Este estudo descreve um novo método de isolamento de adipócitos marrons murinos para análise da expressão gênica e proteica.
O tecido adiposo marrom (BAT) é responsável pela termogênese não trêmula em mamíferos, e os adipócitos marrons (BAs) são as unidades funcionais dos BAT. Os BAs contêm gotículas lipídicas multiloculares e mitocôndrias abundantes, e expressam a proteína de desacoplamento 1 (UCP1). Os BAs são categorizados em dois subtipos com base em sua origem: BAs clássicos derivados de embriões (cBAs) e BAs derivados de adipócitos brancos. Devido à sua densidade relativamente baixa, os BAs não podem ser isolados do MTD com o método tradicional de centrifugação. Neste estudo, um novo método foi desenvolvido para isolar BAs de camundongos para análise de expressão gênica e proteica. Neste protocolo, a MTD interescapular de camundongos adultos foi digerida com solução de colagenase e dispase, e os BAs dissociados foram enriquecidos com solução de iodixanol a 6%. BAs isolados foram então lisados com reagente Trizol para isolamento simultâneo de RNA, DNA e proteína. Após o isolamento do RNA, a fase orgânica do lisado foi utilizada para a extração proteica. Nossos dados mostraram que a solução de iodixanol a 6% enriqueceu eficientemente os BAs sem interferir nos estudos de acompanhamento de expressão gênica e proteica. O fator de crescimento derivado de plaquetas (PDGF) é um fator de crescimento que regula o crescimento e a proliferação de células mesenquimais. Em comparação com o tecido adiposo marrom, os BAs isolados apresentaram expressão significativamente maior de Pdgfa. Em resumo, este novo método fornece uma plataforma para estudar a biologia dos adipócitos marrons em um único nível de tipo celular.
Tanto camundongos quanto humanos possuem dois tipos de tecido adiposo: tecido adiposo branco (WAT) e tecido adiposo marrom (BAT)1. WAT armazena energia na forma de triglicerídeos em adipócitos brancos, e os adipócitos marrons (BAs) de MTD dissipam energia química como calor2. Com base em sua origem desenvolvimentista, os BAs são categorizados em BAs clássicos (cBAs) que se formaram durante o desenvolvimento embrionário e os BAs derivados de adipócitos brancos (células bege/brite, convertidas de adipócitos brancos sob condições de estresse)3. Os BAs são multiloculares e expressam a proteína termogênica de desacoplamento da proteína 1 (UCP1)4. O depósito de MTD interescapular (iBAT) é um dos principais depósitos de cBAs em pequenos mamíferos5, enquanto as células beges estão dispersas no WAT6.
Devido à sua natureza de dissipação de energia, os BAs têm recebido muita atenção como alvo terapêutico para a redução da obesidade7. Para explorar os BAs com a finalidade de tratar a obesidade, é essencial entender os mecanismos moleculares que controlam a função, a sobrevivência e o recrutamento dos BAs. Os tecidos adiposos, incluindo MTD e MTD, são heterogêneos. Com exceção dos adipócitos, os tecidos adiposos contêm muitos outros tipos de células, como células endoteliais, células-tronco mesenquimais e macrófagos8. Embora ferramentas genéticas para esgotar especificamente genes candidatos em BAs de camundongos estejam disponíveis, como UCP1::Cre linha9, as técnicas para purificar BAs de BAT ou WAT são limitadas, dificultando o estudo de BAs em um nível de tipo de célula única. Além disso, sem a obtenção de BAs puros, a relação entre BAs e não-BAs não será claramente delineada. Por exemplo, o receptor alfa do fator de crescimento derivado de plaquetas (PDGFRα) tem sido usado como um marcador para células mesenquimais indiferenciadas, e é expresso nas células endoteliais e intersticiais de BAT. Em MTD estressadas a frio, as células progenitoras positivas para PDGFRα dão origem a novas BAs10. O PDGFRα é ativado por seu ligante PDGF, fator de crescimento que regula o crescimento e a proliferação de células mesenquimais11; no entanto, não está claro se os BAs influenciam o comportamento das células progenitoras positivas para PDGFRα secretando PDGF.
