Isolerande bruna adipocyter från murin interscapular brun fettvävnad för gen- och proteinuttrycksanalys
Summary
Denna studie beskriver en ny metod för att isolera murinbruna adipocyter för gen- och proteinuttrycksanalys.
Abstract
Brun fettvävnad (BAT) är ansvarig för icke-skakande termogenes hos däggdjur, och bruna adipocyter (BA) är de funktionella enheterna i BAT. BA innehåller både multilokulära lipiddroppar och rikliga mitokondrier, och de uttrycker frikopplingsprotein 1 (UCP1). BA kategoriseras i två undertyper baserat på deras ursprung: embryo-härledda klassiska BA (cBA) och vita adipocyter härledda BA. På grund av sin relativt låga densitet kan BA inte isoleras från BAT med traditionell centrifugeringsmetod. I denna studie utvecklades en ny metod för att isolera BA från möss för gen- och proteinuttrycksanalys. I detta protokoll smältes interscapular BAT från vuxna möss med kollagenas och Dispase-lösning, och de dissocierade BA berikades med 6% jodoxanollösning. Isolerade BA lyserades sedan med Trizol-reagens för samtidig isolering av RNA, DNA och protein. Efter RNA-isolering användes den organiska fasen av lysatet för proteinextraktion. Våra data visade att 6% jodoxanollösning effektivt berikade BA utan att störa uppföljande gen- och proteinuttrycksstudier. Trombocyt-härledd tillväxtfaktor (PDGF) är en tillväxtfaktor som reglerar tillväxten och spridningen av mesenkymala celler. Jämfört med den bruna fettvävnaden hade isolerade BA signifikant högre uttryck av Pdgfa. Sammanfattningsvis ger denna nya metod en plattform för att studera biologin hos bruna adipocyter på en enda celltypsnivå.
Introduction
Både möss och människor har två typer av fettvävnader: vit fettvävnad (WAT) och brun fettvävnad (BAT)1. WAT lagrar energi i form av triglycerider i vita adipocyter, och de bruna adipocyterna (BA) i BAT sprider kemisk energi som värme2. Baserat på deras utvecklingsursprung kategoriseras BA vidare i klassiska BA (cBA) som bildades under embryoutveckling och vita adipocyter härledda BA (beige / brite-celler, konverterade från vita adipocyter under stressförhållanden)3. BA är multilokulära och uttrycker det termogena proteinfrikopplingsproteinet 1 (UCP1)4. Interscapular BAT (iBAT) depå är en av de primära cBAs-depåerna i små däggdjur5, medan beige celler sprids inom WAT6.
På grund av deras natur att sprida energi har BA fått mycket uppmärksamhet som ett terapeutiskt mål för att minska fetma7. För att utnyttja BA för att behandla fetma är det viktigt att förstå de molekylära mekanismerna som styr BAs funktion, överlevnad och rekrytering. Fettvävnader inklusive BAT och WAT är heterogena. Med undantag för adipocyter innehåller fettvävnader många andra celltyper, såsom endotelceller, mesenkymala stamceller och makrofager8. Även om genetiska verktyg för att specifikt tömma kandidatgener hos möss BAs finns tillgängliga, såsom UCP1::Cre line9, är tekniker för att rena BA från BAT eller WAT begränsade, vilket gör det svårt att studera BA på encellstypnivå. Dessutom, utan att erhålla rena BAs, kommer förhållandet mellan BA och icke-BAs inte att vara tydligt avgränsat. Till exempel har trombocyt-härledd tillväxtfaktorreceptor alfa (PDGFRα) använts som en markör för odifferentierade mesenkymala celler, och det uttrycks i endotel- och interstitiella celler i BAT. Vid kallstressad BAT ger PDGFRα-positiva stamceller upphov till nya BAs10. PDGFRα aktiveras av dess ligand PDGF, en tillväxtfaktor som reglerar tillväxten och spridningen av mesenkymala celler11; Det är dock oklart om BA påverkar beteendet hos PDGFRα-positiva stamceller genom att utsöndra PDGF.
