Summary

Isolierung von braunen Adipozyten aus murinem interskapulärem braunem Fettgewebe für die Gen- und Proteinexpressionsanalyse

Published: March 12, 2021
doi:

Summary

Diese Studie beschreibt eine neue Methode zur Isolierung von murinen braunen Adipozyten für die Gen- und Proteinexpressionsanalyse.

Abstract

Braunes Fettgewebe (BAT) ist für die nicht zitternde Thermogenese bei Säugetieren verantwortlich, und braune Adipozyten (BAs) sind die funktionellen Einheiten von BAT. BAs enthalten sowohl multilokuläre Lipidtröpfchen als auch reichlich Mitochondrien und exprimieren das Entkopplungsprotein 1 (UCP1). BAs werden basierend auf ihrer Herkunft in zwei Subtypen eingeteilt: embryonale klassische BAs (cBAs) und weiße Adipozyten abgeleitete BAs. Aufgrund ihrer relativ geringen Dichte können BAs mit herkömmlichen Zentrifugationsmethoden nicht aus BVT isoliert werden. In dieser Studie wurde eine neue Methode entwickelt, um BAs aus Mäusen für die Gen- und Proteinexpressionsanalyse zu isolieren. In diesem Protokoll wurde interskapuläre BAT von erwachsenen Mäusen mit Kollagenase- und Dispase-Lösung verdaut, und die dissoziierten BAs wurden mit 6% iger Jodixanollösung angereichert. Isolierte BAs wurden dann mit Trizol-Reagenz zur gleichzeitigen Isolierung von RNA, DNA und Protein lysiert. Nach der RNA-Isolierung wurde die organische Phase des Lysats für die Proteinextraktion verwendet. Unsere Daten zeigten, dass 6% Jodixanollösung BAs effizient anreicherte, ohne Folgestudien zur Gen- und Proteinexpression zu stören. Platelet-derived growth factor (PDGF) ist ein Wachstumsfaktor, der das Wachstum und die Proliferation von mesenchymalen Zellen reguliert. Im Vergleich zum braunen Fettgewebe hatten isolierte BAs eine signifikant höhere Expression von Pdgfa. Zusammenfassend bietet diese neue Methode eine Plattform, um die Biologie brauner Adipozyten auf Einzelzelltypebene zu untersuchen.

Introduction

Sowohl Mäuse als auch Menschen haben zwei Arten von Fettgewebe: weißes Fettgewebe (WAT) und braunes Fettgewebe (BAT)1. WAT speichert Energie in Form von Triglyceriden in weißen Adipozyten, und die braunen Adipozyten (BAs) von BAT leiten chemische Energie als Wärme2 ab. Basierend auf ihrem Entwicklungsursprung werden BAs weiter kategorisiert in klassische BAs (cBAs), die während der Embryonalentwicklung entstanden sind, und aus weißen Adipozyten gewonnene BAs (beige/brite Zellen, die unter Stressbedingungen aus weißen Adipozyten umgewandelt werden)3. BAs sind multilokulär und exprimieren das thermogene Proteinentkopplungsprotein 1 (UCP1)4. Das interskapuläre BAT-Depot (iBAT) ist eines der primären cBAs-Depots bei kleinen Säugetieren5, während beige Zellen innerhalb von WAT6 dispergiert sind.

Aufgrund ihrer Art der Energieableitung haben BAs als therapeutisches Ziel zur Verringerung von Fettleibigkeit viel Aufmerksamkeit erhalten7. Um BAs zur Behandlung von Fettleibigkeit zu nutzen, ist es wichtig, die molekularen Mechanismen zu verstehen, die die Funktion, das Überleben und die Rekrutierung von BAs steuern. Fettgewebe einschließlich BAT und WAT sind heterogen. Abgesehen von Adipozyten enthält Fettgewebe viele andere Zelltypen wie Endothelzellen, mesenchymale Stammzellen und Makrophagen8. Obwohl genetische Werkzeuge zur spezifischen Depletion von Kandidatengenen in Mäuse-BAs verfügbar sind, wie UCP1::Cre Linie9, sind Techniken zur Reinigung von BAs von BAT oder WAT begrenzt, was es schwierig macht, BAs auf Einzelzellebene zu untersuchen. Darüber hinaus wird ohne reine BAs die Beziehung zwischen BAs und Nicht-BAs nicht klar abgegrenzt. Zum Beispiel wurde der von Blutplättchen abgeleitete Wachstumsfaktorrezeptor alpha (PDGFRα) als Marker für undifferenzierte mesenchymale Zellen verwendet und wird in den endothelialen und interstitiellen Zellen von BAT exprimiert. In kalt gestressten BAT entstehen durch PDGFRα-positive Vorläuferzellen neue BAs10. PDGFRα wird durch seinen Liganden PDGF aktiviert, einen Wachstumsfaktor, der das Wachstum und die Proliferation von mesenchymalen Zellen reguliert11; Es ist jedoch unklar, ob BAs das Verhalten von PDGFRα-positiven Vorläuferzellen beeinflussen, indem sie PDGF sezernieren.

