Questo studio descrive un nuovo metodo per isolare gli adipociti bruni murini per l'analisi dell'espressione genica e proteica.
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Articolo metodologico
Isolamento di adipociti bruni da tessuto adiposo bruno interscapolare murino per l'analisi dell'espressione genica e proteica
In questo articolo
Sommario
Abstract
Il tessuto adiposo bruno (BAT) è responsabile della termogenesi senza brividi nei mammiferi e gli adipociti bruni (BA) sono le unità funzionali della BAT. I BA contengono sia goccioline lipidiche multiloculari che abbondanti mitocondri ed esprimono la proteina 1 disaccoppiante (UCP1). I BA sono classificati in due sottotipi in base alla loro origine: BA classici derivati da embrioni (cBA) e BAs derivati da adipociti bianchi. A causa della loro densità relativamente bassa, i BA non possono essere isolati dalle BAT con il metodo di centrifugazione tradizionale. In questo studio, è stato sviluppato un nuovo metodo per isolare i BA dai topi per l'analisi dell'espressione genica e proteica. In questo protocollo, il BAT interscapolare di topi adulti è stato digerito con la soluzione di collagenasi e dispasi e i BA dissociati sono stati arricchiti con una soluzione di iodixanolo al 6%. I BA isolati sono stati quindi lisati con il reagente Trizol per l'isolamento simultaneo di RNA, DNA e proteine. Dopo l'isolamento dell'RNA, la fase organica del lisato è stata utilizzata per l'estrazione delle proteine. I nostri dati hanno mostrato che la soluzione di iodixanolo al 6% ha arricchito efficacemente i BA senza interferire con gli studi di espressione genica e proteica di follow-up. Il fattore di crescita derivato dalle piastrine (PDGF) è un fattore di crescita che regola la crescita e la proliferazione delle cellule mesenchimali. Rispetto al tessuto adiposo bruno, i BA isolati avevano un'espressione significativamente più elevata di Pdgfa. In sintesi, questo nuovo metodo fornisce una piattaforma per studiare la biologia degli adipociti bruni a livello di singola cellula.
Introduzione
Sia i topi che gli esseri umani hanno due tipi di tessuto adiposo: tessuto adiposo bianco (WAT) e tessuto adiposo bruno (BAT)1. WAT immagazzina energia sotto forma di trigliceridi negli adipociti bianchi e gli adipociti bruni (BA) di BAT dissipano l'energia chimica come calore2. In base alla loro origine evolutiva, i BA sono ulteriormente classificati in BA classici (cBA) che si sono formati durante lo sviluppo embrionale e BAs derivati da adipociti bianchi (cellule beige/brite, convertite da adipociti bianchi in condizioni di stress)3. I BA sono multiloculari ed esprimono la proteina termogena disaccoppiante proteina 1 (UCP1)4. Il deposito interscapolare BAT (iBAT) è uno dei principali depositi di cBA nei piccoli mammiferi5, mentre le cellule beige sono disperse all'interno di WAT6.
A causa della loro natura di dissipazione di energia, i BA hanno ricevuto molta attenzione come obiettivo terapeutico per ridurre l'obesità7. Per sfruttare i BA allo scopo di trattare l'obesità, è essenziale comprendere i meccanismi molecolari che controllano la funzione, la sopravvivenza e il reclutamento dei BA. I tessuti adiposi tra cui BAT e WAT sono eterogenei. Ad eccezione degli adipociti, i tessuti adiposi contengono molti altri tipi di cellule, come le cellule endoteliali, le cellule staminali mesenchimali e i macrofagi8. Sebbene siano disponibili strumenti genetici per esaurire specificamente i geni candidati nei BA dei topi, come UCP1::Cre linea9, le tecniche per purificare i BA da BAT o WAT sono limitate, rendendo difficile studiare i BA a livello di tipo di singola cellula. Inoltre, senza ottenere BA puri, la relazione tra BA e non BA non sarà chiaramente delineata. Ad esempio, il recettore alfa del fattore di crescita derivato dalle piastrine (PDGFRα) è stato utilizzato come marker per le cellule mesenchimali indifferenziate ed è espresso nelle cellule endoteliali e interstiziali di BAT. Nelle BAT stressate a freddo, le cellule progenitrici PDGFRα positive danno origine a nuovi BA10. PDGFRα è attivato dal suo ligando PDGF, un fattore di crescita che regola la crescita e la proliferazione delle cellule mesenchimali11; tuttavia, non è chiaro se i BA influenzino il comportamento delle cellule progenitrici PDGFRα positive secernendo PDGF.