Recentemente, foi publicado um protocolo de isolamento de BAs, que se baseia na classificação celular ativada por fluorescência (FACS)12. Neste protocolo, a solução de albumina sérica bovina (BSA) a 3% foi usada para separar BAs de não-BAs, e os BAs enriquecidos foram purificados por FACS. A aplicação deste protocolo é limitada pela exigência do processo FACS, que depende de equipamentos e experiências de operação FACS. Neste estudo, um novo protocolo para o isolamento de BAs de MTD foi desenvolvido. Os BAs isolados por este protocolo podem ser usados diretamente para estudos de expressão gênica e proteica. Além disso, os dados deste estudo sugerem que os BAs são um importante recurso do PDGF.
Neste estudo, um novo método de isolamento de BAs para análise de expressão gênica e proteica foi desenvolvido.
Em um protocolo de isolamento de BAs publicado, uma solução de BSA a 3% foi utilizada para enriquecer os BAs12. No entanto, os BAs enriquecidos alcançados por este protocolo publicado não puderam ser usados diretamente para a análise da expressão proteica. Isso ocorre porque a BSA concentrada existente na solução de BAs interfere no acompanhamento …
The authors have nothing to disclose.
Z. Lin foi apoiado pelos Institutos Nacionais de Saúde HL138454-01 e fundos do Instituto de Pesquisa Médica Maçônica.
Antibodies | |||
Antigen | Company | Catalog | |
PPARγ | LSBio | Ls-C368478 | |
PDGFRa | Santa Cruz | sc-398206 | |
UCP1 | R&D system | IC6158P | |
Chemical and solutions | |||
Collagenase, Type II | Thermo Fisher Scientific | 17101015 | |
1-Bromo-3-chloropropane | Sigma-Aldrich | B62404 | |
Bovine Serum Albumin (BSA) | Goldbio | A-421-10 | |
Calcium chloride | Bio Basic | CT1330 | |
Chloroform | IBI Scientific | IB05040 | |
Dispase II, protease | Sigma-Aldrich | D5693 | |
EDTA | Bio Basic | EB0107 | |
Ethanol | IBI Scientific | IB15724 | |
LiQuant Universal Green qPCR Master Mix | LifeSct | LS01131905Y | |
Magnesium Chloride Hexahydrate | Boston BioProducts | P-855 | |
OneScrip Plus cDNA Synthesis SuperMix | ABM | G454 | |
OptiPrep (Iodixanol) | Cosmo Bio USA | AXS-1114542 | |
PBS (10x) | Caisson Labs | PBL07 | |
PBS (1x) | Caisson Labs | PBL06 | |
Pierce BCA Protein Assay Kit | Thermo Fisher Scientific | 23227 | |
Potassium Chloride | Boston BioProducts | P-1435 | |
SimplyBlue safe Stain | Invitrogen | LC6060 | |
Sodium dodecyl sulfate (SDS) | Sigma-Aldrich | 75746 | |
Trizol reagent | Life technoologies | 15596018 | |
Primers | |||
Gene name (Species) | Forward | Reverse | |
Pdgfra (Mouse) | CTCAGCTGTCTCCTCACAgG | CAACGCATCTCAGAGAAAAGG | |
Pdgfa (Mouse) | TGTGCCCATTCGCAGGAAGAG | TTGGCCACCTTGACACTGCG | |
36B4(Mouse) | TGCTGAACATCTCCCCCTTCTC | TCTCCACAGACAATGCCAGGAC | |
Ucp1 | ACTGCCACACCTCCAGTCATT | CTTTGCCTCACTCAGGATTGG | |
Equipment | |||
Name | Company | Application | |
Keyence BZ-X700 | Keyence | Imaging brown adipocytes | |
Magnetic stirrer | VWR | Dissociate BAT | |
QuantStudio 6 Flex Real-Time PCR System | Applied Biosystem | Quantitative PCR | |
The Odyssey Fc Imaging system | LI-COR | Western blot immaging |