Vor kurzem wurde ein BAs-Isolationsprotokoll veröffentlicht, das auf Fluoreszenz-aktivierter Zellsortierung (FACS)12 basiert. In diesem Protokoll wurde 3% ige Rinderserumalbumin (BSA) -Lösung verwendet, um BAs von Nicht-BAs zu trennen, und die angereicherten BAs wurden durch FACS weiter gereinigt. Die Anwendung dieses Protokolls ist durch die Anforderung des FACS-Prozesses begrenzt, der sowohl auf Geräten als auch auf FACS-Betriebserfahrungen beruht. In dieser Studie wurde ein neues Protokoll zur Isolierung von BAs aus BAT entwickelt. Die durch dieses Protokoll isolierten BAs können direkt für Gen- und Proteinexpressionsstudien verwendet werden. Darüber hinaus deuten Daten aus dieser Studie darauf hin, dass BAs eine wichtige PDGF-Ressource sind.

Protocol

Alle Mäuse wurden unter pathogenfreien Bedingungen gehalten, und alle Verfahren wurden vom Masonic Medical Research Institutional Animal Care and Use Committee (IACUC) genehmigt. UCP1::Cre9 und Rosa 26tdTomato-Mäuse der Linien13 wurden zuvor berichtet. Alle Mäuse wurden bei Raumtemperatur mit einem 12 h Hell-Dunkel-Zyklus gehalten. 1. Herstellung der Lösungen und des braunen Fettgewebes (BVT) Aufschlusslösung und Trennl?…

Representative Results

Herstellung von interakapular BAT zur Isolierung brauner AdipozytenDer Isolationsprozess für braune Adipozyten (BAs) ist in Abbildung 1A dargestellt. Der gesamte Prozess, von der Herstellung von BVT und Aufschluss-/Trennlösungen bis zur Gewinnung isolierter BAs, dauert etwa 4 Stunden. Bei erwachsenen Mäusen gibt es reichlich BAT in der interskapulären Region. Diese interskapuläre BAT (iBAT) wird von Muskelschichten und WAT bedeckt (<stron…

Discussion

In dieser Studie wurde eine neue Methode zur Isolierung von BAs für die Gen- und Proteinexpressionsanalyse entwickelt.

In einem veröffentlichten BAs-Isolationsprotokoll wurde eine 3%ige BSA-Lösung zur Anreicherung von BAs12 verwendet. Dennoch konnten die angereicherten BAs, die durch dieses veröffentlichte Protokoll erzielt wurden, nicht direkt für die Proteinexpressionsanalyse verwendet werden. Dies liegt daran, dass das in der BAs-Lösung vorhandene konzentrierte…

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Z. Lin wurde von den National Institutes of Health HL138454-01 und dem Masonic Medical Research Institute unterstützt.

Materials

Antibodies
Antigen Company Catalog
PPARγ LSBio Ls-C368478
PDGFRa Santa Cruz sc-398206
UCP1 R&D system IC6158P
Chemical and solutions
Collagenase, Type II Thermo Fisher Scientific 17101015
1-Bromo-3-chloropropane Sigma-Aldrich B62404
Bovine Serum Albumin (BSA)  Goldbio A-421-10
Calcium chloride Bio Basic CT1330
Chloroform IBI Scientific IB05040
Dispase II, protease Sigma-Aldrich D5693
EDTA Bio Basic EB0107
Ethanol IBI Scientific IB15724
LiQuant Universal Green qPCR Master Mix LifeSct LS01131905Y
Magnesium Chloride Hexahydrate Boston BioProducts P-855
OneScrip Plus cDNA Synthesis SuperMix ABM G454
OptiPrep (Iodixanol) Cosmo Bio USA AXS-1114542
PBS (10x) Caisson Labs PBL07
PBS (1x) Caisson Labs PBL06
Pierce BCA Protein Assay Kit Thermo Fisher Scientific 23227
Potassium Chloride Boston BioProducts P-1435
SimplyBlue safe Stain Invitrogen LC6060
Sodium dodecyl sulfate (SDS) Sigma-Aldrich 75746
Trizol reagent Life technoologies 15596018
Primers
Gene name (Species)  Forward Reverse
Pdgfra (Mouse) CTCAGCTGTCTCCTCACAgG CAACGCATCTCAGAGAAAAGG
Pdgfa (Mouse) TGTGCCCATTCGCAGGAAGAG TTGGCCACCTTGACACTGCG
36B4(Mouse) TGCTGAACATCTCCCCCTTCTC TCTCCACAGACAATGCCAGGAC
Ucp1 ACTGCCACACCTCCAGTCATT CTTTGCCTCACTCAGGATTGG
Equipment
Name Company Application
Keyence BZ-X700 Keyence Imaging brown adipocytes
Magnetic stirrer VWR Dissociate BAT
QuantStudio 6 Flex Real-Time PCR System Applied Biosystem Quantitative PCR
The Odyssey Fc Imaging system LI-COR Western blot immaging

