Summary
Bu çalışmada, gen ve protein ekspresyon analizi için murin kahverengi adipositlerin izole edilmesinde yeni bir yöntem açıklanmaktadır.
Abstract
Kahverengi yağ dokusu (BAT) memelilerde titremeyen termojenezden sorumludur ve kahverengi adipositler (BA'lar) BAT'ın fonksiyonel birimleridir. BA'lar hem multiloküler lipid damlacıkları hem de bol miktarda mitokondri içerir ve ayrışma proteini 1'i (UCP1) eksprese ederler. BA'lar, kökenlerine göre iki alt tipe ayrılır: embriyo kaynaklı klasik BA'lar (cBA'lar) ve beyaz adipositlerden türetilmiş BA'lar. Nispeten düşük yoğunlukları nedeniyle, BA'lar geleneksel santrifüjleme yöntemiyle BAT'tan izole edilemez. Bu çalışmada, gen ve protein ekspresyon analizi için BA'ları farelerden izole etmek için yeni bir yöntem geliştirilmiştir. Bu protokolde, yetişkin farelerden interskapuler BAT, Kollajenaz ve Dispase çözeltisi ile sindirildi ve ayrışmış BA'lar% 6 iyodiksanol çözeltisi ile zenginleştirildi. İzole BA'lar daha sonra RNA, DNA ve proteinin eşzamanlı izolasyonu için Trizol reaktifi ile lize edildi. RNA izolasyonundan sonra, lizatın organik fazı protein ekstraksiyonu için kullanıldı. Verilerimiz,% 6'lık iyotiksanol çözeltisinin, takip geni ve protein ekspresyon çalışmalarına müdahale etmeden BA'ları verimli bir şekilde zenginleştirdiğini göstermiştir. Trombosit kaynaklı büyüme faktörü (PDGF), mezenkimal hücrelerin büyümesini ve çoğalmasını düzenleyen bir büyüme faktörüdür. Kahverengi yağ dokusu ile karşılaştırıldığında, izole BA'lar Pdgfa'nın anlamlı derecede daha yüksek ekspresyonuna sahipti. Özetle, bu yeni yöntem, kahverengi adipositlerin biyolojisini tek bir hücre tipi seviyesinde incelemek için bir platform sağlar.
Introduction
Hem fareler hem de insanlar iki tür yağ dokusuna sahiptir: beyaz yağ dokusu (WAT) ve kahverengi yağ dokusu (BAT)1. WAT enerjiyi beyaz adipositlerde trigliseritler şeklinde depolar ve BAT'ın kahverengi adipositleri (BA'lar) kimyasal enerjiyi ısı2 olarak dağıtır. Gelişimsel kökenlerine bağlı olarak, BA'lar embriyo gelişimi sırasında oluşan klasik BA'lar (cBA'lar) ve beyaz adipositler türevi BA'lar (stres koşulları altında beyaz adipositlerden dönüştürülen bej / brit hücreleri) olarak kategorize edilir3. BA'lar multilokülerdir ve termojenik protein ayrışma proteini 1'i (UCP1)4 eksprese eder. İnterskapüler BAT (iBAT) deposu, küçük memelilerde birincil cBA depolarından biridir5, bej hücreler ise WAT6 içinde dağılmıştır.
Enerjiyi dağıtma doğası gereği, BA'lar obeziteyi azaltmak için terapötik bir hedef olarak çok dikkat çekmiştir7. Obeziteyi tedavi etmek amacıyla BA'lardan yararlanmak için, BA'ların işlevini, hayatta kalmasını ve işe alımını kontrol eden moleküler mekanizmaları anlamak önemlidir. BAT ve WAT gibi yağ dokuları heterojendir. Adipositler dışında, yağ dokuları endotel hücreleri, mezenkimal kök hücreler ve makrofajlar8 gibi birçok başka hücre tipi içerir. UCP1: Cre hat9 gibi farelerde aday genleri spesifik olarak tüketmek için genetik araçlar mevcut olsa da, BA'ları BAT veya WAT'tan arındırma teknikleri sınırlıdır ve bu da BA'ları tek hücreli tip düzeyinde incelemeyi zorlaştırmaktadır. Ek olarak, saf BA'lar elde edilmeden, BA'lar ve BA'lar olmayanlar arasındaki ilişki açıkça tanımlanmayacaktır. Örneğin, trombosit kaynaklı büyüme faktörü reseptörü alfa (PDGFRa), farklılaşmamış mezenkimal hücreler için bir belirteç olarak kullanılmıştır ve BAT'nin endotel ve interstisyel hücrelerinde eksprese edilir. Soğuk stresli BAT'ta, PDGFRα pozitif progenitör hücreler yeni BA10'a yol açar. PDGFRa, mezenkimal hücrelerin büyümesini ve çoğalmasını düzenleyen bir büyüme faktörü olan ligand PDGF'si tarafından aktive edilir11; Bununla birlikte, BA'ların PDGF'yi salgılayarak PDGFRα pozitif progenitör hücrelerin davranışını etkileyip etkilemediği açık değildir.
