Summary
该议定书旨在为成年和幼羊卵母细胞的玻璃化提供标准方法。它包括从体外成熟介质的准备到暖化后文化的所有步骤。卵母细胞在 MII 阶段使用 Cryotop 进行振动，以确保最低基本体积。
Abstract
在牲畜中，体外胚胎生产系统可以开发和维持，这要归功于大量卵巢和卵母细胞，这些卵巢和卵母细胞很容易从屠宰场获得。成人卵巢总是携带几个心脊囊，而在青春期前的捐赠者中，卵母细胞的最大数量在4周大时可用，而卵巢承担蚂蚁卵泡的峰值数量。因此，4周大的羔羊被认为是很好的捐赠者，即使与成年卵母细胞相比，前卵母细胞的发育能力较低。
从成人和前教皇捐赠者那里获得成功冷冻保存玻璃化卵母细胞的可能性将促进基础研究和商业应用。从前幼年捐赠者那里收集的卵母细胞的振动也允许缩短生成间隔，从而增加育种计划的遗传收益。然而，低温保存后发育潜力的丧失使得哺乳动物卵母细胞可能是冷冻保存最困难的细胞类型之一。在现有的冷冻保存技术中，玻璃化被广泛应用于动物和人类卵母细胞。尽管这项技术最近取得了进步，但暴露于高浓度的低温保护剂以及令人心寒的损伤和渗透应激仍然会导致一些结构和分子变化，并降低哺乳动物卵母细胞的发育潜力。在这里，我们描述了从青少年和成人捐赠者那里收集的羊卵母细胞的体外化协议，并在冷冻保存之前在体外成熟。该协议包括从卵母细胞体外成熟到体外成熟、变暖和后加热潜伏期的所有程序。在MII阶段振动的卵母细胞确实可以在变暖后受精，但它们需要额外的时间在受精前恢复由于冷冻保存程序造成的损害，并增加其发育潜力。因此，暖化后的文化条件和时间是恢复卵母细胞发育潜力的关键步骤，特别是当卵母细胞从青少年捐赠者那里收集时。
Introduction
长期储存雌性卵母细胞可以提供广泛的应用，如通过基因选择计划改善家畜繁殖，通过原地野生动物物种保护计划促进保护生物多样性，以及通过将储存的卵母细胞纳入体外胚胎生产或核移植计划1、2、3，促进体外生物技术的研究和应用。幼细胞振动也会通过缩短育种计划4的生成间隔来增加遗传收益。卵母细胞的超快速冷却和变暖的振动目前被认为是家畜卵母细胞冷冻保存的标准方法5。在反胃动物中，在体外化之前，卵母细胞通常是在体外成熟，从从屠宰场衍生的卵巢2中获取卵泡后。成人，特别是前腹卵巢4，6，确实可以提供几乎无限数量的卵母细胞冷冻保存。
在牛群中，在卵母细胞振动和变暖之后，在过去十年中，几个实验室通常报告的爆破细胞产量为>10%。然而，在小反胃动物卵母细胞化仍然被认为是相对较新的青少年和成人卵母细胞，和羊卵母细胞振动的标准方法仍有待确定2，5。尽管最近取得了进步，但玻璃化和加热的卵母细胞确实呈现出一些功能和结构上的改变，限制了它们的发展潜力7、8、9。因此，很少有文章报告在玻璃化/加热羊卵母细胞2的爆炸性发育在10%或以上。已研究了几种方法，以减少上述变化：优化玻璃化和解冻解决方案的组成10，11：试验使用不同的低温设备8，12，13：并在体外成熟（IVM）4、14、15和/或在变暖6后的恢复时间应用特定治疗。
在这里，我们描述了从青少年和成人捐赠者那里收集的羊卵母细胞的体外化协议，并在冷冻保存之前在体外成熟。该协议包括从卵母细胞体外成熟到体外化、变暖和后暖化培养期的所有程序。
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Protocol
根据欧洲联盟第86/609/EC号指令和欧洲共同体委员会2007/526/EC的建议，动物议定书和下文所述的执行程序符合萨萨里大学生效的道德准则。
1. 为卵母细胞操纵准备介质
- 通过补充杜尔贝科的磷酸盐缓冲盐水0.1克/升青霉素和0.1克/升链霉素（PBS），为收集的卵巢的运输准备媒介。
- 通过稀释 9.5 克组织培养介质 （TCM） 199 粉末，用 1 升米利 Q 水补充青霉素 （0.1%） 来为卵母细胞的收集和成熟做好准备和链霉素 （0.1%）.
- 稀释后，过滤 100 mL 的中等，并将其存储在 4 °C 作为库存成熟介质 （SMM）， 使用一周。
- 准备收集介质 （CM）， 通过补充剩余的 900 毫升与 25 mM HEPES， 0.36 g/L 碳酸氢碳酸酯和 0.1% （w/v） 聚乙烯醇 （PVA） （pH 7.3， 渗透性 290 mOsm/kg）.