Recentemente è stato pubblicato un protocollo di isolamento BAs, basato sulla selezione cellulare attivata dalla fluorescenza (FACS)12. In questo protocollo, la soluzione di albumina sierica bovina al 3% (BSA) è stata utilizzata per separare i BA dai non BA e i BA arricchiti sono stati ulteriormente purificati da FACS. L'applicazione di questo protocollo è limitata dal requisito del processo FACS, che si basa sia sulle apparecchiature che sulle esperienze operative FACS. In questo studio è stato sviluppato un nuovo protocollo per isolare i BA dalle BAT. I BA isolati da questo protocollo possono essere utilizzati direttamente per studi di espressione genica e proteica. Inoltre, i dati di questo studio suggeriscono che i BA sono una delle principali risorse del PDGF.
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Protocollo
Tutti i topi sono stati mantenuti in condizioni prive di agenti patogeni e tutte le procedure sono state approvate dal Masonic Medical Research Institutional Animal Care and Use Committee (IACUC). UCP1::Cre9 e Rosa 26tdTomato topi linee13 sono state segnalate in precedenza. Tutti i topi sono stati tenuti a temperatura ambiente con un ciclo luce/buio di 12 ore.
1. Preparazione delle soluzioni e del tessuto adiposo bruno (BAT)
- Preparare la soluzione di digestione e la soluzione di separazione in provette da centrifuga da 15 ml.
- 10 mL di soluzione di digestione BAT: A 10 mL di soluzione salina sterile tamponata con fosfato (PBS), aggiungere 3,5 mg/mL di Dispase II, 1 mg/mL di collagenasi II e 10 mM di CaCl2 per ottenere una soluzione di digestione BAT.
- 10 mL di soluzione di iodixanolo al 12% (soluzione di separazione): Mescolare 1 mL di 10x PBS, 2 mL di iodixanolo al 60%, 0,01 mL di 1 M MgCl 2, 0,025 mL di 1 M KCl, 0,1 mL di acido etilendiamminotetraacetico 0,2 M (EDTA) e 6,865 mL di ddH2O per ottenere il 12% di iodixanolo.
- Eutanasia di un topo adulto con overdose di CO2 . In breve, riempire la gabbia del topo con CO2 al 100% ad un tasso di spostamento del 10-30% del volume della gabbia al minuto. 5 minuti dopo, confermare la morte controllando l'assenza di respirazione visibilmente.
- Seziona l'animale e raccogli il pipistrello interscapolare. Rimuovere WAT e strati muscolari sotto un microscopio stereo.
- Per avere una digestione sufficiente, tagliare ogni lobo BAT in ~ 3 mm3 parti e metterle in un matraccio pulito da 50 ml con una barra di agitazione metallica e una soluzione digestiva da 5 ml. Prima di iniziare la digestione, lasciare riposare sul ghiaccio il matraccio contenente BAT e tampone di digestione per 1 ora.
NOTA: Nelle fasi seguenti, sono stati utilizzati circa 80 mg di BAT per l'isolamento degli adipociti bruni.
2. Procedura di isolamento dei BA
- Posizionare il pallone su un agitatore magnetico racchiuso in un'incubatrice. Impostare la velocità di agitazione rispettivamente a 60 giri/min e la temperatura dell'incubatore a 35 °C. La digestione durerà circa 30 minuti. Se le fette BAT formano grumi attorno alla barra dell'agitatore durante la digestione, utilizzare una punta di pipetta da 1 mL per interrompere i tessuti aggregati.