Son zamanlarda, floresan ile aktive edilmiş hücre sıralamaya (FACS) dayanan bir BA izolasyon protokolü yayınlanmıştır12. Bu protokolde, BA'ları BA olmayanlardan ayırmak için% 3 sığır serum albümini (BSA) çözeltisi kullanıldı ve zenginleştirilmiş BA'lar FACS tarafından daha da saflaştırıldı. Bu protokolün uygulanması, hem ekipmana hem de FACS operasyon deneyimlerine dayanan FACS sürecinin gerekliliği ile sınırlıdır. Bu çalışmada, BA'ları BAT'tan izole etmek için yeni bir protokol geliştirilmiştir. Bu protokol tarafından izole edilen BA'lar doğrudan gen ve protein ekspresyon çalışmaları için kullanılabilir. Ayrıca, bu çalışmadan elde edilen veriler, BA'ların önemli bir PDGF kaynağı olduğunu göstermektedir.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Tüm fareler patojensiz koşullarda tutuldu ve tüm prosedürler Masonik Tıbbi araştırma Kurumsal Hayvan Bakımı ve Kullanımı Komitesi (IACUC) tarafından onaylandı. UCP1::Cre9 ve Rosa 26tdDomates fareleri hatları13 daha önce bildirilmişti. Tüm fareler 12 saatlik bir ışık / karanlık döngüsü ile oda sıcaklığında tutuldu.
1. Solüsyonların ve kahverengi yağ dokusunun (BAT) hazırlanması
- 15 mL santrifüj tüplerinde sindirim çözeltisi ve ayırma çözeltisi hazırlayın.
- 10 mL BAT Sindirim çözeltisi: 10 mL steril fosfat tamponlu salin (PBS) için, BAT sindirim çözeltisi yapmak için 3.5 mg / mL Dispase II, 1 mg / mL Kollajenaz II ve 10 mM CaCl2 ekleyin.
- 10 mL% 12 iyodiksanol çözeltisi (ayırma çözeltisi): % 12 iyodiksanol elde etmek için 1 mL 10x PBS, 2 mL% 60 iyodiksanol, 0.01 mL 1 M MgCl 2, 0.025 mL 1 M KCl, 0.1 mL 0.2 M etilendiamintetraasetik asit (EDTA) ve 6.865 mL ddH2O karıştırın.
- CO2 doz aşımı ile bir yetişkin fareyi ötenazileştirin. Kısaca, fare kafesini min/min% 10-30 kafes hacmi yer değiştirme oranında% 100 CO2 ile doldurun. 5 dakika sonra, gözle görülür nefes alıp almadığınızı kontrol ederek ölümü onaylayın.
- Hayvanı disseke edin ve interskapular BAT'yi toplayın. WAT ve kas katmanlarını stereo mikroskop altında çıkarın.
- Yeterli sindirime sahip olmak için, her BAT lobunu ~ 3mm3 parçalara bölün ve metal bir karıştırma çubuğu ve 5 mL sindirim çözeltisi ile temiz bir 50 mL şişeye yerleştirin. Sindirime başlamadan önce, BAT ve sindirim tamponu içeren şişenin 1 saat boyunca buz üzerinde oturmasına izin verin.
NOT: Aşağıdaki adımlarda, kahverengi adiposit izolasyonu için yaklaşık 80 mg BAT kullanılmıştır.
2. BA'ların izolasyon prosedürü
- Şişeyi bir inkübatörün içine yerleştirilmiş manyetik bir karıştırıcıya yerleştirin. Karıştırma hızını sırasıyla 60 rpm'ye ve inkübatörün sıcaklığını 35 ° C'ye ayarlayın. Sindirim yaklaşık 30 dakika sürecektir. BAT dilimleri sindirim sırasında karıştırıcı çubuğun etrafında kümeler oluşturursa, toplanan dokuları bozmak için 1 mL'lik bir pipet ucu kullanın.