- 准备成熟介质与SMM补充0.021克/升碳酸氢钠，10%热处理的雌性羊血清，1IU/mL FSH，1IU/mL LH，100微克西苯胺和8毫克/毫升的苯丙酸酯。
注：在使用前至少4小时，必须在标准条件下（在空气中最大湿润大气中以5%CO2 中的39°C孵育体积为10mL的成熟介质）。 - 准备在体外成熟后操纵卵母细胞的基础介质 （BM），包括 PBS 中无 Ca+ 和 Mg++，辅以 20% 胎儿小腿血清 （FCS）。
2. 卵母细胞的收集和成熟
- 从幼年（30-40天年龄，体重6-10公斤）和成人卵巢中恢复卵母细胞。
- 将收集的卵巢从商业屠宰场以 27 °C 的速度在 PBS 的 1-2 小时内运送到实验室。
- 在 PBS 新鲜介质中清洗后，使用微刀片切开 CM 中的卵巢以释放卵泡含量。
- 在60倍放大的立体显微镜检查中，选择cumulus-卵母细胞复合物（COCs）进行体外成熟，选择具有4-10层粒状细胞、具有均匀细胞质的卵母细胞、细胞质中脂质液滴的均匀分布以及外径约90μm（均值）的细胞。
- 在CM中清洗选定的COC三次，最后在成熟介质中转移它们。
注意：对于幼卵母细胞，要提高玻璃化后的存活率，请用100微米三氯环己石补充成熟介质。 - 对于体外成熟，在四井培养皿中将 600μL 成熟介质中的 30-35 COC 转移到四井培养皿中，覆盖 300 μL 的矿物油，并在 39 °C 的空气中以 5% 的 CO2 中孵育 22 （成年卵母细胞） / 24 （幼卵母细胞） h。
- 体外成熟后，通过轻轻管状，去除积积细胞的凹陷 COC。在放大60倍的立体显微镜下检查后，只选择那些显示第一极体挤压，从而在元二（MII）阶段，用于玻璃化。
3. 精液收集、冷冻和解冻程序
- 准备精液冷冻保存的基础介质，包括公羊扩展器（200米三;70m柠檬酸;55m果糖;pH 7.2，渗透性300 mOsm/kg），辅以蛋黄20%（v/v）。
- 仅在绵羊繁殖季节（10 月至 11 月）收集精液。
- 通过成人公羊（2-5岁）的人工阴道获得射精，在室外环境中保持，并喂食活量维持配给。将公羊隔离在单独的笔中，但彼此之间有视觉接触。
- 在整个繁殖季节，每周重复收集一次精液，从每个雄性中获取至少 8 个射精。
- 收集后5分钟内将精液样品在环境温度下运送到实验室并立即处理。汇集两三公羊的射精，评估精子浓度光谱光度测量。
- 汇集后，稀释射精高达400×106 精子佐亚/mL与精液冷冻保存的基础介质补充4%甘油。然后在 2 小时内将稀释的精液冷却至 4 °C，并在冻结前平衡 20 分钟。
- 将精液样品以颗粒形式（0.25 mL）冻结在干冰上，然后放入液氮中。
- 要解冻，请将颗粒放入消毒玻璃猎鹰中，在 39 °C 的水浴中浸入 20s。
4. 体外受精和胚胎培养
- 为合成输卵管液 （SOF） 的构图准备库存。
- 准备库存A：99.4毫升米利Q水：6.29克纳克;0.534克的KCl：0.161克KH2PO4：0.182克 MgSO4 [7H2O：和0.6毫升乳酸钠。保持在4°C长达3个月。
- 准备库存 B： 10 毫升米利Q水;0.210克纳赫科3：和2-3克酚红色。保持在4°C 1个月。
- 准备库存C：10毫升米利Q水：和 0.051 克丙酸钠。保持在4°C 1个月。
- 准备库存 D： 10 毫升米利Q水;和0.262克的CaCl2 2H2O.保持在4°C 1个月。
- 准备 10 毫升 SOF，包括 7.630 毫升的 MilliQ 水、1 毫升的库存 A、1 mL 的库存 B、0.07 毫升的库存 C 和 0.7 毫升的股票 D。
- 准备体外受精 （IVF） 介质：SOF 辅以 2% 热处理的雌性绵羊血清、10 微克/mL 肝素和 1μg/mL 低硫氨酸（渗透性 280-290 mOsm/kg）。
注：10毫升的IVF介质必须在标准条件下孵育（在最大潮湿大气中，在5%CO 2、5%O2和90%N2）下至少4小时才能使用。
- 将冷冻/解冻的精液在1.5毫升以下的加热IVF介质的消毒玻璃圆锥管中转移，并在39°C的潮湿大气中以5%的二氧化碳 在空气中孵育15分钟。
- 孵化后，动性精子向液体柱的顶点部分游去。收集顶层并观察精子的功能评估。
注：精子运动参数应使用计算机辅助精子分析 （CASA） 系统进行评估，其设置如下：为避免精子轨迹重叠而获得的 25 帧、最小对比度 10、平均路径 30 μm/s 的最小速度以及渐进式运动性> 80% 的直度。该系统有一个特定的设置，为公羊精子评估。对于每个样本，5μL 精子悬浮子样本被加载到深度为 10 μm 的预热分析室中。使用相位对比显微镜评估精子的活性为 37 °C，每亚镜应至少分析 500 个精子，至少应在四个不同的微观领域进行分析。评估了总软体和渐进性软体精子的百分比。对于试管婴儿，渐进性软体精子的比例应≥30%。 - 稀释游泳衍生动性精子，浓度为1×106 精子酸精子/mL最终浓度，并在四井培养皿中用矿物油覆盖的300μL IVF介质中与MII卵母细胞共同孵育。
- 22小时后，将含有SF的四井培养皿中的假定酶酸盐与0.4%牛血清白蛋白和必要和非必需氨基酸在矿物油和培养 标准条件下报告，直至爆炸阶段。
- 在22小时、26小时和32小时授精后，通过在放大60倍的立体显微镜下的检查，记录裂开的卵母细胞的数量，显示两个不同的爆炸体。
- 每天从培养的第五天到第九天观察胚胎，新形成的胚射细胞应通过60倍放大倍的立体显微镜进行记录。
5. 卵母细胞振动和变暖
注意：使用设备低温台17进行最低基本音量 （MEV） 方法的玻璃化。
- 在BM中以38.5°C等于5个卵母细胞组，2分钟。BM 的使用保证了低钙浓度 （[Ca2]= 2.2 毫克/分升）10.
