Isolamento di adipociti bruni da tessuto adiposo bruno interscapolare murino per l'analisi dell'espressione genica e proteica
Summary
Questo studio descrive un nuovo metodo per isolare gli adipociti bruni murini per l’analisi dell’espressione genica e proteica.
Abstract
Il tessuto adiposo bruno (BAT) è responsabile della termogenesi senza brividi nei mammiferi e gli adipociti bruni (BA) sono le unità funzionali della BAT. I BA contengono sia goccioline lipidiche multiloculari che abbondanti mitocondri ed esprimono la proteina 1 disaccoppiante (UCP1). I BA sono classificati in due sottotipi in base alla loro origine: BA classici derivati da embrioni (cBA) e BAs derivati da adipociti bianchi. A causa della loro densità relativamente bassa, i BA non possono essere isolati dalle BAT con il metodo di centrifugazione tradizionale. In questo studio, è stato sviluppato un nuovo metodo per isolare i BA dai topi per l’analisi dell’espressione genica e proteica. In questo protocollo, il BAT interscapolare di topi adulti è stato digerito con la soluzione di collagenasi e dispasi e i BA dissociati sono stati arricchiti con una soluzione di iodixanolo al 6%. I BA isolati sono stati quindi lisati con il reagente Trizol per l’isolamento simultaneo di RNA, DNA e proteine. Dopo l’isolamento dell’RNA, la fase organica del lisato è stata utilizzata per l’estrazione delle proteine. I nostri dati hanno mostrato che la soluzione di iodixanolo al 6% ha arricchito efficacemente i BA senza interferire con gli studi di espressione genica e proteica di follow-up. Il fattore di crescita derivato dalle piastrine (PDGF) è un fattore di crescita che regola la crescita e la proliferazione delle cellule mesenchimali. Rispetto al tessuto adiposo bruno, i BA isolati avevano un’espressione significativamente più elevata di Pdgfa. In sintesi, questo nuovo metodo fornisce una piattaforma per studiare la biologia degli adipociti bruni a livello di singola cellula.
Introduction
Sia i topi che gli esseri umani hanno due tipi di tessuto adiposo: tessuto adiposo bianco (WAT) e tessuto adiposo bruno (BAT)1. WAT immagazzina energia sotto forma di trigliceridi negli adipociti bianchi e gli adipociti bruni (BA) di BAT dissipano l’energia chimica come calore2. In base alla loro origine evolutiva, i BA sono ulteriormente classificati in BA classici (cBA) che si sono formati durante lo sviluppo embrionale e BAs derivati da adipociti bianchi (cellule beige/brite, convertite da adipociti bianchi in condizioni di stress)3. I BA sono multiloculari ed esprimono la proteina termogena disaccoppiante proteina 1 (UCP1)4. Il deposito interscapolare BAT (iBAT) è uno dei principali depositi di cBA nei piccoli mammiferi5, mentre le cellule beige sono disperse all’interno di WAT6.
A causa della loro natura di dissipazione di energia, i BA hanno ricevuto molta attenzione come obiettivo terapeutico per ridurre l’obesità7. Per sfruttare i BA allo scopo di trattare l’obesità, è essenziale comprendere i meccanismi molecolari che controllano la funzione, la sopravvivenza e il reclutamento dei BA. I tessuti adiposi tra cui BAT e WAT sono eterogenei. Ad eccezione degli adipociti, i tessuti adiposi contengono molti altri tipi di cellule, come le cellule endoteliali, le cellule staminali mesenchimali e i macrofagi8. Sebbene siano disponibili strumenti genetici per esaurire specificamente i geni candidati nei BA dei topi, come UCP1::Cre linea9, le tecniche per purificare i BA da BAT o WAT sono limitate, rendendo difficile studiare i BA a livello di tipo di singola cellula. Inoltre, senza ottenere BA puri, la relazione tra BA e non BA non sarà chiaramente delineata. Ad esempio, il recettore alfa del fattore di crescita derivato dalle piastrine (PDGFRα) è stato utilizzato come marker per le cellule mesenchimali indifferenziate ed è espresso nelle cellule endoteliali e interstiziali di BAT. Nelle BAT stressate a freddo, le cellule progenitrici PDGFRα positive danno origine a nuovi BA10. PDGFRα è attivato dal suo ligando PDGF, un fattore di crescita che regola la crescita e la proliferazione delle cellule mesenchimali11; tuttavia, non è chiaro se i BA influenzino il comportamento delle cellule progenitrici PDGFRα positive secernendo PDGF.