- Temiz bir 50 mL santrifüj tüpünün üzerine 70 μm'lik bir süzgeç filtresi yerleştirin. Pipet, süzgeçten yaklaşık 4 mL hücre süspansiyonu sağlar. Süzgeci 4 mL% 12 iyodiksanol çözeltisi ile yıkayın. Hücreleri ve iyodiksanol çözeltisini karıştırmak için yukarı ve aşağı pipetleyin. Hücre karışımını iki berrak 5 mL polistiren test tüpüne aktarın.
NOT: Sindirimin sonunda, sindirim çözeltisi bulanık olmalı ve yeterli sindirimi göstermelidir. Her seferinde taze sindirim çözeltisi kullanın. Hazırlandıktan sonra, sindirim çözeltisi 2 saat içinde kullanılmalıdır. - Sindirim yeterli değilse, adım 2.2 ve 2.3'ü bir kez daha tekrarlayın.
- Ayırma çözeltisini ve BA'ları içeren şeffaf polistiren tüpleri 1 saat boyunca buz üzerinde bırakın. BA'lar üstte bir katman oluşturacaktır.
- Mikroskop incelemesi için izole edilmiş BA'ların 20 μL'sini çıkarın.
3. BA'lardan RNA ve protein izolasyonu
- BA'ları RNA ve protein izolasyonu için iki adet 1.7 mL mikrosantrifüj tüpüne pipetleyin. BA tabakasını bozmadan aşırı iyodiksanol çözeltisini dikkatlice çıkarın.
- RNA, DNA ve proteini hücre çözeltisine aynı anda izole etmek için 1 mL Trizol ekleyin. Hücreleri lize etmek için yeterince karıştırın.
- Fazları ayırmak için 200 μL Kloroform ekleyin.
- Tüpü 4 ° C'de 10 dakika boyunca 9.981 x g santrifüj edin.
- Santrifüjlemeden sonra, RNA izolasyonu için sulu fazı kullanın. Bu çalışmada ters transkripsiyon için total RNA kullanılmış ve Gerçek Zamanlı PCR ile kantitatif RT-PCR gerçekleştirilmiştir. Astar dizileri Malzeme Tablosunda listelenmiştir.
- Organik fazın 300 μL'sini 2 mL'lik bir mikrosantrifüj tüpüne aktarın.
- Organik faza, 10 s için 2.5 hacimli% 100 etanol ve vorteks ekleyin.
- 10 s için 200 μL 1-Bromo-3-kloropropan ve vorteks ekleyin.
- 600 μL çift damıtılmış su ve 10 sn için vorteks ekleyin.
- Karışık çözeltinin oda sıcaklığında 10 dakika bekletin.
- 4 °C'de 10 dakika boyunca 9.981 x g'de santrifüj. Bu adımda, aşamalar ayrılacaktır. Protein fazı orta tabakada lokalizedir.
- Üst sulu çözeltiyi çıkarın. Kalan çözeltiye 1 mL% 100 etanol ekleyin.
- 10 dakika, 9.981 x g, 4 °C santrifüj. Santrifüjlemeden sonra, protein peleti oluşacaktır. Süper natantı atın.
- Peleti 1 mL% 100 etanol ile yıkayın.
- 10 dakika, 9981 x g, 4 °C santrifüj. Peleti kurtarın ve süpernatanı atın.
- Peleti oda sıcaklığında 10 dakika boyunca hava ile kurulayın.
- Islak peletin ağırlığını ölçün. 20 μL/mg pelet oranında %1 SDS çözeltisi ekleyin.
- Tüpü ısıtılmış bir çalkalayıcıya koyarak peleti çözün. Sıcaklığı 55 ° C'ye ve hızı 11 x g'ye ayarlayın. Protein peletinin tamamen çözülmesi genellikle 5-10 dakika sürer.
NOT: Çözünmüş proteinin konsantrasyonu BCA testi14 ile ölçülebilir.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Kahverengi adiposit izolasyonu için interakapuler BAT'ın hazırlanması
Kahverengi adipositler (BA'lar) izolasyon süreci Şekil 1A'da gösterilmiştir. BAT ve sindirim / ayırma çözeltilerinin hazırlanmasından izole edilmiş BA'ların elde edilmesine kadar tüm süreç yaklaşık 4 saat sürecektir.
Yetişkin farelerde, interskapuler bölgede bol miktarda BAT bulunur. Bu interskapuler BAT (iBAT) kas katmanları ve WAT ile kaplıdır (Şekil 1B). Sindirim prosedürüne başlamadan önce, temiz iBAT elde etmek için kas katmanlarının ve WAT'ın çıkarılması gerekir (Şekil 1C). Yayınlanmış bir BA izolasyon protokolünde, BA'ların izolasyonu12 için kıyılmış BAT kullanılmıştır. Bu çalışmada,3 mm3 boyutunda BAT'ın sindirimi (Şekil 1D), kıyılmış BAT'den daha fazla BA vermiştir.