- 在 BM 中，3 分钟接触含有 7.5% （v/v） 二甲基硫氧化物 （DMSO） 和 7.5% （v/v） 乙二醇 （EG） 的均衡溶液，使卵母细胞脱水。
- 将卵母细胞转移到玻璃化溶液中，其中含有 16.5% （v/v） DMSO、16.5% （v/v） EG 和 0.5 M 三氯环己树体，然后将其加载到低温设备中，并在 30 秒内直接将其放入液氮中。
- 为了加热到生物温度，将每个玻璃化装置的含量从液氮转移到 BM 中 200 微L 滴 1.25 M 的树黄糖中，在 38.5 °C 下 1 分钟，轻轻搅拌以便于混合。
- 为了促进去除细胞内低温保护剂，将卵母细胞逐步转移到200微L滴的减少三叶草溶液（0.5 M，0.25 M，0.125 M三叶草在BM）30秒在38.5°C之前，在BM中平衡10分钟，在38.5°C。
6. 加热后卵母细胞质量评估
- 变暖后，在 PBS 中孵育卵母细胞 6 小时，无 Ca+ 和 Mg++ 加上 20% FCS （BM）， 在 5% CO2 在空气中在 38.5 °C。
注：卵母细胞在振动后恢复生物和结构特征的能力与使用过的卵母细胞的种类和类别有关。 - 由于卵母细胞恢复低温保存损伤的能力取决于时间，在变暖后在体外培养的不同时间点（0 h， 2 h， 4 h， 6 h）评估卵母细胞质量，以定义卵母细胞受精的最佳时间窗口。
注：在成年羊卵母细胞中，最佳时间为加热后4小时：对于前腹细胞，最佳时间是加热后2小时。
7. 卵母细胞生存评估
- 在变暖之后，以及变暖后文化的每个时间点，形态学使用放大100倍的倒显微镜评估卵母细胞。
注意：结构改变的卵母细胞，如微弱的细胞质，损伤佐纳佩鲁西达和/或膜应分类为退化。 - 使用双微分荧光染色来验证膜完整性评估。
- 在含有碘化物（PI;10μg/mL）和霍奇斯特33342（10μg/mL）的2mL中孵化卵母细胞，在38.5°C的空气中以 5%的二氧化碳含量5分钟。
- 在新鲜BM中清洗三次后，使用350纳米的激发滤光器观察荧光显微镜下的卵母细胞，为Huffst 33342发射460nm，在PI中使用535纳米的激发滤芯，发射617纳米。
注：具有完整膜的卵母细胞可以通过带有霍奇斯特33342的彩色DNA的蓝色荧光来识别。由于DNA沾染了PI，受损膜的卵母细胞显示出红色荧光。
8. 通过共焦激光扫描显微镜评估线粒体活动和ROS细胞内水平
- 准备米托特拉克红色CM-H2XRos（MT-红色）探头。
- 用 1 mL DMSO 稀释 1 瓶 （50μg） 的内容以获得 1 mM 解决方案。将稀释的瓶中保留在液氮中。
- 用DMSO稀释溶液1 mM以获得100μM库存解决方案，并在黑暗中将其存储在-80°C。
- 准备 2+，7+二氯二氢氟西汀二乙酸酯 （H2DCF-DA） 探针。
- 将 H2DCF-DA 稀释在 0.1% 聚乙烯聚丙酮 （PVA）/PBS 中，以获得第一个 100 mM 解决方案。将溶液保持在-80°C的黑暗中。
- 在 0.1% PVA/PBS 中稀释第一个解决方案，以获得 100 μM 库存解决方案。将其存放在-20°C的黑暗中。
- 准备安装介质 （MM）：对于 10 mL 的 MM，添加 5 mL 甘油、5 mL PBS 和 250 毫克阿齐德钠。将其存储在-20°C，直到使用。
- 在BM中以38.5°C孵育卵母细胞30分钟，含500nM MT-红色（库存解决方案：DMSO中100μM）。
- 使用 MT-Red 探头孵育后，在 BM 中清洗三次卵母细胞，并在同一介质中孵育 20 分钟，其中包含 5 μM H2DCF-DA（库存溶液：BM 中的 100μM）。
- 接触探头后，在BM中清洗卵母细胞，并固定在2.5%的谷胱甘肽/PBS中至少15分钟。
- 固定后，在 BM 中清洗卵母细胞三次，然后用 1 毫克/mL Hoechst 33342 将 4μL 滴 MM 安装在玻璃滑梯上，以避免样品压缩。
- 在黑暗中将幻灯片存储在 4 °C，直到进行评估。
- 使用共焦激光扫描显微镜对免疫铃部分进行分析。显微镜配备Ar/He/Ne激光器，使用40/60倍的油目标。按顺序激发分析各部分。
- 对于线粒体评估，用多光子激光观察样品，以检测MT-Red（曝光：579纳米;发射：599纳米）。
- 使用488纳米的砷离子激光和B-2 A滤光片（495纳米曝光和519纳米发射）指出二氯氟辛（DCF）18。
- 在每个单独的卵母细胞中，测量赤道平面19的MT-红色和DCF荧光强化度。
- 在所有图像采集期间，以恒定值保持荧光强度相关参数（激光能量 26%，顺序设置 1：PMT1 获得 649-PMT2 增益 482;顺序设置 2： PMT1 获得 625-PMT2 获得 589;偏移 0：针孔大小：68）。
- 使用莱卡 LAS AF 精简图像分析软件包对荧光强度进行定量分析，遵循20标准化的程序。
- 捕捉一次图片，在Z轴上移动，直到到达赤道平面。