- Posizionare un filtro filtrante da 70 μm sopra una provetta da centrifuga pulita da 50 ml. Pipettare intorno a 4 mL di sospensione cellulare attraverso il filtro. Lavare il colino con 4 ml di soluzione di iodixanolo al 12%. Pipettare su e giù per mescolare le cellule e la soluzione di iodixanolo. Trasferire la miscela cellulare in due provette di polistirene trasparente da 5 ml.
NOTA: Alla fine della digestione, la soluzione di digestione dovrebbe essere torbida, indicando una digestione sufficiente. Utilizzare ogni volta una soluzione digestiva fresca. Una volta preparata, la soluzione di digestione deve essere utilizzata entro 2 ore. - Ripetere i passaggi 2.2 e 2.3 ancora una volta se la digestione non è sufficiente.
- Lasciare i tubi di polistirene trasparente contenenti la soluzione di separazione e i BA sul ghiaccio per 1 ora. I BA formeranno uno strato sulla parte superiore.
- Estrarre 20 μL dei BA isolati per l'esame al microscopio.
3. Isolamento di RNA e proteine da BA
- Pipettare lo strato di BA in due provette da microcentrifuga da 1,7 mL per l'isolamento di RNA e proteine. Rimuovere con attenzione la soluzione di iodixanolo in eccesso senza interrompere lo strato di BA.
- Aggiungere 1 mL di Trizol per isolare simultaneamente RNA, DNA e proteine nella soluzione cellulare. Mescolare a sufficienza per lisare le cellule.
- Aggiungere 200 μL di cloroformio per separare le fasi.
- Centrifugare il tubo per 9.981 x g per 10 minuti a 4 °C.
- Dopo la centrifugazione, utilizzare la fase acquosa per l'isolamento dell'RNA. In questo studio, l'RNA totale è stato utilizzato per la trascrizione inversa e la RT-PCR quantitativa è stata effettuata con Real-Time PCR. Le sequenze di primer sono elencate nella tabella dei materiali.
- Trasferire 300 μL della fase organica in una provetta da microcentrifuga da 2 ml.
- Alla fase organica, aggiungere 2,5 volume 100% etanolo e vortice per 10 s.
- Aggiungere 200 μL di 1-Bromo-3-cloropropano e vortice per 10 s.
- Aggiungere 600 μL di acqua bidistillata e vortice per 10 s.
- Lasciare riposare la soluzione miscelata per 10 minuti a temperatura ambiente.
- Centrifugare a 9,981 x g per 10 minuti a 4 °C. In questa fase, le fasi saranno separate. La fase proteica è localizzata nello strato intermedio.
- Rimuovere la soluzione acquosa superiore. Aggiungere 1 mL di etanolo al 100% nella soluzione rimanente.
- Centrifugare per 10 min, 9.981 x g, 4 °C. Dopo la centrifugazione, si formerà il pellet proteico. Scartare il surnatante.
- Lavare il pellet con 1 mL 100% etanolo.
- Centrifugare per 10 min, 9981 x g, 4 °C. Conservare il pellet e scartare il surnatante.
- Asciugare all'aria il pellet per 10 minuti a temperatura ambiente.
- Misurare il peso del pellet bagnato. Aggiungere la soluzione SDS all'1% in un rapporto di 20 μL/mg di pellet.
- Sciogliere il pellet mettendo il tubo in uno shaker riscaldato. Impostare la temperatura a 55 °C e la velocità a 11 x g. Di solito ci vogliono 5-10 minuti per sciogliere completamente il pellet proteico.
NOTA: La concentrazione della proteina disciolta può essere misurata mediante il saggio BCA14.