BA'ların BA olmayanlardan %3 BSA çözeltisi ile ayrılması
iBAT sindiriminden sonra, ayrışmış BA'lar, sindirim ürünündeki BA olmayanlarla karıştırıldı. BA'lar lipit damlacıkları içerdiğinden, yoğunlukları BA olmayanlardan daha düşüktür; Bununla birlikte, BA'ların yoğunluğu, normal bir PBS çözeltisinin tepesine verimli bir şekilde yüzmelerine izin verecek kadar düşük değildir. BA'ları BA olmayanlardanayırmak için %3 sığır serum albümini (BSA) içeren PBS kullanılmış ve bu çalışmada başarıyla tekrarlanmıştır (Şekil 2A).
Rosa 26 tdTomato, Cre-mediated rekombinasyon13'ü takiben güçlü tdDomates (tdTom) floresan proteinini ifade eden bir muhabir fare hattıdır. Ucp1::Cre transgenik fareler, BA'larda Cre rekombinazını eksprese eder9. Ucp1::Cre fare çizgisi, BA'ları tdTom ile genetik olaraketiketlemek için Rosa 26 tdTomato fareleri ile geçildi (Şekil 2B). BA'ların izolasyon prosedürünü doğrulamak için, Ucp1::Cre;tdTom/+ farelerden iBAT ayrıldı. BSA çözeltisinin üst tabakasında zenginleştirilmiş hücrelerin çoğu ahududu şeklindeydi ve çok loküler lipit damlacıkları içeriyordu. Ayrıca, bu ahududu şeklindeki hücrelerin çoğu tdTom pozitifti (Şekil 2C), kahverengi adipositler olduklarını doğruladı.
BA'ların BA olmayanlardan% 6 iyodiksanol çözeltisi ile ayrılması
%3 BSA ayırma çözeltisi zenginleştirilmiş BA'lar. Bu izole BA'ların gen ve protein ekspresyon analizi için kullanılıp kullanılamayacağı belirsizdi. RNA ve protein daha sonra zenginleştirilmiş BA'lardan ekstrakte edildi. RNA ekstraksiyonu, standart RNA izolasyon prosedürüne göre başarıyla gerçekleştirildi. Bununla birlikte, Guanidinium tiyosiyanat-fenol-kloroform yöntemi (GTPC yöntemi) olarak da bilinen standart Trizol protein izolasyon protokolü, sıkıcı ve çok düşük protein verimine sahip olan iyi çalışmadı. Bu nedenle, Trizol-lize BA'lardan protein çıkarmak için geliştirilmiş bir protein izolasyon yöntemi benimsenmiştir.
Bu geliştirilmiş GTPC protokolünde, organik faz15'ten protein çıkarmak için etanol, bromo-kloropropan ve su kullanılmıştır. Organik faza etanol, bromo-kloropropan ve su eklendikten sonra ve santrifüjlemeden sonra, sulu faz ile organik faz arasında protein peleti oluşur (Şekil 3A). Protein peleti daha sonra% 100 etanol ile yıkandı ve% 1 SDS içinde çözüldü. Bu geliştirilmiş GTPC yöntemi, iBAT ve BSA çözeltisi ile zenginleştirilmiş BA'lardan protein çıkarmak için kullanıldı. BAT protein peleti% 1 SDS'de kolayca çözünmesine rağmen, izole edilmiş BA protein peletinin büyük bir kısmı çözünmezdi. Daha sonra çözünmüş protein SDS-PAGE jeli ile incelendi. Bir Coomassie mavisi lekeli SDS-PAGE jelinde (Şekil 3B) gösterildiği gibi, izole edilmiş BA'larda 60 kDa civarında büyük bir protein bandı mevcuttu, ancak BAT örneklerinde mevcut değildi. BSA'nın moleküler ağırlığı 66 kDa olduğundan ve BA'ların ayırma çözeltisinde bol miktarda BSA bulunduğundan, bu baskın protein bandı BSA olmalıdır. Bu veriler, BA'ların ayırma çözeltisinden BSA'nın protein ekstraksiyonuna müdahale ettiğini göstermektedir.