- 对于每张照片，将转换为灰色比例，并关闭通道 1（与霍赫斯特蓝色相关）被关闭。然后手动在限制区域（即在美奥蒂奇主轴周围）上绘制感兴趣的区域（ROI）。
注：该软件可以自动读取通道 2 （FITC） 上的像素平均值，从中减去背景值。 - 记录像素的平均值并提交统计分析。
9. 统计分析
- 分析以下差异：幼细胞与成年卵母细胞的存活率， 在控制和分卵管治疗的幼卵母细胞的存活率和发展能力，生存和部分遗传活化率和发育能力的成人卵母细胞与不同的钙浓度介质，受精率和胚胎生产在少年卵母细胞中，低或高钙浓度，活性线粒体表型在青少年紫杉卵母细胞期间 使用气方测试，成人和青少年玻璃化卵母细胞之间的后升温培养和部分遗传活化率的不同时间点。
- 分析自温后培养的不同时间点的裂解率和胚胎输出，分析ALNOVA在变暖后不同时间点的线粒体活动荧光强度和幼小紫外线细胞的ROS细胞内水平。使用临时测试后 Tukey 的测试来突出组之间的差异。
- 使用统计软件程序进行统计分析，并将 P < 0.05 的概率视为最小意义级别。所有结果均表示为平均± S.E..M。
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Representative Results
与成人捐赠者相比，青少年捐献者对卵母细胞的低温率较低。观察到的第一个效果是与成年卵母细胞相比，升温后的存活率较低（图1A：χ 2测试P<0.001）。幼细胞在变暖后表现出较低的膜完整性（图1B）。在成熟介质中使用树脂是为了验证这种糖是否能减少幼细胞的低温伤害。数据表明，23个卵母细胞成熟24小时，补充三甲糖素后存活率高于未治疗组（表1：85.7%对75.3%：χ 2测试P<0.05）。甲状糖补充剂确实与变暖后较高的膜完整性有关（图2A）。因此，在幼卵母细胞体外成熟期间使用三氯生菜会提高体外化后的存活率（85.7%）可与成人相媲美的值（90.3%）。然而，幼卵母细胞的、受精和发展率并没有因纤维素补充而增加（表 1 ）。
为了提高卵母细胞在玻璃化后的能力，我们在成人卵巢卵母细胞中测试了不同的玻璃化介质，钙浓度从9.9到0.4毫克/分升10。结果表明，使用钙浓度等于2.2毫克/升的介质可提高加热后存活率，提高发育能力，减少成人卵母细胞10（表2）的部分遗传活化。因此，我们测试了低钙玻璃化介质，以实现幼细胞的玻璃化。如表3所示，与高钙浓度的卵母细胞相比，钙浓度低的幼细胞受精率较高（分别为44.35%和32.29%） ：P<0.05），但在胚胎生产方面没有发现差异。
紫杉/加热卵母细胞在受精前需要额外的时间才能恢复冷冻保存程序造成的损伤，并增加其发育潜力。先前的一项研究确实表明，ATP细胞内浓度、线粒体活动和体外发育能力在体外/解冻卵母细胞中降低，这也显示高细胞内ROS浓度6。这些变化在变暖后立即特别明显。在暖化后的文化中，成人和幼细胞都能够部分地从6、24号玻璃化过程中遭受的损害中恢复过来。通过比较不同持续时间（ 0 、 2 、 4 和 6 h ）的加热后文化，我们表明，从成年卵母细胞中采集的 4 小时培养卵母细胞能够恢复能量平衡6和微管设置24 ，并恢复具有较高（ 50 . 7±3 . 9% ）的发展能力：P< 0.01 ANOVA） 和爆破率 （14.40 ± 1.3%：ANOVA P<0.01）与其他时间点（0、2和6小时） 相比：表4）。因此，4小时的后暖化文化代表了紫外线/加热成年卵母细胞6受精的理想时间窗口。
当同样的实验与从青少年捐赠者那里采集的卵母细胞重复时，这些结果得到了部分证实。与其他时间点（0、2、6） 相比，加热后4小时后，紫外线/加热幼细胞的线粒体活动较高：图3： 阿诺瓦P<0.01）。观察到线粒体分布的几种模式，并分为以下三组（如21日报道）：模式A：同质细，小颗粒遍布细胞质：模式 B：同质颗粒，大颗粒遍布细胞质：模式 C：当存在特别大的颗粒时，异质聚类，分布在细胞质或位于特定的细胞质域。MII中活动线粒体细胞质分布中的不同表型可能与卵母细胞发育能力有关。FINE同质分布是发育能力差的指标，而颗粒和聚类分布则与线粒体活性增加有关，因此发展能力较高。线粒体分布模式在升温后6小时的文化中发生了变化。图4显示了幼细胞在变暖后文化中具有不同线粒体分布模式及其波动的例子。模式 A 在长期孵化期间显著增加，并在升温后 6 小时达到较高值（图 4Aa： χ2 P<0.05），B 模式在加热后未显示显著变化 文化（图4Bb），在长期潜伏期间，在任何幼细胞中都没有发现C型（图4Cc：χ 2P<0.05）。
此外，在变暖后文化的2小时，幼细胞的ROS细胞内水平明显低于0、4和6小时（图5：ANOVAP<0.001）。然而，与成年卵母细胞中发现的情况相反，在幼细胞的后暖化培养期间，自发的部分遗传活化率有所提高（图6）。因此，建议的幼细胞受精时间点为升温后2小时。