References

  1. Zwick, R. K., Guerrero-Juarez, C. F., Horsley, V., Plikus, M. V. Anatomical, physiological, and functional diversity of adipose tissue. Cell Metabolism. 27, 68-83 (2018).
  2. Symonds, M. E. Brown adipose tissue growth and development. Scientifica. 2013, 305763 (2013).
  3. Giralt, M., Villarroya, F. White, brown, beige/brite: Different adipose cells for different functions. Endocrinology. 154, 2992-3000 (2013).
  4. Cannon, B., Nedergaard, J. Brown adipose tissue: function and physiological significance. Physiological Reviews. 84, 277-359 (2004).
  5. Cinti, S. The adipose organ. Prostaglandins, Leukotrienes and Essential Fatty Acids. 73, 9-15 (2005).
  6. Wu, J., et al. Beige adipocytes are a distinct type of thermogenic fat cell in mouse and human. Cell. 150, 366-376 (2012).
  7. Cypess, A. M., Kahn, C. R. Brown fat as a therapy for obesity and diabetes. Current Opinion in Endocrinology, Diabetes and Obesity. 17, 143-149 (2010).
  8. Schoettl, T., Fischer, I. P., Ussar, S. Heterogeneity of adipose tissue in development and metabolic function. Journal of Experimental Biology. 221, (2018).
  9. Kong, X., et al. IRF4 is a key thermogenic transcriptional partner of PGC-1α. Cell. 158, 69-83 (2014).
  10. Lee, Y. H., Petkova, A. P., Konkar, A. A., Granneman, J. G. Cellular origins of cold-induced brown adipocytes in adult mice. The FASEB Journal. 29, 286-299 (2015).
  11. Kim, W. -. S., Park, H. -. S., Sung, J. -. H. The pivotal role of PDGF and its receptor isoforms in adipose-derived stem cells. Histology and Histopathology. 30 (7), 793-799 (2015).
  12. Hagberg, C. E. Flow cytometry of mouse and human adipocytes for the analysis of browning and cellular heterogeneity. Cell Report. 24, 2746-2756 (2018).
  13. Madisen, L., et al. A robust and high-throughput Cre reporting and characterization system for the whole mouse brain. Nature Neuroscience. 13, 133-140 (2010).
  14. Smith, P. K., et al. Measurement of protein using bicinchoninic acid. Analytical biochemistry. 150, 76-85 (1985).
  15. Chey, S., Claus, C., Liebert, U. G. Improved method for simultaneous isolation of proteins and nucleic acids. Analytical Biochemistry. 411, 164-166 (2011).
  16. Ford, T., Graham, J., Rickwood, D. Iodixanol: A nonionic iso-osmotic centrifugation medium for the formation of self-generated gradients. Analytical Biochemistry. 220, 360-366 (1994).
  17. Kovacovicova, K., Vinciguerra, M. Isolation of senescent cells by iodixanol (OptiPrep) density gradient-based separation. Cell Proliferation. 52, 12674 (2019).
  18. Lock, M., et al. versatile manufacturing of recombinant adeno-associated viral vectors at scale. Human Gene Therapy. 21, 1259-1271 (2010).
  19. Marin, R. D., Crespo-Garcia, S., Wilson, A. M., Sapieha, P. RELi protocol: Optimization for protein extraction from white, brown, and beige adipose tissues. MethodsX. 6, 918-928 (2019).
  20. Sonna, L. A., Fujita, J., Gaffin, S. L., Lilly, C. M. Invited Review: effects of heat and cold stress on mammalian gene expression. Journal of Applied Physiology. 92, 1725-1742 (2002).
  21. Gensch, N., Borchardt, T., Schneider, A., Riethmacher, D., Braun, T. Different autonomous myogenic cell populations revealed by ablation of Myf5-expressing cells during mouse embryogenesis. Development. 135, 1597-1604 (2008).

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Cite This Article
Negron, S. G., Xu, B., Lin, Z. Isolating Brown Adipocytes from Murine Interscapular Brown Adipose Tissue for Gene and Protein Expression Analysis. J. Vis. Exp. (169), e62332, doi:10.3791/62332 (2021).

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