Nyligen har ett BAs-isoleringsprotokoll publicerats, som är baserat på fluorescensaktiverad cellsortering (FACS)12. I detta protokoll användes 3% bovint serumalbumin (BSA) lösning för att separera BA från icke-BA, och de berikade BA: erna renades ytterligare av FACS. Tillämpningen av detta protokoll begränsas av kravet på FACS-processen, som bygger på både utrustning och FACS-driftsupplevelser. I denna studie utvecklades ett nytt protokoll för att isolera BA från BAT. De BA som isoleras av detta protokoll kan användas direkt för gen- och proteinuttrycksstudier. Dessutom tyder data från denna studie på att BA är en viktig PDGF-resurs.
Protocol
Representative Results
Discussion
I denna studie utvecklades en ny metod för att isolera BA för gen- och proteinuttrycksanalys.
I ett publicerat BAs-isoleringsprotokoll användes 3% BSA-lösning för att berika BAs12. De berikade BA som uppnåddes genom detta publicerade protokoll kunde dock inte användas direkt för proteinuttrycksanalys. Detta beror på att den koncentrerade BSA som finns i BAs-lösningen stör uppföljningen av proteinextraktionen. När BA berikade i 3% BSA-lösningen behandlades …
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Z. Lin stöddes av National Institutes of Health HL138454-01 och Masonic Medical Research Institute-medel.
Materials
| Antibodies | |||
| Antigen | Company | Catalog | |
| PPARγ | LSBio | Ls-C368478 | |
| PDGFRa | Santa Cruz | sc-398206 | |
| UCP1 | R&D system | IC6158P | |
| Chemical and solutions | |||
| Collagenase, Type II | Thermo Fisher Scientific | 17101015 | |
| 1-Bromo-3-chloropropane | Sigma-Aldrich | B62404 | |
| Bovine Serum Albumin (BSA) | Goldbio | A-421-10 | |
| Calcium chloride | Bio Basic | CT1330 | |
| Chloroform | IBI Scientific | IB05040 | |
| Dispase II, protease | Sigma-Aldrich | D5693 | |
| EDTA | Bio Basic | EB0107 | |
| Ethanol | IBI Scientific | IB15724 | |
| LiQuant Universal Green qPCR Master Mix | LifeSct | LS01131905Y | |
| Magnesium Chloride Hexahydrate | Boston BioProducts | P-855 | |
| OneScrip Plus cDNA Synthesis SuperMix | ABM | G454 | |
| OptiPrep (Iodixanol) | Cosmo Bio USA | AXS-1114542 | |
| PBS (10x) | Caisson Labs | PBL07 | |
| PBS (1x) | Caisson Labs | PBL06 | |
| Pierce BCA Protein Assay Kit | Thermo Fisher Scientific | 23227 | |
| Potassium Chloride | Boston BioProducts | P-1435 | |
| SimplyBlue safe Stain | Invitrogen | LC6060 | |
| Sodium dodecyl sulfate (SDS) | Sigma-Aldrich | 75746 | |
| Trizol reagent | Life technoologies | 15596018 | |
| Primers | |||
| Gene name (Species) | Forward | Reverse | |
| Pdgfra (Mouse) | CTCAGCTGTCTCCTCACAgG | CAACGCATCTCAGAGAAAAGG | |
| Pdgfa (Mouse) | TGTGCCCATTCGCAGGAAGAG | TTGGCCACCTTGACACTGCG | |
| 36B4(Mouse) | TGCTGAACATCTCCCCCTTCTC | TCTCCACAGACAATGCCAGGAC | |
| Ucp1 | ACTGCCACACCTCCAGTCATT | CTTTGCCTCACTCAGGATTGG | |
| Equipment | |||
| Name | Company | Application | |
| Keyence BZ-X700 | Keyence | Imaging brown adipocytes | |
| Magnetic stirrer | VWR | Dissociate BAT | |
| QuantStudio 6 Flex Real-Time PCR System | Applied Biosystem | Quantitative PCR | |
| The Odyssey Fc Imaging system | LI-COR | Western blot immaging | |
References
- Zwick, R. K., Guerrero-Juarez, C. F., Horsley, V., Plikus, M. V. Anatomical, physiological, and functional diversity of adipose tissue. Cell Metabolism. 27, 68-83 (2018).