图1。从青少年和成人捐赠者那里采集的玻璃化/加热卵母细胞的存活率。（A） 卵母细胞在体外成熟后被体外化。存活率由碘化丙酸丙酸（10微克/mL）和霍奇斯特33342（10微克/mL）的荧光染色后确定。N = 165 个成年卵母细胞和 170 个幼卵母细胞。不同的字母表明成人和幼细胞之间有显著差异：χ 2 测试P<0.001。 （B-C） 在形态评估（放大100倍的倒显微镜）中，具有完整（B）和受损等离子膜（C）的玻璃化/加热幼细胞的例子。比例栏 = 10μm. 请单击此处查看此图的较大版本。
图2。幼卵卵母细胞存活率和体外发育能力成熟后与 （TRH） 和无 （CTR） 树黄素 （100 mM 在成熟介质）.（A-B） 在介质中体外成熟后振动的幼细胞的例子在形态评估（放大100倍的倒显微镜）中补充（A）或（B）无颤音。比例栏 = 30μm. 请单击此处查看此图的较大版本。
图3。体外培养后不同时间点（0、2、4、6）中体外/暖化幼细胞活性线粒体荧光强度的量化。 IVM卵母细胞被用作控制（CTR N = 77）。在三个独立的实验中，总共有163个（0 h N = 45;2 h N = 39;4 h N = 40;6 h N = 39）幼细胞被振动和加热。不同的字母表示统计学上显著的差异（ANOVA P = 0.0000）。 请单击此处查看此图的较大版本。
图4。体外培养后6小时内，在体外/暖化幼细胞中分布线粒体模式。精细（A）、颗粒（B）和聚类（C）线粒体分布在玻璃化/加热的幼细胞中的代表性图像。（D）显示线粒体分布精细的幼细胞/加热卵母细胞的百分比：（E）显示细状线粒状分布的幼细胞/加热卵母细胞的百分比：（F）显示分层线粒体分布的幼细胞/加热卵母细胞的百分比。IVM幼细胞被用作控制（CTR：N = 77）。在三个独立的实验中，总共使用了163个（0 h N = 45;2 h N = 39;4 h N = 40;6 h N = 39）幼细胞振动和加热。不同的字母表示统计学上显著的差异（Aa： χ2 P = 0.026;Bb： χ2 P = 0.097;抄送：χ 2 P = 0.014）。比例栏 = 30μm.请单击此处查看此图的较大版本。
图5。体外培养后6小时内体外小母细胞内ROS荧光强度的量化。（A-B）体外成熟（A）和体外化（B）幼细胞中 ROS 荧光强度的代表图像。（C） 在体外培养升温后，由不同时间点（0 h N=45;2 h N=39;4 h N=40;6 h N=39）中体外幼细胞荧光强度的量化决定的ROS细胞内水平。体外成熟的幼细胞被用作控制（CTR N = 77）。不同的字母表示统计学上显著的差异（ANOVA P = 0.0000）。比例尺 = 50μm.请单击此处查看此图的更大版本。
图6。体外培养后6小时内，在体外培养中，在体外幼细胞和成年卵母细胞 中 部分遗传活化。 （A-B） 卵母细胞部分遗传激活的代表图像：（A） 元相 II-端粒体 II 过渡中的卵母细胞和 （B） 前列核形成。（C） 体外培养后，在不同时间点（0、2、4、6 h）部分遗传激活成人和幼细胞的百分比。星号表示在孵化的每个时间点（ANOVA P = 0.000）青少年和成年卵母细胞之间的统计差异。此图已从 Serra 等人修改。 24 比例尺 = 50μm。 请单击此处查看此图的较大版本。
| 卵母细胞 （n） | 存活率 （%） | 试管婴儿 （n） | 受精a （%） | 裂开b （%） | 爆破细胞c （%） | |
| 点击率 | 73 | 75.3* | 452 | 91.1 | 96.1 | 14.3 |
| 特赫 | 77 | 85.7 | 470 | 92.5 | 95.4 | 13 |
| *奇方测试p<0.5 | ||||||
| A 百分比计算在试管婴儿卵母细胞上 | ||||||
| b 受精卵母细胞的百分比计算 | ||||||
| c 百分比计算在裂开的卵母细胞上 | ||||||
表1。幼卵卵母细胞的存活率和体外发育能力成熟后，有和没有树突和体外化。TRH = 通过补充树黄糖成熟幼细胞（成熟介质中为 100 mM）。CTR =控制幼细胞成熟，无需补充三氯二氯生。在荧光染色后确定存活率，包括碘化丙酸丙胺（10微克/mL）和霍奇斯特33342（10微克/mL）的玻璃化/加热卵母细胞。卵母细胞发育能力是在体外生产系统中结合后确定的。a百分比是根据试管婴儿卵母细胞计算的。b百分比是根据受精卵母细胞计算的。c百分比是根据裂开的卵母细胞计算的。*χ 2测试P<0.5。这张桌子已经从柏林格尔等人23号修改了
| 组 | [卡+ ]毫克/德莱 | N卵母细胞 | 自发的部分遗传激活 （%） | 紫金卵母细胞 | 存活和试管婴儿卵母细胞 （%） | （%） | 爆破细胞输出 （%） |
| 中医/中医 | 9.9 | 80 | 33 （41.2）a | 150 | 124 （82.7）a | 40 （32.5）a | 2 （1.6）a |
| PBS/FCS | 4.4 | 82 | 29 （35.3）ac | 115 | 88 （76.5）a | 33 （37.5）ae | 1 （1.1）a |
| PBS卡姆格免费/FCS | 2.2 | 86 | 11 （12.7）b | 126 | 115 （91.3）b | 74 （64.3）b | 12 （10.4）b |