Recentemente è stato pubblicato un protocollo di isolamento BAs, basato sulla selezione cellulare attivata dalla fluorescenza (FACS)12. In questo protocollo, la soluzione di albumina sierica bovina al 3% (BSA) è stata utilizzata per separare i BA dai non BA e i BA arricchiti sono stati ulteriormente purificati da FACS. L’applicazione di questo protocollo è limitata dal requisito del processo FACS, che si basa sia sulle apparecchiature che sulle esperienze operative FACS. In questo studio è stato sviluppato un nuovo protocollo per isolare i BA dalle BAT. I BA isolati da questo protocollo possono essere utilizzati direttamente per studi di espressione genica e proteica. Inoltre, i dati di questo studio suggeriscono che i BA sono una delle principali risorse del PDGF.
Protocol
Representative Results
Discussion
In questo studio è stato sviluppato un nuovo metodo per isolare i BA per l’analisi dell’espressione genica e proteica.
In un protocollo di isolamento BAs pubblicato, la soluzione BSA al 3% è stata utilizzata per arricchire BAs12. Tuttavia, i BA arricchiti ottenuti da questo protocollo pubblicato non potevano essere utilizzati direttamente per l’analisi dell’espressione proteica. Questo perché la BSA concentrata esistente nella soluzione di BA interferisce con l’estra…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Z. Lin è stato supportato dai fondi del National Institutes of Health HL138454-01 e del Masonic Medical Research Institute.
Materials
| Antibodies | |||
| Antigen | Company | Catalog | |
| PPARγ | LSBio | Ls-C368478 | |
| PDGFRa | Santa Cruz | sc-398206 | |
| UCP1 | R&D system | IC6158P | |
| Chemical and solutions | |||
| Collagenase, Type II | Thermo Fisher Scientific | 17101015 | |
| 1-Bromo-3-chloropropane | Sigma-Aldrich | B62404 | |
| Bovine Serum Albumin (BSA) | Goldbio | A-421-10 | |
| Calcium chloride | Bio Basic | CT1330 | |
| Chloroform | IBI Scientific | IB05040 | |
| Dispase II, protease | Sigma-Aldrich | D5693 | |
| EDTA | Bio Basic | EB0107 | |
| Ethanol | IBI Scientific | IB15724 | |
| LiQuant Universal Green qPCR Master Mix | LifeSct | LS01131905Y | |
| Magnesium Chloride Hexahydrate | Boston BioProducts | P-855 | |
| OneScrip Plus cDNA Synthesis SuperMix | ABM | G454 | |
| OptiPrep (Iodixanol) | Cosmo Bio USA | AXS-1114542 | |
| PBS (10x) | Caisson Labs | PBL07 | |
| PBS (1x) | Caisson Labs | PBL06 | |
| Pierce BCA Protein Assay Kit | Thermo Fisher Scientific | 23227 | |
| Potassium Chloride | Boston BioProducts | P-1435 | |
| SimplyBlue safe Stain | Invitrogen | LC6060 | |
| Sodium dodecyl sulfate (SDS) | Sigma-Aldrich | 75746 | |
| Trizol reagent | Life technoologies | 15596018 | |
| Primers | |||
| Gene name (Species) | Forward | Reverse | |
| Pdgfra (Mouse) | CTCAGCTGTCTCCTCACAgG | CAACGCATCTCAGAGAAAAGG | |
| Pdgfa (Mouse) | TGTGCCCATTCGCAGGAAGAG | TTGGCCACCTTGACACTGCG | |
| 36B4(Mouse) | TGCTGAACATCTCCCCCTTCTC | TCTCCACAGACAATGCCAGGAC | |
| Ucp1 | ACTGCCACACCTCCAGTCATT | CTTTGCCTCACTCAGGATTGG | |
| Equipment | |||
| Name | Company | Application | |
| Keyence BZ-X700 | Keyence | Imaging brown adipocytes | |
| Magnetic stirrer | VWR | Dissociate BAT | |
| QuantStudio 6 Flex Real-Time PCR System | Applied Biosystem | Quantitative PCR | |
| The Odyssey Fc Imaging system | LI-COR | Western blot immaging | |
References
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