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Risultati
Preparazione di BAT interacapulare per l'isolamento degli adipociti bruni
Il processo di isolamento degli adipociti bruni (BA) è rappresentato nella Figura 1A. L'intero processo, dalla preparazione delle BAT e delle soluzioni di digestione/separazione all'ottenimento di BA isolati, richiederà circa 4 ore.
Nei topi adulti, esiste un'abbondante BAT nella regione interscapolare. Questo BAT interscapolare (iBAT) è coperto da strati muscolari e WAT ...
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Discussione
In questo studio è stato sviluppato un nuovo metodo per isolare i BA per l'analisi dell'espressione genica e proteica.
In un protocollo di isolamento BAs pubblicato, la soluzione BSA al 3% è stata utilizzata per arricchire BAs12. Tuttavia, i BA arricchiti ottenuti da questo protocollo pubblicato non potevano essere utilizzati direttamente per l'analisi dell'espressione proteica. Questo perché la BSA concentrata esistente nella soluzione di BA interferisce con l'estrazio...
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Ringraziamenti
Z. Lin è stato supportato dai fondi del National Institutes of Health HL138454-01 e del Masonic Medical Research Institute.
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Materiali
| Nome | Azienda | Numero di catalogo | Commenti |
|---|---|---|---|
| Anticorpi | |||
| Antigenio | Azienda | Catalogo | |
| PPARγ | LSBio | Ls-C368478 | |
| PDGFRa | Santa Cruz | sc-398206 | |
| UCP1 | R& Sistema D | IC6158P | |
| Chimica e soluzioni | |||
| Collagenasi, Tipo II | Thermo Fisher Scientific 17101015 | ||
| 1-Bromo-3-cloropropano | Sigma-Aldrich | B62404 | |
| Albumina sierica bovina (BSA) | Goldbio | A-421-10 | |
| Cloruro di calcio | Bio Basic | CT1330 | |
| Cloroformio | IBI Scientific | IB05040 | |
| Dispasi II, proteasi | Sigma-Aldrich | D5693 | |
| EDTA | Bio Basic | EB0107 | |
| Etanolo | IBI Scientific | IB15724 | |
| LiQuant Universal Green qPCR Master Mix | LifeSct | LS01131905Y | |
| Cloruro di magnesio esaidrato | Boston BioProducts | P-855 | |
| OneScrip Plus sintesi di cDNA SuperMix | ABM | G454 | |
| OptiPrep (iodixanol) | Cosmo Bio USA | AXS-1114542 | |
| PBS (10x) | Caisson Labs | PBL07 | |
| PBS (1x) | Caisson Labs | PBL06 | |
| Kit per il dosaggio delle proteine Pierce BCA | Thermo Fisher Scientific | 23227 | |
| Cloruro di potassio | Boston BioProducts | P-1435 | |
| Tinta sicura SimplyBlue | Invitrogen | LC6060 | |
| Dodecil solfato di sodio (SDS) | Sigma-Aldrich | 75746 | |
| Reagente Trizol | Tecnologie di vita | 15596018 | |
| Primers | |||
| Nome del gene (Specie) | Avanti | inverso Pdgfra | |
| (Mouse) | CTCAGCTGTCTCCTCACAgG | CAACGCATCTCAGAGAAAAGG | |
| Pdgfa (Mouse) | TGTGCCCATTCGCAGGAAGAG | TTGGCCACCTTGACACTGCG | |
| 36B4(Mouse) | TGCTGAACATCTCCCCCTTCTC | TCTCCAGAGACAATGCCAGGAC | |
| Ucp1 | ACTGCCACACCTCCAGTCATT | CTTTGCCTCACTCAGGATTGG | |
| strong>Equipment | |||
| Name | Azienda | Application | |
| Keyence BZ-X700 | Keyence Imaging adipociti | ||
| Agitatore magnetico | VWR | Dissociate BAT | |
| QuantStudio 6 Flex Sistema PCR in tempo reale | applicato Biosystem | PCR | |
| L'Odissea Fc Sistema di imaging | LI-COR | Western blot immaging |
Riferimenti
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