İyodiksanol, hücre17 ve adeno ilişkili virüs (AAV) saflaştırması18 için yaygın olarak kullanılan noniyonik ve izo-ozmotik gradyan bir ortam16'dır. Protein ekspresyon çalışmalarının BSA girişimini önlemek için, yeni bir BA ayırma çözeltisinde BSA'nın yerini almak için iyodiksanol kullanılmıştır. % 3 BSA çözeltisi,% 6 iyodiksanole benzer olan 1.03'lük bir yoğunluğa sahiptir. % 6 iyodiksanol çözeltisinde, BA'lar 30-60 dakika içinde tepeye doğru yüzdü (Şekil 3C). Bu çözelti ile izole edilen BA'lar tipik ahududu şekli gösterdi ve multiloküler lipid damlacıkları içeriyordu (Şekil 3D). Bu izole BA'lardan ekstrakte edilen proteinler SDS-PAGE jelinde güzel bir şekilde ayrıldı (Şekil 3E).
% 6'lık iyotiksanol çözeltisinin BA'ları BA olmayanlardan verimli bir şekilde ayırıp ayırmadığını doğrulamak için, BA'ları genetik olarak tdTom ile etiketledik ve% 6'lık berrak iyodiksanol çözeltisinde bulunan hücreleri inceledik. BA'ları BA olmayanlardan ayırdıktan sonra (adım 2.4), BA tabakasının altındaki %6'lık iyotiksanol çözeltisi PBS ile 6 kez seyreltildi ve daha sonra 5 dakika boyunca 600 x g'de santrifüj edildi. Santrifüjlemeden sonra, altta stromal vasküler fraksiyon hücreleri olabilecek küçük bir kırmızı hücre peleti oluşturuldu. Şekil 3'te gösterildiği gibi, BA'lar katmanındaki hücreler tdTom pozitif hücrelerdi (Şekil 3F); ancak peletten elde edilen hücreler tdTom negatifti (Şekil 3G). Ek olarak, tdTom negatif hücrelerinde belirgin bir lipit damlacığı görülmedi. Bu veriler, yeni protokolümüzün BA'ları yağ olmayan hücrelerden verimli bir şekilde ayırabileceğini göstermektedir.
Birlikte, bu veriler BA'ların% 3 BSA çözeltisi ile izole edilmesinin, takip eden biyokimya çalışmalarına müdahale ettiğini ve% 6 iyodiksanol çözeltisinin, BA'ları izole etmek için% 3 BSA çözeltisinden daha iyi olduğunu göstermektedir.
İzole BA'larla gen ve protein ekspresyon analizi.
Bu yeni BA izolasyon prosedürünü moleküler düzeyde doğrulamak için, BAT ve izole BA'lar arasında üç genin ekspresyonu karşılaştırıldı: Ucp1, Pdgfa ve Pdgfra. BAT'de, Pdgfra endotel hücrelerinde ve interstisyel hücrelerde eksprese edilir ve PDGFRa pozitif hücreler varsayılan progenitör hücrelerdir10. Ucp1 ve Pdgfa'nın mRNA düzeyleri, izole BA'larda BAT'a göre anlamlı derecede yüksekti (Şekil 4A, B). Aksine, Pdgfra'nın mRNA'sı sadece BAT'ta tespit edildi (Şekil 4B).
PPARγ, yağ dokusu gelişimini kontrol eden bir transkripsiyonel faktördür, UCP1 bir mitokondri proteinidir ve PDGFRα bir membran reseptör proteinidir. Bu üç protein, farklı hücresel bölmelerde dağılmış proteinleri temsil eder. Trizol-lize BA'lardan ve BAT'tan ekstrakte edilen proteinin protein ekspresyon analizi için uygun olup olmadığını test etmek için Western lekeleri yapıldı. UCP1 ve PPARγ hem BA'larda hem de BAT'ta tespit edildi (Şekil 4C, D), Trizol-lize BA'lardan veya BAT'tan izole edilen toplam proteinin batı lekesi için uygun olduğunu doğruladı. Ayrıca, qRT-PCR sonuçlarıyla tutarlı olarak, UCP1 proteini BA'larda zenginleştirilmiştir (Şekil 4C); PDGFRα ise sadece BAT'ta saptandı, ancak saf BA'larda tespit edilmedi (Şekil 4D). Özetle, bu veriler yeni BA izolasyon yöntemimizin etkili olduğunu göstermekte ve bu yöntemle zenginleştirilmiş BA'ların gen ve protein ekspresyon çalışmaları için doğrudan kullanılabileceğini göstermektedir.
Şekil 1: Kahverengi adiposit izolasyonu için iBAT'ın hazırlanması. (A) Kahverengi adiposit izolasyon prosedürünün iş akışı. (B) BAT, WAT ve kas tabakalarını içeren interskapuler dokunun ventral görünümü. (C) İnterskopüler BAT (iBAT). iBAT'a bitişik kas tabakaları ve WAT çıkarıldı. (D) Kahverengi adiposit izolasyonu için kullanılan iBAT parçalarının temsili bir görüntüsü. B-D, Ölçek çubuğu = 5 mm. Bu şeklin daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.