| PBS/BSA | 3.2 | 83 | 21 （25.3）c | 110 | 90 （81.8）a | 18 （20）c | 0 （0）a |
| PBS卡姆免费/BSA | 0.4 | 87 | 10 （11.5）b | 149 | 123 （82.5）a | 57 （46.3）德 | 3 （2.4）b |
表2。体外成熟成人卵母细胞在玻璃化介质（16.5%乙二醇 +16.5%二甲基硫氧化物）中含有不同钙浓度的发育能力。生存率和受精率以玻璃化卵母细胞计算：总和爆破率是根据幸存的卵母细胞计算的。同一列中具有不同子脚本的值显著不同：χ2测试 P <0.05。此表已从 Succu 等人10 中修改
| [Ca 2]]在玻璃化介质中 | 不。卵 母 细胞 | 玻璃化后存活率 （%） | 受精率 （%） | （%） | 爆破细胞输出 （%） |
| 高 [9.9 毫克/日] | 190 | 161 (84.73) | 52/161 （32.29）a | 43/161 (26.7) | 0 |
| 低 [2.2 毫克/升] | 150 | 124 (82.66) | 55/124 （44.35）b | 41/124 (33.1) | 0 |
表3。体外受精后的受精和发育率，以及使用高（[Ca 2]= 9.9毫克/分升）和低（[Ca 2]]=2.2毫克/分升）钙浓度在玻璃化介质中的幼卵母细胞培养。 不同的字母表示统计差异（≠ b P<0.05 χ2 测试）。
| 暖化后孵化小时数 | 率（ n） | 胚胎输出（n） |
| 0 | 19.2 ± 3%a （82） | 0%a （17） |
| 2 | 41.8 ± 3%b （100） | 6.5 ± 1.3%b （42） |
| 4 | 50.7 ± 3%b （92） | 14.4 ± 1.3%c （48） |
| 6 | 26 ± 3%a （92） | 0%a （23） |
表4。在变暖后培养的不同时间点受精的玻璃化 / 加热成年卵母细胞的率和胚胎输出。 不同的字母表示同一列内的统计差异：ANOVA P<0.01。
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Discussion
家畜卵母细胞低温保存不仅能长期保护雌性遗传资源，而且能促进胚胎生物技术的发展。因此，制定卵母细胞振动的标准方法将有利于牲畜和研究部门。在本议定书中，提出了一套完整的成年绵羊卵母细胞振动方法，可以代表为少年卵母细胞开发高效的卵母细胞振动系统的坚实起点。
建议方法的主要优点之一是它包括从卵母细胞收集、体外成熟、体外化和变暖的所有步骤。此外，它包括一个加热后培养期，使卵母细胞在受精前能够从玻璃化过程中产生的损害中恢复过来。受精的最佳时间应根据冷冻保存方法、初始卵母细胞质量、患者年龄和物种进行定制，这对于考虑时间恢复和卵母细胞老化25、26两个方面至关重要。因此，选择后暖化潜伏期的持续时间具有挑战性，并可能影响卵母细胞振动程序的结果。根据在率和胚胎产量方面获得的结果，在所述协议中描述的条件下，紫外成年绵羊卵母细胞受精的最佳时间是在加热后孵化 4 小时后（表4 ） 6 。在设计卵母细胞振动程序时，此信息至关重要。
然而，该协议虽然在从玻璃化/加热的成年卵母细胞的胚胎输出方面给出了可接受的结果，但如果应用于幼细胞，仍然会导致低至零胚胎。一些结构和功能限制损害了前腹细胞发育能力，如小尺寸，积聚细胞和卵母细胞之间的有缺陷耦合，氨基酸吸收量减少，蛋白质合成减少和能量代谢27，28，29。 在先前的研究中，我们报告说，前卵母细胞对玻璃化程序30表现出高度敏感性。玻璃化和变暖后表现出的低发育能力可能是细胞质因素在细胞骨质重组和（或）激活成熟促进因子30中受损的结果。如表1所示，用一种不可渗透的低温保护剂——三氯环己树脂补充成熟介质，在振动和变暖后能够提高存活率，其价值可与成年卵母细胞4相媲美。同样，使用低钙浓度的玻璃化溶液，在振动和变暖后增加幼细胞的受精率，如表3所示。因此，体外成熟期间文化条件的优化和体外介质构成的优化，都有助于提高紫外和变暖后幼卵母细胞的质量。幼细胞表现出一定的能力，从玻璃化程序引起的损害恢复，如图3，4和5。
然而，在后暖化文化中，自发的亚生遗传活化率高，仍然限制着它们的发展潜力。乙二醇和DMSO是常用的低温保护剂，它们可以在实际受精前人工激活卵母细胞，从而限制受精成功和胚胎发育。它们确实会导致细胞内Ca2+ 浓度31的暂时增加，从而触发皮质颗粒外渗透、前列腺形成和肌细胞恢复32。事实上，在实际受精之前，玻璃化可以人工激活卵母细胞，从而限制受精成功和胚胎发育。因此，钙质合金可用于进一步限制在玻璃化过程中的钙可用性，以限制幼细胞的自发活化速度。
还应考虑，与慢速冷冻不同，玻璃化是一种完全手动技术，因此它依赖于操作员33，34。因此，培训人员的提供是这一方法成功的一个关键因素。首先，操作员必须正确选择要振动的卵母细胞。IVM后，卵母细胞被轻轻地去除积聚细胞，并在立体显微镜下进行评估，以选择只有细胞质均匀、细胞质中脂质液滴均匀分布且外径约90μm的细胞保存。此外，必须选择只有在第一极地体上显示挤压的卵母细胞，因此在MII阶段。
