bovine fraction V, protease free | Sigma-Aldrich | A3059 | |
| Bisbenzimide H 33342 trihydrochloride (Hoechst 33342) | Sigma-Aldrich | 14533 | |
| Calcium chloride (CaCl2 2H20) | Sigma-Aldrich | C8106 | |
| Citric acid | Sigma-Aldrich | C2404 | |
| Confocal laser scanning microscope | Leica Microsystems GmbH,Wetzlar | TCS SP5 DMI 6000CS | |
| Cryotop Kitazato | Medical Biological Technologies | ||
| Cysteamine | Sigma-Aldrich | M9768 | |
| D- (-) Fructose | Sigma-Aldrich | F0127 | |
| D(+)Trehalose dehydrate | Sigma-Aldrich | T0167 | |
| Dimethyl sulfoxide (DMSO) | Sigma-Aldrich | D2438 | |
| Dulbecco Phosphate Buffered Saline | Sigma-Aldrich | D8537 | |
| Egg yolk | Sigma-Aldrich | P3556 | |
| Ethylene glycol (EG) | Sigma-Aldrich | 324558 | |
| FSH | Sigma-Aldrich | F4021 | |
| Glutamic Acid | Sigma-Aldrich | G5638 | |
| Glutaraldehyde | Sigma-Aldrich | G5882 | |
| Glycerol | Sigma-Aldrich | G5516 | |
| Glycine | Sigma-Aldrich | G8790 | |
| Heparin | Sigma-Aldrich | H4149 | |
| HEPES | Sigma-Aldrich | H4034 | |
| Hypoutarine | Sigma-Aldrich | H1384 | |
| Inverted microscope | Diaphot, Nikon | ||
| L-Alanine | Sigma-Aldrich | A3534 | |
| L-Arginine | Sigma-Aldrich | A3784 | |
| L-Asparagine | Sigma-Aldrich | A4284 | |
| L-Aspartic Acid | Sigma-Aldrich | A4534 | |
| L-Cysteine | Sigma-Aldrich | C7352 | |
| L-Cystine | Sigma-Aldrich | C8786 | |
| L-Glutamine | Sigma-Aldrich | G3126 | |
| LH | Sigma-Aldrich | L6420 | |
| L-Histidine | Sigma-Aldrich | H9511 | |
| L-Isoleucine | Sigma-Aldrich | I7383 | |
| L-Leucine | Sigma-Aldrich | L1512 | |
| L-Lysine | Sigma-Aldrich | L1137 | |
| L-Methionine | Sigma-Aldrich | M2893 | |
| L-Ornithine | Sigma-Aldrich | O6503 | |
| L-Phenylalanine | Sigma-Aldrich | P5030 | |
| L-Proline | Sigma-Aldrich | P4655 | |
| L-Serine | Sigma-Aldrich | S5511 | |
| L-Tyrosine | Sigma-Aldrich | T1020 | |
| L-Valine | Sigma-Aldrich | V6504 | |
| Magnesium chloride heptahydrate (MgSO4.7H2O) | Sigma-Aldrich | M2393 | |
| Makler Counting Chamber | Sefi-Medical Instruments ltd.Biosigma S.r.l. | ||
| Medium 199 | Sigma-Aldrich | M5017 | |
| Mineral oil | Sigma-Aldrich | M8410 | |
| MitoTracker Red CM-H2XRos | ThermoFisher | M7512 | |
| New born calf serum heat inactivated (FCS) | Sigma-Aldrich | N4762 | |
| Penicillin G sodium salt | Sigma-Aldrich | P3032 | |
| Phenol Red | Sigma-Aldrich | P3532 | |
| Polyvinyl alcohol (87-90% hydrolyzed, average mol wt 30,000-70,000) | Sigma-Aldrich | P8136 | |
| Potassium Chloride (KCl) | Sigma-Aldrich | P5405 | |
| Potassium phosphate monobasic (KH2PO4) | Sigma-Aldrich | P5655 | |
| Propidium iodide | Sigma-Aldrich | P4170 | |
| Sheep serum | Sigma-Aldrich | S2263 | |
| Sodium azide | Sigma-Aldrich | S2202 | |
| Sodium bicarbonate (NaHCO3) | Sigma-Aldrich | S5761 | |
| Sodium chloride (NaCl) | Sigma-Aldrich | S9888 | |
| Sodium dl-lactate solution syrup | Sigma-Aldrich | L4263 | |
| Sodium pyruvate | Sigma-Aldrich | P2256 | |
| Sperm Class Analyzer | Microptic S.L. | S.C.A. v 3.2.0 | |
| Statistical software Minitab 18.1 | 2017 Minitab | ||
| Stereo microscope | Olimpus | SZ61 | |
| Streptomycin sulfate | Sigma-Aldrich | S9137 | |
| Taurine | Sigma-Aldrich | T7146 | |
| TRIS | Sigma-Aldrich | 15,456-3 |
References
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