Şekil 2: Kahverengi adipositlerin sindirim çözeltisinden ayrılması. (A) Ayrışmış kahverengi adipositlerin ayrılmadan önce ve sonra görüntüleri. Kahverengi adipositleri kahverengi olmayan adipositlerden ayırmak için% 3 BSA çözeltisi kullanıldı. Ölçek çubuğu = 1 cm. (B) Kahverengi adipositlerin tdDomates floresan proteini ile etiketlenmesinin şematik görünümü. (C) İzole kahverengi adipositlerin görüntüleri. DIC, diferansiyel girişim kontrastı. Ölçek çubuğu = 50 μm. Bu şeklin daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.
Şekil 3: Lize kahverengi adipositlerden toplam proteinin ekstraksiyonu . (A) Protein fazının organik fazdan ayrılması. (B) SDS-PAGE jelinin Coomassie boyaması. Toplam protein, BAT veya% 3 BSA çözeltisi saflaştırılmış kahverengi adipositlerden ekstrakte edildi. BSA protein bandı bir okla gösterildi. (C) %6 iyodiksanol çözeltisi üzerine oluşan kahverengi adiposit tabakası. Ölçek çubuğu = 1 cm. (D) %6 iyodiksanol çözeltisi ile izole edilmiş kahverengi adipositler. Kahverengi adipositler sarı oklarla belirtildi. Ölçek çubuğu = 50 μm. (E) SDS-PAGE jelinin Coomassie boyaması. Toplam protein, BAT veya% 6 iyodiksanol çözeltisi ile zenginleştirilmiş BA'lardan ekstrakte edildi. (F) Kahverengi adipositler etiketli tdTom görüntüleri. (G) BA tabakasının altındaki iyodiksanol çözeltisinden elde edilen hücrelerin görüntüleri. F ve G, ölçek çubuğu = 50 μm. Bu şeklin daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.
Şekil 4: İzole kahverengi adipositlerin gen ve protein ekspresyon analizi. Bu gen ve protein ekspresyon çalışmalarında iyodiksanol yöntemi ile izole edilen kahverengi adipositler kullanılmıştır. (A,B) gen ekspresyonunun qRT-PCR ölçümü. mRNA seviyeleri 36B4'e normalleştirildi. N=3. Öğrenci t testi, *, P<0.01; **, P<0.01. (C) PPARγ ve UCP1'in batıda lekelenmesi. (D) PDGFRa'nın batı lekelenmesi. Yükleme kontrolü olarak C ve D, Ponceau S-boyalı membran kullanıldı. Bu şeklin daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Bu çalışmada, gen ve protein ekspresyon analizi için BA'ları izole etmek için yeni bir yöntem geliştirilmiştir.
Yayınlanmış bir BA izolasyon protokolünde, BA'ları zenginleştirmek için% 3 BSA çözeltisi kullanılmıştır12. Bununla birlikte, bu yayınlanmış protokol ile elde edilen zenginleştirilmiş BA'lar, protein ekspresyon analizi için doğrudan kullanılamamıştır. Bunun nedeni, BA çözeltisinde bulunan konsantre BSA'nın, takip eden protein ekstraksiyonuna müdahale etmesidir. % 3 BSA çözeltisinde zenginleştirilmiş BA'lar Trizol reaktifi ile muamele edildiğinde, çoğunluğu GTPC protein ekstraksiyon işleminde çözünmeyen yapışkan protein agregaları oluşacaktır. Ek olarak, GTPC protein ekstraksiyon ürününde, proteinin çoğu BSA idi (Şekil 3B). Bu yeni protokolde,% 3 BSA ayırma çözeltisi, BA'ları saflaştırmak için% 6 iyodiksanol ile değiştirildi. % 6 iyodiksanol çözeltisi BA'ları BA olmayanlardan verimli bir şekilde ayırdı ve izole BA'lar morfolojiyi korudu (Şekil 3D). % 3'lük BSA çözeltisinden daha üstün,% 6'lık iyodiksanol çözeltisi protein ekstraksiyonuna müdahale etmedi ve ekstrakte edilen protein batı leke analizi için uygundu (Şekil 4C, D).