卵母细胞的形态评估必须在几分钟内完成，并且是操作员依赖的，因此对其正确实施的变化非常敏感。为了帮助标准化选择程序，该方法建议将成年卵母细胞体外成熟培养时间限制在22小时以内。此时，优质羊卵母细胞已完成第一个梅花科22， 可选择冷冻保存。这样，消除低质量的卵母细胞，这是完成第一个美科最慢的，应该更简单。
操作者还必须严格遵守玻璃化程序的设定时间，从首次接触低温保护剂到浸入液氮。另一个关键步骤是在所使用的玻璃化设备中加载卵母细胞。该过程必须使用最小的样本量，以提高冷却率，并帮助细胞通过相过渡温度迅速，从而减少低温伤害35。冷冻机使用连接到支架的聚丙烯条。在此方法中，玻璃化溶液中的卵母细胞（<0.1 μL）在薄膜条顶部迅速装载玻璃毛细。然后，必须去除溶液，留下一层薄薄的层，足以覆盖细胞进行冷冻保存。再次，这一步骤必须尽快完成，以限制卵母细胞暴露在玻璃化溶液的高低温保护浓度，这可能会导致渗透冲击，对细胞有毒。
由于这些原因，与此方法相关的一个主要挑战是需要手动操作和熟练的技术员。其他作者报告说，卵母细胞振动结果似乎受到"学习曲线"效应的影响，因为获得手工技能可以显著减少玻璃化程序34诱发的生物损伤。因此，研究人员在评价玻璃化过程的结果时应考虑到"操作者效应"。
进一步的研究将侧重于标准化卵母细胞选择程序，更好地根据幼细胞的需要调整介质组成和文化条件。在这方面，使用钙质和抗氧化剂都可能提供有希望的机会。同样，协议的优化将允许提高玻璃化/加热成年卵母细胞的发育能力。
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Disclosures
作者宣称他们没有相互竞争的经济利益。
Acknowledgments
作者没有获得这项工作的具体资金。玛丽亚·格拉齐亚·卡帕伊教授和瓦莱里亚·帕修博士因视频画外音和在视频制作过程中建立实验室而获得感谢。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 2′,7′-Dichlorofluorescin diacetate | Sigma-Aldrich | D-6883 | |
| Albumin bovine fraction V, protease free | Sigma-Aldrich | A3059 | |
| Bisbenzimide H 33342 trihydrochloride (Hoechst 33342) | Sigma-Aldrich | 14533 | |
| Calcium chloride (CaCl2 2H20) | Sigma-Aldrich | C8106 | |
| Citric acid | Sigma-Aldrich | C2404 | |
| Confocal laser scanning microscope | Leica Microsystems GmbH,Wetzlar | TCS SP5 DMI 6000CS | |
| Cryotop Kitazato | Medical Biological Technologies | ||
| Cysteamine | Sigma-Aldrich | M9768 | |
| D- (-) Fructose | Sigma-Aldrich | F0127 | |
| D(+)Trehalose dehydrate | Sigma-Aldrich | T0167 | |
| Dimethyl sulfoxide (DMSO) | Sigma-Aldrich | D2438 | |
| Dulbecco Phosphate Buffered Saline | Sigma-Aldrich | D8537 | |
| Egg yolk | Sigma-Aldrich | P3556 | |
| Ethylene glycol (EG) | Sigma-Aldrich | 324558 | |
| FSH | Sigma-Aldrich | F4021 | |
| Glutamic Acid | Sigma-Aldrich | G5638 | |
| Glutaraldehyde | Sigma-Aldrich | G5882 | |
| Glycerol | Sigma-Aldrich | G5516 | |
| Glycine | Sigma-Aldrich | G8790 | |
| Heparin | Sigma-Aldrich | H4149 | |
| HEPES | Sigma-Aldrich | H4034 | |
| Hypoutarine | Sigma-Aldrich | H1384 | |
| Inverted microscope | Diaphot, Nikon | ||
| L-Alanine | Sigma-Aldrich | A3534 | |