- Symonds, M. E. Brown adipose tissue growth and development. Scientifica. 2013, 305763 (2013).
- Giralt, M., Villarroya, F. White, brown, beige/brite: Different adipose cells for different functions. Endocrinology. 154, 2992-3000 (2013).
- Cannon, B., Nedergaard, J. Brown adipose tissue: function and physiological significance. Physiological Reviews. 84, 277-359 (2004).
- Cinti, S. The adipose organ. Prostaglandins, Leukotrienes and Essential Fatty Acids. 73, 9-15 (2005).
- Wu, J., et al. Beige adipocytes are a distinct type of thermogenic fat cell in mouse and human. Cell. 150, 366-376 (2012).
- Cypess, A. M., Kahn, C. R. Brown fat as a therapy for obesity and diabetes. Current Opinion in Endocrinology, Diabetes and Obesity. 17, 143-149 (2010).
- Schoettl, T., Fischer, I. P., Ussar, S. Heterogeneity of adipose tissue in development and metabolic function. Journal of Experimental Biology. 221, (2018).
- Kong, X., et al. IRF4 is a key thermogenic transcriptional partner of PGC-1α. Cell. 158, 69-83 (2014).
- Lee, Y. H., Petkova, A. P., Konkar, A. A., Granneman, J. G. Cellular origins of cold-induced brown adipocytes in adult mice. The FASEB Journal. 29, 286-299 (2015).
- Kim, W. -. S., Park, H. -. S., Sung, J. -. H. The pivotal role of PDGF and its receptor isoforms in adipose-derived stem cells. Histology and Histopathology. 30 (7), 793-799 (2015).
- Hagberg, C. E. Flow cytometry of mouse and human adipocytes for the analysis of browning and cellular heterogeneity. Cell Report. 24, 2746-2756 (2018).
- Madisen, L., et al. A robust and high-throughput Cre reporting and characterization system for the whole mouse brain. Nature Neuroscience. 13, 133-140 (2010).
- Smith, P. K., et al. Measurement of protein using bicinchoninic acid. Analytical biochemistry. 150, 76-85 (1985).
- Chey, S., Claus, C., Liebert, U. G. Improved method for simultaneous isolation of proteins and nucleic acids. Analytical Biochemistry. 411, 164-166 (2011).
- Ford, T., Graham, J., Rickwood, D. Iodixanol: A nonionic iso-osmotic centrifugation medium for the formation of self-generated gradients. Analytical Biochemistry. 220, 360-366 (1994).
- Kovacovicova, K., Vinciguerra, M. Isolation of senescent cells by iodixanol (OptiPrep) density gradient-based separation. Cell Proliferation. 52, 12674 (2019).
- Lock, M., et al. versatile manufacturing of recombinant adeno-associated viral vectors at scale. Human Gene Therapy. 21, 1259-1271 (2010).
- Marin, R. D., Crespo-Garcia, S., Wilson, A. M., Sapieha, P. RELi protocol: Optimization for protein extraction from white, brown, and beige adipose tissues. MethodsX. 6, 918-928 (2019).
- Sonna, L. A., Fujita, J., Gaffin, S. L., Lilly, C. M. Invited Review: effects of heat and cold stress on mammalian gene expression. Journal of Applied Physiology. 92, 1725-1742 (2002).
- Gensch, N., Borchardt, T., Schneider, A., Riethmacher, D., Braun, T. Different autonomous myogenic cell populations revealed by ablation of Myf5-expressing cells during mouse embryogenesis. Development. 135, 1597-1604 (2008).