Yağ dokusu çok miktarda lipit içerir ve ekstrakte edilen protein numunelerinde lipit kontaminasyonu protein konsantrasyonu ölçümünü engeller. Son zamanlarda, protein ekstraksiyonlarından lipitleri çıkarmak için bir protokol yayınlanmıştır. Bu protokolde, sıkıcı olan ve çok miktarda başlangıç malzemesine ihtiyaç duyan bir dizi düşük sıcaklık santrifüjleme gereklidir19. Bu çalışmada, proteini BAT'den izole etmek için geliştirilmiş bir GTPC yöntemi15 benimsenmiştir. Klasik GTPC protokolünden farklı olarak, bu geliştirilmiş GTPC protokolü, proteini organik fazdan çıkarmak için etanol, bromo-kloropropan ve su kullandı. Verilerimiz, bu geliştirilmiş GTPC yöntemiyle izole edilen proteinin, bikinkoninik asit testi (BCA) bazlı protein konsantrasyonu ölçümü ile uyumlu olduğunu göstermiştir.
Mevcut BA'ların izolasyon protokolünde, enzim ayrışma işleminin başlamasından önce, BAT ve sindirim çözeltisi karışımı bir saat boyunca buz üzerine yerleştirildi. Bu prosedürün amacı, hücre metabolizmasını ve gen ekspresyon hızını20 azaltmanın yanı sıra, sindirim enzimlerinin kahverengi yağ dokusuna verimli bir şekilde nüfuz etmesine izin vermektir.
Bu çalışma, gen ekspresyon çalışması için kahverengi adiopositleri interskapuler BAT'tan izole etmek için bir straitforward yöntemi geliştirmeyi amaçlamıştır; Bununla birlikte, izole BA'larda beyaz adiposit kontaminasyonu olabilir. Bunun nedeni, interskapuler BAT'ın bazen BAT hazırlama adımı sırasında tamamen çıkarılamayan beyaz yağ dokusu tarafından bağlanmasıdır. Mevcut protokol, hücre yoğunluğuna bağlı olarak BA'ları WA'lardan ayıramaz. Bu nedenle, çok yüksek saflık gerekliyse, izole edilmiş BA'ların analiz edilmeden önce FACS'a göre sıralanması gerekir.
İnterskapüler BAT (iBAT), embriyonik gelişim sırasında Myf5 hücre soyundan türetilen bol miktarda klasik BA içerir21. Burada iBAT, BA'ları izole etmek için bir örnek olarak kullanılmıştır. Yayınlanan protokol12'ye benzer şekilde, yöntemimiz bej hücreleri WAT'tan izole etmek için de kullanılabilir. Bununla birlikte, WAT'tan saf bej hücreler elde etmek için, bej hücrelerin floresan proteini ile etiketlenmesi ve FACS ile zenginleştirilmesi gerekir. Mevcut protokolümüzü takiben, FACS ile zenginleştirilmiş bej hücreler hem gen hem de protein ekspresyon analizi için kullanılabilir ve bu da biyolojik malzeme kullanımının verimliliğini büyük ölçüde artıracaktır.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Hiç kimse
Acknowledgments
Z. Lin, Ulusal Sağlık Enstitüleri HL138454-01 ve Masonik Tıbbi Araştırma Enstitüsü fonları tarafından desteklenmiştir.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Antibodies | |||
| Antigen | Company | Catalog | |
| PPARγ | LSBio | Ls-C368478 | |
| PDGFRa | Santa Cruz | sc-398206 | |
| UCP1 | R&D system | IC6158P | |
| Chemical and solutions | |||
| Collagenase, Type II | Thermo Fisher Scientific | 17101015 | |
| 1-Bromo-3-chloropropane | Sigma-Aldrich | B62404 | |
| Bovine Serum Albumin (BSA) | Goldbio | A-421-10 | |
| Calcium chloride | Bio Basic | CT1330 | |
| Chloroform | IBI Scientific | IB05040 | |
| Dispase II, protease | Sigma-Aldrich | D5693 | |
| EDTA | Bio Basic | EB0107 | |
| Ethanol | IBI Scientific | IB15724 | |
| LiQuant Universal Green qPCR Master Mix | LifeSct | LS01131905Y | |
| Magnesium Chloride Hexahydrate | Boston BioProducts | P-855 | |
| OneScrip Plus cDNA Synthesis SuperMix | ABM | G454 | |
| OptiPrep (Iodixanol) | Cosmo Bio USA | AXS-1114542 | |
| PBS (10x) | Caisson Labs | PBL07 | |
| PBS (1x) | Caisson Labs | PBL06 | |
| Pierce BCA Protein Assay Kit | Thermo Fisher Scientific | 23227 | |
| Potassium Chloride | Boston BioProducts | P-1435 | |
| SimplyBlue safe Stain | Invitrogen | LC6060 | |
| Sodium dodecyl sulfate (SDS) | Sigma-Aldrich | 75746 | |
| Trizol reagent | Life technoologies | 15596018 | |
| Primers | |||
| Gene name (Species) | Forward | Reverse | |
| Pdgfra (Mouse) | CTCAGCTGTCTCCTCACAgG | CAACGCATCTCAGAGAAAAGG | |
| Pdgfa (Mouse) | TGTGCCCATTCGCAGGAAGAG | TTGGCCACCTTGACACTGCG | |
| 36B4(Mouse) | TGCTGAACATCTCCCCCTTCTC | TCTCCACAGACAATGCCAGGAC | |
| Ucp1 | ACTGCCACACCTCCAGTCATT | CTTTGCCTCACTCAGGATTGG | |
| Equipment | |||
| Name | Company | Application | |
| Keyence BZ-X700 | Keyence | Imaging brown adipocytes | |
| Magnetic stirrer | VWR | Dissociate BAT | |
| QuantStudio 6 Flex Real-Time PCR System | Applied Biosystem | Quantitative PCR | |
| The Odyssey Fc Imaging system | LI-COR | Western blot immaging |
References
- Zwick, R. K., Guerrero-Juarez, C. F., Horsley, V., Plikus, M. V. Anatomical, physiological, and functional diversity of adipose tissue. Cell Metabolism. 27, 68-83 (2018).