| L-Arginine | Sigma-Aldrich | A3784 | |
| L-Asparagine | Sigma-Aldrich | A4284 | |
| L-Aspartic Acid | Sigma-Aldrich | A4534 | |
| L-Cysteine | Sigma-Aldrich | C7352 | |
| L-Cystine | Sigma-Aldrich | C8786 | |
| L-Glutamine | Sigma-Aldrich | G3126 | |
| LH | Sigma-Aldrich | L6420 | |
| L-Histidine | Sigma-Aldrich | H9511 | |
| L-Isoleucine | Sigma-Aldrich | I7383 | |
| L-Leucine | Sigma-Aldrich | L1512 | |
| L-Lysine | Sigma-Aldrich | L1137 | |
| L-Methionine | Sigma-Aldrich | M2893 | |
| L-Ornithine | Sigma-Aldrich | O6503 | |
| L-Phenylalanine | Sigma-Aldrich | P5030 | |
| L-Proline | Sigma-Aldrich | P4655 | |
| L-Serine | Sigma-Aldrich | S5511 | |
| L-Tyrosine | Sigma-Aldrich | T1020 | |
| L-Valine | Sigma-Aldrich | V6504 | |
| Magnesium chloride heptahydrate (MgSO4.7H2O) | Sigma-Aldrich | M2393 | |
| Makler Counting Chamber | Sefi-Medical Instruments ltd.Biosigma S.r.l. | ||
| Medium 199 | Sigma-Aldrich | M5017 | |
| Mineral oil | Sigma-Aldrich | M8410 | |
| MitoTracker Red CM-H2XRos | ThermoFisher | M7512 | |
| New born calf serum heat inactivated (FCS) | Sigma-Aldrich | N4762 | |
| Penicillin G sodium salt | Sigma-Aldrich | P3032 | |
| Phenol Red | Sigma-Aldrich | P3532 | |
| Polyvinyl alcohol (87-90% hydrolyzed, average mol wt 30,000-70,000) | Sigma-Aldrich | P8136 | |
| Potassium Chloride (KCl) | Sigma-Aldrich | P5405 | |
| Potassium phosphate monobasic (KH2PO4) | Sigma-Aldrich | P5655 | |
| Propidium iodide | Sigma-Aldrich | P4170 | |
| Sheep serum | Sigma-Aldrich | S2263 | |
| Sodium azide | Sigma-Aldrich | S2202 | |
| Sodium bicarbonate (NaHCO3) | Sigma-Aldrich | S5761 | |
| Sodium chloride (NaCl) | Sigma-Aldrich | S9888 | |
| Sodium dl-lactate solution syrup | Sigma-Aldrich | L4263 | |
| Sodium pyruvate | Sigma-Aldrich | P2256 | |
| Sperm Class Analyzer | Microptic S.L. | S.C.A. v 3.2.0 | |
| Statistical software Minitab 18.1 | 2017 Minitab | ||
| Stereo microscope | Olimpus | SZ61 | |
| Streptomycin sulfate | Sigma-Aldrich | S9137 | |
| Taurine | Sigma-Aldrich | T7146 | |
| TRIS | Sigma-Aldrich | 15,456-3 |
References
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