- Symonds, M. E. Brown adipose tissue growth and development. Scientifica. 2013, Cairo. 305763 (2013).
- Giralt, M., Villarroya, F. White, brown, beige/brite: Different adipose cells for different functions. Endocrinology. 154, 2992-3000 (2013).
- Cannon, B., Nedergaard, J. Brown adipose tissue: function and physiological significance. Physiological Reviews. 84, 277-359 (2004).
- Cinti, S.
- Wu, J., et al. Beige adipocytes are a distinct type of thermogenic fat cell in mouse and human. Cell. 150, 366-376 (2012).
- Cypess, A. M., Kahn, C. R. Brown fat as a therapy for obesity and diabetes. Current Opinion in Endocrinology, Diabetes and Obesity. 17, 143-149 (2010).
- Schoettl, T., Fischer, I. P., Ussar, S. Heterogeneity of adipose tissue in development and metabolic function. Journal of Experimental Biology. 221, (2018).
- Kong, X., et al. IRF4 is a key thermogenic transcriptional partner of PGC-1α. Cell. 158, 69-83 (2014).
- Lee, Y. H., Petkova, A. P., Konkar, A. A., Granneman, J. G. Cellular origins of cold-induced brown adipocytes in adult mice. The FASEB Journal. 29, 286-299 (2015).
- Kim, W. -S., Park, H. -S., Sung, J. -H. The pivotal role of PDGF and its receptor isoforms in adipose-derived stem cells. Histology and Histopathology. 30 (7), 793-799 (2015).
- Hagberg, C. E. Flow cytometry of mouse and human adipocytes for the analysis of browning and cellular heterogeneity. Cell Report. 24, 2746-2756 (2018).
- Madisen, L., et al. A robust and high-throughput Cre reporting and characterization system for the whole mouse brain. Nature Neuroscience. 13, 133-140 (2010).
- Smith, P. K., et al.
- Chey, S., Claus, C., Liebert, U. G. Improved method for simultaneous isolation of proteins and nucleic acids. Analytical Biochemistry. 411, 164-166 (2011).
- Ford, T., Graham, J., Rickwood, D. Iodixanol: A nonionic iso-osmotic centrifugation medium for the formation of self-generated gradients. Analytical Biochemistry. 220, 360-366 (1994).
- Kovacovicova, K., Vinciguerra, M. Isolation of senescent cells by iodixanol (OptiPrep) density gradient-based separation. Cell Proliferation. 52, 12674 (2019).
- Lock, M., et al. versatile manufacturing of recombinant adeno-associated viral vectors at scale. Human Gene Therapy. 21, 1259-1271 (2010).
- Marin, R. D., Crespo-Garcia, S., Wilson, A. M., Sapieha, P. RELi protocol: Optimization for protein extraction from white, brown, and beige adipose tissues. MethodsX. 6, 918-928 (2019).
- Sonna, L. A., Fujita, J., Gaffin, S. L., Lilly, C. M. Invited Review: effects of heat and cold stress on mammalian gene expression. Journal of Applied Physiology. 92, 1725-1742 (2002).
- Gensch, N., Borchardt, T., Schneider, A., Riethmacher, D., Braun, T. Different autonomous myogenic cell populations revealed by ablation of Myf5-expressing cells during mouse embryogenesis. Development. 135, 1597-1604 (2008).
